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CHAPTER 9

DEFINEN MEDIOS Y SUPLEMENTOS


9.1 DESARROLLO DE MEDIOS DE COMUNICACIN

Intentos iniciales de clulas en cultivo se realizaron en natural medios de comunicacin basados
en extractos de tejidos y uidos del cuerpo, tales como chica. Extracto de embrin, suero, linfa,
etc.. Con la propagacin del lneas celulares, la demanda de grandes cantidades de un medio de
calidad ms consistente que condujo a la introduccin de qumicamente definido los medios de
comunicacin basados en anlisis de cuerpo uids y bioqumica nutricional. Medio Basal del guila
[guila, 1955] y, posteriormente, un medio esencial mnimo del guila (MEM) [guila, 1959] lleg a
ser ampliamente adoptado, vario suplementado con protena becerro, humanos o suero de
caballo, hidrolizados y Extracto de embrin. Como clula ms continua las lneas se convirtieron
disponibles (elucin de L929 clulas, HeLa, etc.), era evidente que estos medios eran
perfectamente adecuados para la mayora de esas lneas y la mayora de los desarrollos
posteriores fueron encaminadas a la sustitucin del suero (vase seccin 10.2), optimizando los
medios para diferentes tipos de clulas (por ejemplo, RPMI 1640 para linfoblastoides lneas
celulares), o la modificacin de las condiciones especficas (por ejemplo, Leibovitz L15 para
eliminar la necesidad de adicin de CO2 y NaHCO3) [Leibovitz, 1963].
Aislamiento y propagacin de las clulas de un linaje especcas puede requieren un medio libre
de suero selectivo (ver seccin 10.2.1), mientras que las clulas cultivadas para la formacin de
productos, como anfitriones para propagacin viral, o para los estudios moleculares no-celular-
especficas dependen principalmente del guila de MEM [guila, 1959], Dulbecco s modificacin
del medio del guila, DMEM [Dulbecco & Freeman, 1959], o, cada vez ms, RPMI 1640 [Moore et
al., 1967], suplementado con suero. Sin embargo, muchos tcnicas de produccin a escala
industrial ahora usan libre de suero medios de comunicacin, para facilitar el procesamiento
descendente y reducir el riesgo de agentes infecciosos adventicios (vase la seccin 10.1). A
compromiso popular para muchos laboratorios es una mezcla de un medio complejo, como el F12
de jamn [jamn, 1965], con una con mayor aminocido y las concentraciones de vitaminas, tales
como DMEM. Esta alternativa horroriza a los puristas, pero lo hace generar un medio til, multiuso
para cultivo primario como as como la propagacin de la lnea celular. En este captulo se
concentra en los principios generales de composicin media, usando el serumsupplemented
ampliamente utilizado los medios de comunicacin como ejemplos y captulo 10 se centrarn en el
diseo y uso de los medios sin suero.

9.2 PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE

9.2.1 pH

La mayora de las lneas celulares crecen bien a pH 7,4. Aunque el ptimo pH para el crecimiento
celular vara relativamente poco entre diferentes cepas celulares, algunas lneas de fibroblastos
normales realizan mejor a pH 7.47.7 y las clulas transformadas pueden hacerlo mejor en pH
7.07.4 [guila, 1973]. Se inform que podran ser clulas epidrmicas mantenido a pH 5.5
[Eisinger et al., 1979], pero este nivel tiene No han adoptado universalmente. En casos especiales
puede resultar ventajoso hacer un crecimiento breve experimento (ver protocolos 21,7 y 21,8),
ensayo de eficacia de chapado (vase seccin 21,10), o anlisis de funcin especial (por ejemplo,
vase seccin 17,7) para determinar el pH ptimo. Rojo de fenol se utiliza comnmente como un
indicador. Es de color rojo en pH 7,4 y se convierte en naranja a pH 7,0, amarillo a pH 6.5, limn
amarillo debajo de pH 6,5, ms rosa en pH 7.6 y prpura a pH 7.8 (ver placa 22b). Porque es la
evaluacin del color altamente subjetivo, es til componer un conjunto de normas con rojo de
fenol en una solucin salina equilibrada estril (BSS) la concentracin correcta, en el mismo tipo
de botella, con la mismo espacio para el aire, que normalmente utilizas para preparar un medio. El
siguiente ejemplo se utilizar la cultura 25-cm2 frascos como los receptculos del finales y puede
ser utilizado en conjuncin con ejercicio 8.

PROTOCOLO 9.1. PREPARACIN de pH

ESTNDARES

Materiales
Estril:
Una solucin salina equilibrada de Hanks (HBSS) o del guila
MEM, concentrado 10, sin bicarbonato o glucosa, con 20 mM HEPES............... . 10 mL
Agua ultrapura (UPW)............... 90 mL
1 N NaOH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 mL
Envases universales, 30 mL........... 7
Frascos de cultivo, 25 cm2................. 7
Puntas de pipeta, 100 L
No estril: medidor de pH
Pipeta, 10 L
Protocolo
1. haga la HBSS o medio a pH 6,5 o inferior, y distribuir 10 mL en cada uno de siete aos con la
etiqueta envases universales.
2. deje que se equilibren con aire durante 30 minutos.
3. ajustar el pH en los envases separados a 6.5,
6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6 y 7.8 con 1 N NaOH, usando un medidor de pH.
4. filtro esterilizar 5 mL cada HBSS en separado frascos etiquetados (vase protocolo 11.11),
utilizando la primera
5 ml para purgar el filtro, antes de recoger la segundo 5 mL en el matraz.
5. Tape los frascos firmemente.


9.2.2 CO2 y bicarbonato

Dixido de carbono en la fase gaseosa se disuelve en el medio,vestablece equilibrio con HCO3
Los iones y disminuye el pH.

Porque disuelto CO2, HCO3 y el pH son todos interrelacionados, es difcil determinar el principal
efecto directo del CO2. La tensin de CO2 atmosfrica regular la concentracin de disuelto CO2
directamente, en funcin de la temperatura. El presente Reglamento, a su vez produce H2CO3,
que disocia segn la reaccin.

