Está en la página 1de 13

CENTRIFUGACIN

1. Sedimentacin
Transporte de una partcula en solucin
sometida a una fuerza (gravitacional o centrfuga). Para sedimentar una partcula slo por
accin de la gravedad, deben ser partculas grandes. Para separar macromolculas biolgicas
en suspensin por sedimentacin debemos usar fuerza centrfuga (CENTRIFUGACIN), y
aceleraciones altas.
Representacion del campo centrfugo, G=
2
X, que actua sobre un punto situado a una
distancia X del eje de giro, y sometido a una rotacion cuya velocidad angular es .
La velocidad de operacin de la centrfuga se expresa en "rpm" que se pueden convertir en
radianes:
= rpm/30
La magnitud de la fuerza centrifuga depende de la velocidad angular en radianes (F=
2
r)
pero es frecuentemente expresada relativa a la fuerza gravitacional (fuerza centrfuga relativa,
RCF):
RCF=
2
r/980 g (El resultado se deja en funcin de g)
Experimento de velocidad de sedimentacin: Solucin de una protena a determinada
concentracin, c, la sometemos a centrifugacin. Se empieza a mover hacia el fondo del tubo
1
y se genera una zona clara, slo solvente cerca del menisco y un frente mvil que limita
solvente de solucin. Si seguimos la velocidad con que se mueve ese frente mvil (en una
ultracentrfuga analtica), podemos determinar S, coeficiente de sedimentacin para esa
protena.
2. Fuerzas que intervienen
- La fuerza centrfuga:
Fc= m
2
r
Esta ecuacin dice que cuanto mayor es la molcula, o ms rpida es la centrifugacin, o ms
largo el eje de rotacin, mayor es la fuerza centrfuga y la velocidad de sedimentacin.
- La fuerza de empuje (opuesta a la fuerza centrfuga):
FE = V
2
r V=volumen; =densidad
La fuerza neta (Fc-FE) determinar si una partcula flota o se sedimenta. Las particulas con
una densidad mayor experimentarn una menor FE y por tanto, una sedimentacion mas
rapida.
- La fuerza de friccin (resistencia de una molcula de movimiento):
F
f
= V f
v = velocidad relativa al tubo de centrfugacion; f = coeficiente de friccin = 6 r; :
viscosidad del medio; r: radio de la partcula
La partcula alcanza una velocidad constante (v) cuando la fuerza neta es cero: Fc + FE + F
f
=
0
3. Coeficiente de sedimentacion
v = dr/dt =
2
x S S= 2r(
p
-
m
)/ 9 ln r/r
o
=
2
S (t t
o
)
Factores que aumentan este coeficiente:
-Aumento del tamao de la partcula (Hongos> Bacterias> Virus). Aumento de radio por el
factor 2 se incrementar por S 4.
-Aumento en la diferencia entre la densidad de la partcula dp y la del medio dm.
-Disminucin en la viscosidad del medio.
-Aumento en la fuerza debida a la gravedad.
4. Centrfugas
La centrfuga es el instrumento que utilizamos para llevar a cabo un experimento de
2
sedimentacin. Hay distintos tipos que podemos agrupar en: centrfugas preparativas para
separar compuestos biolgicos y centrfugas analticas para caracterizar un material que
previamente ha sido purificado.
Una centrfuga preparativa consta de las siguientes
unidades: un rotor situado en una cmara blindada, que estar sometido a la rotacin que
genera un motor y que se transmite a travs de un vstago; un sistema de control de la
temperatura de centrifugacin; un sistema de bomba(s) de vaco y un panel de mandos para
fijar los parmetros experimentales de la centrifugacin, esto es la velocidad (revoluciones
por minuto, rpm), el tiempo, la temperatura y las condiciones de vaco y frenado, si da lugar.
En general, las centrfugas preparativas se clasifican en distintas categoras, en funcin del
campo centrfugo que pueden alcanzar: (A) centrfugas de mesa y baja velocidad, (B)
centrfugas de alta velocidad y (C) ultracentrfugas. Dependiendo de la categora del aparato,
alguna de las unidades especificadas en el anterior prrafo, puede no ser necesaria.
