Actividad antibacteriana de seis pptidos nuevos de veneno de Escorpin

Tityus discrepans. Un estudio de sonda fluorescente de membrana

microbiano, cambios de permeabilidad Na+

Resumen
Seis nuevos pptidos (llamado bactridines) fueron aislados de Tityus discrepans Veneno. De la
masa espectrometra de masas moleculares fueron 6916, 7362, 7226, 7011, 7101 y 7173 Da
(bactridines 1-6). Bactridines 1 y 2 se secuenciaron por la degradacin de Edman. Las secuencias y
in silico anlisis, indic que est cargado positivamente polipptidos compuesto por 61 y 64
aminocidos (AA), respectivamente, bactridine 1 y 2 bactridine contiene 4 puentes disulfuro.
Bactridine un slo txico para las cucarachas y cangrejos, y bactridine 2-6 slo txico para los
ratones. Bactridine 1 tiene una identidad de secuencia con el 78% ardiscretin. Ardisctretin es una
toxina para insectos de sodio especficos que tambin produce una pequea e induce la
despolarizacin de coccin repetitivos en los axones del calamar parecidas a las del DDT [1,10
(pchlorobenzyl)] 2-trichloretane en su capacidad para frenar potencial de accin, para inducir la
coccin repetitivos. Medido como la concentracin inhibitoria mnima, bactridines tuvieron
actividad antibacteriana de alta en contra de una amplia gama de bacterias Gram positivas y Gram
negativas. La inhibicin completa se produjo el crecimiento de bacterias en concentraciones 20 a 80
mM dependiendo de la bacteria y el pptido prueba. Efectos sobre la membrana de Na
+
la
permeabilidad inducida por bactridines se observaron en Yersinia enterocolitica cargado con una
mM Corona Roja . Corona fugas fluorescencia roja de las bacterias se observ despus de la
exposicin a 0,3 mM de cualquier bactridine probado, lo que indica que han modificado Na
+

permeabilidad de la membrana. Este efecto fue bloqueado por amilorida 10 mM y en un 25 mM
mibefradil drogas que afectan a Na
+
y Ca
2 +
canales respectivamente. No se encontraron pruebas de
los cambios de K
+
o Ca
2 +
concentraciones ni dentro ni fuera de la bacteria en experimentos con los
tintes fluorescentes 04 a.m. Fluo (10 mM) y PBFI (20 mM).
Introduccin
los organismos vivos, estn expuestos diariamente a las infecciones microbianas. Con el fin de
defenderse contra el medio ambiente hostil, han desarrollado potentes mecanismos de defensa que
forman parte de la inmunidad innata y adaptativa. pptidos antibacterianos son las molculas
efectoras de la inmunidad innata y su principal objetivo son las membranas bacterianas. Los
pptidos antimicrobianos fueron descubiertas inicialmente en invertebrados y ms tarde tambin se
han descrito en los vertebrados. Estos pptidos presentan secuencias diferentes, las estructuras y la
especificidad de destino. Algunos de ellos son catinicos, pptidos anfipticos con masas
moleculares por debajo de 10kDa y una mayor especificidad para los procariotas que para clula
eucariota. Con el problema creciente de organismos patgenos resistentes a los antibiticos
convencionales, hay un creciente inters en la aplicacin farmacolgica de los pptidos
antimicrobianos. Los pptidos antimicrobianos puede de divide en tres grandes grupos: (1)
anfipticas pptidos lineales libre de la cistena y la frecuencia con la estructura alfa-hlice, (2)
pptidos con tres enlaces disulfuro y (3) pptidos con abundancia inusual de ciertos aminocidos,
prolina , arginina, triptfano o histidina. El pptido antimicrobiano aislado por primera vez desde
escorpiones eran del tipo de defensina quinquestriatus Leirus Hebraeus hemolinfa. Ms tarde
cytolitic y / o pptidos antibacterianos fueron aislados de escorpin que pertenece tambin el
Buthidae, Scorpionidae, Ischnuridae, y la linfa superfamilias luridae hemo-y veneno. El
descubrimiento de estos pptidos en el veneno de escorpin de Eurasia, frica y Amrica, han
confirmado su presencia generalizada de las funciones biolgicas importantes.
