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a migracin celular es un
proceso fundamental para el
desarrollo y mantenimiento
de los organismos multice-
lulares.
1
Durante el desarro-
llo embrionario, la migracin celular per-
mite dar forma a estructuras complejas
como el sistema nervioso, el siste-
ma vascular, o el rbol bronquial.
En los organismos adultos, la mi-
gracin celular es esencial para la
defensa inmunolgica. En res-
puesta a una infeccin bacteriana,
por ejemplo, los neutrfilos
migran rpidamente hacia el lu-
gar de la inflamacin dirigidos por
gradientes de seales qumicas y,
una vez llegados a su destino, pro-
ceden a eliminar los patgenos
causantes de la infeccin.
La desregulacin de los mecanis-
mos que gobiernan la migracin
celular es el causante de enferme-
dades graves como la inflamacin crni-
ca o el cncer. En este ltimo caso, la
migracin celular es el proceso clave que
permite a las clulas tumorales invadir los
tejidos vecinos y penetrar los vasos san-
guneos y linfticos para metastatizar en
rganos o tejidos distantes. En este sen-
tido, varios autores han catalogado el cn-
cer como una enfermedad de la migracin,
ya que, si se pudiera controlar esta fun-
cin de las clulas tumorales, la gran
mayora de muertes por cncer se podran
evitar. Desgraciadamente, an nos encon-
tramos lejos de este objetivo, pero el de-
sarrollo reciente de la nanotecnologa y
su aplicacin a la migracin celular est
dando lugar a avances prometedores en
la lucha contra el cncer y enfermedades
infecciosas.
Las leyes de Newton establecen que no
es posible entender el movimiento de un
objeto sin conocer las fuerzas que actan
sobre l, y las clulas no son una excep-
cin a esta regla.
2
Qu fuerzas genera una
clula tumoral para poder invadir un te-
jido vecino? Qu fuerza debe aplicar un
neutrfilo para cruzar el endotelio
y llegar al lugar de infeccin? Es-
tas fuerzas se encuentran en el ran-
go del nanonewton, y solo han
podido ser medidas recientemen-
te gracias al desarrollo de nano-
tcnicas como la microscopia de
traccin y la microscopia de fuer-
za atmica. Gracias a estas tcni-
cas hemos podido comprender los
mecanismos bsicos que permiten
el movimiento de las clulas a es-
cala nanomtrica.
La migracin celular se produce
mediante un ciclo biomecnico
consistente en cuatro pasos (fig.
1). El primero de estos pasos es la exten-
sin de una protrusin en el polo ante-
rior de la clula. Seguidamente, esta
protrusin se adhiere al sustrato por me-
dio de un complejo focal que involucra
ms de un centenar de protenas diferen-
Nanotecnologas para el estudio
de la migracin celular
Xavier Serra-Picamal y Xavier Trepat
L
DOSSI ER CI ENT FI CO
Una gran variedad de procesos fisiolgicos y patofisiolgicos como el desarrollo embrionario,
la respuesta inmune, la metstasis y la cicatrizacin de tejidos dependen de la capacidad migratoria celular.
La migracin celular involucra procesos bioqumicos y biomecnicos, pero se desconoce cmo estos
procesos estn integrados a escala molecular. El reciente desarrollo de bionanotecnologas como
la microscopia de traccin o los biosensores FRET est permitiendo la medicin directa de la fuerzas
fsicas que gobiernan la migracin celular y los mecanismos por los cuales estas fuerzas se transducen
en seales bioqumicas. El acceso experimental a estos procesos biofsicos ofrece nuevas posibilidades
para la comprensin de los mecanismos que subyacen a enfermedades graves
como la inflamacin crnica o el cncer.
Los biosensores, genticamente
codificados, pueden ser
introducidos en las clulas como
plsmidos y all son transcritos
y traducidos por la propia
maquinaria celular.
Esta posibilidad les convierte
en una herramienta muy atractiva
para la investigacin en
biologa celular.
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tes. Una vez la protusin est firmemen-
te adherida al sustrato, la clula activa su
maquinaria contrctil y genera tensin.