Tipos de rotores:
- Rotor flotante o de balanceo: Consta de una serie de tubos metlicos que actan de carcasa,
donde se alojan los tubos con la muestra biolgica. Los ejes del tubo de centrifugacin y del
rotor son paralelos cuando sta est en reposo. Al actuar el campo centrfugo, el tubo de
centrifugacin da un giro de 90C y se sita perpendicularmente al eje del rotor. En esta
posicin tiene lugar la separacin del material biolgico. La distancia al eje de giro vara
desde un valor de radio mnimo (parte superior del tubo) a uno mximo (fondo del tubo).
- Rotor de ngulo fijo: Los tubos con la muestra se colocan en los correspondientes agujeros
de la carcasa. El eje de rotacin y el correspondiente al tubo de centrifugacin forman un
ngulo fijo.
- Rotor vertical: Los ejes del tubo de centrifugacin y de rotacin son paralelos. Las partculas
corrern como mximo la distancia correspondiente al dimetro del tubo de centrifugacin.
3
5. Centrifugacin diferencial (Preparativa)
Consideremos una
suspensin de partculas en un tubo de centrfuga: todos los solutos sedimentarn al aplicar un
4
campo centrfugo durante un tiempo determinado y su velocidad depender de su coeficiente
de sedimentacin y posicin en el tubo. Al finalizar la centrifugacin, se habr formado un
sedimento enriquecido con las partculas de mayor coeficiente de sedimentacin que est
contaminado por cualquier soluto que haya podido llegar al fondo del tubo y un sobrenadante
con los solutos que permanecen en solucin o suspensin. Si se incrementa el campo
centrfugo o el tiempo de centrifugacin, los solutos con menor coeficiente de sedimentacin
tambin sedimentarn. As pues, los precipitados o sedimentos que se obtienen con esta
tcnica no son homogneos.
La centrifugacin diferencial separa los solutos en funcin de sus coeficientes de
sedimentacin. En general, la tcnica permite aislar los orgnulos subcelulares en fracciones
heterogneas, cuando sus coeficientes de sedimentacin difieren como mnimo en un orden de
magnitud. Con los valores de coeficiente de sedimentacin de las partculas subcelulares
ilustrados en la tabla, es fcil observar que las fracciones nuclear, mitocondrial, microsomal y
soluble pueden aislarse mediante la tcnica de centrifugacin diferencial. Para ello, es
necesario realizar sucesivas centrifugaciones, incrementando cada vez el campo centrfugo
aplicado y el tiempo de centrifugacin. Sin embargo, el solapamiento de los coeficientes de
sedimentacin de las mitocondrias y lisosomas determina que la fraccin mitocondrial
siempre estar compuesta por ambos tipos de partculas.
Debido a las caractersticas de la tcnica, la centrifugacin diferencial se aplica en el
procesamiento inicial de volmenes importantes de muestras heterogneas para obtener
fracciones que posteriormente se purificarn. Tambin tiene inters para concentrar un soluto
mediante la obtencin de un sedimento que posteriormente se disolver en un menor volumen
acuoso.
6. Centrifugacin en gradiente de densidad (Preparativa)
La figura presenta un tubo de centrfuga con un gradiente de densidad formado que decrece
desde el fondo del tubo hasta la parte superior. La suspensin de material particulado se
deposita sobre la superficie de la columna de lquido. Para que el sistema sea estable, la
mezcla de solutos debe tener una densidad global menor que el gradiente, aunque cada
partcula individualmente pueda ser ms densa.
Durante la centrifugacin, los solutos sedimentan a travs del gradiente y hacia el fondo del
tubo. Todas las partculas con el mismo coeficiente de sedimentacin forman bandas o zonas
que viajan a la misma velocidad, tanto mayor cuanto mayor sea su coeficiente de
sedimentacin. Al finalizar el proceso, las bandas separadas se recuperan mediante una
puncin en el tubo con una jeringa y recogiendo alcuotas gota a gota, o desplazando el
5
gradiente mediante un lquido ms denso.
Mtodos para recuperar las fracciones separadas en un gradiente de densidad: (A) se hace una
puncin con una jeringa en el tubo de centrfuga y se recogen alcuotas gota a gota, (B) se
inserta una cancula hasta el fondo del tubo para recuperar las alcuotas de muestra de mayor a
menor densidad y (C) a travs de la cancula insertada hasta el fondo del tubo se introduce -un
lquido de mayor densidad que desplaza la solucin del gradiente. En este ltimo mtodo, se
recuperan alcuotas de muestra de menor a mayor densidad.
