Análisis y Evaluación de Los Procesos de Limpieza Manual de Equipos de Manufactura en La Industria Nutracéutica

ANLISIS Y EVALUACIN DE LOS PROCESOS DE LIMPIEZA MANUAL
DE EQUIPOS DE MANUFACTURA EN UNA INDUSTRIA

NUTRACUTICA.

Rafael Alberto Forero Vargas
Diana Carolina Piedrahita Navarrete

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al Titulo de

MICROBIOLOGO(A) INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
FACULTAD DE CIENCIAS
Fort Laurderdale, Florida - Estados Unidos de Amrica
Julio de 2008

NOTA DE ADVERTENCIA

Artculo 23 de la Resolucin N13 de Julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velara por qu no se publique nada contrario al dogma
y a la moral catlica y por que las tesis no contengan ataques personales contra
persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia
NUTRACUTICA.


APROBADO

_____________________
Diego F. Congote
Microbilogo Industrial
Director

_____________________
Luz ngela Montao
Microbiloga Industrial
Candidata a CIH
Jurado

______________________
Janeth Arias
Bacteriloga M. Sc
Co Director

_______________________
Mara Cristina Pea
Microbiloga Industrial
Jurado
NUTRACUTICA.


APROBADO

______________________ ______________________
Ingrid Schuler Ph.D
Decana Acadmica
Facultad de Ciencias

Janeth Arias P. M.Sc
Bacteriloga
Directora de Carrera

RESUMEN

La evaluacin de la limpieza de equipos e instalaciones en una Industria Nutracutica
es uno de los factores fundamentales para garantizar y asegurar que un producto
(suplemento nutricional) es apto para el consumo.
En este trabajo se evalu la eficacia los agentes limpiadores Alconox (detergente
aninico) y alcohol isoproplico (desinfectante) utilizados durante la limpieza manual
de equipos; se llevaron a cabo pruebas in vitro de suspensin y superficies aprobadas
por la FDA y validadas por la AOAC (Association of Official Analytical Chemist) e
in vivo en donde se tomaron muestras de las superficies de los equipos del rea de
manufactura una vez finalizados los procesos de limpieza. Finalmente, se utiliz el
criterio del caso o condicin extrema (worst case) para la evaluacin en el rea de
manufactura. Los microorganismos que se utilizaron para las pruebas fueron:
Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa y Candida albicans.
La concentracin recomendada de alcohol isoproplico (70%v/v) resulto ser adecuada
para el uso establecido, debido a que mediante las pruebas realizadas se demostr la
inhibicin del crecimiento de todos los microorganismos en suspensin con un
tiempo mnimo de un minuto.
En la evaluacin de superficies para el alcohol isoproplico se observ que el
desinfectante es sensible a diferentes concentraciones de materia orgnica (suero
bovino 0.01g/mL, 0.125g/mL y 0.25g/mL) permitiendo el crecimiento de
microorganismos.
Alconox evidenci accin bactericida frente a Staphylococcus aureus a una
concentracin del 2% p/v en un tiempo de exposicin mnimo de 5 minutos. Adems,
segn el tipo de residuo este debe ser utilizado a diferentes concentraciones entre
1%p/v y 2%p/v.
La inmersin de las partes pequeas removibles de la maquina en Alcohol
isoproplico al 70%v/v, el uso peridico de agentes esporocidas, y la rotacin del
desinfectante, son algunas de las implementaciones sugeridas mediante la realizacin
de este trabajo.
ABSTRACT

Facilities and equipment cleaning evaluation in the Nutraceutical Industry is an
important aspect to guarantee and assure that dietary supplements are suitable for
human consumption.
The effectiveness of an anionic detergent (Alconox) and a disinfectant (Isopropyl
alcohol) utilized during the manual cleaning of manufacturing equipment were
evaluated in this study. In vitro tests were separated in two parts; suspension tests and
carrier test. Suspension test were the Phenol Coefficient (AOAC 955.11) and the
Kirby-Bauer disk diffusion method, while carrier test was the Use dilution method
(AOAC 955.15). These methods are approved by the FDA and EPA for disinfectant
evaluation. In vivo test was carried out by taking swab samples of the equipments
surfaces before and after the cleaning process in order to identify the residues and
microorganisms left behind the cleaning process. Specific analytical methods were
used to identify minimal concentration of residue. The process was then evaluated by
the worst case scenario. The microorganisms used were Escherichia coli, Salmonella
enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans.
The recommended dilution of Isopropyl Alcohol (70% v/v) was suitable for the
inhibiting of bacterial growth even, at on (1) minute of exposure.
Meanwhile, surface test done with isopropyl alcohol showed that the disinfectant is
inactivated by organic matter (Bovine serum at 0.01 g/mL, 0.125 g/mL and 0.25
g/mL) allowing the growth of microorganisms.
Alconox showed bactericidal action against Staphylococcus aureus at 2% w/v after 5
minutes of exposure. Even though, the concentration of alconox (1% w/v or 2% w/v)
depends on the nature of the residue.
Immersion of the removable small pieces of equipment in 70% v/v isopropyl alcohol
solution as well as the periodic intervals of disinfectant solutions were some of the
feedback given once the study was over.

AGRADECIMIMIENTOS

A la Pontificia Universidad Javeriana por sus enseanzas a lo largo de nuestra
carrera.

A Arnet Pharmaceutical Corp. por brindarnos la oportunidad de tener esta gran
experiencia profesional.

A la familia Tabacinic por aceptarnos dentro de su compaa y acogernos durante
todo el tiempo del estudio.

A la familia Congote Montao por la gran oportunidad de estar aqu, su amistad,
acogimiento y sus sabios consejos.

A Diego Congote por guiarnos a lo largo de todo este estudio, por brindarnos su
amistad, su afecto y su paciencia.

A Janeth Arias por creer en nosotros y apoyarnos.

Al equipo del laboratorio, manufactura y empaque por ser nuestros amigos, hacernos
rer y colaborarnos para llevar en buen trmino este trabajo.

A nuestra familia por su amor, comprensin y constante apoyo.

A nuestros amigos por su constante apoyo.

Y a todos gracias!!!
Dedicatoria
A Dios por bendecirme,

A mis padres por su amor, su confianza, su apoyo, su constancia y sus sabios consejos
Los amo.
A mi familia por su voz de aliento a pesar de la distancia,
A Janeth Arias por su apoyo incondicional,
A Diego por su apoyo, su paciencia, su alegra, su amistad y por ser un gran maestro,
A Rafa por su paciencia y constante alegra,
A David por ser mi ngel,
A Viviana, Diana, Karem, Laura y Sandra que desde cada uno de los rincones del mundo en
que se encuentran dieron el apoyo y la energa necesaria para salir adelante.
Y a todas aquellas personas que colaboraron a que este proyecto sea un sueo hecho
realidad!!
Diana C. Piedrahita