H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3 (1)
HCO3
tiene una constante de disociacin bastante baja con la mayora de los cationes disponibles as
que tiende a reasociar, dejando el medio cido. El resultado neto de aumento de CO2 atmosfrico
es a deprimir el pH, as que es el efecto de la elevada tensin de CO2 neutralizado por el aumento
de la concentracin de bicarbonato:
NaHCO3 Na+ + HCO3 (2)

El aumento de HCO3- concentracin configuracin la ecuacin (1) a la izquierda hasta el equilibrio
se alcanza un pH de 7,4. Si otro lcali (por ejemplo, NaOH) se utiliza en lugar de ello, el resultado
neto es el mismo:
NaOH + H2CO3 NaHCO3 + H2O Na+ +HCO3 + H2O (3)

Las concentraciones de NaHCO3 equivalentes usadas con CO2 diferentes tensiones aparecen en
las tablas 9.1, 9.2, y 9.3. Valores intermedios de CO2 y HCO3 puede utilizar, siempre que la
concentracin de ambos es muy variada proporcionalmente. Porque muchos medios de
comunicacin se componen de cido solucin y puede incorporar un buffer, es difcil predecir
Cunto bicarbonato para utilizar cuando otro lcali puede tambin terminan como bicarbonato,
al igual que en la ecuacin (3). Cuando prepare un nuevo medio por primera vez, aadir la
cantidad especificada de bicarbonato y luego suficiente 1 N NaOH tal que el medio equilibra el pH
deseado despus de la incubacin en una placa de Petri a C 37, en la correcta concentracin de
CO2, durante la noche. Al tratarse de un medio que ya est en trabajando la fuerza, variar la
cantidad de HCO3 para adaptarse a la fase gaseosa (ver tabla 9.1) y dejar el medio de la noche
para equilibrar a 37C. Cada medio tiene un recomendado concentracin de bicarbonato y la
tensin de CO2 para el logro de la correcta pH y la osmolalidad, pero las variaciones menores se
producirn en diferentes mtodos de preparacin.

Con la introduccin de los bferes del bien (por ejemplo, HEPES, Tricina) [bien et al., 1966] en cultivo de
tejidos, haba
algunas especulaciones que, como CO2 ya no era necesario estabilizar el pH, puede ser omitido.
Esto prob ser falso [Itagaki & Kimura, 1974], al menos para un gran nmero tipos de clulas,
particularmente en las concentraciones de bajos de clulas. Aunque 20 mM HEPES puede
controlar pH dentro de los fisiolgicos gama, la ausencia de CO2 atmosfrico permite la ecuacin
(1) para mover a la izquierda, eliminando finalmente disuelto CO2, y en ltima instancia, HCO3,
del medio. Esta cadena de eventos aparece limitar el crecimiento de la clula, aunque si el las
clulas requieren el CO2 disuelto o el HCO3 (o ambos) No est claro. HCO3 recomendada , CO2
y HEPES las concentraciones se dan en la tabla 9.1.

Permite la inclusin de piruvato en el medio clulas para aumentar su produccin endgena de
CO2, hacindolos independientes de CO2 exgeno, as como HCO3. Leibovitz L15 medio
[Leibovitz, 1963] contiene una mayor concentracin de piruvato sdico (550 mg/L) pero carece de
NaHCO3 y no requiere de CO2 en la fase gaseosa. Almacenamiento en bfer se obtiene mediante
la relativamente alta concentraciones de aminocidos. Porque no requiere CO2, L15 a veces se
recomienda para el transporte de las muestras de tejido. -glicerofosfato de sodio puede tambin
utilizarse para amortiguar autoclavable medios carecen de CO2 y HCO3 *Waymouth, 1979+ y
Invitrogen comercializa un CO2- medio independiente. Si la eliminacin de CO2 es importante para
ahorrar costos, conveniencia o por otras razones, puede serVale la pena considerar una de estas
formulaciones, pero slo despus de realizar una prueba apropiada.

En suma, las culturas en abran vasos necesitas ser incubadas en una atmsfera de CO2, la
concentracin de los cuales est en equilibrio con el bicarbonato de sodio en el medio (ver tablas
9.1, 9.2 y 9.3). Las clulas en moderadamente alta concentraciones (1 105 clulas/mL) y crecido
en sellado frascos no necesitan CO2 aadida a la fase gaseosa, proporcionado que la
concentracin de bicarbonato se mantiene baja (4 mM), especialmente si las clulas son
productores de cido altos. En baja de la clula concentraciones, sin embargo (por ejemplo,
durante la clonacin) y con algunos cultivos primarios, es necesario aadir CO2 al gas fase de
frascos sellados. Cuando sea necesaria, para permitir la ventilacin el equilibrado de CO2 o su
escape en alto cido los productores, es necesario dejar la holgura del casquillo o usar un Tapa
permeable al CO2 (ver Fig. 8.8).

9.2.3 Almacenamiento en bfer

Medios de cultivo debe ser protegido bajo dos conjuntos de condiciones: (1) Abra platos, en
donde la evolucin de CO2 provoca la pH a subir (consulte Seccin 9.2.2) y (2) sobreproduccin de
CO2 y cido lctico en lneas celulares transformadas en clulas alta concentraciones, cuando el
pH se caer. Puede ser un bfer incorporado en el medio para estabilizar el pH, pero en (1)
exgeno CO2 todava puede ser requerido por algunas lneas celulares, particularmente en las
concentraciones de baja de la clula, para evitar la prdida total de CO2 disuelto y bicarbonato del
medio. A pesar de su escasa capacidad de almacenamiento en bfer en bicarbonato pH fisiolgico
tampn todava se utiliza con ms frecuencia que cualquier otro buffer debido a su baja toxicidad,
bajo costo y beneficio nutricional a la cultura. HEPES es un buffer mucho ms fuerte en el rango de
pH 7.27.6 y se utiliza en 10-20 mM. Ha sido encontr que, cuando se usa HEPES con CO2
exgenos, la HEPES concentracin debe ser ms del doble de la bicarbonato para el adecuado
almacenamiento en bfer (vase tabla 9.1). Una variacin de F12 de jamn con 20 mM HEPES,
bicarbonato de 10 mM, y 2% CO2 se ha utilizado con xito en laboratorio del autor para el cultivo
de un nmero de diferentes lneas celulares. Permite el manejo de titulacin y otras placas de
pocillos fuera de la incubadora sin un aumento excesivo en el pH y minimiza la necesidad de
HEPES, que es txico y caro.
9.2.4 oxgeno