Finalmente las adhesiones del polo pos-
terior de la clula ceden a este incremen-
to de tensin, lo cual da lugar al avance
del cuerpo celular.
3
Cmo medir las fuerzas de tensin que
ejerce la clula a travs de sus adhesiones
sobre el sustrato? La respuesta se halla en
una nanotecnologa an poco conocida
pero de gran proyeccin: la microscopia
de traccin (fig. 2). Esta tcnica se basa
en estudiar las clulas migrando sobre un
sustrato elstico y transparente. Si el
sustrato es suficientemente blando, la ten-
sin que ejercen las clulas es suficiente
para deformarlo entre decenas y cente-
nares de nanmetros.
5
Estas deformacio-
nes se pueden medir introduciendo
nanomarcadores fluorescentes que se
visualizan utilizando microscopia ptica
de gran aumento y algoritmos avanzados
de procesado de imgenes. El resultado
es un mapa bidimensional de la defor-
macin del sustrato como consecuencia
de las fuerzas ejercidas por las clulas.
Para obtener la localizacin y la magni-
tud de estas fuerzas es necesario resolver
un problema inverso de mecnica de
medios continuos. Conociendo la defor-
macin de un material, cmo podemos
determinar las fuerzas que la causan? Este
problema fue resuelto a finales del siglo
XIX por Boussinesq para el caso de ma-
teriales con geometra sencilla y propie-
dades mecnicas ideales. Para condicio-
nes experimentales reales, es necesario el
desarrollo de modelos computacionales
avanzados que tengan en cuenta la
viscoelasticidad y la falta de linealidad de
los geles fisiolgicos as como su compleja
geometra.
2
Las primeras medidas de microsocopia de
traccin confirmaron la naturaleza ccli-
ca de la motilidad celular y demostraron
que el rango de fuerzas que las clulas
generan para migrar se encuentra alrede-
dor del nanonewton, aunque algunas c-
lulas son capaces de migrar con fuerzas
mucho menores.
6
Pero quizs el descu-
brimiento ms relevante y al mismo tiem-
po ms inesperado es que las clulas son
capaces no solo de generar fuerzas sino
tambin de medir estas fuerzas. De este
modo, las clulas migratorias pueden co-
nocer las propiedades fsicas de su entor-
no y actuar en consecuencia. No es lo
mismo andar sobre asfalto que en arenas
movedizas! Esta funcin que permite la
medida de fuerzas por parte de las clulas
se conoce como mecanotransduccin.
7
Cmo interaccionan las fuerzas fsicas
con los mecanismos moleculares que re-
gulan la migracin celular, incluyendo
complejas vas de sealizacin o la acti-
vacin de protenas de la familia de las
pequeas GTPasas? El estudio de estos
mecanismos moleculares se ha basado en
gran medida en tcnicas de immunofluo-
rescencia e immunoblotting. Sin embar-
go, estas tcnicas tienen una resolucin
temporal y espacial limitada y, por lo tan-
to, no son ideales para detectar procesos
rpidos, localizados y transitorios. Ade-
ms no permiten el estudio de la coloca-
lizacin de la actividad mecnica y de la
actividad bioqumica. Una solucin a es-
tas limitaciones la ofrece la combinacin
de microscopia de traccin y biosensores
FRET (Fluorescence Resonance Energy
Transfer).
Los biosensores FRET se basan en la trans-
ferencia de energa de un fluorforo do-
nador a un fluorforo aceptor, dando lu-
gar a un aumento en la fluorescencia
emitida por el fluorforo aceptor y a una
disminucin de la fluorescencia emitida
por el donador.