7. Centrifugacin zonal (Preparativa)
El gradiente de densidad se disea para que la
densidad de las partculas a separar sea mayor que la del medio de sedimentacin. En estas
condiciones, todas los solutos sedimentarn (dx/dt >0) y el tiempo de centrifugacin ser un
parmetro experimental crtico. Puede ocurrir que la densidad de un componente de la
muestra sea inferior a la del gradiente preparado, ello determinar que el soluto flote durante
la centrifugacin (dx/dt <0), circunstancia que a veces puede ser ventajosa en una separacin.
La longitud de recorrido del gradiente debe ser suficiente para la separacin de ocurrir. Si
realiza recorridos demasiado largos, las partculas quedarn sedimentadas en la parte inferior
del tubo.
Las partculas biolgicas tienen valores de densidad relativamente pequeos y muy similares.
Por consiguiente, los gradientes de densidad que podemos formar son muy suaves y el
parmetro molecular ms influyente en la velocidad de sedimentacin es el tamao de la
partcula.
6
8. Centrifugacin isopcnica (Preparativa)
El gradiente se disea con un valor de densidad mxima superior a la densidad de la partcula
a aislar. Al iniciar la centrifugacin, la velocidad del soluto es positiva (p > m) y sedimenta,
o negativa (p < m) y en este caso flotar. Cuando la densidad del orgnulo se iguala a la del
medio, su velocidad ser cero y habr alcanzado su posicin isopcnica. En esta tcnica, las
partculas se separan por sus diferencias en densidad. la densidad de la partcula de la muestra
debe estar dentro de de los lmites de la densidad de gradiente. Cualquier longitud gradiente
es aceptable. El tiempo de ejecucin debe ser suficiente para que el partculas a la banda en su
punto isopcnica, excesivos tiempos de ejecucin no tienen ningn efecto adverso.
9. Gradientes de densidad: caractersticas
Las partculas biolgicas son osmmetros muy sensibles a las condiciones de fuerza inica y
viscosidad del medio. La naturaleza del material biolgico (cidos nucleicos, protenas,
clulas o partculas subcelulares) condiciona la eleccin de los solutos comerciales para
formar el gradiente y sus lmites de densidad.
En general, se pueden fabricar tres prototipos de gradientes de densidad con las siguientes
caractersticas:
(1) Gradiente de densidad discontinuo. Es un tipo de gradiente preformado, donde la densidad
aumenta de forma escalonada desde la parte superior del tubo de centrfuga hasta el fondo del
mismo. Se prepara depositando las soluciones de densidad decreciente una encima de otra y
de forma sucesiva con ayuda de una pipeta Pasteur. El perfil abrupto de variacin de densidad
del gradiente se suaviza durante la centrifugacin debido a la difusin molecular.
7
(2) Gradiente de densidad continuo.
En este segundo tipo de gradiente preformado, la densidad vara de forma continua a lo largo
del volumen del tubo de centrifugacin. Se prepara mediante un aparato denominado
gradientmetro formado por dos vasos comunicantes, unidos por un estrecho conducto con
una llave de paso, que contienen las dos soluciones de densidad lmite entre las cuales se
formar el gradiente. Para formar un gradiente de densidad que vare linealmente con el
volumen, es necesario que ambos vasos sean iguales y cilindricos. Los dos compartimentos s
vaciarn a la misma velocidad y la densidad de la solucin en el tubo de centrfuga aumentar
lineal con el volumen. En los dems casos, el perfil del gradiente ser cncavo o convexo. En
general, los gradientes preformados se utilizan para separaciones determinadas por las
diferencias en los coeficientes de sedimentacin.
(3) Gradiente de densidad autogenerado. Una solucin de densidad uniforme de partculas
relativamente pequeas, como las sales de metales alcalinos, especialmente de cesio, o una
suspensin de partculas coloidales (por ejemplo, slice coloidal) que presentan una
polidispersin de tamaos, pueden generar un gradiente de densidad continuo durante la
centrifugacin (figura 5.10). En el primer caso, se auto genera un gradiente estable cuando el
flujo de masa debido a la sedimentacin se iguala con el flujo en direccin centrpeta
producido por el fenmeno de difusin. La naturaleza del equilibrio establecido entre ambos
tipos de flujos depender del valor de FCR aplicado; por lo que la velocidad del rotor
determina el perfil del gradiente generado. En el segundo caso, la velocidad de sedimentacin
diferencial del soluto polidisperso produce el propio gradiente de densidad. Los gradientes
autogenerados se utilizan en experimentos para separar partculas en funcin de sus
diferencias en densidad y con la modalidad de centrifugacin isopcnica.