El otro importante constituyente principal de la fase gaseosa es oxgeno. Considerando que la
mayora de las clulas requiere oxgeno para la respiracin las clulas cultivadas, en vivo a menudo
se basan principalmente en la gluclisis, una alta proporcin de los cuales, al igual que en las
clulas transformadas, puede ser anaerobios. Aunque ha habido intentos de incorporar
Portadores de O2, por analoga con la hemoglobina en la sangre, an esta prctica no es de uso
general, y las clulas dependen principalmente de disuelto O2, que pueden ser txicos debido a la
elevacin en el nivel de los radicales libres. Proporcionar la correcta tensin de O2 es, por lo tanto,
siempre un compromiso entre el cumplimiento de la requisito respiratorio y evitar la toxicidad.
Estrategias O2 reducida y elevadas que implican los niveles han sido empleado, como la
incorporacin de depuradores de radicales libres, como el glutatin, 2-Mercaptoetanol (-
mercaptoetanol) o Ditiotreitol, en el medio. La mayora de esas estrategias han han derivado
empricamente.

Las culturas varan en sus requerimientos de oxgeno, la mayor distincin entre rgano y cultivos
celulares. Aunque las tensiones de oxgeno atmosfrico o inferior [Cooper et al., 1958; Balin et al.,
1976] son preferibles para la mayora de las culturas de clula, algunos cultivos de rganos,
particularmente de embriones en fase tarda, los recin nacidos, o adultos, requiere hasta un 95%
O2 en la fase gaseosa [Trowell, 1959; De Ridder & Mareel, 1978]. Este requisito para un alto nivel
de O2 puede ser un problema de difusin relacionadas con la geometra y la penetracin gaseosa
de cultivos de rganos (ver seccin 25.2.1) pero tambin puede reflejar la diferencia entre las
clulas diferenciadas y rpidamente proliferantes. Oxgeno difusin tambin puede ser limitante
en poroso microcarriers [Preissmann et al., 1997] (vase tambin seccin 26.2.4).

Ms cultivos de clulas dispersas prefieren ms bajas tensiones de oxgeno, y algunos sistemas
(por ejemplo, clulas tumorales humanas en clonogenic ensayo [Courtenay et al., 1978] y pulmn
embrionario humano los fibroblastos [Balin et al., 1976]) hacerloen mejor menos de la nivel
normal de la tensin de oxgeno atmosfrico. McKeehan et al [1976] sugiri que el requisito para
el selenio en medio est relacionada a la toxicidad del oxgeno, como el selenio es un cofactor en
la sntesis de glutatin. Tolerancia de oxgeno y selenio como Bueno pueden ser
proporcionados por suero, as que el control de O2 la tensin es probable ser ms crtica en los
medios sin suero.

Porque puede influir en la profundidad del medio de cultivo la tasa de difusin de oxgeno a las
clulas, es aconsejable Mantenga la profundidad del medio en el rango de 2 a 5 mm (0,5 mL/cm2)
en cultura esttica. Algunos tipos de clulas, por ejemplo, epitelio bronquial y keratinocytes,
crecidos en filtro bien insertos, parecen distinguir mejor cuando coloca en el AirLiquid interfaz
(vase la seccin 25.3.6).

9.2.5 Osmolalidad

Las clulas ms cultivadas tienen una tolerancia bastante amplia para osmtica presin
[Waymouth, 1970]. Como la osmolalidad del ser humano el plasma es de 290 mosmol/kg, es
razonable suponer que que este nivel es el ptimo para las clulas humanas in vitro, Aunque
puede ser diferente de otras especies (por ejemplo, alrededor de 310 mosmol/kg para los ratones
[Waymouth, 1970]). En la prctica, osmolalidades suero entre 260 mosmol/kg y 320 mosmol/kg
son bastante aceptables para la mayora de las clulas pero, una vez seleccionado, debe se
mantuvo consistente en 10 mosmol/kg. Ligeramente hipotnica medio puede ser mejor para la
placa de Petri o cultura abierta-placa compensar la evaporacin durante la incubacin.

Osmolalidad se mide generalmente por la depresin de la congelacinpunto (Fig. 9.1) o elevacin
de la presin de vapor, de la medio. Un control til es la medicin de la osmolalidad.
Si usted se ha puesto encima de la media, como un paso ayuda a proteger contra errores en el
pesaje, dilucin, etc.. Lo es particularmente importante para monitorear la osmolalidad si las
alteraciones se realizan en la Constitucin del medio. La adicin de HEPES y drogas disuelven en
cidos fuertes y bases y sus posteriores neutralizaciones todos marcadamente afectan la
osmolalidad.

9.2.6 Temperatura

Depende de la temperatura ptima para el cultivo celular (1) la temperatura del cuerpo del
animal de la cual las clulas se obtuvieron, (2) cualquier variacin anatmica de la temperatura
(por ejemplo, la temperatura de la piel y el testculo puede ser inferior que la del resto del cuerpo)
y (3) la incorporacin de un factor de seguridad para permitir errores menores en la regulacin la
incubadora. Por lo tanto la temperatura recomendada para la mayora lneas celulares animales
humanos y sangre caliente est 37C, cerca de calor del cuerpo, pero establece un poco menor
para la seguridad, como sobrecalentamiento es un problema ms grave que el calentamiento
insuficiente.

Debido a la temperatura del cuerpo mayor en las aves, aviar Las clulas deben ser mantenidas a
38,5 C para el crecimiento mximo, pero van a crecer bastante satisfactoria, aunque ms
lentamente, a 37 C. Clulas de mamfero cultivadas tolerarn gotas considerables de la
temperatura, puede sobrevivir varios das a 4 C, y puede ser congelada y se enfri a -196 C
(vase el Protocolo 20,1), pero no puede tolerar ms de aproximadamente 2 C por encima de lo
normal (39,5 C) durante ms de unas pocas horas y va a morir muy rpidamente a 40 C y otra
vez.

