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Recibido: Mayo, 2005. Aprobado: Agosto, 2006.


Publicado como ARTCULO en Agrociencia 40: 741-751. 2006.
RESUMEN
Seevalu la toxicidad aguda del extracto crudo dedos cosechas
desemillas deneem (Azadirachta indica) y del producto comer-
cial a basedeneem, PHC Neem, sobreVarroa destructor y Apis
mellifera, as como la repelencia dedichos productos slo sobre
V. destructor (varroa). Para determinar toxicidad aguda seapli-
caron diluciones 0.33, 0.67 y 1.32% de los productos citados
sobrehembras devarroa y abejas obreras, por aspersin me-
diantela torredeBurgerjon. Seles incub a 322 C y 7010%
HR, provistas del alimento adecuado, y seregistr su mortalidad
a 24 y 48 horas. En pruebas derepelencia setrat a pupas de
abejas con las diluciones anotadas y sedetermin la capacidad
delas varroas para localizar y alimentarsedepupas con o sin
tratamiento. En la prueba detoxicidad aguda, ninguno delos
productos caus mortalidad devarroa ni deabejas. En las prue-
ba derepelencia, los tres productos mostraron repelencia signifi-
cativa, en relacin directa entreconcentracin y efecto. El ex-
tracto crudo deneem cosecha 2003 a 1.32% present la repelencia
ms alta y estable, queimpidi que98% delas varroas seposa-
ran sobrepupas deabejas y caus 100% demortalidad devarroa,
aparentementepor inanicin, en 72 h.
Palabras clave: Apis mellifera, abejas, azadiractina, neem.
INTRODUCCIN
E
l caro Varroa destructor Anderson y Trueman
(2000) se considera como la plaga ms impor-
tante de la abeja comn Apis mellifera L. en el
mundo (Sammataro et al., 2000). El uso indiscrimina-
do de productos qumicos para controlar la varroasis
ha favorecido la aparicin de resistencia en muchos
pases (Elzen et al., 1999a y b; Mathieu y Faucon,
2000; Thompson et al., 2002). Mxico corre ese mis-
mo riesgo porque slo tiene dos piretroides sintticos:
fluvalinato (nombre comercial Apistan) y flumetrina
(nombre comercial Bayvarol).
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor
(ACARI: VARROIDAE)
Azadirachta indica TOXICITY AND REPELLENCE OF Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
Rebeca Gonzlez-Gmez
1
, Gabriel Otero-Colina
1
, J . Antonio Villanueva-Jimnez
2
,
J . Alberto Prez-Amaro
3
y R. Marcos Soto-Hernndez
4
1
Entomologa y Acarologa.
4
Botnica. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230.
Montecillo, Estado de Mxico.
2
Campus Veracruz. Colegio de Postgraduados. 91700. Predio Tepetates,
Veracruz, Veracruz.
3
Universidad del Papaloapan. 68100. Campus Loma Bonita, Oaxaca.
ABSTRACT
Crude extract of two neem seed (Azadirachta indica) harvests
and the neem-based commercial product PHC Neem
TM
were
evaluated in terms of their acutetoxicity on Varroa destructor
and Apis mellifera as well as their repellenceonly on V. destructor
(varroa mites). To determineacutetoxicity, 0.33, 0.67, and 1.32%
dilutions of the above products were sprayed on varroa mites
and worker bees with a Burgerjons tower. They wereincubated
at 322 C and 7010% RH and provided with sufficient food.
Mortality was recorded at 24 and 48 h. In repellency tests, bee
pupaeweretreated with thesamedilutions, and theability of
varroa mites to locateand feed on thepupae, with or without the
treatment, was determined. In theacutetoxicity test, noneof the
products caused varroa or beemortality. In therepellency test,
the three products significantly repelled varroa, in a direct
relationship between concentration and effect. The1.32% crude
neem extract, 2003 harvest, had the highest and most stable
repellency, impeding 98% of thevarroa mites from settling on
beepupaeand caused 100% mortality of varroa mites, apparently
from starvation, in 72 h.
Key words: Apis mellifera, bees, azadirachtin, neem.
INTRODUCTION
T
he mite Varroa destructor (Anderson and
Trueman, 2000) is considered the major pest
of common Apis mellifera L. honey bees
worldwide (Sammataro et al., 2000). The indiscriminate
use of chemical products for the control of varroasis
has favored resistance in many countries (Milani, 1999;
Elzen et al., 1999a and b; Mathieu and Faucon, 2000;
Thompson et al., 2002). Mexico runs the same risk,
with only two synthetic pyrethroids: fluvalinate
(commercial name Apistan
TM
), and flumetrine
(commercial name Bayvarol
TM
).
Botanical products for pest control are very
important at present. This is the case of the neem tree
Azadirachta indica A. J uss. (Meliaceae), from which
a broad diversity of secondary compounds are extracted.
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
742 VOLUMEN 40, NMERO 6
Los productos botnicos para el manejo de plagas
tienen gran importancia en la actualidad. As, del r-
bol de neem Azadirachta indica A. J uss. (Meliaceae)
se extraen diversos compuestos secundarios; la
azadiractina es el de mayor importancia, pues acta
como repelente, antialimentario y retarda el crecimiento
de los insectos (Mordue y Blackwell, 1993). Las sus-
tancias contenidas en el neem se pueden considerar
como una fuente potencial para el control de varroa;
su incorporacin como producto natural alternativo al
uso de sustancias qumicas podra contribuir a dismi-
nuir la contaminacin de los productos de la colmena.
Los efectos subletales pueden ser tiles en el con-
trol de varroa; cualquier efecto en este caro que inter-
fiera con su capacidad para localizar a su husped pue-
de tener un valor prctico como mtodo de control.
Colin et al. (1994) desarrollaron una escuela en la
bsqueda de efectos subletales para controlar parsitos
de las abejas, y propusieron un protocolo para evaluar
productos vegetales.