8
La eficiencia de los
biosensores depende principalmente del
rea de superposicin entre el espectro de
emisin del fluorforo donador y el es-
pectro de excitacin del fluorforo aceptor
(a ms superposicin, ms transferencia
de energa), de la orientacin relativa de
los dipolos de los fluorforos y de la dis-
tancia entre el donador y el aceptor (la
transferencia de energa solo se produce
si los dos fluorforos estn a menos de
La migracin celular r La migracin celular r La migracin celular r La migracin celular r La migracin celular resulta de la combi- esulta de la combi- esulta de la combi- esulta de la combi- esulta de la combi-
nacin de ciclos de extensin-contraccin nacin de ciclos de extensin-contraccin nacin de ciclos de extensin-contraccin nacin de ciclos de extensin-contraccin nacin de ciclos de extensin-contraccin
y de adhesin-desenganche. y de adhesin-desenganche. y de adhesin-desenganche. y de adhesin-desenganche. y de adhesin-desenganche.
Fuente: Fuente: Fuente: Fuente: Fuente: Adaptada de T Adaptada de T Adaptada de T Adaptada de T Adaptada de Tr rr rrepat. epat. epat. epat. epat.
4 44 44
Figura 1. Figura 1. Figura 1. Figura 1. Figura 1. Mecanismo de la migra- Mecanismo de la migra- Mecanismo de la migra- Mecanismo de la migra- Mecanismo de la migra-
cin celular cin celular cin celular cin celular cin celular
Figura 2. Figura 2. Figura 2. Figura 2. Figura 2. Microscopia de traccin Microscopia de traccin Microscopia de traccin Microscopia de traccin Microscopia de traccin
a) Imagen de una clula epitelial (lnea celular MCF-10A) sobr Imagen de una clula epitelial (lnea celular MCF-10A) sobr Imagen de una clula epitelial (lnea celular MCF-10A) sobr Imagen de una clula epitelial (lnea celular MCF-10A) sobr Imagen de una clula epitelial (lnea celular MCF-10A) sobre un gel r e un gel r e un gel r e un gel r e un gel recubierto con ecubierto con ecubierto con ecubierto con ecubierto con
colgeno. colgeno. colgeno. colgeno. colgeno. b) Superposicin de las imgenes de los nanomar Superposicin de las imgenes de los nanomar Superposicin de las imgenes de los nanomar Superposicin de las imgenes de los nanomar Superposicin de las imgenes de los nanomarcador cador cador cador cadores fluor es fluor es fluor es fluor es fluorescentes toma- escentes toma- escentes toma- escentes toma- escentes toma-
das cuando la clula est pr das cuando la clula est pr das cuando la clula est pr das cuando la clula est pr das cuando la clula est presente sobr esente sobr esente sobr esente sobr esente sobre el sustrato (en r e el sustrato (en r e el sustrato (en r e el sustrato (en r e el sustrato (en rojo) o una vez sta ha sido ojo) o una vez sta ha sido ojo) o una vez sta ha sido ojo) o una vez sta ha sido ojo) o una vez sta ha sido
despegada con tripsina (ver despegada con tripsina (ver despegada con tripsina (ver despegada con tripsina (ver despegada con tripsina (verde). El color amarillo indica que no se observa desplazamiento de). El color amarillo indica que no se observa desplazamiento de). El color amarillo indica que no se observa desplazamiento de). El color amarillo indica que no se observa desplazamiento de). El color amarillo indica que no se observa desplazamiento
de los nanomar de los nanomar de los nanomar de los nanomar de los nanomarcador cador cador cador cadores entr es entr es entr es entr es entre las dos imgenes. La zona ampliada muestra una r e las dos imgenes. La zona ampliada muestra una r e las dos imgenes. La zona ampliada muestra una r e las dos imgenes. La zona ampliada muestra una r e las dos imgenes. La zona ampliada muestra una regin egin egin egin egin
donde se observa claramente el desplazamiento de los nanomar donde se observa claramente el desplazamiento de los nanomar donde se observa claramente el desplazamiento de los nanomar donde se observa claramente el desplazamiento de los nanomar donde se observa claramente el desplazamiento de los nanomarcador cador cador cador cadores inducido por la es inducido por la es inducido por la es inducido por la es inducido por la
clula. clula. clula. clula. clula. c) Fuerzas de traccin (en pascales) ejer Fuerzas de traccin (en pascales) ejer Fuerzas de traccin (en pascales) ejer Fuerzas de traccin (en pascales) ejer Fuerzas de traccin (en pascales) ejercidas por la clula. La dir cidas por la clula. La dir cidas por la clula. La dir cidas por la clula. La dir cidas por la clula. La direccin de las eccin de las eccin de las eccin de las eccin de las
fuerzas es centrpeta. fuerzas es centrpeta. fuerzas es centrpeta. fuerzas es centrpeta. fuerzas es centrpeta.