Se debe prestar atencin a la consistencia de la temperatura (dentro de 0,5 C) para asegurar
resultados reproducibles. Puertas de incubadoras o salas calientes no se debe dejar abierta ms
de elementos o volmenes necesarios, y grandes de lquido, ubicados en el habitacin caliente al
calor, no se debe poner el aparato cerca de las culturas. la distribucin espacial de la temperatura
dentro de la incubadora o caliente habitacin tambin debe ser uniforme (vanse las secciones
4.4 y 5.3); hay debe haber puntos fros'''', y el aire debe circular libremente. Esto significa que un
gran nmero de matraces no debe ser apilado junto al primer puesto en la incubadora o sala
caliente; espacio se debe permitir entre ellas para que circule el aire. Como el gas fase dentro de
matraces se expande a 37 matraces de C, en particular cuando apilada, debe ser ventilado
aflojando brevemente la tapa 30 min a 1 h despus de la colocacin de los matraces en la
incubadora.

Poikilotermos (animales de sangre fra que no regulan el calor de la sangre dentro de lmites
estrechos) tolera una temperatura amplia rango, entre 15 C y 26 C. Simulacin en vivo
condiciones (por ejemplo, para los peces de agua fra) pueden requerir una incubadora con
refrigeracin y calefaccin, para mantener la incubadora temperatura inferior a la ambiente. Si es
necesario, los animales poikilothermic las clulas se pueden mantener a temperatura ambiente,
pero el la variabilidad de la temperatura ambiente en laboratorios hace este indeseable, y una
incubadora enfriada es preferible.
Un nmero de lneas de clulas mutantes termosensibles (ts) se han desarrollado que permiten la
expresin de especficas genes debajo de una temperatura de ajuste, pero no sobre ella [Su et
al.,1991; Foster & Martin, 1992; Wyllie et al., 1992]. Estos los mutantes facilitan estudios sobre la
regulacin de la clula, pero tambin enfatizan la gama estrecha dentro de los cuales uno puede
funcionar, como los dos discriminar las temperaturas son generalmente solamente sobre 23C
Apart. El uso de mutantes ts generalmente requiere una incubadora con refrigeracin y
calefaccin, para compensar un clido la temperatura ambiente.

Aparte de su efecto directo sobre el crecimiento celular, la temperatura tambin influir el pH
debido a la mayor solubilidad del CO2 a temperaturas ms bajas y, posiblemente, debido a
cambios en ionizacin y el pKa de la memoria intermedia. El pH debe ser ajustado a la baja en la
temperatura que en 0,2 unidades 37C. en la preparacin de un medio por primera vez, es mejor
para hacer subir el medio completo e incubar una muestra noche en 37C bajo la tensin correcta
del gas, a fin de Compruebe el pH (ver seccin 9.2.2 y placa 22b).
9.2.7 viscosidad

La viscosidad del medio de cultivo est influenciada principalmente por el suero de contenido y en
la mayora de los casos tendr poco efecto sobre la clula crecimiento. Viscosidad se vuelve
importante, sin embargo, cuando una suspensin celular se agita (por ejemplo, cuando una
cultura de suspensin se agita) o cuando las clulas son disociadas despus tripsinizacin.
Cualquier dao celular que se produce en estas condiciones puede reducirse por el aumento de la
viscosidad del medio con carboximetilcelulosa (CMC) o polivinilpirrolidona (PVP) [Cherry &
Papoutsakis, 1990; vase tambin el apndice I]. Esto llega a ser particularmente importante en
las concentraciones bajas de suero, en ausencia de suero y en las culturas bioreactor agitado
(vase Seccin 26.1), en el cual Pluronic F68 es de uso frecuente, aunque su efecto es
probablemente multifactorial.

9.2.8 tensin de superficie y espuma

No se han definido claramente los efectos de la espuma, pero la puede aumentar la tasa de
desnaturalizacin de la protena, como el riesgo de contaminacin si la espuma alcanza el cuello
de la cultura nave. Espuma tambin limitarn difusin gaseosa si una pelcula de una espuma o
derrames entra en el espacio capilar entre el tapn y la botella, o entre la tapa y la base de un
plato de Petri.

Espuma puede surgir en las culturas de la suspensin en los vasos agitador o Biorreactores al 5%
de CO2 en el aire es burbujeado por medio con suero. La adicin de un Antiespumante de silicona
(Dow Chemical) o Pluronic F68 (Sigma), ayuda 0.010.1%, evitar la formacin de espuma en esta
situacin reduciendo la tensin superficial y tambin puede proteger las clulas contra la tensin
de esquileo de burbujas. No debe ser burbujas de CO2 a travs del medio cuando un frasco de
burbujeo ya que esto puede generar una espuma y tambin puede propagar aerosol del frasco

9.3 SOLUCIONES DE SAL EQUILIBRADAS

Una solucin salina equilibrada (BSS) se compone de sales inorgnicas y puede incluir bicarbonato
de sodio y, en algunos casos, glucosa. Las composiciones de sal comn equilibrado las soluciones
se dan en la tabla 9.2. Buffer HEPES (5-20 mM) pueden agregarse a estas soluciones si es necesario
y el equivalente cantidad de NaCl se omite mantener la osmolalidad correcta. BSS constituye la
base de muchos medios de comunicacin completas y comercial proveedores proporcionarn del
guila MEM con las de madejas sales [Hanks & Wallace, 1949] o del guila MEM con Earle sales
[Earle et al., 1943], indicando que formulacin BSS se utiliz; Sales de Hanks implicara el uso de
frascos sellados con una fase de gas de aire, mientras que las sales de Earle implicara un mayor
concentracin de bicarbonato compatible con el crecimiento en 5% de CO2.

BSS tambin se utiliza como diluyente para concentrados de aminocidos los cidos y las vitaminas
para hacer los medios completos, como una isotnica lavado o diseccin mediana y para
incubaciones cortas para arriba a aproximadamente 4 h (generalmente con glucosa presente).
Recetas de BSS a menudo modificado por ejemplo, omitiendo la glucosa o fenol rojo de Hanks
es BSS o dejando salir Ca2 + o Mg2 + iones de PBS de Dulbecco [Dulbecco & Vogt, 1954]. PBS sin
Ca2 + y Mg2 + es conocido como solucin de PBS A, y a lo largo de este libro se utilizar la
Convencin D-PBSA para indicar la ausencia de estos cationes divalentes. Uno debe Compruebe
siempre que las modificaciones en la compra de BSS y debe citar las modificaciones a la frmula
Publicada en informes y publicaciones.