8
Rotores en la centrifugacin en gradiente de densidad: En la centrifugacin zonal se utilizan
generalmente los rotores flotantes. Los rotores de ngulo fijo son poco adecuados debido al
acusado efecto de pared que produce sedimentacin de material sobre las paredes. La
centrifugacin isopcnica se realiza con cualquier tipo de rotor, no obstante, se utilizan con
preferencia los rotores verticales y los flotantes.
Perfil del gradiente de densidad en los
diferentes rotores: El gradiente de densidad se prepara en el tubo de centrifugacin y ste se
coloca en la carcasa del rotor. Al iniciarse la centrifugacin y durante el proceso, el gradiente
de densidad se reorienta debido a la accin del campo centrfugo radial. Como un ejemplo de
9
este hecho, se ilustra el caso concreto de un rotor vertical (Figura de etapas).
El perfil y las caractersticas del gradiente de densidad durante la centrifugacin dependen del
tipo de rotor. El mismo gradiente de densidad lineal en un rotor flotante o de ngulo fijo
presenta una relacin lineal entre la densidad y el radio (o distancia respecto al eje de giro),
pero la pendiente del gradiente es distinta, siendo ms suave en un rotor flotante. En un el
rotor vertical, el gradiente de densidad lineal muestra un perfil sigmoidal de variacin de la
densidad con el radio. As pues, la resolucin y eficacia de una centrifugacin en gradiente de
densidad dependen de la geometra del rotor. Los resultados experimentales obtenidos con un
determinado rotor no son extrapolables a cualquier tipo de rotor.
10. Ultracentrifugacin (Preparativa)
El material biolgico puede clasificarse en funcin de los parmetros coeficiente de
sedimentacin y densidad. La figura (5.13) ilustra como las partculas subcelulares tienen un
estrecho intervalo de densidades y un amplio margen de coeficientes de sedimentacin. Por
ello, en los protocolos de purificacin de orgnulos subcelulares se aplican gradientes muy
suaves y mauritanamente con una centrifugacin zonal. Por su parte, los cidos nucleicos
DNA y RNA presentan valores de densidad muy diferentes y se separan mediante una
centrifugacin isopcnica.
El inters de la centrifugacin en gradiente de densidad se centrar en el campo de los cidos
nucleicos considerando ejemplos clsicos de la literatura cientfica:
(A) El experimento de Meselson-Sthal demostr que la replicacin del DNA es
semiconservativa. El diseo experimental se basa en el mareaje de DNA con los istopos
estables
15
N o
14
N y su posterior separacin mediante una centrifugacin isopcnica en
gradiente de densidad de CsCl. El protocolo est descrito en los textos de bioqumica y se
recomienda que el alumno lo analice desde la ptica de las tcnicas instrumentales. Es
importante destacar que las propiedades de los istopos permiten separar las bandas isodensas
10
de DNA dplex con mareaje en las dos hebras
14
N
14
N,
15
N
14
N y
l3
N
15
N, ya que las cadenas
tienen diferente densidad en funcin del nmero msico del istopo correspondiente. La
aparicin de una simple banda isodensa de DNA dplex
l5
N
14
N, en la primera generacin,
constituy la primera prueba experimental de que el DNA se replicaba dando una especie
molecular hbrida (rplica semiconservativa) que exclua el modelo de rplica conservativa.
En la segunda generacin, la presencia de dos bandas de DNA isodensas (
14
N
14
N y
15
N
14
N) e
iguales en magnitud di validez al modelo de la rplica semiconservativa, en contra de los
modelos de rplica conservativa y dispersiva.
(B) Aislamiento de DNA satlite mediante centrifugacin isopcnica en gradiente de densidad
de CsCl. El mtodo se fundamenta en las dos siguientes propiedades:
i- El DNA satlite se caracteriza por un elevado contenido de bases A/T. En solucin acuosa
los pares de bases AT tienen un mayor grado de hidratacin que los GC. En solucin acuosa,
el valor de la densidad isopcnica del cido nucleico es el que corresponde a la molcula
hidratada. Por consiguiente, la densidad de las molculas de DNA de igual tamao variar en
funcin del porcentaje en pares de bases AT.
ii- En un gradiente en cloruro de cesio hay una relacin lineal entre el porcentaje de pares de
bases GC del DNA y su densidad. Dicha propiedad es peculiar de los gradientes de CsCl y se
debe a las propiedades de hidratacin de los iones Cl" y Cs+ y los pares de bases AT.
