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GUA DE PROCEDIMIENTO PRCTICO DE BIOLOGA MOLECULAR

Fecha de Prcticas: 31 de Mayo y 01 de Junio de 2014.


PRECAUCIN: Usar los elementos de Bioseguridad en todo momento.
Nmero de Grupos: Se conformaran 4 grupos, 2 con 6 integrantes y 2 con 5
integrantes.
Los 4 grupos trabajarn de la siguiente manera:

GRUPO N 1 GRUPO N 2
*Tipo de Muestra: Sangre total (Deben
sangrar a 4 integrantes del grupo).
*Para la extraccin deben trabajar con
el KIT comercial.
*MPM 50bp.
*Tipo de Muestra: Staphylococcus
aureus y Enterococcus faecalis.
*Para la extraccin deben trabajar con
la tcnica manual.
*MPM 100bp.
GRUPO N 3 GRUPO N 4
*Tipo de Muestra: Candida spp. y
Escherichia coli.
*Para la extraccin deben trabajar con
la tcnica manual.
*MPM 50bp.
*Tipo de Muestra: Staphylococcus
epidermidis y Escherichia coli.
*Para la extraccin deben trabajar con
la tcnica manual.
*MPM 100bp.

NOTA: Antes de comenzar cada procedimiento verificar que todo el material este
completo e informar.





EXTARCCIN Y PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS

OBJETIVOS
1. Conocer algunos mtodos de extraccin de cidos nucleicos.
2. Realizar la extraccin de ADN por los mtodos de choque trmico y Kit
comercial.
3. Determinar las propiedades de los cidos nucleicos que son evidenciadas
en la prctica.

HABILIDADES A DESARROLLAR

Al finalizar la prctica el estudiante debe ser capaz de conocer y explicar
brevemente el fundamento de cada uno de los mtodos de extraccin o
purificacin de cidos Nuclecos y su aplicacin en la investigacin en
microbiologa.

METODOLOGA

Para llevar a cabo la prctica se tendrn en cuenta las siguientes
recomendaciones.

1. El docente realizara una breve explicacin de los diferentes mtodos de
extraccin de cidos nuclecos que actualmente se utilizan en la biologa
molecular y la microbiologa.
2. Los estudiantes se organizaran en cuatro grupos y luego recibirn un cultivo
puro de un microorganismo especfico.
3. Se socializaran paso a paso los fundamentos del mtodo a desarrollar. Este
ser considerado el primer momento de evaluacin de la prctica del
docente.
4. Se realizara el procedimiento de extraccin de ADN de bacterias/hongo, por
lavado con Tris y lisis por calentamiento.
5. Se realizara el procedimiento de extraccin de ADN de sangre, utilizando
un Kit comercial.

TCNICA DE EXTRACCIN KIT MO BIO
MATERIALES Y REACTIVOS:
4 tubos vacutainer tapa lila
4 agujas vacutainer
1 camisas para vacutainer
Algodn
Alcohol
Toallas absorbentes
Frasco de viales de 1.5ml
estriles
Solucin G1
Solucin G2
RNasa A
Solucin G3
Isopropanol al 100%
Etanol al 70%
Solucin G4

EQUIPOS Y ACCESORIOS
Centrfuga
Vortex
Bao serolgico
Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l
Putas para Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l
Timer
PROCEDIMIENTO
1. Tomar un vial de 1.5ml y aadir 300ul de sangre total o de capa de glbulos
blancos ms 900ul de Solucin G1.
2. Invertir dos veces e incuba por 5 minutos a temperatura ambiente.
3. invertir dos veces durante la incubacin.
4. Centrifugar durante 30 segundos a 13.000 rpm. Remover sobrenadante con
punta de pipeta y descartar sin molestar pellet blanco.
5. Pasar por vortex para resuspender completamente pellet.
6. Observe la Solucin G2. Si se encuentra precipitada, colocar al calor de
55 - 65 C durante 5 minutos para disolver. Aadir 300ul de Solucin G2.
7. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para lisar las clulas (en caso de
observar grupos de clulas, incubar a 37 C hasta que se disuelva).
8. Aadir 1.5l de RNasa A, invertir 5 veces y pasar por vortex a baja
velocidad durante 5 segundos.
9. Adicionar 100ul de Solucin G3.
10. Inmediatamente pasar por vortex a mxima potencia durante 15 segundos.
11. Centrifugar por 3 minutos a 13.000 rpm.
12. Transferir sobrenadante a un tubo de coleccin limpio.
13. Agregar 300ul de Isopropanol al 100%.
14. Invertir 15 veces e incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos.
15. Centrifugar 1 minuto a 13.000 rpm.
16. Vierta cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar pellet y escurrir sobre
una toalla de papel o material absorbente.
17. Adicionar 300ul de Etanol al 70%.
18. Invertir el tubo 5 veces para lavar el pellet.
19. Centrifugar 30 segundos a 13.000 rpm.
20. Vierta cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar pellet y escurrir sobre
una toalla de papel o material absorbente.
21. Centrifugar por 30 segundos y eliminar el sobrenadante residual con punta
de pipeta estrecha sin perturbar el pellet.
22. Adicionar 100ul de la Solucin G4.
23. Calentar en un bao serolgico a 65 C o bloque de calor, tocando el tubo
de vez en cuando, hasta que se resuspenda el pellet (debera tomar de 30-
40 minutos).
24. El DNA genmico est en el tubo ya est listo para utilizar para cualquier
aplicacin.