El sitio principal de la actividad antimicrobiana es la membrana plasmtica de las bacterias y los
protozoos parsitos. Algunos pptidos antimicrobianos son inicamente atrajo al grupo de carga
negativa de la superficie celular, donde se adoptan una conformacin alfa-helicoidal y acumulan en
la membrana. Esto puede resultar en la formacin de poros transitorios, perturbacin de la
membrana y lisis celular. Otros pptidos antimicrobianos se ha demostrado que inducen
perturbaciones permeabilidad de la membrana bacteriana que indica interaccion con los canales
inicos de la membrana. Su mecanismo de accin de las bacterias canales de la membrana de iones
no se entiende bien.
En el presente trabajo, reportamos el aislamiento de seis pptidos antibacterianos del veneno de
escorpin T. discrepans. Su capacidad para inducir cambios de permeabilidad de la membrana
bacteriana se estudi con mtodos de epifluorescencia en diferentes condiciones experimentales.
la actividad biolgica y las interacciones farmacolgicas de estos pptidos con tetrodotoxina,
amilorida y el mibefradil bacteriana canales de Na +-, sugieren que actan en los canales parecida
a la de cchannels NaChBact hallodurans bacilo. Algunos de los resultados presentados aqu han
sido comunicados previamente en forma preliminar.
Discusion
La mayora de los pptidos antimicrobianos aisladas de venenos de artrpodos son pptidos
lineales helicoidales alfa-. Sin embargo dos pptidos antimicrobianos escorpin cistena ricos, y
scorpine BmTXKS2, son estructuralmente diferentes. Un pptido antibacteriano nuevo y nico que
es tambin rico en cistenas y las caractersticas de las defensinas y K +-bloqueadores de los
canales toxinas es aurelin, recientemente aislada de la medusa Aurelia aurita. En este trabajo se
han estudiado 28 picos de T. discrepans veneno fraccin II Sephadex G50, a partir de stos, slo 6
fueron anti-bacteriano, y fueron nombrados bactridines. Las estructuras de bactridine 6.4
Actualmente se desconocen, pero posiblemente puede ser similar a bactridine 1 y 2, basado en el
comportamiento cromatogrfico, masa molecular, y la actividad antibacteriana. Bactridine 1 y 2 se
secuenciaron por completo y se comprob que la cistena pptidos ricos como scorpine. Sin
embargo scorpine es capaz de bloquear los canales de potasio, mientras que la membrana
bactridines actuar sobre los canales de membrana de sodio. Bactridine 1 es 78% idntico a
ardiscretin un insecto Na +-canal de sodio a partir de la toxina beta T discrepans veneno y un 63%
con TsNTxP una protena no txica del veneno de T serrulatus. Bactridine 1 era txico para las
cucarachas y cangrejos, y no es txico para los ratones. el cuadro 4 contiene una alineacin Clustal
W de bactridine 1 y 2, abarcando tambin gran ardiscretin y TsNTx. A pesar de los 4 pptidos
tienen diversos grados de identidad de secuencia (consenso de los otros 3 pptidos con una
bactridine estn subrayados en la tabla), las identidades y la secuencia entre ardiscretin bactridine
1 son sorprendentes (onda subray residuos en la tabla). partir de la secuencia de AA bactridine 1
y 2 se puede inferir que tienen carga positiva, como todos los pptidos antibacterianos conocidos
de hemolinfa de artrpodos venenosos o venenos.
motivos tericos han sido establecidas para determinar cuando el resultado de modelado in silico
predecir con precisin una estructura terciaria, y definir, la llamada "zona de seguridad modelado
por homologa". En esta zona secuencias similares adoptar estructuras prcticamente idnticas, y
las secuencias relacionadas lejanamente todava se pliegan en estructuras similares. Algunas de las
razones tericas fueron establecidas por chothia y Lesk (1986), lijadora y Schneider (1991) y Rost
(1999) y se resumen por Krieger et al. (2003). En bactridine modelos 1 y 2, las similitudes con la
plantilla de pptidos utilizados, garantizamos que nuestras modelado por homologa se encuentra
dentro de la llamada "zona de seguridad modelado por homologa". que existen para los pptidos
de AA = 60 cuando la identidad entre el alcalde de destino o Igual un 60%. los modelos
tridimensionales obtenidos mediante modelado por homologa sugieren fuertemente que
bactridine 1 y 2 que se muestra en la fig. 3 son protenas globulares que doblan de acuerdo con la
alfa-beta-cistena motivo. Estos pptidos tienen un segmento de alfa-hlice y una estructura
conservada beta-hoja gestionada por puentes disulfuro.
