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Evaluacin de la actividad ureoltica de cepas aisladas de suelos de la


Comarca Lagunera y su potencial para el desarrollo de bioconcreto

Obregn Calvillo, C. L.
Alvarado, A.
Balagurusamy, N.

Laboratorio de Biorremediacin
Escuela de Ciencias Biolgicas
Universidad Autnoma de Coahuila
Unidad Torren

RESUMEN

Se ha demostrado que existen bacterias con la capacidad de hidrolizar urea, las
cuales pueden propiciar las condiciones adecuadas para la precipitacin de CaCO3.
Esto sugiere que pueden ser utilizadas en la restauracin de estructuras de concreto.
La mayora de las bacterias utilizadas para estos estudios son del genero Bacillus. Este
estudio se realiz el aislamiento de cepas en la Regin Lagunera con actividad
ureoltica, se observ su crecimiento, la cantidad de protena extracelular e
intracelular producida y la actividad enzimtica, en orden de obtener una
aproximacin del potencial de las cepas nativas para esta aplicacin.

INTRODUCCIN

La biomineralizacin es un proceso complejo que se presenta de manera natural
gracias a distintas bacterias. Por ejemplo Bacillus pasteurii, Shewanella sp, Bacillus
sphaericus, Bacillus pseudofirmus y Bacillus cohnii, las cuales segn resumieron
Narayanasamy et al. en el 2010, tienen la capacidad de precipitar CaCO3 gracias a la
enzima ureasa (EC 3.5.1.5). La formacin natural del CaCO3 se da cuando la urea es
desdoblada por la enzima ureasa, convirtindola en 2 moles de amoniaco y 1 mol de



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CO2, propiciando un medio alcalino que en presencia de iones Ca
+2
da lugar al
compuesto:

Ca
2+
+ Cell Cell-Ca
2+

Cl
-
+ HCO
3
-
+ NH
3
NH
4
Cl + CO
3
2-

Cell-Ca
2+
+ CO
3
2-
Cell-CaCO
3


La ureasa producida por la actividad bacteriana puede inducir la precipitacin de
CaCO3, el cual puede ser utilizado como sellador para reparar crack y fisuras en
estructuras, formaciones de granito y concreto como mencionaron Gollapudi et al.
(1995) y Ramachandran et al. (2001). Dicho efecto puede proponerse como alternativa
para la restauracin y/o mantenimiento de edificios.

Experimental

Se manejaron de inicio 24 cepas aisladas de distintas reas de construccin (Tabla 1)
en dos medios de cultivo diferentes; el medio B4 propuesto por Boquet et al. (1973) y
en medio UreaCaCl2 descrito por StocksFische et al. (1999).

TABLA 1
LUGARES DE MUESTREO PARA EL AISLAMIENTO DE LAS CEPAS UREOLTICAS
Nomenclatura Lugar de toma de muestra Tipo de muestra
L1 Construccin de FAFF (suelo profundo) Arena/Piedras
L2 Construccin de FAFF (superficie) Arena/Piedras
L3 Cemento utilizado en Ingeniera Civil Piedras
L4 Ciudad Universitaria Suelo



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El rastreo de la Actividad Ureasa fue determinado utilizando Medio Lquido Urea
(Extracto de carne 0.1 gr, Fosfato Monobsico de Potasio 9.1 gr, Fosfato Dibsico de
Potasio 9.1 gr, Urea 20 gr, Rojo Fenol 0.01 gr por litro) y Caldo Urea (Merck)
previamente preparado. En el caso del Medio Lquido Urea se sustituy el Rojo Fenol
por Bromotimol Blue en la misma concentracin. Se realizaron pruebas para medir
crecimiento, protena cruda, protena celular y actividad enzimtica a las 6 cepas que
mostraron mejor actividad en el rastreo en medio lquido UreaCaCl2 utilizando
como control un testigo sin inocular.

Medicin de Protena extracelular y Protena celular por Mtodo Bradford (1976)

Se centrifugaron 1.5 ml de medio de cultivo inoculado de cada matraz durante 20 min
a 10000 rpm. En un tubo de ensaye se colocaron 500l del sobrenadante obtenido y se
le aadi 2500l de reactivo Bradford y fue ledo en el espectrofotmetro UV
(Gnesis 10 uv) a 595 nm como protena extracelular. Al pellet resultante de la
centrifugacin se le agregaron 500l de NaOH a 0.1 M y se puso a bao mara por 10
min. Al terminar se centrifug por 20 min a 10000 rpm y se tomaron 500l, los cuales
se colocaron en un tubo de ensaye con 2500l de reactivo Bradford. La muestra se
ley en el espectrofotmetro UV a 595 nm obteniendo la protena celular. Se utiliz
agua destilada y Reactivo Bradford como blanco para ambas mediciones.