TCNICA DE EXTRACCIN MANUAL
REACTIVOS:
Tris-HCl (0.5 M; pH: 8.0)
Buffer TE (Tris HCl 10mM, pH:8.0 + EDTA 1mM)
EQUIPOS Y MATERILES
Bloque de calentamiento en seco
Congelador
Centrfuga
Vortex
Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l
Putas para Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l
Toallas absorbentes
Frasco de viales de 1.5ml estriles
Gradilla plstica


PROCEDIMIENTO
1. Resuspender una gran cantidad de colonias bacterianas (>30) en 0.5 ml de
Tris-HCl (0.5 M; pH: 8.0), agregar 0.5 ml Tris-HCl para completar un volumen de 1
ml y agitar en vortex durante 30 segundos.
Nota: Encender el Bloque de calentamiento
2. Centrifugar a 13000 rpm x 5 minutos y descartar el sobrenadante aspirando con
micropipeta.
3. Resuspender el pellet resultante en 0.5 ml de buffer TE (Tris-HCl 10mM, pH: 8.0
+ EDTA 1mM).
4. Calentar a 100 C por 30 minutos en bloque de calentamiento.
Nota: Cuidar que los tubos permanezcan cerrados durante el calentamiento.
5. Congelar durante 20 minutos y descongelar en bloque de calentamiento.
6. Centrifugar a 13000 rpm x 15 minutos.
7. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo cuidando de no tomar parte del
pellet.
8. Medir la calidad y concentracin del ADN.

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y ELECTROFORESIS
DE CIDOS NUCLECO
OBJETIVOS
1. Adquirir los fundamentos tericos y prcticos para llevar a cabo la
amplificacin de fragmentos de ADN mediante la Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR).
2. Separar y analizar los fragmentos de ADN mediante electroforesis.

HABILIDADES A DESARRROLLAR
El estudiante debe ser capaz de reconocer los pasos de la PCR, ciclos y reactivos
necesarios. Disear un protocolo de PCR y realizar clculos y concentraciones
ptimas de cada reactivo y de las muestras utilizadas en diferentes mbitos de la
biologa molecular.
DISEO DE LA PCR
REACTIVOS:
Master Mix
Buffer
dNTPs
MgCl2
Primer Upstream
Primer Downstream
Taq Polimerasa
ADN
Agua libre de nucleasas
EQUIPOS Y MATERIALES
Termociclador
Vortex
Tubos para PCR (Viales de 0.2ml)
Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l
Putas para Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l
Toallas desechables
Gradilla plstica


GRUPO N 1 y GRUPO N 3

Utilizar la Master Mix
Reactivos
Concentracin
Inicial
Concentracin
Final
GoTaq Green
Master Mix 2X
2X 1X
Primer
Upstream
5M 0.2M
Primer
Downstream
5M 0.2M
ADN Volumen: 5l

Volumen de Reaccin: 25l
NOTA: Completar el volumen faltante de la reaccin de PCR con agua libre
de nucleasas, hasta llegar a 25l.

GRUPO N2 y GRUPO N4

Utilizar los siguientes reactivos:








Reactivos
Concentracin
Inicial
Concentracin
Final
*Buffer 5X 1X
dNTPs 100mM 10mM
MgCl
2
25mM 3mM
Primer
Upstream
5M 0.2M
Primer
Downstream
5M 0.2M
Taq
Polimerasa
5U/l 2.5U/l
ADN Volumen: 5l




Volumen de Reaccin: 25l
NOTA: Completar el volumen faltante de la reaccin de PCR con agua libre
de nucleasas, hasta llegar a 25l.
*El buffer del grupo N 2 es: 5X Green GotTaq Flexi Buffer y el buffer del
grupo N 4 es: 5X Colorless GoTaq Flexi Buffer.