Por tanto, los objetivos del presente trabajo fueron
evaluar la toxicidad aguda del extracto crudo de las
semillas de neem (A. indica) y el producto comercial a
base de neem, PHC Neem, sobre V. destructor y A.
mellifera, y evaluar la repelencia de los mismos ex-
tractos sobre varroa.
MATERIALES Y MTODOS
Las varroas se recolectaron mediante el mtodo del panal tram-
pa (Maul, 1983), usando panales con celdas de tamao de cra de
znganos; se colocaron en cajas Petri de plstico (8 cmdimetro) y
cada tapa tena un agujero (4.5 cmdimetro) cubierto con una ma-
lla. Las varroas se alimentaron con pupas de znganos. Antes de su
uso y durante un mximo de 2 d, los panales y los ejemplares de
varroa se incubaron a 322 C y 7010% HR.
Las pupas de abejas obreras se obtuvieron de los panales de la
cmara de cra, se eligi aqullas de los estados Pw y Pp segn
Rembold y Kramer (1980). Pw significa literalmente Pupa white
(ojos blancos), y Pp significa Pupa purple (ojos morados), etapas
que se alcanzan 7-8 d despus de que las obreras haban operculado
la celda. En todas las pruebas se utilizaron pupas recolectadas 1 h
antes de realizar los bioensayos.
Las abejas adultas se recolectaron en la cmara de cra y se
seleccionaron aqullas localizadas a los lados de la cra, para evitar
la captura de abejas nodrizas jvenes (Felton et al., 1986). Se pusie-
ron en frascos de cristal de 500 mL cuyas tapas tenan un orificio de
ventilacin cubierto con malla; se incubaron a 322 C y 7010%
HR y se les proporcion miel y agua.
Se evalu aceite crudo de neem, as como el producto comercial
a base de neemllamado PHC Neem. El aceite crudo se obtuvo de
las semillas de neemrecolectados del Campus Veracruz, Colegio de
Postgraduados, en Tepetates, Veracruz, en agosto de 2002 y 2003.
El aceite se obtuvo a temperatura inferiores a 35 C, con un extractor
Of these, azadirachtin is the most important, acting as
an insect repellant, feeding inhibitor, and insect growth
retarder (Mordue and Blackwell, 1993). The substances
contained in neem can be considered potentially useful
in varroa control; their incorporation as a natural
product alternative to the use of chemical substances
could contribute to reduce contamination of products
from the beehive.
Sublethal effects can be useful in controlling varroa.
Any effect that interferes in the mites ability to locate
its host may have a practical value as a method of
control. Colin et al. (1994) formed a school in the
search for sublethal effects to control bee parasites and
they proposed a protocol for assessing plant products.
Therefore, the objectives of the present study were
to evaluate acute toxicity of crude neem seed extract
(A. indica) and of the neem-based commercial product,
PHC Neem
TM
, on V. destructor and A. mellifera, and
to evaluate their repellence of varroa.
MATERIALS AND METHODS
Varroa mites were collected with the method of the honeycomb
trap (Maul, 1983), using honeycombs with drone-rearing-size cells.
The mites were placed in plastic Petri dishes, 8 cmin diameter, with
caps with a 4.5 cmdiameter hole covered with a screen, and received
drone pupae as food. Before use, and for a maximumof 2 d, both
honeycomb and varroa specimens were incubated at 322 C and
7010% RH.
The worker bee pupae were obtained from rearing chamber
combs, and those in Pw and Pp stages, following Rembold and
Kramer (1980) were selected. Pw literally means pupa white (white
eyes), while Pp means pupa purple (purple eyes), stages that are
reached 7-8 d after worker bees have capped the cell. In all of the
tests pupae collected 1 h before performing the bioassays were used.
Adult bees were collected in the rearing chamber and those
that were found outside the brood zone were selected to avoid
capturing young nurses (Felton et al., 1986). The adults were
confined in 500 mL glass jars with caps with a ventilation orifice
covered with screen; they were incubated at 322 C and 7010%
RH and given honey and water.
Crude neemoil, as well as the commercial neem-based product
PHC Neem
TM
, was evaluated. The crude oil was obtained from
neem seeds collected in the Veracruz Campus of Colegio de
Postgraduados, Tepetates, Veracruz, in August, 2002 and 2003. Oil
was extracted at temperatures below 35 C with a stainless steel
extractor by applying 3 t pressure and was stored at 3 C. Mother
suspensions were prepared fromthe 2002 and 2003 crude oils and of
PHC Neemand mixed with water and Tween 20 (1:1:1, by weight).
Fromthese, dilutions were made for application on bees and varroa
mites.
The products mentioned were sprayed on varroa or bees with a
Burgerjons (1956) pulverization tower, which nebulizes products to
15 mdrops. This tower was calibrated to apply 1 to 2 mg cm
2
743 GONZLEZ-GMEZ et al.
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
deacero inoxidable, aplicando 3 t depresin, y sealmacen a3 C. Se
prepararon suspensiones madre de los aceites crudos de 2002 y 2003
y de PHC Neem, mezclndolos con agua y Tween 20 (1:1:1, por
peso); a partir de ellas se hicieron diluciones para aplicarlas a abejas
o varroas.
Los productos mencionados se aplicaron sobre varroas o abejas
usando la torre de pulverizacin de Burgerjon (1956), la cual nebuliza
los productos en gotas de 15 mde dimetro. Esta torre se calibr
para aplicar 1 a 2 mg cm
2
(Colin et al., 1994). Esto se logr
aplicando 15 mL de la solucin a una presin de 0.703 kg cm
2
, y se
dej 1 min ms para permitir la sedimentacin de las gotas sobre los
organismos.