La eleccin de BSS depende tanto la tensin de CO2 (consulte Seccin 9.2.2 y tablas 9.1 y 9.2) y la
intencin uso de la solucin para la disgregacin del tejido o monocapa dispersin; en estos casos
se omiten generalmente Ca2 + y Mg2 +, al igual que en solucin salina libre de calcio y magnesio
[1952] de Moscona (CMF) o D-PBSA (vase la tabla 9.2). Tambin est la opcin de BSS onwhether
dependiente del solutionwill ser utilizado para la suspensin cultivo de clulas adherentes. S-
MEM, basado en la ruleta del guila solucin de sal, es esencial una variante del mnimo [1959] del
guila medio que es deficiente en Ca2 + para reducir de la clula agregacin y accesorio (vase
tabla 9.2). HBSS, EBSS y PBS dependen de la relativamente dbil tampn de fosfato, que no est
en su ms eficaz a pH fisiolgico. Paul [1975] construye un tampn Tris BSS que es ms eficaz, pero
que a veces las clulas requieren un perodo de adaptacin. HEPES (10-20 mM) es Actualmente el
buffer ms eficaz en el rango de pH 7.27.8, y la gama de tricino en el 7.48.0 de pH, aunque
ambos tienden a ser caro si se utiliza en grandes cantidades.

9.4 MEDIOS COMPLETO

El medio de trmino completo implica un medio que ha tenido todos sus componentes y
suplementos aadidos y es suficientes para el uso especificado. Generalmente se compone de un
definido componente medio, algunos de los componentes de los cuales, como la glutamina, puede
aadirse justo antes del uso y varios suplementos, tales como suero, factores de crecimiento u
hormonas. Gama de medios definidos en complejidad, desde la relativamente simple MEM
[guila, 1959], que contiene aminocidos esenciales del guila cidos, vitaminas y sales, a medios
complejos como medio 199 (M199) [Morgan et al, 1950], CMRL 1066 [Parker et al., 1957], 752/1
[Waymouth, 1959], RPMI 1640 MB [Moore et al., 1967] y F12 [jamn, 1965] (tabla 9.3) y una
amplia gama de formulaciones sin suero (ver tablas 10.1 y 10.2). Los medios complejos contienen
un nmero ms grande de diferentes aminocidos, incluyendo los aminocidos los cidos y las
vitaminas adicionales y son a menudo complementada con metabolitos adicionales (por ejemplo,
nuclesidos, cido tricarboxlico ciclo de intermedios y lpidos) y minerales. Nutrientes las
concentraciones son, en general, bajo en F12 (que era optimizado por clonacin) y alta en
modificacin de Dulbecco del guila MEM (DMEM) [Dulbecco & Freeman, 1959; Morton, 1970],
optimizado con densidades superiores de la clula para viral propagacin. Barnes y Sato [1980]
utilizan una mezcla 1:1 de DMEM y F12 como base para sus formulaciones libre de suero para
combinar la riqueza de F12 y el mayor nutriente concentracin de DMEM. Aunque no siempre del
todo racional, esta combinacin ha proporcionado una frmula emprica es adecuado como un
medio bsico para la suplementacin con aditivos especiales para muchos diferentes tipos de
clulas.
9.4.1 aminocidos

Los aminocidos esenciales (es decir, aquellos que no son sintetizados en el cuerpo) son
requeridos por las clulas cultivadas, adems de cistina o cistena, arginina, glutamina y tirosina,
aunque necesidades individuales de aminocidos varan de uno tipo de la clula a otra. Otros
aminocidos no esenciales son a menudo se agregan, para compensar tanto para una celda
determinada incapacidad del tipo para hacerlos o porque estn hechas, Pero perdi por fugas en
el medio. La concentracin de los aminocidos generalmente limita la concentracin mxima de la
clula alcanzable, y el equilibrio puede influir en la supervivencia celular y tasa de crecimiento.
Glutamina es requerido por la mayora de las clulas, aunque algunas lneas celulares utilizar
glutamato; la evidencia sugiereglutamina tambin es utilizado por las clulas cultivadas como
fuente de energa y carbono [Butler Christie &, 1994; vase tambin la seccin 3.6]. GlutaMAX
(Invitrogen) es un dipptido alanil-glutamina que es ms estable que la glutamina.

9.4.2 vitaminas

Del guila MEM contiene slo las vitaminas solubles en agua (las Grupo B, adems de colina, cido
flico, inositol y nicotinamida, pero excluyendo biotina; ver tabla 9.3); otros requisitos
presumiblemente se derivan del suero. La biotina est presente en la mayora de los medios de
comunicacin ms complejas, incluyendo la serumfree recetas y cido p-aminobenzoico (PABA)
est presente en M199, CMRL 1066 (que deriva de M199), y RPMI 1640. Todas las vitaminas
liposolubles (A, D, E y K) Slo estn presentes en M199, considerando que la vitamina A est
presente en LHC-9 y la vitamina E en MCDB 110 (vase tabla 10.1). Algunas vitaminas (por ej.,
colina y Nicotinamida) han aumentado concentraciones en medios sin suero. Limitacin de
vitamina para ejemplo, por la precipitacin de folato de caldo concentrado soluciones se
expresa generalmente en trminos de reduccin celular las tasas de supervivencia y crecimiento
en lugar de la densidad mxima de la clula. Como las de los aminocidos, vitamina requisitos
tienen sido derivados empricamente y a menudo se refieren a la clula lnea originalmente
utilizada en su desarrollo; por ejemplo, Fischer medio tiene una concentracin alta de folato
debido al folato dependencia de L5178Y, que fue utilizado en el desarrollo del medio [Fischer &
Sartorelli, 1964].