PREPARACIN GEL DE AGAROSA

REACTIVOS

Agarosa
TAE 50X
SAYB SAFE 10000
Agua destilada


EQUIPOS Y MATERIALES

Cmara de electroforesis
Fuente de poder para la cmara de electroforesis
Balanza Analtica
Plancha con calentamiento
Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l
Putas para Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l
Soporte o molde para gel
Peines
Erlenmeyer de 250ml
Esptula
Probeta graduada
Papel kraft
Guantes para calor
Brocha para limpiar la balanza

DESARROLLO/ PROCEDIMIENTO

Procedimiento para la preparacin de geles de agarosa para realizar corrido
electroforticos de las distintas muestras a investigar.

Cerciorarse que la balanza este calibrada. Lugo encender balanza y llevarla
a cero, pesar el papel kraft o recipiente y nuevamente llevar a cero,
despus pesar la agarosa dependiendo del volumen del soporte de la
cmara de electroforesis: 0.2gramos de agarosa para 20ml o 0.4gramos
para 40ml y depositarla la agarosa en un erlenmeyer.

Medir en una probeta graduada los volmenes necesario para preparar el
TAE a una concentracin 1X, dependiendo el volumen del soporte de la
cmara de electroforesis: 0.4ml de TAE 50X ms 19.6ml de agua destilada
para un gel de 20ml o 0.8ml de TAE 50X ms 39.2ml de agua destilada
para un gel de 40ml y agregar al erlenmeyer que contiene la agarosa.




Gel para una cmara de 20ml. Todo va al 1%.

MATERIAL CANTIDAD
Agarosa 0.2gr
Agua destilada 19.6ml
TAE 50X 0.4ml = 400l



Gel para una cmara de 40ml. Todo va al 1%.

MATERIAL CANTIDAD
Agarosa 0.4gr
Agua destilada 39.2ml
TAE 50X 0.8ml = 800l

Colocar la preparacin en un una plancha de calentamiento con agitacin
por unos minutos hasta que se disuelva totalmente la agarosa, trasparente
y sin grumos.
Trascurrido el tiempo con los guantes para calor retirar el erlenmeyer de la
plancha de calentamiento con agitacin. Dejar reposar de 3 a 5 minutos.
Durante este tiempo prepara la cmara (Ajustar el soporte del gel, nivelar y
colocar los peines en el soporte).
Adicionar a la mezcla la cantidad de SAYB SAFE 10000 requerida,
dependiendo del volumen de la preparacin. (2l SYBR SAFE para un
volumen de 20ml o 4l para un volumen de 40ml).
Agregar la mezcla al soporte por los bordes y suavemente, con el fin de no
producir burbujas, dejar gelificar aproximadamente por 20 a 30 minutos a
temperatura ambiente.
Retirar los peines y los imanes suavemente para no romper el gel.
Dejar el gel en el soporte y dentro de la cmara.




MONTAJE DE ELECTROFORESIS
REACTIVOS

TAE 50X
Agua destilada
Buffer de Carga (Grupo N4)
DNA


EQUIPOS Y MATERIALES

Cmara de electroforesis
Fuente de poder para la cmara de electroforesis
Fotodocumentador
Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l
Putas para Micropipetas de 0.5 - 10l, 10 - 100l y de 101 - 1000l
Probeta graduada
Papel parafilm

PROCEDIMIENTO

Preparar el buffer de llenado para la cmara, tomando una probeta
graduada y medir 294ml de agua destilada y agregar 6ml de TAE 50X.

MATERIALES CANTIDAD
Agua destilada 294ml
TAE 50X 6ml

Agregar el buffer a la cmara de electroforesis hasta cubrir por completo el
gel.
Luego el grupo N 4 tomar el papel parafilm y sobre este colocar 1l del
buffer de carga + 5l de ADN de la muestra (segn nmero de muestras a
utilizar), mezclar bien con punta de micropipeta y colocar en el pozo
correspondiente (tener en cuenta cambiar el volumen de la micropipeta al
momento de la siembra 1l + 5l = 6l). NOTA: En el primer pozo adicionar
el MPM.
Los dems grupos agregar 5l de la muestra de ADN de manera directa a
cada pozo.
Despus tapar la cmara de electroforesis y conectar a la fuente de poder
teniendo en cuenta la carga del ADN.
Hacer corrido a 70 voltios por 45 minutos.
Anlisis las bandas en fotodocumentador.

NOTA: Luego de utilizado el gel debe ser descartado en la bolsa roja.