Barra de escala = 10 Barra de escala = 10 Barra de escala = 10 Barra de escala = 10 Barra de escala = 10 m. m. m. m. m.
Movimiento
1 11 11 Extensin del polo anterior
2 22 22 Adhesin del polo a la matriz extracelular
3 33 33 Retraccin del polo posterior
4 44 44 Contraccin de la maquinaria
actina-miosina intracelular
b a c
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
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10 nN) (fig. 3). Esta gran sensibilidad de
la eficiencia FRET con la distancia entre
donador y aceptor permite el uso de las
sondas FRET como biosensores de defor-
macin a escala nanomtrica.
Los biosensores, genticamente codifica-
dos, pueden ser introducidos en las clu-
las como plsmidos, y all son transcritos
y traducidos por la propia maquinaria
celular. Esta posibilidad les convierte en
una herramienta muy atractiva para la
investigacin en biologa celular. La es-
tructura de los biosensores puede ser de
dos tipos. En primer lugar, los biosensores
intramoleculares son diseados como una
sola cadena peptdica que contiene los dos
fluorforos y una regin intermedia que
modifica su estado conformacional cuan-
do el sensor se activa. Como consecuen-
cia de este cambio conformacional, se al-
tera la distancia y/o la orientacin de los
fluorforos y, en consecuencia, la eficien-
cia FRET. En segundo lugar, los biosen-
sores intermoleculares se basan en fusio-
nar los fluorforos, separadamente, a dos
protenas distintas, permitiendo as
monitorizar la interaccin de estas pro-
tenas: la proximidad o separacin de las
dos protenas afectar la eficiencia FRET
entre los fluorforos. Adicionalmente, en
la estructura del biosensor se pueden aa-
dir secuencias de posicionamiento espe-
cficas, de modo que el biosensor se site
en un compartimento celular determina-
do, como por ejemplo la membrana ce-
lular o el retculo citoplasmtico.
Los biosensores FRET han contribuido
a avances notables en varios aspectos de
DOSSI ER CI ENT FI CO
la migracin celular. En un estudio re-
ciente se caracterizaron los eventos
moleculares que se producen en las
protrusiones de clulas en migracin uti-
lizando biosensores para monitorizar la
actividad de RhoA, Cdc42 y Rac1 (pro-
tenas de la familia de las GTPasas Rho).
9
Se consigui, as, entender la funcin de
estas protenas con elevada resolucin
temporal (segundos) y espacial (micr-
metros) (fig. 4). Concretamente, se des-
cubri que RhoA es activa en la parte ms
anterior de la protrusin celular, y que
Cdc42 y Rac1 se activan aproximada-
mente 2 m detrs y con un retraso de
40 segundos respeto la activacin de
RhoA. Otro interesante estudio permi-
ti comprender la activacin de Src, pro-
tena tirosina quinasa relacionada con
procesos tumorognicos, mediante un
biosensor FRET.
10
Adems de activarse
mediante estmulos bioqumicos, se pudo
comprobar y visualizar que Src puede ser
activado a travs de la aplicacin de fuer-
zas fsicas externas, y que esta activacin
mecnica se propaga en forma de onda a
travs de la membrana plasmtica.
10
Ade-
ms de los biosensores descritos previa-
mente, se ha desarrollado una gran can-
tidad de biosensores para el estudio de
las distintas fases y eventos que se produ-
cen durante la migracin celular (activa-
cin de pequeas GTPasas, quinasas o
protenas de adhesin, entre otros). Una
relacin exhaustiva de los biosensores
existentes y las caractersticas de los mis-
mos se puede encontrar en lnea.