9.4.3 sales

Las sales son principalmente los de Na +, K +, Mg2 +, Ca2 +, Cl, SO42, PO43 y HCO3 y son los
principales componentes contribuyendo a la osmolaridad del medio. Mayora de los medios deriva
sus concentraciones de sal originaria de Earle (alto bicarbonato; fase gaseosa, 5% de CO2) orHanks
(bicarbonato baja; fase de gas, aire) BSS. Cationes divalentes, particularmente Ca2 +, son
requeridos por algunas molculas de adhesin celular, tales como las caderinas [Yamada & Geiger,
1997]. Ca2 + tambin acta como intermediario en la transduccin de la seal [Alberts et al., 2002]
y la concentracin de Ca2 + en el medio puede influir en las clulas se proliferan o distinguir (ver
las secciones 17.2.2, 23.2.1.) Na +, K + y Cl regular membrana potencial, mientras que SO42,
PO43 y HCO3 tienen funciones como aniones requeridos por la matriz y nutricionales
precursores de macromolculas, as como los reguladores de carga intracelular. Calcio se reduce
en las culturas de suspensin con el fin de minimizar la agregacin celular y accesorio (vase la
seccin 9.3). La concentracin de bicarbonato de sodio es determinada por el concentracin de
CO2 en la fase gaseosa (ver seccin 9.2.2) y tiene un importante papel nutricional adems de su
capacidad de almacenamiento en bfer.
9.4.4 glucosa

Glucosa est incluida en la mayora de los medios como fuente de energa. Es se metaboliza
principalmente por gluclisis a piruvato forma, que se puede convertir en lactato o acetoacetato y
pueden entrar en el ciclo del cido ctrico y se oxida para formar CO2 y agua. La acumulacin de
cido lctico en el medio, particularmente evidente en las clulas embrionarias y transformadas,
implica que el ciclo del cido ctrico puede no funcionar enteramente como lo hace en vivo, y los
datos recientes han demostrado que gran parte de su carbn se deriva de glutamina en lugar de
glucosa. Este hallazgo podra explicar El excepcionalmente alto requisito de algunas clulas
cultivadas para glutamina o glutamato.

9.4.5 suplementos orgnicos

Una variedad de otros compuestos, incluyendo protenas, pptidos, nuclesidos, intermedios del
ciclo de cido ctrico, piruvato, y los lpidos, aparecen en medios complejos. Otra vez, estos
componentes se han encontrado para ser necesario cuando el suero concentracin se reduce, y
pueden ayudar en la clonacin y en el mantenimiento de ciertas clulas especializadas, incluso en
la presencia del suero.

9.4.6 hormonas y factores de crecimiento

Las hormonas y factores de crecimiento no se especifican en las frmulas de los medios ms
habituales, aunque con frecuencia se agregan a medio libre de suero (vanse las secciones 9.5.2,
9.5.3 10.4.2, 10.4.3).

9.4.7 antibiticos

Los antibiticos fueron introducidos originalmente en medios de cultivo a reducir la frecuencia de
la contaminacin. Sin embargo, el uso de campanas de flujo laminar, junto con una tcnica
asptica estricta, los antibiticos hace innecesario. De hecho, los antibiticos tienen un nmero de
desventajas significativas:

(1) estimulan el desarrollo de algunos organismos.
(2) esconden la presencia de bajo nivel, crptico los contaminantes que pueden llegar a ser
plenamente operativos si el los antibiticos son borrados, cambian las condiciones de cultivo, o
desarrollan cepas resistentes.
(3) se pueden ocultar infecciones por micoplasma.
(4) tienen efectos antinutritivos que pueden reaccin cruzada con clulas mamferas.
(5) animan a pobres en condiciones aspticas.

Por lo tanto, se recomienda encarecidamente que la rutina cultura ser realizada en ausencia de
antibiticos y que su uso restringirse al cultivo primario o a gran escala requiere mucho trabajo
experimentos con un elevado coste de los consumibles. Si las condiciones exigir el uso de
antibiticos, entonces ellos deben eliminarse tan pronto como sea posible, o, si se utilizan en el
largo plazo, culturas paralelas deben mantenerse libres de antibiticos (vase Seccin 13.7.7).
Es una serie de antibiticos usados en cultivo de tejidos moderadamente eficaz en el control de las
infecciones bacterianas
(Tabla 9.4). Sin embargo, un nmero significativo de cepas bacterianas son resistentes a los
antibiticos, ya sea natural o por la seleccin, As que el control que ofrecen nunca es absoluto.
Fungicida y contaminaciones de levadura son particularmente difciles de controlar con
antibiticos; ellos podrn realizarse en jaque, pero rara vez son eliminados (vase seccin 19,4).

9.5 SUERO

Suero contiene factores de crecimiento, que promueven la clula actividad antitripsina y factores
de adhesin y proliferacin, que promuevan el apego de la clula. El suero es tambin una fuente
de minerales, lpidos y hormonas, muchos de los cuales pueden ser unida a protena (tabla 9.5).
Los sueros ms utilizados en el tejido cultura son humanos, fetal bovino, caballo adulto y cra
bovina suero. Ternero (CS) y suero fetal bovino (SFB) son las ms ampliamente utilizado, el ltimo
particularmente para los ms exigentes de la clula las lneas y para la clonacin. A veces se utiliza
en suero humano junto con algunas lneas de clulas humanas, pero tiene que ser prueba de
deteccin de virus, como el VIH y la hepatitis B. caballo el suero es preferible a suero de ternera
por algunos trabajadores, como puede obtenerse de una manada de donantes cerrado y es a
menudo ms consistente de lote a lote. Tambin puede ser de suero equino menos probabilidades
de metabolizar las poliaminas, debido a bajos niveles de oxidasa poliamina; las poliaminas son
mitgenos para algunas clulas [Hyvonen et al., 1988; Kaminska et al., 1990].

9.5.1 protena

Aunque las protenas son un componente importante del suero, la las funciones de muchas
protenas in vitro permanecen oscuras; puede ser que relativamente pocas protenas se requieren
ms que como portadores para minerales, cidos grasos y las hormonas. Esas protenas para Qu
requisitos se han encontrado son albmina [Iscove & Melchers, 1978; Barnes & Sato, 1980], que
puede ser importante como portador de los lpidos, minerales y globulinas [Tozer & Pirt, 1964];
fibronectina (globulina insoluble en fro), que promueve el apego de la clula [Yamada & Geiger,
1997; Hynes, 1992], aunque probablemente no tan eficazmente como derivados de la clula
fibronectina; y 2-macroglobulina, que inhibe la tripsina [de Vonne & Mouray, 1978]. Fetuin en el
suero fetal aumenta la clula accesorio [Fisher et al., 1958] y transferrina [Guilbert & Iscove, 1976]
une a hierro, por lo que es menos txico y biodisponible. Otras protenas, como todava no
caracterizados, pueden ser esenciales para accesorio de celular y el crecimiento. La protena
tambin aumenta la viscosidad del medio,reducir la tensin de esquileo durante el pipeteo y
agitacin y mayo Aadir a la capacidad del soporte almacenamiento en bfer.
9.5.2 factores de crecimiento