Prueba deletalidad aguda en varroa y abejas
Con las suspensiones madre descritas se prepararon diluciones
1%, 2% y 4% (0.33, 0.67 y 1.32% del producto concentrado), que
corresponden aproximadamente a las recomendadas por el fabrican-
te del PHC Neem. Para la aplicacin en varroa, grupos de 10 hem-
bras adultas se colocaron en una caja Petri (14 cmdimetro) con el
fondo cubierto con un crculo de papel filtro, y enseguida se aplica-
ron las suspensiones. Al terminar la aplicacin se transfirieron las
varroas a cajas Petri (8 cmde dimetro) tratadas con una capa de
flun (politetrafluoruro de etileno) en las paredes laterales, para
impedir que escaparan. Luego se adicionaron pupas de abejas de
ojos rosas a violeta como alimento, y se incub a 322C y 7010%
HR. Paralelamente a los tratamientos, hubo grupos testigo, a los que
se aplic agua destilada ms emulsificante, en concentraciones co-
rrespondientes a las usadas para cada tratamiento de las diluciones
(1, 2 y 4%).
Las abejas, antes de la pulverizacin, se anestesiaron con CO
2
durante 15 s. Se seleccionaron grupos de 30 obreras adultas, y se
aplicaron los mismos tratamientos que con los caros. Enseguida las
abejas fueron transferidas a jaulas de madera y malla de hierro
galvanizado, de 151515 cm.
Tanto para varroas como para abejas, cada dilucin, as como
los testigos, se realizaron en cuatro repeticiones; las lecturas de
mortalidad se registraron a las 24 y 48 h. En pruebas complementa-
rias, sin repeticiones, las concentraciones aplicadas a varroa y a
abejas se elevaron hasta alcanzar 50% del producto concentrado.
Prueba derepelencia con eleccin
Las arenas de observacin fueron cajas Petri de plstico de 8 cm
de dimetro, con tapa con orificio de ventilacin como ya se descri-
bi. Cada caja estaba dividida en dos zonas principales (A y B), y
cada zona formada por tres subdivisiones (a, b y c). La zona cero (0)
correspondi al centro de la caja, en la cual se colocaron diez hem-
bras de varroa, mientras que en los extremos de la caja (zonas Ac y
Bc) se colocaron tres pupas de abejas obreras (cuerpo blanco y ojos
rosa a violeta) en cada una (Figura 1). Slo las pupas colocadas en la
zona Ac haban sido tratadas previamente con 15 mL de las concen-
traciones de 1%, 2% o 4%, mediante la torre de Burgerjon. Se
hicieron cuatro repeticiones por tratamiento y se tomaron lecturas
(Colin et al., 1994). This was accomplished by applying 15 mL of
solution at a pressure of 0.703 kg cm
2
, and left for 1 min more to
allow drops to settle on the organisms.
Acutelethality tests in varroa and bees
With the mother suspensions described, 1, 2, and 4% dilutions
(0.33, 0.67, and 1.32% of the concentrated product), corresponding
approximately to those recommended by the manufacturer of PHC
Neem, were prepared. For application on varroa, groups of 10 adult
females were placed in a Petri dish (14 cmin diameter), the bottom
covered with a circle of filter paper, and immediately sprayed with
the solutions. After application, the varroa were transferred to 8 cm
Petri dishes which had been treated with a layer of ethylene
polytetrafluoride on the inner sides to prevent their escape. Later,
pink or purple eye bee pupae were introduced as food, and incubated
at 322 C and 70% RH. Parallel to the treatments, there were
control groups on which distilled water plus an emulsifier was applied
in concentrations corresponding to the dilutions (1, 2, and 4%) used
for the treatments.
Before being sprayed, the bees were anesthetized with CO
2
for
15 s. Groups of 30 adult workers were selected and sprayed with the
same treatments in the same manner as with the mites. Bees were
immediately transferred to galvanized iron screen and wooden cages
151515 cm.
For both varroa and bees, four replications were performed
with each dilution and control. Mortality was recorded after 24 and
48 h. In complementary tests, without replications, the concentrations
applied to varroa and bees were increased up to 50% of the
concentrated product.
Repellency test with choice
The observation arenas were 8 cmdiameter plastic Petri dishes,
which had caps with ventilation orifices as described above. Each
dish was divided into two main sections (A and B) and each section
was composed of three subdivisions (a, b, and c). Section zero (0)
was the center of the dish in which ten varroa females were placed,
while three worker bee pupae (white body and pink to purple eyes)
were placed in the outermost parts of each dish (Ac and Bc) (Figure
1). Only the pupae placed in the Ac subdivision had been treated
previously with 15 mL of 1, 2, or 4% concentrations with the
Burgerjons tower. Each treatment was replicated four times, and
readings of mite location were taken at 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, and
72 h, quantifying the tendency of the mites to move fromone section
to another.
To determine numerically whether the extracts repelled, or even
attracted, the following formula was used (Colin et al., 1994):
VR=100+{(Ba+2Bb+3Bc+4Pb)(Aa+2Ab+3Ac +4Pa)}10/S
where, VR=repellency value; Aa, Ab and Ac=number of mites on
sections Aa, Ab, and Ac; Pa=number of mites on side A pupae
(treated); Ba, Bb, and Bc=number of mites on sections Ba, Bb, and
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
744 VOLUMEN 40, NMERO 6
de la ubicacin de los caros a 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48 y 72 h; en ellas
se cuantific la tendencia de dichos caros a desplazarse de una zona
a otra.
Para determinar numricamente si existi repelencia o atrac-
cin por los extractos, se us la siguiente frmula (Colin et al.,
1994):
VR=100+{(Ba+2Bb+3Bc+4Pb)(Aa+2Ab+3Ac +4Pa)}10/S
donde, VR=valor de repelencia; Aa, Ab y Ac=nmero de caros
sobre las zonas Aa, Ab y Ac; Pa=nmero de caros sobre las pupas
del lado A (tratadas); Ba, Bb y Bc=nmero de caros sobre las
zonas Ba, Bb y Bc; Pb=nmero de caros sobre las pupas del lado
B (no tratadas); S=nmero de caros sobrevivientes al momento de
la observacin.
La notacin citada da un valor ponderado superior a la posicin
de un parsito sobre una pupa (4) o en inmediata proximidad
(3), en contraste con una posicin ms alejada de las pupas o ms
central (2 1). Si todas las varroas permanecen sobre la zona
cero o hay un reparto equitativo sobre ambas zonas, los valores de A
contrarrestarn a los de B; si todos los caros permanecen sobre las
pupas de la zona B, los valores de A sern cero y los valores de B
sern 40. El nmero 100 tiene por funcin desplazar el origen y
facilitar el anlisis estadstico; entonces, los valores fluctuarn de 60
al 140; es decir, desde una fuerte atraccin hasta una total repelencia.