11
Si bien la informacin que proporcionan
los biosensores FRET es muy valiosa, su
implementacin puede resultar comple-
ja. Existen distintas cuestiones que difi-
cultan su uso y la interpretacin de los
resultados. En primer lugar, se debe con-
seguir un nivel de expresin que propor-
cione una relacin seal/ruido adecuada.
Una concentracin elevada de biosensor
produce una seal ms intensa, pero su
sobreexpresin puede provocar saturacin
de la va de sealizacin o de la protena
que se quiere monitorizar. Por otra par-
te, los espectros de emisin y excitacin
de los dos fluorforos estn parcialmente
superpuestos, lo cual es inherente a la tc-
nica FRET, de modo que la fluorescen-
cia proveniente del donador puede en-
trar en el canal de deteccin del aceptor.
Este fenmeno se debe tener en cuenta y
corregir a posteriori. Finalmente, en el
caso FRET intermolecular, se debe con-
seguir una estequiometra donador: acep-
tor adecuada que permita la deteccin
FRET.
Figura 3. Figura 3. Figura 3. Figura 3. Figura 3. Principio de los biosensores FRET Principio de los biosensores FRET Principio de los biosensores FRET Principio de los biosensores FRET Principio de los biosensores FRET
a) Espectr Espectr Espectr Espectr Espectros de excitacin (lneas discontinuas) y emisin (lneas continuas) de CFP ( os de excitacin (lneas discontinuas) y emisin (lneas continuas) de CFP ( os de excitacin (lneas discontinuas) y emisin (lneas continuas) de CFP ( os de excitacin (lneas discontinuas) y emisin (lneas continuas) de CFP ( os de excitacin (lneas discontinuas) y emisin (lneas continuas) de CFP (Cyan Cyan Cyan Cyan Cyan
Fluorescent Protein Fluorescent Protein Fluorescent Protein Fluorescent Protein Fluorescent Protein, en cin) y YFP ( , en cin) y YFP ( , en cin) y YFP ( , en cin) y YFP ( , en cin) y YFP (Y YY YYellow Fluorescent Protein ellow Fluorescent Protein ellow Fluorescent Protein ellow Fluorescent Protein ellow Fluorescent Protein, en amarillo), fluorfor , en amarillo), fluorfor , en amarillo), fluorfor , en amarillo), fluorfor , en amarillo), fluorforos os os os os
comnmente utilizados como donador y aceptor en FRET comnmente utilizados como donador y aceptor en FRET comnmente utilizados como donador y aceptor en FRET comnmente utilizados como donador y aceptor en FRET comnmente utilizados como donador y aceptor en FRET. El r . El r . El r . El r . El rea gris delimita la superpo- ea gris delimita la superpo- ea gris delimita la superpo- ea gris delimita la superpo- ea gris delimita la superpo-
sicin entr sicin entr sicin entr sicin entr sicin entre la emisin de CFP y la excitacin de YFP e la emisin de CFP y la excitacin de YFP e la emisin de CFP y la excitacin de YFP e la emisin de CFP y la excitacin de YFP e la emisin de CFP y la excitacin de YFP. . . . . b) Esquemas del funcionamiento de Esquemas del funcionamiento de Esquemas del funcionamiento de Esquemas del funcionamiento de Esquemas del funcionamiento de
un biosensor FRET un biosensor FRET un biosensor FRET un biosensor FRET un biosensor FRET. En la izquier . En la izquier . En la izquier . En la izquier . En la izquierda, los fluorfor da, los fluorfor da, los fluorfor da, los fluorfor da, los fluorforos no estn suficientemente cer os no estn suficientemente cer os no estn suficientemente cer os no estn suficientemente cer os no estn suficientemente cerca ni ca ni ca ni ca ni ca ni
corr corr corr corr correctamente orientados, de modo que no hay FRET ectamente orientados, de modo que no hay FRET ectamente orientados, de modo que no hay FRET ectamente orientados, de modo que no hay FRET ectamente orientados, de modo que no hay FRET, lo que si ocurr , lo que si ocurr , lo que si ocurr , lo que si ocurr , lo que si ocurre en la parte der e en la parte der e en la parte der e en la parte der e en la parte derecha. echa. echa. echa. echa.