Dedico mi trabajo y mi esfuerzo a Dios.gracias por escucharme y apoyarme,

A mis papitos por ser todo en mi vida y darme todo el nimo, amor y compresin que
necesite siempre para salir adelante. Los amo y siempre los llevo en mi corazn!,
A mis hermanitos Germn y Juan Sebastin por estar siempre conmigo y hacerme la vida
ms feliz,
A mi familia por su constante apoyo y nimo. Los amo!
A mi bibe divina por su apoyo y todo su amor. Te amo mucho bibec!!,
A The Boss por brindarme el conocimiento, la instruccin, su afecto e incondicional
amistad durante todo este tiempo. Te quiero The Boss,
A Carito por ser mi compaera a lo largo de todo este tiempo, parce lo logramos!
A Janeth Arias por su constante apoyo y nimo,
A todos mis amigos con lo que crec y a todas las personas bonitas que me brindaron su
amistad y apoyo durante todo este tiempo, gracias.
RAFAEL FORERO V.
173
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN
ABSTRACT
1. INTRODUCCION ................................................................................................. 1
2. MARCO TEORICO .................................................................................................. 3
2.1 Antecedentes en la Industria Nutracutica .............................................................. 3
2.1 Suplementos nutricionales ..................................................................................... 4
2.1.1 Que es un suplemento nutricional?................................................................. 4
2.1.1.1 Alergias a los Alimentos - Alimentos Alergnicos ................................... 5
2.2.2 Diagrama de flujo para la fabricacin de un suplemento ................................... 7
2.2.3 Descripcin de los equipos utilizados en la elaboracin de suplementos ............ 7
2.2.3.1 Mezcladores o Blenders .................................................................................... 7
2.2.3.2 Encapsuladoras .................................................................................................. 8
2.2.3.3 Tableteadoras .................................................................................................. 10
2.2.3.4 Recubrimientos y pinturas............................................................................... 11
2.2.3.5 Equipos y Utensilios complementarios ........................................................... 13
2.3 Regulaciones para la manufactura de suplementos.............................................. 14
2.3.1 Buenas Prcticas de Manufactura (BPMs) Cdigo de Regulacin Federal,
Capitulo 21 parte 111 .................................................................................................. 14
2.4 Control de calidad de los suplementos Nutricionales .......................................... 14
2.5 Establecimiento de Lmites para la Industria Nutracutica ................................. 15
2.5.1 Toma de muestras ......................................................................................... 16
2.5.1.1 Mtodos Analticos ................................................................................... 16
2.5.1.2 Criterios de Lmites de Aceptacin. ......................................................... 18
2.6 Agentes Antimicrobianos ..................................................................................... 20
2.6.1 Factores que influyen en la actividad de los antimicrobianos ...................... 33
2.7 Mecanismos de evaluacin de los desinfectantes. ............................................... 33
2.7.1 Pruebas en suspensin .................................................................................. 34
2.7.1.1 Dilucin en tubo ....................................................................................... 35
VII
174
2.7.1.2 Sensibilidad antimicrobiana (Kirby-Bauer) .............................................. 36
2.7.1.3 Coeficiente Fenlico ................................................................................. 36
2.7.2 Pruebas Carrier ............................................................................................ 37
2.7.2.1 Mtodo de la Dilucin de Uso .................................................................. 37
2.7.3 Pruebas en superficie In Vivo .................................................................... 38
2.8 Limpieza............................................................................................................... 38
2.8.1 Limpieza manual de equipos ........................................................................ 39
2.8.2 Limpieza Automatizada de equipos ............................................................. 40
2.8.2.1 COP (Clean-Out-of- Place) ....................................................................... 40
2.8.2.2 CIP (Clean-In-Place) ................................................................................ 41
2.9 Descripcin del proceso de limpieza manual ....................................................... 42
2.10Mecanismos de resistencia de los microorganismos ............................................ 42
2.10.1 Intrnseca ...................................................................................................... 43
2.10.1.1 Bacterias ................................................................................................... 43
2.10.1.2 Mohos y levaduras .................................................................................... 45
2.10.2 Adquiridas .................................................................................................... 46
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA ................................................................. 47
3.1 Problema .............................................................................................................. 47
3.2 J ustificacin.......................................................................................................... 47
4. OBJ ETIVOS ........................................................................................................ 49
4.1 General ................................................................................................................. 49
4.2 Especficos ........................................................................................................... 49
5. HIPOTESIS .......................................................................................................... 50
6. MATERIALES Y MTODOS ............................................................................ 51
6.1 Identificacin de los microorganismos prueba. ................................................... 51
6.2 Agentes de limpieza. ............................................................................................ 53
6.2.1. Evaluacin de la efectividad antimicrobiana Desinfectante y Detergente .... 53
6.2.1.1 Pruebas en suspensin. ................................................................................... 53
6.2.1.1.1 Dilucin en tubo y sensibilidad antimicrobiana (Kirby - Bauer)
Desinfectante y Detergente ...................................................................................... 53
VIII
175
6.2.1.1.2 Mtodo del Coeficiente Fenlico para el Alcohol isoproplico USP segn
la AOAC 955.11. ........................................................................................................ 55
6.2.1.2 Prueba en soporte Carrier. ................................................................... 57
6.2.1.2.1 Mtodo de la dilucin de uso - AOAC 955.15. ........................................ 57
6.2.2 Evaluacin de la efectividad del detergente para la remocin del material
orgnico. ...................................................................................................................... 64
6.3 Proceso de limpieza manual ................................................................................. 65
6.3.1 Evaluacin del proceso de limpieza segn limites fsico, qumicos y
microbiolgicos. ........................................................................................................ 65
6.3.1.1 Condiciones Normales. ............................................................................. 65
6.3.1.2 Condicin crtica ....................................................................................... 67
7. RESULTADOS Y DISCUSIN DE RESULTADOS. ....................................... 71
7.1 Agentes de Limpieza ............................................................................................ 73
7.1.1 Evaluacin de la efectividad antimicrobiana de los agentes de limpieza 7.1.1.1
Pruebas en suspensin ................................................................................................. 73
7.1.1.1.2 Mtodo del Coeficiente fenlico para el alcohol isoproplico USP AOAC
955.11 .................................................................................................................. 81
7.1.1.2 Pruebas soporte Carrier. ....................................................................... 87
7.1.1.2.1 Mtodo de la dilucin de uso AOAC 955.15. ....................................... 87
7.1.2 Evaluacin de la efectividad del detergente para la remocin de material
orgnico. ...................................................................................................................... 91
7.2 Proceso de limpieza manual. ................................................................................ 93
7.2.1 Evaluacin del proceso de limpieza segn limite fsico, qumico y
microbiolgico. ......................................................................................................... 93
7.2.1.1. Condiciones normales. ................................................................................... 93
7.2.1.2 Condiciones crticas ..................................................................................... 100
8. CONCLUSIONES ............................................................................................. 106
9. RECOMENDACIONES .................................................................................... 109
10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ............................................................... 111
11. ANEXOS ............................................................................................................ 121
Anexo A Cronologa de la regulacin para suplementos nutricionales ................... 121
IX
176
Anexo B Diagrama de flujo para la obtencin de un suplemento nutricional. ........ 122
ANEXO C DIAGRAMA DE FLUJ O DEL PROCESO GENERAL DE UN
MEZCLADOR (BLENDER). ................................................................................... 123
ANEXO D DIAGRAMA DE FLUJ O DEL PROCESO GENERAL DE UNA
ENCAPSULADORA ................................................................................................ 124
ANEXO E. DIAGRAMA DE FLUJ O DEL PROCESO GENERAL DE UNA
TABLETEADORA ................................................................................................... 126
ANEXO F DIAGRAMA DE FLUJ O DEL PROCESO GENERAL DE UNA
MAQUINA DE RECUBRIMIENTOS Y PINTURAS. ........................................... 127
ANEXO G. Buenas Prcticas de Manufactura (BPMs) para suplementos
nutricionales Cdigo de Regulacin Federal, Capitulo 21 parte 111..................... 128
ANEXO H Ventajas y Desventajas de algunos desinfectantes ................................. 145
ANEXO I FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD DE LOS
ANTIMICROBIANOS ............................................................................................. 146
ANEXO J Descripcin de limpieza manual de equipos. ......................................... 145
ANEXO K Diagrama general pruebas In Vivo e In vitro ........................................ 147
ANEXO L Susceptibilidad antimicrobiana (KIRBY-BAUER) ............................... 148
ANEXO M DIAGRAMA DE FLUJ O TCNICA DEL COEFICIENTE FENLICO
............................................................................................................................ 150
ANEXO N DIAGRAMA DE FLUJ O PRUEBA EN SOPORTE Carrier. ...... 152
ANEXO O Evaluacin de la efectividad de la remocin de material orgnico por
parte del detergente ................................................................................................... 158
ANEXO P PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO .................................... 160
ANEXO Q FORMATO DE TABLA DE RESULTADOS ...................................... 167
ANEXO R ANLISIS DE VARIANZA DE LAS PRUEBAS IN VITRO ............. 172
177
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Blender en forma de V ............................................................................... 8

Figura 2. Encapsuladora Bosch GFK 2500 ................................................................... 9
Figura 3 - 3a. J CMCO modelo J C SH31D; 3b. Compresores y ponches ............... 10
Figura 4 Vector Hi Coater. Modelo VHC - 5811..................................................... 13
Figura 5. A. Alquil ter sulfato; B. Alquil sulfato Linear; C. cidos grasos y
jabones. ....................................................................................................................... 31
Figura 7 Eficacia de los agentes de limpieza (concentracin microbiana vs tiempo de
exposicin) .................................................................................................................. 32
Figura 6 Surfactantes catinicos: A. Esquerato; B. Amonio cuaternario; C.
Surfactante no inico: ................................................................................................. 32
Figura 8 Clean Out of Place ....................................................................................... 40
Figura 9 Clean in Place .............................................................................................. 42
Figura 10 Resistencia de los microorganismos a los desinfectantes. .......................... 43
Figura 11 Estructuras de resistencia de las esporas bacterianas. ............................... 45
Figura 12. Lyfocults (Fuente: MSL Microbiologicals) ............................................... 51
Figura 13 Oxi Ferm tube II ....................................................................................... 52
Figura 14 Metodologa general para la prueba #1 del mtodo de superficies. ......... 61
Figura 15 Metodologa para la prueba #3 del mtodo de superficies ....................... 62
Figura 16 Metodologa para la prueba #4 del mtodo de superficies. ...................... 62
Figura 17 Escherichia coli en agar EMB .................................................................... 71
Figura 18 Pseudomonas aeruginosa en agar Cetrimide ............................................. 72
Figura 19 Salmonella enterica en agar Hecktoen ....................................................... 72
Figura 20 Staphylococcus aureus en agar Vogel J ohnson .......................................... 72
Figura 21 Evaluacin de la efectividad antimicrobiana de Alconox frente a
Staphylococcus aureus. ............................................................................................... 74
Figura 22 Evaluacin de la efectividad antimicrobiana de Alconox frente a
Escherichia coli. .......................................................................................................... 75
XI
178
Figura 23 Evaluacin de la efectividad antimicrobiana del alcohol isoproplico y
Alconox frente a Escherichia coli. .............................................................................. 76
Alconox frente a Pseudomonas aeruginosa. ............................................................... 77
Alconox frente a Salmonella enterica. ........................................................................ 78
Alconox frente a Staphylococcus aureus. ................................................................... 78
Alconox frente a Candida albicans. ........................................................................... 79
Figura 28 Mtodo del coeficiente fenlico para Escherichia coli .............................. 81
Figura 29 Mtodo del coeficiente fenlico para Salmonella enterica. ....................... 82
Figura 30 Mtodo del coeficiente fenlico para Pseudomonas aeruginosa. .............. 83
Figura 31 Mtodo del coeficiente fenlico para Staphylococcus aureus .................... 84
Figura 32. Mtodo del coeficiente fenlico para Candida albicans. .......................... 85
Figura 33 Seleccin de la concentracin de materia orgnica. evaluacin de
superficies. ................................................................................................................. 87
Figura 34. Resultados de la evaluacin de superficie. ............................................... 88
Figura 35. Evaluacin de superficies (In Vivo) Alcohol isoproplico rea de
manufactura. ................................................................................................................ 90
Figura 36. Efectividad de la limpieza con Alconox. ................................................... 92
Figura 37. Control Microbiolgico - Bacterias ........................................................... 94
Figura 38. Control microbiolgico Mohos y Levaduras ......................................... 95
Figura 39. Grfica de Control Microbiolgico Bacterias, Mohos y Levaduras. ...... 96
Figura 40 Grfica de control microbiolgico en condiciones crticas (bacterias,
mohos y levaduras). .................................................................................................. 103