El factor 10/S sirve para compensar la mortalidad de los caros al
momento de la observacin.
Prueba derepelencia sin eleccin
La finalidad de esta prueba fue determinar el efecto repelente de
los tratamientos a evaluar, en ausencia de pupas no tratadas. En este
caso las pupas que se colocaron en la zona Ac y en la Bc fueron
tratadas con los productos y concentraciones correspondientes, as
como los testigos descritos. En esta prueba tambin hubo cuatro
repeticiones por tratamiento. El criterio de eficacia fue la posicin
del caro sobre las zonas marcadas, el nmero de caros sobre las
pupas y la mortalidad de caros.
Diseo experimental y anlisis estadstico
El diseo experimental fue completamente al azar, en arreglo
factorial 448, con cuatro repeticiones. El factor A fue el pro-
ducto aplicado, con cuatro niveles: a
1
=producto comercial formula-
do (PHCNeem); a
2
=aceite de neemcosecha 2002; a
3
=aceite de
neemcosecha 2003 y a
4
=emulsificante (Tween 20). El factor B fue
la concentracin, con cuatro niveles: b
1
=concentracin 0%, sto es,
testigos tratados con agua destilada; b
2
=concentracin 1%;
b
3
=concentracin 2%; b
4
=concentracin 4%. El factor C fue el
tiempo, con ocho niveles: c
1
=30 min; c
2
=1 h; c
3
=2 h; c
4
=4 h;
c
5
=8 h; c
6
=24 h; c
7
=48 h; c
8
=72 h.
Los datos de analizaron con el procedimiento GLM (SAS, 2000)
y las medias se compararon mediante la prueba de Tukey (p0.05).
Figura 1. Zonas dedistribucin dela caja experimental, para las
pruebas derepelencia.
Figure1. Distribution zones of the experimental dish for
repellency tests.
Zona A
Zona B
Pa
Ac
Ab
Aa
Ba
Bb
Bc
0
Pb
Bc; Pb=number of mites on pupae on side B (not treated); S=number
of surviving mites at the moment of observation.
The cited notation assigns a higher weighted value to the position
of a parasite on a pupa (4) or in the immediate vicinity (3), in
contrast with a more central position or farther fromthe pupae (2
or 1). If all of the varroa remain in Section 0, or there is an equal
distribution over the two sections, the A values counteract B values;
if all the mites remain on the pupae of section B, the values of A are
zero and the values of B are 40. The number 100 has the function of
moving the intercept and facilitating the statistical analysis. Therefore,
the values fluctuate between 60 and 140, that is, fromstrong attraction
to total repellence. The factor 10/S serves to compensate mortality
of the mites at the moment of observation.
Repellency test without choice
This test was conducted to determine the repellent effect of the
treatments to be evaluated in absence of untreated pupae. In this
case, the pupae that were placed in both sections Ac and Bc were
treated with the respective products and concentrations, as well as
the previously described controls. In this test there were also four
replications per treatment. The criteria of effectiveness were position
of the mite on the marked sections, number of mites on the pupae,
and mite mortality.
Experimental design and statistical analysis
The experimental design was completely randomyzed with a
factorial arrangement of treatments 448, with four replications.
Factor A was the applied product, with four levels: a
1
=commercially
formulated product (PHC
TM
Neem); a
2
=neem oil, 2002 harvest;
a
3
=neemoil, 2003 harvest; a
4
=emulsifier (Tween 20). Factor B
was concentration with four levels: b
1
=0% concentration, controls
745 GONZLEZ-GMEZ et al.
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
Tambin se realizaron anlisis con una sola fuente de variacin
de las variables de respuesta (valor de repelencia, caros sobre las
pupas y caros muertos) en cada uno de los tiempos (0.5, 2, 4, 8, 24
y 72 h) y concentraciones (1, 2 y 4%).
RESULTADOS Y DISCUSIN
Prueba de letalidad aguda en varroa y abejas
El producto comercial (PHCNeem), aceite de neem
cosecha 2002 (neem1), cosecha 2003 (neem2) y Tween
20 (emulsificante), a concentraciones de 1%, 2% y
4%, as como el testigo, no causaron mortalidad de
varroa ni de abejas, a 48 h, ni con una concentracin
de 50%, en pruebas complementarias. Estos resulta-
dos difieren de los citados por Melathopoulos et al.
(2000), quienes evaluaron aceite de neem y Neem-
aza; el primero, al usar aplicacin tpica, caus 45%
de mortalidad de varroa, mientras que el segundo, con
aplicaciones tpica, oral y como vapor caus mortali-
dad significativa del caro.
Se decidi no aumentar la concentracin de los pro-
ductos porque hubo problemas para la formacin de
suspensiones estables; asimismo, se consider que ele-
var la concentracin hara poco prctico y econmico
el uso de este producto. Para PHC Neem, la recomen-
dacin del fabricante para control de plagas de frutales
es 0.5-2 L concentrado 100 L
1
agua; contra plagas
de hortalizas es 50 mL 15 L
1
agua. Dichos valores
equivalen a 0.5-2% y 0.33% de producto concentra-
do; esto es, muy cercanos a las usadas en el presente
estudio.
El contacto directo de neem a concentraciones de
20 ppm sobre abejas adultas no produce efectos nega-
tivos y se puede lograr un control efectivo de las pla-
gas con aplicaciones de 30 a 50 ppm de azadiractina
(Larson, 1990; Isman, 1995). Segn Atkins (1992) la
azadiractina es una sustancia relativamente no txica
para las abejas, con una DL
50
de 11 g por abeja.