100
50
400
0
450 500 550 600 650 350
CFP CFP YFP
No FRET FRET
Y
FP
430 nm
b
a
475 nm 430 nm 530 nm
Longitud de onda (nm)
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a

n
o
r
m
a
l
i
z
a
d
a
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La microscopia de traccin y los sensores
FRET son solo dos ejemplos de nanotec-
nologas que estn permitiendo avances
sustanciales en nuestra comprensin de
la migracin celular. Otras nanotecno-
logas como las pinzas magnticas y pti-
cas, la microscopia de fuerza atmica, o
la nanofabricacin de patrones tambin
estn contribuyendo a la caracterizacin
biomecnica de las clulas migratorias a
escala nanomtrica. La combinacin de
estas nanotcnicas con el desarrollo de
sofisticadas herramientas de biologa
molecular estn contribuyendo, sin lugar
a dudas, a descifrar los mecanismos que
gobiernan la migracin celular, pero al
mismo tiempo plantean un nuevo reto:
cmo podemos organizar y sintetizar la
inmensa cantidad de informacin que
obtenemos a escala nanomtrica para
Figura 4. Figura 4. Figura 4. Figura 4. Figura 4. Actividad de GTPasas Rho en fibroblastos embrionarios de ra- Actividad de GTPasas Rho en fibroblastos embrionarios de ra- Actividad de GTPasas Rho en fibroblastos embrionarios de ra- Actividad de GTPasas Rho en fibroblastos embrionarios de ra- Actividad de GTPasas Rho en fibroblastos embrionarios de ra-
tn obtenidas con biosensores FRET tn obtenidas con biosensores FRET tn obtenidas con biosensores FRET tn obtenidas con biosensores FRET tn obtenidas con biosensores FRET
poder generar modelos con capacidad
predictiva? Desconocemos la respuesta a
este reto, pero podemos asegurar que
implicar necesariamente una colabo-
racin estrecha entre investigadores de
campos tan dispares como la biologa
molecular, la informtica, la fsica, y la
bioqumica. #
Xavier Serra-Picamal
BECARIO FPU
FACULTAD DE MEDICINA,
UNIVERSIDAD DE BARCELONA
Xavier Trepat
INVESTIGADOR ICREA SENIOR, INSTITUTO
DE BIOINGENIERA DE CATALUA
PROFESOR ASOCIADO, FACULTAD DE
MEDICINA, UNIVERSIDAD DE BARCELONA
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Activacin de Rac1 Activacin de Rac1 Activacin de Rac1 Activacin de Rac1 Activacin de Rac1 (a), Cdc42 , Cdc42 , Cdc42 , Cdc42 , Cdc42 (b) y RhoA y RhoA y RhoA y RhoA y RhoA (c) en fibr en fibr en fibr en fibr en fibroblastos embrionarios de ratn en oblastos embrionarios de ratn en oblastos embrionarios de ratn en oblastos embrionarios de ratn en oblastos embrionarios de ratn en
migracin. La caja blanca indica la zona de pr migracin. La caja blanca indica la zona de pr migracin. La caja blanca indica la zona de pr migracin. La caja blanca indica la zona de pr migracin. La caja blanca indica la zona de protrusin celular otrusin celular otrusin celular otrusin celular otrusin celular. La escala de color indica la . La escala de color indica la . La escala de color indica la . La escala de color indica la . La escala de color indica la
r rr rrespuesta del biosensor espuesta del biosensor espuesta del biosensor espuesta del biosensor espuesta del biosensor. .. ..
Barra de escala = 20 Barra de escala = 20 Barra de escala = 20 Barra de escala = 20 Barra de escala = 20 m. m. m. m. m.
Fuente: Fuente: Fuente: Fuente: Fuente: Adaptada de Machacek Adaptada de Machacek Adaptada de Machacek Adaptada de Machacek Adaptada de Machacek et al. et al. et al. et al. et al.
9 99 99
DOSSI ER CI ENT FI CO
................................................
a b c
Rac1 Cdc42 RhoA
1,0 24,0 1,0 3,5 1,0 1,5