Suero del cogulo natural estimula la proliferacin celular ms suero de la cual las clulas han
eliminado fsicamente (por ejemplo, mediante centrifugacin). Esta estimulacin creciente parece
debido a la liberacin del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) de las plaquetas
durante la coagulacin. PDGF [Antoniades et al., 1979; Es uno de una familia de polipptidos en et
al., 1979] con actividad mitognica y es probablemente el mayor crecimiento un factor en el
suero. PDGF estimula el crecimiento de fibroblastos y glia, pero otros factores, derivado de las
plaquetas, como TGF-, puede inhiben el crecimiento o promover la diferenciacin en clulas
epiteliales [Lechner et al., 1981]. Otros factores de crecimiento (ver tabla 10.3), como el
fibroblasto factores de crecimiento (FGFs) [Gospodarowicz, 1974], epidrmicos factor de
crecimiento (EGF) [Cohen, 1962; Carpintero & Cohen, 1977; Gospodarowicz et al., 1978a],
crecimiento de la clula endotelial factores tales como el factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF) y angiogenina [Hu et al., 1997; Folkman & ' d ' amore, 1996; Zhukov et al., 1997; Folkman et
al., 1979; Maciag et al., 1979], y factores de crecimiento similares a la insulina IGF-I e IGF-II [le
Roith & Raizada, 1989], que han sido aislados de todo tejido o liberados en el medio de las clulas
en cultivo, tienen diferentes grados de especificidad [Hollenberg & Cuatrecasas, 1973] y son
Probablemente presentes en suero en pequeas cantidades [Gospodarowicz & Moran, 1974].
Muchos de estos factores de crecimiento estn disponibles comercialmente (vase Apndice II)
como protenas recombinantes, algunos de los cuales tambin estn disponibles en formato largo
anlogos (Sigma) con mayor estabilidad y actividad mitognica.
9.5.3 hormonas

La insulina promueve la absorcin de la glucosa y los aminocidos [Kelley et al., 1978; Stryer, 1995]
y podra deberle su mitognica efecto a esta propiedad o a la actividad a travs de la IGF-I
receptor. IGF-I y sino tambin se unen a los receptores de insulina, IGF-II tienen sus propios
receptores especficos, puede obligar a que la insulina con menor afinidad. IGF-II tambin estimula
la absorcin de glucosa [Sinha et al., 1990]. La hormona de crecimiento puede estar presente en
suero, suero fetal particularmente y, en conjunto con las somatomedinas (IGF), puede tener un
efecto mitognico. Tambin est presente en el suero hidrocortisona particularmente fetal
suero bovino en diferentes cantidades y puede promover la clula accesorio [Ballard &
Tomkins, 1969; Fredin et al., 1979] y celulares proliferacin [Guner et al., 1977; McLean et
al.,1986; Vase tambin las secciones 23.1.1, 23.1.3, 23.1.4], pero bajo ciertas condiciones (por
ejemplo, en alta densidad celular) pueden ser de citostticos [Freshney et al., 1980a, b] y puede
inducir la diferenciacin celular [Moscona & Piddington, 1966; Ballard, 1979; McLean et al., 1986;
Speirs et al., 1991; McCormick et al., 1995, 2000].

9.5.4 nutrientes y metabolitos

Suero tambin puede contener aminocidos, glucosa, oxo (ceto) cidos, nuclesidos y un nmero
de otros nutrientes y intermediarymetabolites. Estos pueden ser importantes en los medios de
comunicacin simple Pero tanto en medios complejos, particularmente aquellos con mayor las
concentraciones de aminocidos y otros definen suplementos.

9.5.5 lpidos

El cido linoleico, cido oleico, etanolamina y Fosfoetanolamina estn presentes en suero en
pequeas cantidades, generalmente obligado a protenas como la albmina.

9.5.6 minerales

Reemplazo de suero experimentos [jamn & McKeehan, 1978] tambin han sugerido que los
oligoelementos y el hierro, cobre, y cinc puede obligarse a la protena de suero.McKeehan et al
[1976] demostr un requisito para el selenio, que probablemente ayuda a desintoxicar los
radicales libres como cofactor de sintetasa GSH.

9.5.7 inhibidores

Suero puede contener sustancias que inhiben la proliferacin celular [Harrington & Godman, 1980;
Liu et al., 1992; Varga Weisz & Barnes, 1993]. Algunos de stos pueden ser artefactos de la
preparacin (por ejemplo, toxinas bacterianas de la contaminacin antes de filtracin, o
anticuerpos, contenidos en el -fraccin globulina, que eptopes con epitopos superficiales de las
clulas cultivadas), pero otros pueden ser reguladores del crecimiento negativo fisiolgicas, tales
como TGF- *Massague et al., 1992+. Inactivacin de calor elimina complemento del suero y
reduce la accin citotxica de inmunoglobulinas sin daar crecimiento polipptido factores, sino
que tambin puede eliminar a algunos constituyentes ms lbiles y no siempre es tan satisfactorio
como suero no tratado.