XII
179
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Niveles de actividad de los desinfectantes .................................................... 25
Tabla 2 Caractersticas de los Desinfectantes ............................................................ 26
Tabla 3 Mecanismos de resistencia intrnsecas de las bacterias a los desinfectantes. 44
Tabla 4 Mecanismos de resistencia - Levaduras y Mohos ......................................... 46
Tabla 5 Agares Selectivos .......................................................................................... 52
Tabla 6 Concentraciones de Alcohol isoproplico y fenol (empleadas) .................... 56
Tabla 7 Parmetros a evaluar en la evaluacin de superficies. .................................. 60
Tabla 8. Distribucin del material Evaluacin de superficies ................................ 60
Tabla 9. Interpretacin de resultados. Evaluacin de Superficies. .......................... 63
Tabla 10 Identificacin Microscpica Coloracin de Gram .................................... 71
Tabla 11 Resultados Oxi/Ferm Tube II ...................................................................... 73
Tabla 12. Nmero del coeficiente fenlico ................................................................. 86
Tabla 13. Lmite Qumico en base al producto anterior .............................................. 98
Tabla 14. Cuantificacin del fsforo. Alconox ........................................................... 99
Tabla 15 Resultados Recuento de Bacterias, Mohos y Levaduras Lmite
microbiolgico. ......................................................................................................... 102
Tabla 16 Recuento de Lactobacillus sp. Lmite microbiolgico en condiciones
crticas. ...................................................................................................................... 104

XIII
180
INDICE DE ECUACIONES
Ecuacin 1. Nmero del Coeficiente fenlico ............................................................ 37

Ecuacin 2 Nmero del coeficiente fenlico .............................................................. 57
Ecuacin 3 Evaluacin de la efectividad de Alconox Porcentaje de Residuo ......... 65

XIV
1
1. INTRODUCCION
Los suplementos nutricionales son definidos como productos naturales compuestos

de sustancias bioactivas y que al ser consumidos en una dosis superior a la existente
comnmente en los alimentos, tienen un efecto favorable sobre la salud; estos se
encuentran en el mercado en varias presentaciones como cpsulas, tabletas o polvos.
En la antigedad, la humanidad utilizaba partes de animales o plantas para la
elaboracin de preparados teraputicos o remedios en bsqueda del alivio a las
enfermedades. En Amrica, las culturas indgenas desarrollaron remedios contra
enfermedades a lo largo de los siglos; por ejemplo en Per se utiliz la quina o
quinina (alcaloide) para el tratamiento de la malaria. En el siglo XVI, Paracelso,
mdico naturista suizo, fue el primero en expresar que la doctrina de los procesos
vitales es qumica, ya que en durante su estudio puede hallarse la curacin de las
enfermedades.
El sector de la industria nutracutica es unos de los segmentos de la economa que en
la actualidad ha tenido un crecimiento significativo que ha sobrepasado el de la
industria farmacutica y alimenticia, posicionndose como una de las grandes
industrias del futuro.
Los recientes estudios de mercadeo en los Estados Unidos han demostrado que la
industria nutracutica ha tenido ventas por ms de 18 mil billones de dlares en el ao
2000, es por esto que las entidades federales de regulacin de los Estados Unidos
tales como la Administracin de Alimentos y Medicamentos (FDA), la Agencia de
Proteccin Ambiental (EPA), y la Comisin Federal de Comercio (FTC) se
encuentren vigilndola con mayor atencin.
Por tales motivos es necesario mantener y acogerse a las medidas exigidas por cada
de una de ellas; dentro de las cuales se encuentra la implementacin de las Buenas
Prcticas de Manufactura para Suplementos Alimenticios (Cdigo de Regulacin
Federal, Capitulo 21 parte 111), en donde uno de sus numerales (subparte G) exige el
2
constante control en cada una de las reas, superficies, equipos y utensilios que entran
en contacto directo con el producto.
La evaluacin o validacin de la limpieza surge de la necesidad de documentar,
garantizar y verificar que los procedimientos implementados en la actualidad estn
cumpliendo con su objetivo especfico de reducir de manera constante la suciedad
sobre la superficie del equipo, zonas comunes, as como los residuos entre los
diferentes productos a un nivel aceptable preestablecido, el cual asegura no ser
ningn peligro para el consumidor final (sustancias alergnicas).

3
2. MARCO TEORICO
2.1 Antecedentes en la Industria Nutracutica
Durante aos los suplementos nutricionales han sido considerados como alimentos y
su industria era diferente a la actualmente conocida. Los procesos y la produccin no
estaban estandarizados, el saneamiento era inseguro y su distribucin era desordenada
(Hollenstein, 2007).
Por dcadas, FDA regul a los suplementos nutricionales como alimentos en muchas
circunstancias, con el fin de asegurar la calidad del producto. En el ao 1994 se firm el
Acta de Salud y Educacin (DSHEA) en donde los suplementos nutricionales
tuvieron sus primeras reglamentaciones las cuales difieren de las de alimentos y
medicamentos (Ver Anexo A). Segn establece DSHEA, las industrias nutracuticas
son responsables de garantizar que un suplemento nutricional es seguro antes de su
comercializacin. El acta comisiona a FDA para que sea el organismo regulador de la
fabricacin de los suplementos nutricionales; FDA solamente es responsable de tomar
acciones contra cualquier suplemento que no sea seguro despus de que este en el
mercado (FDA, 2006).
El trmino de suplemento nutricional o diettico fue definido por el congreso de los
Estados Unidos en DSHEA como productos (sin incluir el tabaco) administrados
oralmente que contienen un ingrediente nutricional o diettico a fin de complementar
la dieta (DHSEA, 1994).
En el ao 2006 FDA estim que los ciudadanos americanos gastan ms de $8.5
billones de dlares al ao en suplementos nutricionales y el mercado mundial est
estimado en $60 billones de dlares; la mayora de los consumidores (74%)
concuerdan en que el gobierno debera prestar una mayor atencin al control de los
suplementos para garantizar su seguridad y eficacia (Crowley et al, 2006). Los
productores de suplementos nutricionales no requieren registrar sus productos ante la
FDA as como tampoco necesitan su aprobacin antes de ser producidos o vendidos.
4
En J unio del ao 2007, FDA public las Buenas Prcticas de Manufactura (BPMs)
para suplementos alimenticios - Cdigo de Regulacin Federal (CFR), Capitulo 21
parte 111. Estas regulaciones estn enfocadas hacia la manufactura, empaque,
etiquetado, almacenaje y distribucin de los suplementos nutricionales.
(FDA/CFSAN, 2008).

2.1 Suplementos nutricionales
2.1.1 Que es un suplemento nutricional?

FDA tradicionalmente considera a los suplementos nutricionales o alimenticios
(como tambin se conocen en el mercado), como un producto compuesto por
vitaminas, minerales o protenas con el fin de proveer nutrientes que pueden
encontrarse en bajos niveles debido a los malos hbitos alimenticios. La ley de
educacin y etiquetado para los alimentos (NLEA, por sus siglas en ingls) de 1990
adiciona al trmino de suplemento alimenticio a las hierbas o sustancias nutricionales
similares a estas como el Ginseng (planta aromtica China), ajo, aceite de pescado,
enzimas, semillas de Physillum, grnulos y mezclas de estos (FDA/CFSAN, 2008).

Finalmente, DSHEA establece que un suplemento alimenticio:
Es un producto (adems del tabaco) que contiene uno o ms de los siguientes
ingredientes: vitaminas, minerales, hierbas y otros compuestos botnicos,
aminocidos o concentrados, metabolitos, tejidos de rganos, tejidos de
glndulas, constituyentes, extractos o combinaciones de estos ingredientes.
Esta designado para su ingestin en tableta, cpsula, cpsula lquida, gelcaps,
forma lquida o en polvo. Pueden tambin presentarse en forma de barra pero en
este caso se debe aclarar en la etiqueta que no representa una comida ni es un
reemplazo de esta.
Esta etiquetado como Suplemento Nutricional Dietary Supplement.
5
No est fabricado para ser utilizado como medicamento.
En la etiqueta se debe aclarar que no es un producto fabricado como reemplazo de
una comida.
2.1.1.1 Alergias a los Alimentos - Alimentos Alergnicos
La alergia alimenticia es una reaccin que presenta el sistema inmunolgico, ante el

consumo de un alimento o el componente de un alimento (usualmente una protena)
que es reconocido como extrao en el cuerpo. (Alimentacin Sana, 2006).

