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Cromatografa en capa delgada

Laboratorio de Qumica (Ing. Ambiental)


Martes 10 de junio de 2014
Rodrguez Laura & Rodrguez Sebastin

Resumen

La cromatografa en capa fina es un tipo de cromatografa de reparto en las que los componentes
de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre un sistema de disolventes. Los
elementos del sistema cromatogrfico son: fase estacionaria (slica gel/albumina), y fase mvil
(disolvente 1/disolvente 2). Es una tcnica de realizacin simple respecto al equipamiento
necesario para su desarrollo. El parmetro experimental asociado a la tcnica es el Rf (coeficiente
de reparto), relacionado con la solubilidad relativa de un compuesto en la fase estacionaria y fase
mvil, y que depende de su estructura qumica y su hidrosolubilidad. Dentro de la presente
prctica se llevara a cabo la separacin de pigmentos de espinaca en solvente de teres para
identificar los diferentes gradientes, as como la separacin de una mezcla de aminocidos, que
se revelaran e identificaran mediante la reaccin con ninhidrina.

Palabras claves: aminocidos, espinaca, fase estacionaria, fase mvil, separacin de pigmentos.

Introduccin

La cromatografa en capa delgada en una tcnica usada en la separacin de mezclas de dos o
ms compuestos donde estn involucradas dos fases, mvil y estacionaria (Gennaro, 2000).

Para llevar a cabo cierta separacin se tiene en cuenta el tipo de cromatografa a usar, el cual es
usada la forma de cromatografa de adsorcin slido-lquido, donde la muestra se adiciona una
placa rectangular(fase estacionaria) con ayuda de un capilar a 0,5 mm aproximadamente del
extremo inferior. Dicha placa se introduce a un vaso de precipitado con una pequea cantidad de
solvente (fase mvil), se tapa y se deja ascender hasta 0,5 mm abajo del extremo superior. Los
dos adsorbentes ms utilizados son gel de slice y almina, ambas de carcter polar, donde
almina retiene con ms fuerza a los compuestos apolares y el gel de slice para retener
compuestos polares (Dupont & Gokel).

Las molculas se comportan de manera diferente respecto al solvente usado. Para determinar la
rapidez con que se mueve el soluto se usa el Rf (Rf = distancia recorrida por el compuesto (X) /
distancia recorrida por el eluyente (Y)), el cual determina la relacin entre las distancias
recorridas por el soluto y por el eluyente desde el origen de la placa.

Esta tcnica es usada principalmente para separar molculas relativamente pequeas, donde
determina su composicin, grado de afinidad y mostrar que la fase estacionaria tender a retener
las sustancias en mayor o menor grado, la fase mvil asciende por capilaridad, de forma que se
produce el mayor o menor avance de los componentes de la mezcla, segn su polaridad (Harris,
2003). La prctica fue realizada con hojas de espinaca ya que con esta se logra ver los diferentes
pigmentos fotosintticos que son arrastrados por el solvente tales como la clorofila a y b, xantofila
y carotenos.







Procedimiento

1. Cromatografa en capa delgada sobre slica gel de pigmentos de la espinaca.

Se tomo una pequea cantidad de espinaca previamente desecada la cual se deposito en un
mortero de cermica (Imagen 1) para ser triturada, una vez se obtuvo un polvo fino se agrego
aproximadamente 5mL de ter de petrleo, se continuo con la maceracin unos cuantos minutos
para obtener el extracto de pigmentos (Imagen 2).

Contiguo a esto, se trazo una lnea con un lpiz de punta roma a 0.5cm en cada uno de los
extremos de la placa de slica gel. Posteriormente, con un tubo capilar se aplico una gota del
extracto obtenido en el paso anterior en tres puntos diferentes de una de las lneas, la cual se
sumergi en la fase mvil de aproximadamente 15ml correspondiente a un solvente para elucin
de pigmentos: ter etlico: ter de petrleo (2:1) contenido en un erlenmeyer y se tapo con ayuda
de un vidrio de reloj permitiendo que el solvente ascendiera (Imagen 3).

Una vez el solvente llego hasta la lnea trazada a 0.5 cm de la parte superior, se retiro la placa,
marcando en esta, el frente del solvente y encerrando con lpiz las manchas correspondientes por
lo menos a un pigmento.

2. Cromatografa en capa delgada de una mezcla de aminocidos sobre almina.

Se tomo con ayuda de un tubo capilar una gota de los extractos aminocidos de Lisina y Propalina
para ser aplicados en tres puntos diferentes (lisina, propalina, lisina, respectivamente) sobre una
lnea previamente marcada en una placa de almina a 1cm de uno de sus extremos.