Las concentraciones utilizadas para los experimentos toxicolgicos y fisiolgicas para ardiscretin
en DSuze et al (2004). Se ha calculado suponiendo que alfa prime = 1, que ahora volvern a
calcular los valores de la primera alfa de ardiscretin de la misma manera hace aqu por los
bactridine y obtuve 4,458 Asumiendo que todas las cistenas cys aparecen como media. por lo
tanto, utilizando a primera alfa = 4,458, ardiscretin: 0,7 gramos Por microgramos cangrejos
muertos U. rapax, 12-22 gramos Por microgramos mataron grillos y 33-300 gramos Por
microgramos muertos triatominos (Rhodnius prolixus). en esta comunicacin bactridine 1, 1,3
microgramos Por gramos no mat a los ratones, una dosis aproximadamente igual al doble de la
dosis de ardiscretin utilizado por D'Suze et al (2004), pero bactridine 1 en una dosis tan baja 0,9
aas Por gramos microgramos sialorrea inducida en los cangrejos, qhen la dosis se aument a 1,8
gramos Por microgramoss la sialorrea era ms intensa y el 43% de cangrejo muerto. Las
cucarachas (americana P, similares 1 pc g) inyectado a travs de la primera articulacin de una
pierna con = 22 gramos Por microgramos de bactridine 1, muri; esta dosis est cerca de la una
grillos matar, y cerca del lmite inferior de la dosis matando triatominos en D'Suzr (2004). Estos
resultados indican que ardiscretin y bactridine 1 son aproximadamente igualmente txico para los
vertebrados e invertebrados.
Bactridine 5 tenan una masa molecular de 7101 Da, muy cerca de ardiscretin que tiene una masa
molecular de 7103 Da, sin embargo, las masas similares, no me refiero a la igualdad de las
secuencias. Bactridine 5 se encontr que los ratones afectan a = 1 Gramo Por microgramo, y no
tuvo efecto sobre las cucarachas incluso usando = 20 Por miicrogramos cucarachas Gramo, por lo
que es o alcalde Igual 20 veces ms potente en los mamferos que en los insectos, junto con
bactridine 2 , 3 y 4, 5 bactridine fue totalmente ineficaz en los cangrejos. Ardiscretin, 0,7 gramos
Por micragramos animal, no tuvo ningn efecto en ratones, pero aproximadamente a la misma
dosis cangrejos muertos, y mat a los grillos aproximadamente a la misma dosis bactridine 5 no
matar a las cucarachas. dos molculas qumicamente diferentes pueden tener el mismo efecto,
pero si difieren del efecto de dos molculas, estudi en los mismos animales (ratones y cangrejo),
en condiciones similares y en concentraciones similares, sus estructuras tienen que ser diferente
este parece ser el caso de bactridine 5 y ardiscretin.
Bactridine fueron eficaces contra varios Gram positivas y Gram-negativos en concentraciones que
iban 20-77 micrometro en funcin de las bacterias y bactridine prueba. este rango est de acuerdo
muy razonable con la CIM de otros pptidos aislados de artrpodos hemolinfa y veneno contra las
bacterias Gram positivas o contra las bacterias Gram negativas. Desde bactridine se detectaron en
los lotes veneno diferentes, parecen ser parte integral de T veneno de escorpin discrepans; Esto
sugiere que se puede escuchar bactridine un papel fisiolgico importante en este escorpin.
Curiosamente, los escorpiones, al menos en cautividad, su veneno rociado sobre sus cuerpos de
una manera que sugiere una limpieza o la prctica de proteccin.