Los sntomas de una reaccin alergnica no siempre son iguales, y varan
dependiendo del mecanismo implicado en la reaccin inmune causada por la alergia.
As, existen reacciones inmediatas que se producen al cabo de pocos minutos
(mediadas por la Inmunoglobulina E - IgE); sntomas comunes de este tipo de
reacciones son: Urticaria, Angioedema (edema localizado en la cara, con hinchazn
de prpados, labios, lengua y cierta dificultad para tragar), vmito, tos, asma,
anafilaxia (choque alrgico), reacciones diferidas (no mediadas por IgE) que
comienzan al menos despus de 2 horas de la ingestin del alimento y en ocasiones
pueden aparecer al cabo de 24 a 48 horas; este tipo de reacciones nicamente
producen sntomas digestivos (diarrea), y tardas que aparecen varios das despus de
la ingestin del alimento, el sntoma ms frecuente en este caso es la dermatitis.
(Alimentacin sana, 2008)
El efecto de las reacciones alergnicas dependen de la fisiologa de las personas y de
la concentracin del o los alergnicos consumidos; algunos pueden causar solamente
algn sntoma, otras por el contrario pueden causar hasta la muerte. La concentracin
de alimento o ingrediente con protena alergnica es mnima y en general oscila entre
los 5 a los 100mg de alergnico consumido (FDA Food Facts, 2007).
Una reaccin alrgica a los alimentos incluye tres componentes principales:
(Alimentacin sana, 2008)
6
1. Contacto con los alrgenos (sustancia que provoca la reaccin, casi siempre se trata
de una protena)
2. Inmunoglobulina E (IgE un anticuerpo del sistema inmunolgico que reacciona
frente a los alrgenos).
3. Mastocitos (clulas del tejido) y basfilos (clulas sanguneas), que cuando se
conectan con los anticuerpos IgE liberan histamina u otras sustancias que causan los
sntomas alrgicos. (Alimentacin sana, 2008).
Aproximadamente el 2% de adultos y cerca del 5% de nios y jvenes en los Estados
Unidos sufren de alergias alimentarias y cada ao aproximadamente 30,000 personas
acuden al hospital y 150 personas mueren a causa de las reacciones alrgicas. (FDA -
Food Facts, 2007).
En el ao 2004 el Congreso de los Estados Unidos aprob la Ley de Etiquetado de
Alrgenos Alimentarios y Proteccin del Consumidor (FALCPA, con sus siglas en
ingls). Con la nueva ley a partir del 1 de Enero de 2006, las etiquetas de los
alimentos (incluyendo los suplementos nutricionales) deben identificar claramente el
origen de todos los ingredientes que sean o se deriven de los alrgenos alimentarios
ms comunes. (FDA Food Facts, 2007).
Hasta el momento existen ms de 160 alimentos que pueden provocar reacciones
alrgicas, la nueva ley identifica los ocho alimentos alergnicos ms comunes. Estos
alimentos ocasionan el 90% de las reacciones alergnicas alimentarias y son las
fuentes de las que se derivan otros ingredientes. (FDA Food Facts, 2007).
Los ocho alimentos identificados por la ley son: Leche, Huevos, Pescado, Crustceos,
Frutos secos (Almendras, nueces, pecanas), Man, Trigo y Soya; estos ocho alimentos
y cualquier ingrediente que contenga protenas derivadas de uno o ms de ellos,
fueron designados por la ley como los principales alergnicos alimentarios. (FDA
Food Facts, 2007).
7
2.2.2 Diagrama de flujo para la fabricacin de un suplemento
Ver ANEXO B.
2.2.3 Descripcin de los equipos utilizados en la elaboracin de suplementos
2.2.3.1 Mezcladores o Blenders
La funcin de estas mquinas, como su nombre lo indica, es mezclar las materias

primas (secas) para que tengan uniformidad en el producto final; la mezcla se realiza
a travs de procesos de rotacin de la tolva y de un tornillo rotatorio dentro de esta el
cual realiza el movimiento de rotacin opuesto. Es importante tener en cuenta el
tiempo y la velocidad de rotacin de la tolva del mezclador as como la fuerza del
movimiento rotatorio del tornillo. La velocidad, fuerza y tiempo de homogenizacin
dependen de los ingredientes a mezclar y de cada una de sus propiedades (Keith
Machinery Corp., 2008).
El diagrama de flujo del Anexo C permite entender el proceso que se realiza en un
mezclador.
Los mezcladores o blenders como son conocidos varan en su tamao (de 1 a 100
pies cbicos) y forma dependiendo del producto que se va a manufacturar. Estos
pueden ser:
- Blenders en forma de V (Figura 1)
- Blenders en forma de Cono
- Blenders en forma de Trapecio
- Blenders Horizontales

P
M

2
M
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Partes Princ
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P
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Materiales:
2.2.3.2 Enca
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9
figura 2 se observa una encapsuladora marca Bosch modelo GKF 2500 (NJ M/CLI,
2008).

Figura 2. Encapsuladora Bosch GFK 2500
Partes Principales:
La mayora de las encapsuladoras modernas se encuentran divididas en cuatro o ms
partes principales, las cuales cumplen funciones especficas en el proceso de llenado
de las cpsulas; estas partes son:
1. Tanques de almacenamiento para las cpsulas vacas y recepcin del producto
en polvo procedente del blender.
2. Torre o Turret con segmentos para la recepcin de cpsulas vacas.
3. El proceso de llenado (estacin de estructura) se encuentra subdividido en:
Estacin de limpieza de los segmentos de recepcin.
Apertura de las cpsulas vacas con aire comprimido
Llenado Segn el peso establecido para cada cpsula
Cierre
Verificacin (las cpsulas defectuosas en este proceso son descartadas por
la mquina).
Tanque de cpsulas vacas
Tanque del producto en polvo
10
Expulsin de cpsulas.
4. Seleccin de las cpsulas por peso promedio (deduster)

En el anexo D se observa el diagrama de flujo para la obtencin de una cpsula
(Suplemento alimenticio) en las mquinas Bosch y Zanasi 40F.
Material: Acero inoxidable tipo 304, silicona y aluminio.
2.2.3.3 Tableteadoras
Estas mquinas son utilizadas para fabricar tabletas de distintas formas y tamaos
dependiendo del molde y los ponches que se instalen; el procedimiento se realiza
mediante la pre-compresin y compresin de la mezcla proveniente del blender, que
resulta en la formacin de una tableta compacta la cual debe cumplir estrictas
caractersticas fsicas como: dureza, tiempo de desintegracin, friabilidad y peso
promedio. Es importante establecer previamente el peso de cada tableta as como la
fuerza de pre-compresin y compresin. La seleccin de estas mquinas se debe
realizar basados en las mismas caractersticas de las encapsuladoras. En las figuras 3a
y 3b se observa una tableteadora marca J CMCO modelo J C-SH 31D (J CMCO, 2008).

Figura 3 - 3a. JCMCO modelo JC SH31D; 3b. Compresores y ponches
3b
3a
Ponches
Contenedor de entrada del polvo
Compresores
11
Partes Principales:
Ponches
Moldes
Plataforma bascula
Torre
Contenedor de polvo (Hopper)
Feed Frame (Dispensador de producto en polvo a la torre).
Material: Acero inoxidable tipo 304.

2.2.3.4 Recubrimientos y pinturas
Estas mquinas son el paso final de las tabletas antes de ser llevadas a la presentacin
final al consumidor. El material de recubrimiento debe presentar ciertas
caractersticas: (Universidad de Antioquia, 2008)
Debe ser estable durante el almacenamiento.
Debe producir un recubrimiento uniforme.
No debe ser txico.
No debe ser reactivo.
A su vez las tabletas deben tener unas condiciones especficas:
Baja friabilidad.
Velocidad de disolucin rpida.
No deben ser porosas.
Deben poseer una dureza que permita su manipulacin.
Deben ser los suficientemente impermeables para que no absorba los
solventes utilizados en el recubrimiento.
12
Los recubrimientos de las tabletas se clasifican en dos categoras: recubrimiento por
azcar, y recubrimiento por pelcula (entrica y no entrica).
El recubrimiento azucarado consiste en cubrir las tabletas en numerosas capas de
azcar, generalmente sacarosa y resinas como: zena, blsamo, talato-acetato-celulosa
y Shellac (laca purificada secrecin roja del insecto Laccifer lacca kerr). Alguno de
los componentes son utilizados para: liberacin controlada del principio activo,
mejoramiento de la apariencia, enmascaramiento de sabores y olores desagradables,
proteccin para el suplemento de la descomposicin producida por el oxgeno o la
humedad. (Universidad de Antioquia, 2008)
El recubrimiento por pelcula tiene las mismas funciones que el recubrimiento
azucarado, adems tambin se usa para evitar la destruccin del suplemento a pH
acido o por enzimas estomacales y para la liberacin continua del suplemento. Este
recubrimiento se realiza cubriendo las tabletas con una o ms sustancias naturales o
sintticas como diluyentes, azcares, plastificantes, resinas, gomas, alcoholes
polihdricos, ceras y agentes saborizantes. Actualmente, se utilizan polmeros
hidrosolubles (CMC, HEC, PE) y otros como dietilaminocelulosa y polisteres
sustituidos; los recubrimientos difieren con respecto al tiempo necesario para la
liberacin del producto. (Universidad de Antioquia, 2008)
Para realizar un buen proceso de recubrimiento es necesario tener en cuenta la mezcla
de pinturas para obtener el color deseado as como la reaccin que esta mezcla pueda
tener frente a los ingredientes de las tabletas. Por esto, siempre se recomienda realizar
lotes piloto y pruebas de estabilidad. El proceso de recubrimiento de las tabletas se
observa en el diagrama de flujo en el anexo F; a continuacin la figura #4 se observa
un equipo de recubrimiento marca Vector modelo VHC-5811 (Freund Vector, 2008).
13

Figura 4 Vector Hi Coater. Modelo VHC - 5811
Partes Principales:
- Contenedor principal
- Aspersores
- Entrada y salida de Aire

Materiales: Acero inoxidable tipo 306 en el contenedor principal, el resto de material
es acero inoxidable tipo 304 y silicona.