Naumann et al. (1994) encontraron que el extracto
de semillas de neem es un insecticida seguro cuando al
momento de usarlo hay abejas melferas presentes. De
hecho, los tratamientos que ellos usaron no repelieron
las abejas, y sugieren que el neem puede usarse para
controlar plagas en cultivos en floracin, incluso cuan-
do se requieren abejas para la polinizacin.
Prueba de repelencia con eleccin
Hubo diferencias significativas en el valor de
repelencia, atribuibles a las interacciones dobles de las
variables tipo de producto, concentracin y tiempo de
lectura, pero no a la triple interaccin (Cuadro 1).
Adems hubo diferencias significativas debidas a la
treated with distilled water; b
2
=1% concentration; b
3
=2%
concentration; b
4
=4% concentration. Factor C was time, with eight
levels: c
1
=30 min; c
2
=1 h; c
3
=2 h; c
4
=4 h; c
5
=8 h; c
6
=24 h;
c
7
=48 h; c
8
=72 h.
Data were analyzed with GLM procedure (SAS, 2000) and means
were compared with Tukey test (p0.05).
Analyses were also performed with a single source of variation
of the response variables (repellency value, mites on pupae and dead
mites) at each of the times (0.5, 2, 4, 8, 24, and 72 h) and
concentrations (1, 2, and 4%).
RESULTS AND DISCUSSION
Acute lethality test in varroa and bees
With the commercial product (PHC
TM
Neem), neem
oil 2002 harvest (neem1), 2003 harvest (neem2) and
Tween 20 (emulsifier), at concentrations of 1%, 2%,
and 4%, as well as 0% (control), no mortality of varroa
or bees was observed at 48 h, neither with a 50% in
complementary tests. These results differ from those
reported by Melathopoulos et al. (2000), who evaluated
neem oil and Neem-aza
TM
; the former, using topical
application, caused 45% mortality in varroa, while the
latter used topical, oral and vapor applications and
caused significant mite mortality.
It was decided not to increase the concentration of the
products because there were problems in forming stable
suspensions were encountered; also, it was considered
that elevating the concentration would make use of the
product impractical or costly. For PHC Neem, the
recommendation of the manufacturer for pest control on
fruit trees is 0.5-2 L concentrate 100 L
1
water, and on
vegetables 50 mL 15 L
1
water is recommended. These
values are equivalent to 0.5-2% and 0.33% of product
concentrate; that is, very close to those used in our study.
Direct contact of bees with neem at concentrations
of 20 ppm does not produce negative effects, and
effective pest control can be achieved with applications
of 30 to 50 ppm of azadirachtin (Larson, 1990; Isman,
1995). According to Atkins (1992), azadirachtin is a
relatively non-toxic substance for bees, with a LD
50
of
11 g per bee.
Naumann et al. (1994) found that neem seed extract
is a safe insecticide to use when there are honey bees
present at the moment of use. In fact, the treatments
they used did not repel the bees and suggest that neem
can be used for pest control in crops at the flowering
stage even when bees are required for pollination.
Repellency test with choice
There were significant differences in repellency
values attributable to double interactions of the variables
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
746 VOLUMEN 40, NMERO 6
accin individual de cada variable. Por tanto, las va-
riables producto y concentracin son de inters en la
discusin, mientras que la variable tiempo, aunque fue
analizada, representa slo la diferencia atribuible a las
fluctuaciones en las lecturas, por lo que es pertinente
omitirla de la discusin.
En la Figura 2 se muestra la tendencia en los valo-
res de repelencia (VR) a lo largo del tiempo. Primero
puede apreciarse la tendencia estable (de 98 a 110.3)
que present el testigo (tratado con agua) durante las
72 h de observaciones. El tratamiento a base de
emulsificante pareci mostrar un ligero efecto repelen-
te durante las primeras 4 h, pero slo tuvo diferencia
significativa respecto al testigo a los 30 min y a con-
centracin de 1%; el VR del emulsificante no fue su-
perior a 114. Estos valores de repelencia concuerdan
con los citados por Colin et al. (1994), VR alrededor
de 100 para el agua y el emulsificante, los que mues-
tran que las hembras de varroa se distribuyen unifor-
memente en las arenas de observacin.
Para el aceite de neem el efecto repelente vari en
las dos cosechas; en la de 2002 (neem1), los VR en las
diferentes concentraciones fueron significativamente ms
altos que en el testigo, con un valor mximo de 132 a
las 4 h (concentracin 2%). Pero el efecto se redujo en
todas las concentraciones al pasar el tiempo, y a las
72 h el VR mnimo fue 101, igual al testigo. La
cosecha de 2003 (neem2) tuvo altos VR en todas las
concentraciones, que se separaron de los testigos (agua
y emulsificante); a la concentracin ms alta (4%) hubo
diferencias significativas (p0.05) desde 30 min hasta
72 h, y los VR oscilaron entre 128 y 139, lo cual est
muy cercano a la repulsin total (140). Colin et al.
(1994) encontraron que el extracto de Thymus vulgaris
tuvo el VR ms alto, 124 a las 24 h, el cual disminuy
con el tiempo. Estos resultados contrastan con los VR
y estabilidad que de neem2 en la presente investiga-
cin.
Dado que los extractos de neem de 2002 y 2003 se
obtuvieron de la misma plantacin y se extrajeron de
Cuadro 1. Anlisis devarianza dela prueba derepelencia deextractos deneem con eleccin, dondela variablederespuesta es el valor
derepelencia (VR).
Table1. Analysis of varianceof therepellency test of neem extracts with choice, in which theresponsevariableis therepellency value
(RV).
Fuente de variacin GL Suma de cuadrados Cuadrados medios Fcal Significancia F
Producto 3 24606.125 8202.042 109.87 <0.001
Concentracin 3 29805.750 9935.250 133.08 <0.001
Tiempo 7 3050.031 435.719 5.84 <0.001
Producto*concentracin 9 9572.812 1063.646 14.25 <0.001
Producto*tiempo 21 4669.219 222.344 2.98 <0.001
Concentracin*tiempo 21 5654.094 269.242 3.61 <0.001
Producto*concentracin*tiempo 63 3536.469 56.134 0.75 0.92
type of product, concentration and observation time,
but not to triple interactions (Table 1). Besides, there
were significant differences due to the action of each
of the variables individually. Therefore, the variables
product and concentration are of interest in the
discussion, while the variable time, although it was
analyzed, represents only the difference attributable to
fluctuations in the observations, and so it is pertinent
to omit it in the discussion.