Estas caractersticas permiten la separacin de DNA satlite y DNA cromosmico; cuanto
mayor sea el porcentaje en pares de bases AT, menor ser la densidad del DNA.
(C) Aislamiento de plsmido. Se obtiene mediante una centrifugacin isopcnica en gradiente
de densidad de CsCl autogenerado y en presencia de bromuro de etidio (EtBr). El
experimento se realiza, mayoritariamente, con rotores flotantes. El mtodo presenta el
siguiente fundamento:
i- La densidad de flotacin de la molcula de DNA es dependiente de sus propiedades
estructurales. Una molcula de DNA superenrollado tiene mayor densidad que un DNA lineal
con el mismo nmero de pares de bases.
ii- El efecto del bromuro de etidio (EtBr) sobre las propiedades topolgicas del DNA lineal y
circular determina una variacin diferencial de sus respectivas densidades. La molcula de
EtBr tiene una estructura plana que le permite intercalarse entre los pares de bases del DNA y
en cada proceso de intercalacin se desenrosca la doble hlice y se alarga, afectando a la
densidad de la macromolcula. En general, cuanto mayor sea la cantidad de ligando que se
une al DNA, menor es la densidad de flotacin del complejo. As pues, un DNA lineal que no
tiene restricciones topolgicas, puede intercalar un nmero muy elevado de molculas de
EtBr que producirn una disminucin significativa de su densidad. Sin embargo, el DNA
circular bicatenario no puede aceptar un nmero ilimitado de molculas de ligando, ya que al
incorporar EtBr forma la estructura de DNA superenrollado e incrementa su densidad.
iii- El bromuro de etidio es un ligando que a su vez, acta de detector, ya que el complejo de
intercalacin EtBr-DNA es fluorescente y permite localizar la posicin de las bandas
isodensas, cuando ha terminado la centrifugacin.
11. Aplicaciones de la centrifugacion preparativa
-Fraccionamiento subcelular
11
-Determinacion del coeficiente de sedimentacion de proteinas
12. Ultracentrifugacion analitica
La ultracentrifugacin como tcnica analtica permite abordar dos aplicaciones de inters en
bioqumica: (1) determinar experimentalmente el coeficiente de sedimentacin de una
partcula biolgica y (2) caracterizar algunos parmetros moleculares, una vez conocido el
valor de su coeficiente de sedimentacin. Este tipo de experimentacin se lleva a cabo con
una ultracentrfiga analtica que consta de las mismas unidades bsicas que la ultracentrfiga
preparativa, pero los rotores tienen un diseo especial y adems, dispone de un sistema ptico
de observacin y registro del desplazamiento de la muestra durante el tiempo de
sedimentacin. El rotor (visto en seccin transversal) consta de dos compartimentos o clulas
donde se colocan la solucin problema (M) y el disolvente (R) para equilibrar el sistema.
Cada clula situada en un cilindro, est formada por una pieza central y dos ventanas que
permiten el paso de luz. Tiene un corte sectorial, de forma que las paredes son paralelas a las
lneas del campo centrfugo y no hay sedimentacin sobre las mismas. Los sistemas pticos
de anlisis pueden ser de tres tipos: (A) absorcin que mide la absorbancia de la muestra que
sedimenta, (B) Schlieren y (C) interferencia (que no se incluye en esta exposicin). En estos
dos ltimos, la lectura experimental se basa en el ndice de refraccin.
Supongamos un experimento de velocidad de sedimentacin de una macromolcula pura en
solucin con los diferentes sistemas pticos. Inicialmente las partculas se distribuyen por
toda la clula y al actuar el campo centrfugo forman un frente de sedimentacin que viaja
hasta el fondo de la misma y deja atrs una regin de disolvente. El anlisis se basa en
detectar la posicin del frente de sedimentacin en funcin del tiempo. El mtodo ptico de
absorcin registra un incremento de absorbancia relacionado con el cambio de concentracin,
cuando el rayo ptico pasa a travs del frente de sedimentacin. En el mtodo de Schlieren, el
haz de rayos que atraviesa la zona de discontinuidad disolvente/disolucin, se desva debido
al cambio del ndice de refraccin que vara con la concentracin. El sistema ptico convierte
estas desviaciones en una curva de variacin del gradiente de concentracin.
12
13