2.2.3.5 Equipos y Utensilios complementarios

Adems de los equipos anteriormente mencionados, existen otro tipo de mquinas
que directamente se encuentran relacionadas con la fabricacin del producto. Son
utilizadas cuando el polvo pre mezclado o alguna materia prima no cumplen con las
caractersticas fsicas requeridas para su produccin, por ejemplo los molinos, que
son utilizados cuando un producto posee partculas de gran tamao que dificultan la
fabricacin, la mquina disminuye el tamao de las partculas haciendo que estas se
transformen en partculas ms finas en un proceso conocido como pulverizacin o
molienda el cual mejorar la homogenizacin, mejorar el flujo del polvo en la mquina
(tableteadora o encapsuladora) y ajustar el color (Quiminet, 2003).
14

Igualmente, existen procesos que se encargan de realizar la accin contraria a la
pulverizacin, como la granulacin por va hmeda que consiste en la adicin de
alcohol (50 - 80%) al producto en polvo para la formacin de grnulos
(compactacin del material) y el eslogado o granulacin por compresin que consiste
en comprimir el polvo y molerlo para la elaboracin de partculas de mayor tamao.
(Quiminet, 2003)

Asimismo se deben tener en cuenta las herramientas manuales (palas de acero
inoxidable) utilizadas por los operarios para la adicin de producto a las mquinas o
para el peso de cada uno de las materias primas que van a formar el producto
(Groover, 1997).
2.3 Regulaciones para la manufactura de suplementos.
2.3.1 Buenas Prcticas de Manufactura (BPMs) Cdigo de Regulacin
Federal, Capitulo 21 parte 111

Ver Anexo G

2.4 Control de calidad de los suplementos Nutricionales

El control de calidad de los suplementos nutricionales se encarga de garantizar que
los productos manufacturados cumplan con las especificaciones con respecto a su
identidad, pureza, calidad, potencia y composicin (Crowley, 2006).

El grupo de control de calidad tambin est encargado de la toma y recoleccin de
muestras, todas las medidas tomadas por el departamento de calidad deben estar
debidamente documentadas. El departamento de calidad y el laboratorio deben
trabajar juntos en un solo equipo para garantizar que el producto cumple con las
especificaciones fsicas, qumicas y microbiolgicas requeridas. Las siguientes son
15
las caractersticas que el equipo de calidad junto con el laboratorio deben tener en
cuenta segn las BPMs para garantizar la calidad de los suplementos nutricionales:
(Crowley, 2006).

a. Olor
b. Sabor (si aplica)
c. Potencia
d. Identidad
e. Microbiologa
f. Tiempo de desintegracin
g. Variacin en el color
h. Tamao de la tableta
i. Empacado y/o etiquetado errneo.

Lo ms importante que se debe tener en cuenta para mantener un eficiente control
microbiolgico es: (Wirtanen, 2003)

Minimizar la carga microbiana que puede llegar por fuentes externas.
Control eficiente del crecimiento microbiano en zonas vulnerables (Puntos
Crticos)
Limpieza y desinfeccin adecuada de los materiales utilizados durante el proceso.

2.5 Establecimiento de Lmites para la Industria Nutracutica

Para el establecimiento de lmites de aceptacin se pueden tomar como gua los
parmetros que se siguen regularmente en la Industria Farmacutica. Estos
parmetros son: (Fourman et al, 1993).

Realizar una lista de todos los productos que son manufacturados en la compaa
Por cada producto identificar:
16
Tamao de Lote
Nmero de unidades por lote (miles de tabletas o capsulas por ejemplo).
Menor tamao manufacturado
Mxima dosis diaria
rea de contacto del producto sobre la superficie del equipo.

En el caso de una industria nutracutica donde los controles no son tan rigurosos y se
manufacturan numerosos tipos de suplementos, es conveniente usar un solo limite o
agrupar los productos segn la similitud que presenten sus ingredientes y continuar
con los parmetros mencionados, generalizando en todos los aspectos como si se
tratara de un solo producto (Agalloco, 1992).

2.5.1 Toma de muestras

Saber cmo y de donde se deben tomar las muestras para verificar los lmites de
aceptacin es un parmetro fundamental en la validacin de un proceso de limpieza,
algunos de los mtodos de toma de muestra son: (Agalloco, 1992).

Muestro con escobilln en areas abiertas
Muestreo con escobilln en areas cerradas
Producto Placebo
Examinacin Visual
Extraccin de solvente

2.5.1.1 Mtodos Analticos
Los mtodos analticos son desarrollados para asegurar que los ingredientes y
suplementos cumplan las especificaciones a lo largo de los procesos de manufactura y
17
distribucin, para de esta manera confirmar que las cantidades sealadas en las
etiquetas de los suplementos nutricionales son reales (Crowley, 2006).

Las muestras deben poder ser cuantificadas por mtodos analticos validados, ya sean
cualitativos o cuantitativos. El uso de ms de un mtodo analtico es til para la
confirmacin de los resultados. Los mtodos ms utilizados son: (Agalloco, 1992).

Mtodos especficos (Por cada ingrediente del producto): Utilizando adaptaciones
del mtodo de identificacin rutinario del producto se selecciona la tcnica ms
sensible con el nivel de deteccin ms especfico para verificar concentraciones
que se que se pueden presentar despus de un proceso de limpieza. Estos mtodos
deben estar validados. Algunos de los mtodos analticos especficos son: (FDA,
2005)

HPLC
Absorcin atmica
Fotometra de Flama
Deteccin enzimtica
Titulacin

Mtodos inespecficos: cuantificacin de Carbono Orgnico Total (TOC): Este
mtodo solamente identifica los carbonos orgnicos, no identifica residuos
especficos por lo que se hace difcil la cuantificacin. Es conveniente
complementar esta tcnica con un mtodo especfico para un determinado
ingrediente del producto. Otros mtodos inespecficos son:

pH
Conductividad.
Mtodos sensoriales, organolpticos.
18

La FDA recomienda los mtodos especficos para la cuantificacin de residuos (FDA,
2005).

2.5.1.2 Criterios de Lmites de Aceptacin.

Lmite Fsico

Tambin se conoce como Criterio de limpieza Visual o Visualmente Limpio
Generalmente se utiliza como revisin preliminar del equipo una vez se realiza el
proceso de limpieza. No debe existir ninguna cantidad visible de residuos despus de
la limpieza. En el caso de identificarse algn residuo se debe tomar una muestra para
su posterior anlisis (Fourman et al, 1993).

Lmite Qumico

Una vez cuantificados los residuos por los mtodos anteriormente mencionados, se
debe establecer el criterio por el cual van a ser evaluados, entre los criterios ms
utilizados se encuentran: (Agalloco, 1992).

Menor porcentaje de la dosis teraputica (Lowest Therapeutic Dose - LTD): entre
0.01 a 10% de ingrediente activo puede ser identificado tras un anlisis con un
mtodo analtico.
Porcentaje de dosis txica: Es utilizado para sustancias no activas pero txicas
como los detergentes, sanitizadores, desinfectantes etc. Son generalmente ms
amplios que los lmites LTD, y se deben establecer con base en los anlisis de
toxicidad como LD50.
Partes por milln y partes por billn: Algunos mtodos analticos proveen
resultados en estas unidades. Para saber la cantidad real es necesario relacionar
estos datos con la dosis teraputica o la dosis toxica. Un lmite bien conocido y
19
aceptado por la FDA es el de no ms de 10 ppm despus del proceso de
limpieza (LeBlanc, 1998).
Aunque se pueden utilizar uno o ms de los criterios mencionados, para el caso
de los suplementos nutricionales se recomiendan dos criterios de aceptacin: El
primero es con respecto a los productos que no presentan ningn riesgo (inocuos)
es de 1/100 y el segundo es para los productos que poseen ingredientes txicos
y/o alergnicos de 1/10000 (Frey, 2006).

Lmite Microbiolgico

El lmite microbiolgico es establecido bajo el criterio de una reduccin: logartmica
en la concentracin de UFC. En el caso de los microorganismos que se encuentran en
una suspensin el lmite es de una reduccin mnima de cinco unidades logartmicas.
Si se encuentran adheridos a una superficie el lmite ser la reduccin de mnimo tres
unidades logartmicas. Es por esto que las muestras para evidenciar los lmites
microbiolgicos deben tomarse antes y despus de realizado el proceso de limpieza
(Wirtanen, 2003).

Finalmente la ausencia de los microorganismos patgenos: Escherichia coli
Salmonella sp, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa (FDA The
bad bug book, 2008).

Seis pasos simples son sugeridos por FDA para realizar un control de calidad
despus de la limpieza de los equipos, estos pasos consisten en: (FDA, 1993).

Aplicar el concepto de visualmente limpio Visualmente limpio
Tomar muestras si se observan residuos despus de la limpieza utilizando alguno
de los mtodos anteriormente mencionados.
Tomar muestras para el recuento microbiolgico y la cuantificacin residual.
Cuantificacin de muestras por mtodos analticos.
20
Recuento de microorganismos Ausencia de patgenos
Comparar los resultados con los lmites de aceptacin.

2.6 Agentes Antimicrobianos

Segn EPA, son sustancias o mezclas de sustancias utilizadas para inhibir o eliminar
el crecimiento de cualquier tipo de microorganismo incluyendo esporas bacterianas.
Los principales usos de los agentes antimicrobianos son: (EPA, 2008)
Desinfectar, sanitizar, reducir o mitigar el crecimiento y desarrollo de
microorganismos.
Proteger los objetos inanimados, procesos o sistemas industriales, superficies,
agua u otras sustancias qumicas de contaminacin, suciedad, desgaste y deterioro
causado por bacterias, virus, mohos, protozoos, algas o biofilms.