The trend of repellency values (RV) over time is
shown in Figure 2. Firstly, it can be seen that the
control (treated with water) maintained a stable trend
(98 to 110.3) over the 72 h that the observations lasted.
The treatment based on the emulsifier seemed to exhibit
a slight repellent effect during the first 4 h, even though
it was only significantly different from the control at
30 min at 1% concentration; the emulsifier RV was
not above 114. These repellency values coincide with
those reported by Colin et al. (1994), RV around 100
for water and emulsifier, showing that the female varroa
distribute themselves uniformly on the observation
arenas.
For neem oil, the repellant effect varied between
the two harvests: in the 2002 harvest (neem1) RV in
the different concentrations were significantly higher
than those of the control, with a maximum value of
132 at 4 h (2% concentration). But the effect decreased
with time in all of the concentrations and at 72 h, the
lowest RV was 101, the same as the control. The 2003
harvest (neem 2) had high RV in all of the concentrations
that differed from the controls (water and emulsifier).
At the highest concentration (4%) there were significant
differences (p0.05) from 30 min up to 72 h, and RV
oscillated between 128 and 139, which was very nearly
total repellency (140). Colin et al. (1994) found that
the extract of Thymus vulgaris had the highest RV,
124 at 24 h, decreasing over time. These results contrast
with the RV and stability of neem2 in this study.
The fact that the 2002 and 2003 neem extracts were
obtained from the same plantation and were extracted
747 GONZLEZ-GMEZ et al.
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
la misma forma, se sugiere que la diferencia en efecto
puede deberse a la degradacin de los posibles ingre-
dientes activos en el tiempo.
El producto comercial PHC Neempresent un
efecto similar al del neem1, pues VR no fue significa-
tivamente diferente entre ambos productos, si bien mos-
tr un efecto ms estable y a 4% fue significativamen-
te diferente del testigo aun a 72 h.
En la Figura 3 se muestra la preferencia de las
hembras de varroa para elegir las pupas tratadas de las
no tratadas, y posarse en ellas, en todas las lecturas.
La tendencia de los caros para posarse en pupas trata-
das con agua y con emulsificante fue indistinta o equi-
valente, es decir, no mostraron preferencia por una
zona particular. En contraste, fue clara la tendencia de
los caros a posarse sobre pupas no tratadas con cual-
quiera de los productos a base de neem; sin embargo,
destac el neem2 porque se posaron significativamente
ms hembras de varroa sobre las pupas no tratadas
(7.05 varroas/pupas).
Prueba de repelencia sin eleccin
Respecto al nmero de caros que se posaron sobre
las pupas, hubo efecto significativo de todas las fuen-
tes de variacin y sus interacciones (Cuadro 2). Como
en el experimento con posibilidad de eleccin, slo se
discuten las variables de producto y concentracin.
En la Figura 4 se muestra la tendencia de las hem-
bras de varroa a posarse sobre las pupas de abejas,
todas tratadas, en el tiempo. Se aprecia que en las
pupas tratadas con agua y con emulsificante, aproxi-
madamente 60% de las hembras de varroa pudieron
localizarlas y posarse sobre ellas 30 min despus de la
aplicacin; gradualmente este porcentaje aument a ms
de 80%, lo cual se observ en la ltima lectura a las 72 h.
Slo se contabilizaron las varroas que estaban sobre
las pupas en el momento de la observacin, lo cual no
excluye que varroas cercanas pudieran tener acceso a
las pupas en otro momento.
Todos los tratamientos con neem tuvieron un n-
mero significativamente menor (p 0.05) de varroas
sobre las pupas respecto al testigo. Slo en la concen-
tracin 1%, en la lectura a las 4 h, no hubo diferencia
significativa respecto al testigo.
En el Cuadro 3 se presenta los promedios del n-
mero de varroas posadas sobre las pupas. Hubo un
efecto significativo del producto y de la concentracin;
sorprendentemente, el neem2 a 4% slo permiti que
un promedio de 0.2 varroas se posaran sobre las pupas
tratadas.
El nmero promedio de varroas muertas en las lec-
turas sucesivas; se muestra en la Figura 5. Se presen-
tan slo los valores observados a partir de las 24 h
140
140
140
130
130
130
120
120
120
110
110
110
a
A
B
C
a
a
ab
bc
bc
bc
bc abc
abc abc
ab
ab
ab
ab
ab
ab
bc
ab
ab
ab ab
ab
bc
bc
bc
bc
ab
ab
ab
a
a
a
b
b
b
b
c
c
c
c
c
c
c
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b
b
b
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c
b
c
b
b
b
b b
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
100
100
100
90
90
90
NEEM1
NEEM2
EMUL
Testigo
V
a
l
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p
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n
c
i
a
V
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n
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i
a
V
a
l
o
r

d
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r
e
p
e
l
e
n
c
i
a
80
80
80
0.5
Tiempo (horas)
1 2 4 8 24 48 72
PHC
Figura 2. Valor de repelencia en los intervalos de tiempo. A)
concentracin 1%; B) concentracin 2%; C) concen-
tracin 4%. PHC=PHCNeem (producto comercial);
NEEM1=extracto deaceitecrudo delas semillas de
neem cosecha 2002; NEEM2=extracto deaceitecrudo
delas semillas deneem cosecha 2003; EMUL= Tween
20; Testigo=agua. Las intersecciones marcadas con
diferenteletra, para las lecturas tomadas en un mismo
tiempo, son significativamentediferentes (p 0.05).