Posteriormente, se sumergi en una fase mvil de aproximadamente 15ml correspondiente a un
solvente para elucin butanol: acetona: cido actico: agua (35:35:70:10), contenido en un
erlenmeyer y se tapo con ayuda de un vidrio de reloj permitiendo que el solvente ascendiera.

Una vez el solvente llego hasta la lnea trazada a 0.5 cm de la parte superior, se retiro la placa,
rosendose con solucin de Ninhidrina y fue llevada a una estufa a 60C por veinte minutos.


Imagen 1. Elementos usados en la prctica: a. mortero de cermica, b. placa de slica gel /
alumina, c. vidrio de reloj y d. erlenmeyer.

a.
b.
c.
d.

Imagen 2. Extracto de pigmento de espinaca, obtenidos con una solucin de ter de petrleo.



Imagen 3. Recorrido y revelacin de pigmentos mediante la absorcin de la fase mvil por parte
de la placa de slica gel.
Resultados


Imagen 4. Placa de slica gel en los que se puede observar diferentes pigmentos (P
n
) revelados a
lo largo de la misma.


Imagen 5. Placa de Almina previamente roseada con ninhidrina, en la cual se observa una gran
mancha irregular de color purpura que impide determinar el recorrido de los aminocidos: Lisina (l)
y Propalina (p).

P
1
.
P
2
.
P
3
.
D
e.

p
L
1

L
2

Muestra de clculos


Imagen 6. Determinacin del factor de retencin en muestra de espinaca.

Anlisis de resultados

El reparto de los aminocidos en la placa de albumina se debe a su naturaleza qumica. Los
aminocidos apolares son los que mejor interaccionan con el solvente y son arrastrados por l; la
lisina presenta la menor movilidad debido a que al pH del solvente, este aminocido presenta sus
dos grupos amino cargados positivamente por lo que interacciona de forma poco eficiente con el
solvente, mayoritariamente apolar (n-butanol). En el caso de la propalina presenta una menor
movilidad respecto a la lisina debido a que su polaridad es mucho menor. La posicin del
aminocido se revela con ninhidrina, apareciendo una mancha de coloracin azul-violeta. La
ninhidrina reacciona con los aminocidos formando aductos coloreados segn la reaccin.
La reaccin de los aminocidos con ninhidrina se debe a la presencia del grupo NH2 en los
mismos. La prolina no tiene dicho grupo libre, sino NH- ya que forma parte del anillo de
pirrolidina, y al reaccionar con ninhidrina se forma un color amarillo.

El fundamento de la separacin implica que los aminocidos cuya cadena lateral (R) tenga un
carcter ms apolar, tendrn tendencia a desplazarse con la fase mvil, mientras que los
aminocidos que sean polares, ya sean con carga o sin carga, sern retenidos por la fase
estacionaria. Ello es as, porque la fase mvil est formada por solventes que son ms apolares
que el agua, que es el solvente de la fase estacionaria.

La mezcla de pigmentos presentes en hojas de espinaca como los carotenos, xantofilas y
clorofilas, presentan diferentes grados de solubilidad en disolventes apolares, gracias a esto se
permite la separacin al ascender por capilaridad, dejando una gama de colores de diferentes
tamaos.



Conclusiones
El pigmento de mayor abundancia obtenido en el extracto de espinaca fue el
correspondiente a la clorofila debido a que este es uno de los principales componentes en
las hojas vegetales para la realizacin de los procesos fotosintticos.
Los pigmentos observados en la tcnica cromatografca con aminocidos presento
resultados confusos o imposibles de leer debido a su inconsistencia en la trayectoria
obtenida, a este hecho se le atribuye a la aplicacin de gotas demasiado grandes sobre la
placa, dado que la tcnica utilizada (ninhidrina) requiere de pequeas cantidades por ser
una tcnica muy sensible.
Bibliografa
Cromatografa en placa fina. Recuperado el 16 de Junio de 2014. Obtenido de
http://www.uam.es/docencia/jppid/documentos/practicas/actuales/guion-p6.pdf
Dupont. H, Gokel. G. Qumica orgnica experimental. McGraw-Hill Book Company.
Gennaro,A. (2000).Remington Farmacia. Filadelfia: Lippicott Williams & Wilkins, USA.
Harris, D. (2003). Anlisis Qumico Cuantitativo .USA: W.H. Freeman and Company.
Russelber S. (2009). Reacciones cromatograficas de aminocidos en un compuesto mixto.
Obtenido de
http://www.odonto.unam.mx/pdfs/bioquimica_experimentalparte4_defiparte1.pdf