En la actualidad existen dos grupos de productos Antimicrobianos: (EPA, 2008)

Productos que no son de salud pblica son utilizados especialmente para inhibir
el crecimiento de:
a. Algas.
b. Bacterias que causan el mal olor.
c. Microorganismos que deterioran, degastan y destruyen los materiales
d. Microorganismos patgenos para humanos.
Estos productos son utilizados en: Pintura, tratamientos textiles, torres de
enfriamiento.

Productos de salud pblica son utilizados para controlar los microorganismos
infecciosos en cualquier ambiente. Los productos comnmente utilizados se
pueden clasificar de la siguiente manera (EPA, 2008).

21

Esterilizantes

Son utilizados para destruir y eliminar todas las formas de vida microbiolgica,
incluyendo: mohos, virus, todas las formas de bacterias vegetativas y sus esporas. La
esterilizacin es importante para prevenir la aparicin de infecciones; es ampliamente
utilizada con los instrumentos mdicos y quirrgicos de los hospitales, as como en
las industrias alimentarias. La esterilizacin se puede realizar por mtodos fsicos o
qumicos (EPA, 2008). Los mtodos fsicos no son utilizados en la industria
nutracutica debido que estos pueden alterar las propiedades del producto final, sin
embargo en algunos casos es usada la radiacin ionizante (rayos gamma) sobre los
productos terminados que presenten algn tipo de contaminacin microbiolgica.
Dentro de los mtodos fsicos se incluyen: (USP/NF, 2007).

Vapor bajo presin (Autoclave)
Calor Seco y Hmedo
Bajar temperaturas
Presin osmtica
pH

Los mtodos qumicos incluyen sustancias altamente txicas para los
microorganismos (incluyendo esporas bacterianas) estos esterilizantes son: (USP/NF,
2007).

Glutaraldehdos - en una solucin acuosa al 2% v/v
Oxido de Etileno Inactiva enzimas y otras protenas que poseen grupos
sulfhidrilos, mediante la reaccin llamada alquilacin.

22
Desinfectantes y Sanitizantes Agentes de limpieza.

Segn FDA un sanitizante es un agente qumico o fsico el cual reduce los niveles de
contaminacin microbiana en una superficie inanimada, EPA seala que los
sanitizantes tambin son utilizados para reducir, pero no necesariamente eliminar
microorganismos de reas inanimadas a niveles que se consideren seguros por los
cdigos o regulaciones de salud pblica (Luppens, et al. 2002; Springthorpe, et al.
2005)

Por otra parte, FDA considera que un desinfectante es un agente qumico que elimina
microorganismos indeseables de superficies inanimadas, EPA completa esta
definicin especificando que un desinfectante es un agente qumico utilizado en
superficies inanimadas cuyo objetivo es destruir o inactivar de forma irreversible
mohos y bacterias, pero no necesariamente sus esporas (Luppens, et al. 2002;
Springthorpe, et al. 2005). El titulo 7 del Cdigo de los Estados Unidos (acta federal
de insecticidas, fungicidas, y rondenticidas FIFRA por sus siglas en ingles) ordena
que los desinfectantes deben estar registrados con EPA para su venta y distribucin
(Martnez, 2006).

Un desinfectante debe eliminar por lo menos un 99.999% (5 unidades logartmicas)
de patgenos bacterianos en un tiempo de 5 a 10 minutos, no necesariamente destruye
bacterias esporo formadoras o virus. Las caractersticas que un desinfectante debe
tener son: (Reynols, 2002; Fraise, 1999)

Amplio espectro de accin frente a los microorganismos
Baja toxicidad
Alta penetrabilidad
Estabilidad (Tiempo de almacenamiento)
Solubilidad (agua)
Compatibilidad con detergentes (Sinergismo)
23
Inoloro
No corrosivo.
No debe desteir.
Rpida accin

En la actualidad existen varios tipos de desinfectantes los cuales difieren en su
composicin y propiedades. Los tipos de desinfectantes pueden ser orgnicos o
inorgnicos.

Desinfectantes Inorgnicos.

Los desinfectantes inorgnicos son: (Mac Donell, 1999)

Metales: Dentro de los cuales se destacan mercurio, plata, bronce y zinc al
desactivar las protenas mezclndose con ellas, tambin alteran los grupos
funcionales de los cidos nuclicos, componentes de la pared y membrana.
cidos y lcalis: Se destacan el acido sulfrico, el acido ntrico, el hidrxido
de sodio y hidrxido potsico. Tienen como funcin alterar la permeabilidad
de la membrana y la coagulacin de protenas. Son bactericidas, fungicidas,
virucidas y esporocidas. Son corrosivos.
Compuestos inorgnicos oxidantes: Poseen accin bactericida, fungicida,
micobactericida y virucida, algunos son corrosivos como el acido per-actico.
Sus mecanismos de accin incluyen la inactivacin de protenas enzimticas y
de membrana; los compuestos de mayor tamao pueden alterar los radicales
amino, el grupo indol y la tirosina. Algunos de los compuestos inorgnicos
oxidantes ms importantes son:
a. Agua oxigenada: Como el agua oxigenada al 6% v/v, funcionan oxidando
los componentes de la membrana y las enzimas
b. Halgenos: Son compuestos altamente oxidantes, reactivos y destructivos
con los componentes vitales de los microorganismos. Algunos de estos
24
compuestos son el cloro y el iodo funcionan oxidando las protenas,
membranas y enzimas de los microorganismos.
Aldehdos: Su actividad se debe a la alquilacin de sulfhdrilos y otros grupos
funcionales que causan alteracin a protenas y cidos nucledos, poseen accin
bactericida, fungicida, micobactericida, virucida y esporocida. Son cancergenos y
estn clasificados como qumicos esterilizantes (Fraise, 1999).

Desinfectantes Orgnicos

Los desinfectantes orgnicos son: (MacDonell, 1999)

Alcoholes: Los alcoholes solubilizan la membrana celular y desnaturalizan las
protenas, tienen actividad bactericida, no son corrosivos pero si inflamables;
tienen una actividad residual limitada debido a su tasa de evaporacin y proveen
una actividad limitada en presencia de materia orgnica; adems, no se
consideran efectivos frente a esporas de mohos y bacterias. (Chemical
disinfectant, 2008)

La accin bactericida mejora a medida que la longitud de la cadena carbonatada
aumenta incluso aquellos con ocho y diez tomos de carbono (C
8
C
10
); los
alcoholes de cadenas ms largas de C
10
disminuyen la solubilidad en el agua lo
que conlleva a la perdida de la accin. (Chemical disinfectant, 2008)

El Alcohol isoproplico (60 90% v/v) est registrado en EPA con el cdigo
CAS#67-63-0 y se conoce tambin como: 2-Propanol, Isopropanol, Dimetil
Carbinol o Sec-propil Alcohol. Su temperatura de ebullicin es de 87C y su
punto de ignicin es de 25C. Debe evitar utilizarse en zonas donde exista riesgos
de chispas; de igual forma no se debe utilizar a elevadas temperaturas ni se debe
exponer a una llama abierta (EPA, 1999). Es un desinfectante excelente por su
rpida accin y por no dejar residuos qumicos sobre las superficies, sin embargo
25
la accin de este desinfectante disminuye cuando es diluido por debajo de un 50%
v/v en una solucin con agua; no es considerado como un desinfectante de alto
nivel debido a que no inactiva esporas de bacterias ni algunos virus, sin embargo
son efectivos frente a VIH. Para su almacenamiento es necesaria un rea fra y
ventilada debido a que es inflamable. (Chemical disinfectant, 2008).

Sus ventajas son: Rpida accin bactericida, no es corrosivo con el metal,
econmico, no deja residuos qumicos que requieran un enjuague posterior.

Sus desventajas son: Rpida evaporacin Inactivacin en presencia de materia
orgnica que se puede dar por la adsorcin del desinfectante a coloides de
protenas, formacin de complejos inertes o poco activos y unin de grupos
activos del desinfectante a protenas extraas (Chemical disinfectant, 2008).

A continuacin (tabla 1) se observan los niveles de actividad de los desinfectantes
en donde se clasifica a los alcoholes en un nivel intermedio (Russell, 1998).
Tabla 1. Niveles de actividad de los desinfectantes

Fenol y compuestos fenlicos: El fenol (acido carboxlico) fue el primer
desinfectante usado por J oseph Lister en 1867, en la actualidad no es utilizado
26
como desinfectante debido a su toxicidad, debido a esto es reemplazado por
compuestos fenlicos que son sustancias derivadas del fenol menos toxicas y con
mayor actividad frente a los microorganismos. Se caracteriza por ser bactericida,
fungicida y micobactericida; el fenol y los compuestos fenlicos alteran la
permeabilidad de la membrana citoplasmtica, desnaturalizan las protenas de los
microorganismos (forma vegetativa) e inactivan las oxigenasas y deshidrogenasas
de la membrana. (Fraise, 1999)

Amonios Cuaternarios: Son utilizados como desinfectantes y antispticos, son
tensoactivos (sirven como detergentes), efectivos para inhibir el crecimiento de
bacterias Gram positivas y Gram Negativas, aunque estas ltimas en menor
proporcin. Son bactericidas, fungicidas y virucidas; la actividad se desarrolla
tanto sobre medio cido como alcalino, aunque en ste ltimo tiene mejor accin.
Se inactivan fcilmente en presencia de materia orgnica (Quiminet, 2006)

Actan extracelularmente incrementando la permeabilidad de la bicapa lipdica,
con la consecuente prdida de los componentes citoplasmticos. Adems,
atraviesa la pared celular cargada negativamente reduciendo la perdida de potasio
y provocando la desnaturalizacin de protenas. (Fraise, 1999).