Figure 2. Repellency value at of time intervals. A) 1%
concentration; B) 2% concentration; C) 4%
concentration. PHC=PHC
TM
Neem (commercial
product); NEEM1=extract of crudeneem seed oil from
2002 neem harvest; NEEM2=extract of crude neem
seed oil from 2003 neem harvest; EMUL=Tween 20;
Control=water. The intersections marked with
different letter, for readings taken at thesametime,
aresignificantly different (p0.05).
in the same way, suggests that the difference in effect
could be due to degradation of the possible active
ingredients over time.
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
748 VOLUMEN 40, NMERO 6
Figura 3. Nmero promedio decaros posados sobrelas pupas
deabejas en la prueba derepelencia con eleccin, lue-
go de la aplicacin de los productos probados. Las
letras maysculas hacen comparaciones entrebarras
grises, y las minsculas entrebarras negras. Pa=pupas
tratadas. Pb= pupas no tratadas.
Figure3. Averagenumber of mites settled on beepupaein the
repellency test with choice, after application of tested
products. Upper caseletters arecomparisons between
bars and thin lines, and lower case letters between
bars and thick lines. Pa=treated pupae. Pb=non-
treated pupae.
8
7
6
5
4
N

m
e
r
o

d
e

c
a
r
o
s

s
o
b
r
e

l
a

p
u
l
p
a
3
2
A
Pa
Pb
c
c
b
b
a
A
B B
B
1
0
Testigo EMUL NEEM1 PHC NEEM2
Cuadro 2. Anlisis devarianza dela prueba derepelencia deextractos deneem sin eleccin; la variablederespuesta es el nmero de
caros sobrelas pupas.
Table2. Analysis of varianceof therepellency test of neem extracts without choice; theresponsevariableis thenumber of mites on
pupae.
Fuente de variacin GL Suma de cuadrados Cuadrados medios F Pr > F
Producto 3 1388.687 462.896 474.64 <0.0011
Concentracin 3 2160.641 720.213 738.48 <0.0011
Tiempo 7 187.719 26.817 27.50 <0.0011
Producto*concentracin 9 540.828 60.092 61.62 <0.0011
Producto*tiempo 21 124.312 5.920 6.07 <0.0011
concentracin*tiempo 21 178.734 8.511 8.73 <0.0011
Producto*concentracin*tiempo 63 128.2969 2.036 2.09 <0.0011
porque antes de esta lectura todas las varroas estaban
vivas. Tanto en el testigo como en el emulsificante
todas las varroas sobrevivieron hasta el final del estu-
dio, mientras que en los tratamientos con neem se ob-
serv mortalidad desde 24 h. El PHC Neem no fue
diferente del testigo, aun a 72 h, mientras que el neem1
y el neem2 s lo fueron. El efecto de neem2 fue ms
rpido, pues la mortalidad de varroa se inici a las 24 h,
y a 2 y 4% murieron todos los ejemplares. Tanto en
neem1 como en neem2 hubo una relacin positiva en-
tre la concentracin y la mortalidad.
Estos resultados concuerdan con los de Colin et al.
(1994), quienes evaluaron la efectividad biolgica de
Thymus vulgaris, Salvia officinalis, Anonna spp. y
The commercial product PHC Neem
TM
had an effect
similar to that of neem1 since no significant differences
were found between the two products for VR, even
though the effect of the commercial product was more
stable and at 4% was significantly different from the
control even at 72 h.
Female varroa preference in selecting treated or
untreated pupae, and setthing in them in all readings,
is shown in Figure 3. The tendency of the mites to
settle on pupae treated with water and with emulsifier
was indistinct or equivalent, that is, they showed no
preference for a particular section. In contrast, the
tendency of the mites to settle on non-treated pupae
was clear, regardless of the neem-based product used;
however, the neem2 was outstanding because
significantly more female varroa settled on non-treated
pupae (7.05 varroa/pupa).
Repellency test without choice
Regarding the number of mites settled on pupae,
there was significant effect for all of the sources of
variation and their interactions (Table 2). As in the
experiment with choice, only the variables product and
concentration are discussed.
The tendency of female varroa to settle on bee pupae,
all treated, over time is shown in Figure 4. It can be
seen that approximately 60% of the female varroa were
able to locate and settle on the pupae treated with water
and with emulsifier as of 30 min after application; this
percentage gradually increased to over 80%, observed
in the last reading at 72 h. It should be noted that only
those varroa found on the pupae at the moment of
observation were counted, a fact that does not exclude
nearby varroa that could have had access to the pupae
at another time.
All of the neem treatments had a significantly lower
(p0.05) number of varroa on pupae than the control.
Only with the 1% concentration, in the reading taken at
4 h, there was no significant difference from the control.
749 GONZLEZ-GMEZ et al.
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
12
12
12
10
10
10
8
8
8
6
6
6
a
a
a
ab
bc
bc
bc
ab
ab
ab
bc bc
ab
bc
bc
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b
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b
b
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c
c
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b
b
a
a
a
a
a
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a
a
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a
a
a
a
a
a
a
a
4
4
4
2
2
2
NEEM1
NEEM2
EMUL
Testigo
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o
b
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u
p
a
s
0
0
0
0.5
Tiempo (horas)
1 2 4 8 24 48 72
PHC
A
A
B
C
Figura 4. Nmero decaros sobrelas pupas en la prueba sin
eleccin en los intervalos detiempo. A) concentracin
1%; B) concentracin 2%; C) concentracin 4%.
PHC=PHC Neem (producto comercial);
NEEM1=extracto deaceitecrudo delas semillas de
neem cosecha 2002; NEEM2=extracto deaceitecru-
do de las semillas de neem cosecha 2003;
EMUL=Tween 20; Testigo=agua. Las intersecciones
marcadas con diferenteletra, para las lecturas toma-
das en un mismo tiempo, son significativamentedife-
rentes (p0.05).
Figure4. Number of mites on pupaein thetest without choice
at time intervals. A) 1% concentration; B) 2%
concentration; C) 4% concentration. PHC= PHC
TM
Neem (commercial product); NEEM1=extract of crude
neem seed oil from 2002 neem harvest;
NEEM2=extract of crude neem seed oil from 2003
neem harvest; EMUL=Tween 20; Control=water.