9.6 SELECCIN DEL MEDIO Y DEL SUERO

Todos los 12 medios que se describe en la tabla 9.3 se desarrollaron a soporte lneas celulares
particulares o condiciones. Muchos eran desarrollado con fibroblastos de ratn de elucin de L929
o cervical HeLa las clulas del carcinoma y F12 de Ham fue diseado para los chinos clulas de
ovario (CHO) del hmster; Todos tienen ahora ms general aplicaciones y se han convertido en
formulaciones clsicas. Entre los datos de los proveedores indicara que RPMI 1640, DMEM y MEM
son los ms populares, para sobre 75% de las ventas. Otras formulaciones rara vez representan
ms del 5% del total; la mayora constituye 2 3%, aunque mezclado Se aproxima DMEM/F12, con
ms del 4%. Medio esencial mnimo (MEM) del guila fue desarrollado de medio Basal del guila
(BME) mediante el aumento de la gama y la concentracin de los constituyentes. Durante muchos
aos, guila MEM tena el uso ms general de todos los medios. De Dulbecco modificacin de BME
(DMEM) fue desarrollado para el ratn fibroblastos para estudios de propagacin de virus y
transformacin. Tiene dos veces las concentraciones del aminocido de MEM, tiene cuatro veces
las concentraciones de vitamina y utiliza dos veces el HCO3 y las concentraciones de CO2 para
lograr mejor almacenamiento en bfer. MEM *Stanners et al., 1971+ tiene aminocidos
adicionales y vitaminas, as como nuclesidos y cido lipoico; ha sido utilizado para una amplia
gama de tipos celulares, incluyendo hematopoytico clulas. F12 de Ham fue desarrollado para
clonar clulas CHO en soporte de suero baja; tambin se utiliza ampliamente, particularmente
para anlisis clonogenic (vase protocolo 22.3.2) y en cultivo primario (vase protocolo 12,7).
Todos estaban CMRL 1066 y M199 de Waymouth medios desarrollado para cultivar clulas de
elucin de L929 libre de suero, pero se han utilizado solos o en combinacin con otros medios,
tales como DMEM o F12, para una variedad de condiciones ms exigentes. RPMI 1640 y los
medios de comunicacin de Fischer fueron desarrollados para las clulas linfoides fischeri
especficamente para el linfoma L5178Y, que tiene un requisito de folato alto. RPMI 1640 en
particular ha uso muy generalizado, a menudo para las clulas adjuntas, a pesar de ser diseado
para la cultura de suspensin y calcio falta. L15 medio fue desarrollado especficamente para
proporcionar almacenamiento en bfer en la ausencia de HCO3 y CO2. A menudo se utiliza como
una transporte y el medio de cultivo primario por este motivo, pero su valor fue disminuido por la
introduccin de HEPES y la demostracin que HCO3 y CO2 son a menudo esencial para el
crecimiento celular ptimo, independientemente de los requerimientos para el almacenamiento
en bfer.
Informacin sobre la seleccin de la correspondiente medio para un determinado tipo de clula
est generalmente disponible en el literatura en artculos sobre el origen de la lnea celular o de la
cultura de clulas similares. Tambin puede obtenerse informacin de la origen de las clulas.
Bancos de clulas, tales como ATCC y ECACC, proporcionar informacin sobre los medios utilizados
para actualmente disponibles las lneas celulares y hojas de datos se pueden acceder desde sus
sitios web (vase el Apndice III; vase tambin tabla 9.6). Su defecto, la opcin se realiza ya sea
emprico o mediante pruebas comparativas de varios los medios de comunicacin, en cuanto a
seleccin de suero (ver seccin 9.6.2).

Muchas lneas celulares continua (por ejemplo, HeLa, elucin de L929, BHK21), cultivos primarios
de humanos, roedores y aves fibroblastos, y lneas celulares derivadas de ellos pueden
mantenerse en un relativamente simple media como la del guila MEM, complementado con
suero de ternera. Los medios de comunicacin ms complejas pueden ser necesario cuando se se
expresa una funcin especializada (vase la seccin 17,7) o cuando las clulas son subcultivadas a
baja densidad de siembra (< 1 103/mL), como en la clonacin (vase la seccin 14.2). Con
frecuencia, las condiciones de cultivo ms exigentes que requieren complejas los medios de
comunicacin tambin requieren suero bovino fetal en lugar de ternera o caballo del suero, a
menos que la formulacin permite especficamente para el omisin del suero. Algunas sugerencias
para la eleccin del medio y varios se dan ejemplos de tipos de la clula y los medios utilizados
para ellos en el cuadro 9.6 [vase tambin Mather, 1998]. Si la informacin no es disponible, un
crecimiento de la clula simple experimento con comercialmente los medios disponibles y las
placas pocillos (ver protocolos 21.721.9) puede llevarse a cabo dentro de dos semanas. Ensayo
para clonal crecimiento (vase protocolo 21,10) y medir la expresin de funciones especializadas
pueden estrecharse la eleccin ms. Te sorprenders al ver que tus mejores condiciones No
coinciden con los mencionados en la literatura; reproducir las condiciones encontradas en otro
laboratorio puede ser difcil, debido a las variaciones en la preparacin o proveedor, las impurezas
presentan en los reactivos y el agua, y diferencias entre lotes de suero. Es de esperar As se
reducen los requerimientos de suero y la pureza de los aumentos de los reactivos, la
estandarizacin de los medios de comunicacin sern mejorar. Por ltimo, tendr que
comprometerse en su eleccin de medio o suero por coste. Son los medios de comunicacin en el
autoclave disponible de proveedores comerciales (vase el Apndice II). Ellos son fcil de preparar,
a partir del polvo y conveniente para muchos dos, dada la formacin de ese producto o algunos
otros especializados funcin es la misma. Si el suero bovino fetal parece esencial, intentar
mezclndola con becerro suero. Esto puede permitir reducir la concentracin de el suero fetal ms
caro. Si puedes, dejar de lado el suero en conjunto, o reducir la concentracin y utilizar un suero-
libre formulacin (vase la seccin 10.5).

9.6.1 lote reserva

Puede preverse una considerable variacin entre lotes del suero. Dicha variacin resultados de
diferentes mtodos de de preparacin y esterilizacin, diferentes edades y almacenamiento las
condiciones y las variaciones en las poblaciones animales de los cuales el suero fue derivado,
incluyendo las disparidades y diferentes cepas en pasto, el clima y otras condiciones ambientales.
Es importante para seleccionar un lote, usarlo tanto tiempo como sea posible, y eventualmente,
reemplazarlo con uno similar a la como sea posible.
Estandarizacin del suero es difcil, ya que varan en lotes considerablemente, y un lote durar
slo unos seis meses a un ao, almacenado en 20C. Seleccione el tipo de suero que es ms
apropiado para sus propsitos y solicitar los lotes a prueba de un nmero de proveedores.
Mayora de los proveedores del suero ser reservar un lote hasta que un cliente puede seleccionar
los ms adecuados uno (siempre y cuando esto no tomar ms de tres semanas o algo as).
Cuando se ha seleccionado un lote adecuado, el proveedor se solicita para mantener el volumen
apropiado para hasta uno ao, para expedirse sobre la demanda. Otros proveedores deben
tambin estar informado, para que puedan volver los lotes rechazados a sus existencias.