La tabla #2 muestra el efecto de los desinfectantes ms conocidos sobre la mayora
de los microorganismos y en el anexo H se nombran las ventajas y desventajas de
algunos desinfectantes (Wirtanen, 2003).
Tabla 2 Caractersticas de los Desinfectantes
Agente Qumico Accin Usos
Etanol (50-70%) Denatura protenas y
solubiliza lpidos
Antisptico utilizado en la
piel o en superficies
Isopropanol (50-70%) Denatura protenas y
solubiliza lpidos
Antisptico utilizado en la
piel o en superficies
27
Agente Qumico Accin Usos
Tintura de Yodo (2% I
2
en
70% alcohol)
Inactiva protenas Antisptico utilizado en la
piel
Nitrato de plata (AgNO
3
) Precipita protenas Antisptico general y
utilizado en los ojos de
recin nacidos
Cloruro de mercurio
(HgCl)
Inactiva protenas por
reaccin con los grupos
sulfuro

Desinfectante. En
ocasiones utilizado como
componente en
antispticos para la piel.
Detergentes Ruptura de membranas
celulares
Leve efecto desinfectante
y antisptico para la piel.
Compuestos fenlicos Denatura protenas y
rompen las membranas
celulares
Antispticos a bajas
concentraciones,
desinfectantes en altas
concentraciones
Oxido de etileno Agente alquilante Desinfectante utilizado
para la esterilizacin de
objetos sensibles al calor
como goma y plsticos.

Detergentes

Se conocen con el nombre de Detergentes o Agentes tensoactivos a las sustancias que
disminuyen la tensin superficial y de superficies lmites del agua, actuando as como
agentes humectantes, emulsionantes, dispersantes y adsorbentes. Pueden ser desde
agua pura hasta soluciones con detergentes y otras sustancias llamadas aditivos que
ayudan a la remocin del sustrato. Los limpiadores acuosos estn disponibles en
polvo o en lquidos concentrados. Este tipo de limpiadores es el que se usa para la
limpieza de metales, ya que estos son capaces de eliminar residuos orgnicos e
28
inorgnicos de las superficies slidas, as como: partculas, pelculas, aceites ligeros,
disolventes y otros tipos de limpiadores resultantes del proceso de fabricacin. Los
agentes limpiadores usan una combinacin de propiedades fsicas y qumicas para
eliminar contaminantes de sustrato (Procter & Gamble, 2005).
Los agentes limpiadores acuosos ofrecen una variabilidad en su aplicacin, ya que su
rendimiento depende de la medida de su formulacin, dilucin y temperatura. Los
limpiadores acuosos cidos o alcalinos pueden tener ciertas desventajas como el
hecho de atacar las superficies metlicas. Por eso con frecuencia se aaden aditivos a
estos agentes con el fin de minimizar los efectos adversos, otra desventaja es que su
consumo de agua es mayor y el proceso de secado puede prolongarse por ms tiempo
(Procter & Gamble, 2005).
Las propiedades que los agentes limpiadores poseen son: (Procter & Gamble, 2005).
Humectacin: Se entiende como la capacidad de mojar ms, es decir una
misma gota de agua es capaz de abarcar una mayor superficie de contacto.
Penetracin: Como la palabra lo indica, es la capacidad de penetrar o
introducirse en las superficies porosas sucias o en la suciedad.
Emulsin: Es la dispersin o suspensin de finas partculas de uno o ms
lquidos en otro lquido. Por ejemplo el aceite o grasa en agua.
Suspensin: Consiste en dejar la suciedad o partculas de suciedad en
solucin, evitando que estas se vuelvan a re depositar.
Los ingredientes que pueden incluir los agentes limpiadores son:
a. Detergentes alcalinos
Estos se caracterizan por poseer ingredientes altamente alcalinos como el hidrxido
de sodio (soda caustica) o el hidrxido de potasio (potasio caustico). Una de las
grandes ventajas que brindan este tipo de detergentes es la emulsificacin de las
grasas y alteracin en los enlaces de las protenas.
29
Para inhibir la corrosin por el detergente se agrega a la formula silicatos que son
sales que impiden el desgaste del metal. Estos detergentes solo son utilizados en las
industrias de alimentos (Chemestry and New Zealand, 2007).
b. Detergentes cidos
Estos pueden ser tanto orgnicos como inorgnicos; los cidos inorgnicos ms
utilizados son: fosfrico, ntrico, sulfmico, sulfato cido de sodio y el clorhdrico y
entre los cidos orgnicos estn el cido hidroxiactico, ctrico y glucnico. El
mecanismo de accin de estos detergentes, es por reaccin qumica de los cidos
sobre la superficie disolviendo las partculas adheridas a ella.
c. Solventes
Se usan para darle volumen y diluir las formas peligrosas de detergentes. Por ejemplo
los lcalis fuertes suelen diluirse con rellenos con el fin de hacer ms fcil su
manipulacin. El agua es utilizada como principal relleno y para soluciones en polvo
se usa el cloruro y/o sulfato sdico (Chemestry and New Zealand, 2007).
d. Acondicionadores acuosos
Previenen la acumulacin de diversos minerales que pueden inactivar la accin del
agente limpiador. Estos iones son los mismos que le confieren la dureza al agua
(Calcio y Magnesio), la funcin entonces de los acondicionadores acuosos es la de
formar complejos solubles con estos iones para permitir la accin normal del agente
limpiador. Algunos de estos acondicionadores son: gluconato sdico y el acido
etildiaminotetraacetico. (Chemestry and New Zealand, 2007).
e. Surfactantes
Los surfactantes son el grupo ms importante dentro de la composicin de un
detergente. Un surfactante reduce la tensin superficial del agua cuando es utilizado
en bajas concentraciones. Un surfactante consta de dos partes moleculares: parte
soluble (hidroflica) e insoluble (hidrofbica). (Chemestry and New Zealand, 2007).
30
La parte hidrofbica es una cadena carbonada de 8 a 18 carbonos, que puede ser
aliftica, aromtica o ambas, esto confiere la hidrofobicidad a la molcula; las
cadenas suelen ser grasas naturales, aceites, fracciones de petrleo, polmeros
sintticos pequeos o alcoholes sintticos de peso molecular considerable. La parte
hidroflica es la que clasifica al surfactante, entre: aninicos, catinicos y no inicos.
Los aninicos son los surfactantes carboxilados, sulfatados o fosfatados; los
catinicos son producto de las aminas. Finalmente, los no inicos se asocian al agua
que est enlazada por enlaces ter a una cadena de poli etilenglicol, en este caso la
parte hidroflica terminal de la molcula se enlaza mejor y ms fuerte con la molcula
de agua. (Chemestry and New Zealand, 2007).

Surfactantes aninicos

En una solucin con agua, la parte hidroflica de un surfactante tiene una carga
negativa; estos detergentes son efectivos en cuanto a la remocin de aceites en
superficies, debido a que pueden reaccionar con la carga positiva de los iones del
agua, por lo tanto cualquier ion puede afectar la efectividad del surfactante; entre
mayor sea la dureza del agua, es decir, mas iones de calcio o magnesio all en la
solucin, el surfactante aninico puede ser desactivado. Para prevenir la prdida del
efecto del surfactante dentro del detergente existen otras sustancias, las cuales
capturan los iones de magnesio y calcio presentes dentro de la solucin. Los
detergentes aninicos ms comunes son los alquil sulfonatos, alquil etoxilatos y
jabones; son utilizados para la limpieza en las industrias farmacuticas, alimenticias y
nutracuticas (Procter & Gamble, 2005). Las figuras 5a, 5b y 5c muestran los
diferentes tipos de Surfactantes aninicos.

31

Figura 5. A. Alquil ter sulfato; B. Alquil sulfato Linear; C. cidos grasos y jabones.

Surfactantes catinicos
En soluciones acuosas la parte hidroflica est cargada positivamente. Existen 3
posibles usos de surfactantes catinicos:

En los suavizantes y los detergentes que tienen suavizantes usan surfactantes
catinicos.
En los detergentes de lavadora los surfactantes catinicos mejoran la
capacidad de los surfactantes aninicos de encapsular partculas de suciedad,
ya que reduce la tensin interfacial entre el agua y la suciedad.
Poseen propiedades desinfectantes y sanitizadores, por lo que son utilizados
en las sustancias limpia baos (Procter & Gamble, 2005).

Las figuras 6a y 6b son algunos ejemplos de surfactantes catinicos:

32

Surfactantes no-inicos (Figura 6c)
No poseen carga y esto hace que la dureza del agua no afecte al detergente, son
excelente removedores de grasa. La mayora de los detergentes contienen tanto
surfactantes aninicos como no-inicos, los surfactantes no-inicos ms comunes son
los teres de los alcoholes grasos (Procter & Gamble, 2005).
Finalmente, en la figura #7 se observa la eficacia de algunos agentes de limpieza
sobre una determinada poblacin microbiana.

Figura 7 Eficacia de los agentes de limpieza (concentracin microbiana vs tiempo de exposicin)
Figura 6 Surfactantes catinicos: A. Esquerato; B. Amonio cuaternario; C. Surfactante no inico:
33
2.6.1 Factores que influyen en la actividad de los antimicrobianos

Ver ANEXO I.

2.7 Mecanismos de evaluacin de los desinfectantes.

Con el fin de obtener el registro ante la EPA, en el acta FIFRA se encuentran las
guas para la evaluacin de los desinfectantes (considerados como pesticidas), las
cuales establecen que se deben realizar pruebas de efectividad del desinfectante
mediante mtodos utilizados por la Asociacin Oficial de Qumicos Analticos
(AOAC) para poder obtener el registro. Las pruebas que se reportan son: Pruebas
soporte (Carrier test), y de dilucin de uso (Use-Dilution) para evidenciar la
actividad bactericida, micobactericida, y esporocida; estas pruebas se conocen como
Pruebas de efectividad de los desinfectantes o DET's por sus siglas en ingles
(Martnez, 2006).