Ensayo de Actividad Ureasa (Natarajan, 1995)

Se tomaron 10 l de extracto extracelular y se diluy 100 veces. Se tomaron 10 l en
un tubo de ensaye con 10 l de solucin urea a 0.01M como sustrato, completando a 1
ml con agua destilada. Las muestras as preparadas se incubaron por 5 min a 30 C.
En seguida se les aadieron 2 ml de Hipoclorito de Sodio (5%) y 2 ml de
Nitroprusiato de Fenol, incubando la mezcla a 5060 C durante 10 min. Despus se



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agit utilizando el vortex y se ley en el espectrofotmetro UV a 630 nm. El blanco
(agua destilada) fue tratado de la misma manera que la muestra.
Aparte se realiz un anlisis de Protena celular despus de emplear
ultrasonicacin (Ultrasonic Processor, Cole Parmer, US) para propiciar la lisis celular. Se
aplic pulsing de 20 segundos de trabajo con 10 segundos de descanso por 3 minutos.
Y se aplicaron dos ciclos a cada cepa. Posteriormente esta protena se emple para un
ensayo de Actividad Enzimtica. El crecimiento diario fue determinado en el
espectrofotmetro UV a 600 nm, solo que en este caso se utiliz como blanco el control
sin inocular. Tambin se realizaron Tinciones de Gram.

RESULTADOS

Se evaluaron 24 cepas, de las cuales se seleccionaron las 6 que presentaron la mayor
actividad ureasa durante la prueba de rastreo Dichas cepas son: ACRN1 (L2), ACRN2
(L1), ACRN3 (L2), ACRN4 (L2), ACRN5 (L1) y ACRN6 (L2). Todas las cepas alcanzaron el
final de si fase exponencial a las 24 horas, y en su mayora decayeron luego de tres
das (Figura 1). A diferencia de la cepa ACRN6, la cual se mantuvo en una fase
estacionaria an a los tres das. Sin embargo, la cepa ACRN6 no creci en las
cantidades que sus contrapartes, la cepa ACRN4 fue la que demostr una generacin
de biomasa superior (Figura 1).
De acuerdo a los resultados de Protena Extracelular (Figura 2) la mayora de las
cepas ACRN2, ACRN6, ACRN5 y ACRN3 alcanzaron un incremento en la generacin de
protena a las 24 horas de incubacin a 35 C, lo que sugiere una actividad rpida. En
el caso de la cepa CRN1 la protena extracelular fue inducida luego de dos das,
mientras que en la ACRN4 esto sucedi hasta los cuatro das. En cuanto a Protena
celular, las cepas ACRN1 y ACRN6 son las que posean la mxima concentracin inicial,



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de 0.168 mg/ml ambas. La cepa ACRN1 redujo su cantidad de protena en un 41.66%,
mientras que la cepa ACRN6 redujo un 23.8%.

Figura 1. Crecimiento celular de las cepas ureolticas aisladas.












Figura 2. Protena extracelular (lneas) y protena celular (barras) de las cepas ureolticas.
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
0.045
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
P
r
o
t
e

n
a

c
e
l
u
l
a
r

(
m
g
/
m
l
)
P
r
o
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n
a

e
x
t
r
a
c
e
l
u
l
a
r

(
m
g
/
m
l
)
Dias
ACRN1 ACRN2 ACRN3 ACRN4 ACRN6 ACRN5
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
A
b
s
Dias
ACRN 1 ACRN 2 ACRN 3 ACRN 6 ACRN 4 ACRN 5
Crecimiento.



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Figura 3. Actividad Enzimtica Ureoltica de las cepas aisladas (mol/ml).

Los resultados de Actividad Enzimtica muestran que con excepcin de la cepa
ACRN5 todas las dems alcanzan su mayor actividad luego de 24 horas (Figura 5). La
mejor cepa en este sentido fue la ACRN6, que alcanz una actividad de 37.35 mol/ml,
casi un 50% superior a la cepa con la siguiente mejor actividad, la ACRN3.
Al terminar las 72 h de incubacin a 4 cepas (ACRN1, ACRN4, ACRN5 y ACRN6) se
les midi la Actividad Enzimtica de protena celular. Al contrario de extracelular, en
este ensayo la cepa ACRN4 evidenci mejor actividad que las dems, seguida por
ACRN1, ACRN5 y finalmente la ACRN6, la cual muestro mejor actividad ureolitica
extracelular. Las pruebas de Gram establecen que la mayora de las cepas (dos por
determinar) poseen forma baciliar (Tabla 2).




0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

m
o
l
/
m
l
Dias
ACRN1 ACRN2 ACRN3 ACRN4 ACRN6 ACRN5



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TABLA 2
CARACTERSTICAS DE LAS CEPAS UREOLTICAS AISLADAS
N/D: no determinado.

CONCLUSIONES

La cepa ACRN4 mostr hidrlisis de 18.676 mol de urea en 24 h de incubacin; a su
vez mantuvo un alto porcentaje de protena extracelular y celular en las mismas 24 h,
as como en la Actividad Enzimtica de protena celular, pudiendo sugerir que esta
cepa produce la enzima Ureasa tanto de manera extracelular como intracelular. Son
necesarias ms pruebas para determinar con certeza la actividad de la cepa ACRN4, y
demostrar que efectivamente posee una alta capacidad de desdoblar la urea.

BIBLIOGRAFA

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Cepa Gram caracter Morfologa celular
ACRN 1 + Bacilo
ACRN 2 + Bacilo
ACRN 3 + Bacilo
ACRN 4 + N/D
ACRN 5 + Bacilo
ACRN 6 + N/D



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