Intersections marked with different letter, for readings
taken at the same time, are significantly different
(p 0.05).
The average numbers of varroa settled on pupae
are shown in Table 3. There was a significant effect of
both the product and the concentration can be seen;
surprisingly neem2 at 4% allowed an average of only
0.2 varroa to settle on treated pupae.
The average number of dead varroa in successive
readings is shown in Figure 5. Only values observed
as of 24 h are presented since before this reading all of
the varroa were alive. In both the control and the
emulsifier, all of the varroa survived to the end of the
study, while in the neem treatments mortality was
observed as of 24 h. PHC Neem was not different
from the control, even at 72 h, while neem1 and neem2
were. The effect of neem2 was more rapid; varroa
mortality began at 24 h and at 2 and 4% all of the
specimens died. In both neem1 and neem2 treatments
there was a positive relationship between concentration
and mortality.
These results coincide with those of Colin et al.
(1994), who evaluated the biological effectiveness of
Thymus vulgaris, Salvia officinalis, Annona spp. and
Chenopodiumspp. These authors observed a repellency
effect that prevented the female varroa from settling
on bee pupae. As a result of the application of essential
oils of S. officinalis and Chenopodiumspp., there was
90% mortality of varroa 16 h after application.
The effects of essential oils in the behavior of varroa
have been defined as attraction, repellency or toxicity
(Rickli et al., 1991). In the present experiment the
sum of the results of the tests of repellency with or
without choice proves that neem2 at 4% had the greatest
repellant effect and that, in the end, led to the death of
the varroa specimens. It is suggested that this was due
to the interference of the neem extracts in the behavior
of the varroa and in their ability to locate bee pupae to
feed on. Their death would therefore be from starvation.
CONCLUSIONS
At the concentrations used, there was no acute toxic
effect of any of the neem extracts on varroa or bees.
An important repellant effect was observed with neem
extracts, which interfered with the ability of female
varroa to locate bee pupae to feed on.
Neem-based products used in this study had a
persistent repellency effect that lasted at least 48 h.
Among these, the neem2, 2003 harvest, was outstanding;
this had an effect that persisted at least 72 h, sufficient
time to cause 100% mortality of the varroa.
It is postulated that death of female varroa was due
to starvation caused by the inability of the mites to
feed on the offered pupae.
End of the English version

AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006


750 VOLUMEN 40, NMERO 6
Cuadro 3. Promedio devarroas posadas sobrelas pupas en la
interaccin producto-concentracin. Prueba de
repelencia deextractos deneem sin eleccin.
Table3. Average number of varroa settled on pupae in the
interaction product-concentration. Test of repellency
of neem extracts without choice.
Tratamiento caros sobre las pupas
Testigo 7.8 a
Emulsificante 1% 7.3 a
2% 7.0 a
4% 7.1 a
PHC 1% 3.8 c
2% 2.4 d
4% 1.5 ef
Neem1 1% 3.7 c
2% 1.9 de
4% 1.0 f
Neem2 1% 2.5 d
2% 1.9 de
4% 0.2 g
Medias con diferente literal son diferentes (p0.05).
Figura 5. Nmero decaros muertos en la prueba sin eleccin a
las 24, 48 y 72 horas. A) concentracin 1%; B) con-
centracin 2%; C) concentracin 4%. Las compara-
ciones sehacen entrenmeros, literales minsculas y
maysculas para 24, 48 y 72 h.
Figure5. Number of dead mites in thetest without choiceat 24,
48, and 72 hours. A) 1% concentration; B) 2%
concentration; C) 4% concentration. Comparisons are
madebetween numerals, lower caseletters and upper
caseletters for 24, 48 and 72 h.
10
10
10
9
9
9
N

m
.
d
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c
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2
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Testigo
Testigo
Testigo
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b
b
24 h
48 h
72 h
b
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b
b
b
b b
b
b
a
a
a
B
B
B
B
B
B
B
B
A
AB AB
B
A
A
A
A
B
C
EMUL
EMUL
EMUL
NEEM1
NEEM1
NEEM1
PHC
PHC
PHC
NEEM2
NEEM2
NEEM2
Chenopodiumspp. Dichos autores observaron un efec-
to de repelencia que impidi que las hembras de varroa
se posaran sobre las pupas de abejas. Como resultado
de la aplicacin de aceites esenciales de S. officinalis y
Chenopodiumspp., hubo 90% de mortalidad de varroa
16 h despus de la aplicacin.
Los efectos de los aceites esenciales en la conducta
de varroa han sido definidos como de atraccin,
repelencia o toxicidad (Rickli et al., 1991). En el pre-
sente experimento la suma de los resultados de las
pruebas de repelencia con o sin eleccin comprueban
que el neem2 a 4% tuvo el mayor efecto repelente, y
condujo al final a la muerte de los ejemplares de varroa.
Se sugiere que esto se debi a la interferencia que
tuvieron los extractos de neem en el comportamiento
de varroa y en su incapacidad para localizar las pupas
de abejas y alimentarse de ellas. La muerte sera en-
tonces por inanicin.
CONCLUSIONES
A las concentraciones usadas, no hubo efecto txi-
co agudo de ningn extracto de neem, sobre varroa y
abejas.
Se observ un importante efecto repelente de ex-
tractos de neem que interfiri con la capacidad de las
hembras de varroa para localizar las pupas de abejas y
alimentarse de ellas.
Los productos a base de neem usados en este estu-
dio tuvieron un efecto persistente de repelencia que
dur al menos 48 h. Entre ellos destac el neem2 cose-
cha de 2003; ste tuvo un efecto que persisti al menos
por 72 h, tiempo suficiente para causar la muerte de
100% de las varroas.
Se postula que la muerte de las hembras de varroa
se debe a inanicin, causada por la incapacidad de los
caros para alimentarse de las pupas ofrecidas.
751 GONZLEZ-GMEZ et al.
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
LITERATURA CITADA
Anderson, D. L., and W. H. Trueman. 2000. Varroa jacobsoni is
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