En resumen si se utiliza un desinfectante que este registrado con EPA, este ya se
encuentra evaluado. La concentracin recomendada, espectro de accin, condiciones
y tiempo de exposicin ya han sido establecidos.

Cuando el desinfectante es preparado in situ es necesaria una calificacin la cual es
equivalente a las pruebas realizadas para el registro ante la EPA.

Recientemente en el ao 2007, la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) expidi
la seccin <1072> Antispticos y Desinfectantes en la cual se detalla la
metodologa que puede desarrollarse para realizar la evaluacin de la efectividad de
los desinfectantes; las pruebas que la farmacopea sugiere son el coeficiente fenlico
34
(pruebas en suspensin) y la dilucin de uso (pruebas carrier), las cuales estn
incluidas dentro de los DETs (Martnez, 2006).

Sin embargo, estas no son las nicas pruebas que se deben realizar a los
desinfectantes. Los DETs no representan las condiciones de uso real, adems
existen grandes dificultades para DETs en cuanto a su repetibilidad y a su
reproducibilidad de resultados (Reyboruck, 1998). En estas no se toma en cuenta el
proceso de limpieza completo; es por esto que la toma de muestras despus de un
proceso de limpieza y desinfeccin in vivo asegura tanto la efectividad real del
desinfectante como del mismo proceso de limpieza (Martnez, 2006).

Los DETs se dividen en tres: pruebas en suspensin, pruebas soporte Carrier y
desinfeccin de superficies. Para brindar seguridad en cuanto a la eficacia de un
desinfectante es conveniente realizarle los 3 tipos de estudios (Reyboruck, 1998).

2.7.1 Pruebas en suspensin

Existen diferentes tipos de pruebas en suspensin: Las pruebas en suspensin
cualitativas, el mtodo del coeficiente fenlico y las pruebas en suspensin
cuantitativas. Todas tienen en comn el siguiente procedimiento: un volumen
apropiado de suspensin bacteriana es adicionado a una concentracin determinada
de una solucin de desinfectante. Despus de un tiempo prudente de exposicin la
muestra es examinada para evidenciar si la suspensin bacteriana fue inhibida o no.
Los resultados cualitativos se dan como crecimiento o no crecimiento.

Mientras que para las pruebas en suspensin cuantitativas se procede a realizar
recuentos para identificar el efecto microbiocida (Microbiocidal Effect, ME), para
que un desinfectante apruebe un test de suspensin cuantitativa de haber inhibido por
lo menos al 99.999% de los microorganismos lo que equivale a la reduccin de 5
unidades logartmicas (Reybrouck, 1998).
35

2.7.1.1 Dilucin en tubo

Se realizan diferentes soluciones del desinfectante. El mismo volumen de cada
dilucin se adiciona en tubos estriles, a cada tubo se le aade la misma cantidad de
una suspensin del microorganismo utilizado como prueba. A determinados
intervalos de tiempo se transfiere un alcuota de cada tubo a otro que contenga medio
de cultivo. Estos tubos inoculados se incuban a la temperatura y crecimiento ptimo
de crecimiento segn el microorganismo. Al cabo de este tiempo se examina el
crecimiento del microorganismo mediante la aparicin o ausencia de turbidez en el
tubo (crecimiento positivo o negativo). Aquellos tubos que presentan crecimiento
negativo indican la dilucin a la cual ese agente qumico inhibe al microorganismo
prueba. El control de la prueba se realiza con agua estril siguiendo el mismo
procedimiento (Rojas, 2001).

Una complementacin de esta tcnica es el aislamiento e identificacin de una
muestra representativa de los tubos positivos con el fin de confirmar que el
crecimiento pertenece al microorganismo estudiado y descartar una posible
contaminacin que altere los resultados promoviendo la aparicin de resultados
falsos negativos respecto a la presencia de turbidez (Reybrouck, 1998)

Por otra parte tambin es importante tener en cuenta las propiedades del o de los
desinfectantes en el momento de realizar la transferencia al tubo con medio de cultivo
ya que la accin bactericida de algunos desinfectantes puede continuar aun despus
de haber realizado la transferencia al tubo a incubar lo que prolongara el tiempo de
exposicin; si el desinfectante se inactiva por dilucin (como el alcohol ) el
procedimiento y los resultados pueden ser confiables, pero si por el contrario no se
inactiva por dilucin (que es lo que se realiza al momento de la transferencia), se
debe realizar una pre-transferencia a un medio neutralizante (MN) los cuales tienen
compuestos que inactivan la accin bactericida del o los desinfectantes permitiendo
36
de esta forma obtener resultados reales de la prueba evitando los resultados falsos
negativos (Sutton, et al, 2002).

2.7.1.2 Sensibilidad antimicrobiana (Kirby-Bauer)

La sensibilidad antimicrobiana tambin se puede evaluar de forma semi-cuantitativa
observando los halos de inhibicin de un agente antimicrobiano bien sea antibitico o
desinfectante. La tcnica consiste en preparar una suspensin con una concentracin
conocida de microorganismo del orden de 10
8-7
ufc/mL. La suspensin es inoculada y
sembrada masivamente en una placa de agar Mueller Hinton, el cual permite una
mayor difusin del agente antimicrobiano; para que el medio permita la difusin de
debe cumplir con ciertas caractersticas: profundidad de medio de 4 a 5 mm y el pH
debe ser de 7.4 +/-0.2. A su vez depende de ciertos factores como la concentracin de
microorganismo sembrado y la concentracin de cationes divalentes que hay en el
medio (Murray, et al. 1983). Discos de papel filtro son sumergidos en una
concentracin determinada del desinfectante y colocados sobre la placa de agar con el
microorganismo, el control de la tcnica son discos impregnados con agua estril. La
lectura se realiza segn el tiempo de incubacin de los microorganismos. Se deben
observar halos que indican la inhibicin del crecimiento, estos deben ser medidos; a
mayor dimetro de halo mayor es la efectividad del desinfectante (Olson, 2007).

2.7.1.3 Coeficiente Fenlico

Es la tcnica ms conocida para la evaluacin de los desinfectantes en suspensin,
esta validada por la AOAC (Phenol Coefficient Method 955.11); en esta se compara
la accin bactericida de un determinado desinfectante frente a la del Fenol; se prepara
una suspensin conocida del microorganismo, concentraciones de los desinfectante
de prueba en tubos (dilucin recomendada, una mayor y una menor a esta con un
volumen final de 5mL). De igual forma se preparan tres concentraciones de fenol
segn el microorganismo de estudio generalmente 1/100, 1/90,1/80. Una vez
37
preparado el material se adicionan 0.5 mL o una asada de la suspensin a los tubos
con la dilucin. El estudio evala tres tiempos de exposicin (5, 10 y 15 minutos) por
cada dilucin tanto de desinfectante prueba como de dilucin de fenol, cada vez que
pase un tiempo de exposicin se transfieren 0.5 mL o una asada (4 mm) del tubo la
dilucin y microorganismo a un caldo nutritivo y este se deja incubar segn el tipo de
microorganismo en estudio. Los resultados son expresados cualitativamente
(crecimiento o inhibicin del crecimiento) a cada uno de los tiempos de exposicin,
teniendo en cuenta la dilucin del desinfectante y fenol que no inhiba a los
microorganismos a los cinco pero si a los diez y quince minutos con respecto a cada
uno de los microorganismos, para obtener el numero del coeficiente fenlico, el cual
expresa cuantas veces es mejor el desinfectante de prueba que el fenol, se aplica la
ecuacin #1; si el nmero es menor a 1 no se recomienda la utilizacin del
desinfectante por lo menos a esa concentracin. (AOAC, 2005)

C. F =
Mayur d||uc|un de dex|nectante que |nh|ha e| crec|m|entu en 5 m|n peru nu en 1 m|n
Mayur d||uc|un de Fenu| que |nh|ha e| crec|me|ntu en 5 m|n peru nu en 1 m|n

Ecuacin 1. Nmero del Coeficiente fenlico

2.7.2 Pruebas Carrier
2.7.2.1 Mtodo de la Dilucin de Uso
Este mtodo validado por la AOAC (Use-Dilution Method 955.15) se utiliza para
verificar la accin de un desinfectante frente a un microorganismo el cual esta
adherido a una superficie inerte. El mtodo consiste en contaminar el soporte -
carrier (material caracterstico de la industria como: acero inoxidable, polietileno,
PVC, etc.) sumergindolos con una suspensin del microorganismo en una
concentracin conocida por 30 minutos; despus del tiempo de exposicin, el soporte
es extrado de la suspensin y se deja secar a temperatura ambiente. Luego, el soporte
es sumergido en una dilucin conocida de desinfectante por 10 minutos (tiempo
estandarizado) y finalizado el tiempo de exposicin el soporte es extrado y
38
depositado en un Medio Neutralizante por 30 minutos para finalmente ser adicionado
a un caldo de crecimiento. La lectura se realiza de forma cualitativa observando la
turbidez de tubo, esta prueba se debe realizar simultneamente con mnimo 10
soportes para mayor confiabilidad. Una modificacin a esta tcnica que esta validada
por la AOAC es la adicin de materia orgnica como interferente, con el fin de
evidenciar inactivacin de la accin bactericida del desinfectante. Con el objetivo de
confirmar la inactivacin del desinfectante frente al microorganismo prueba sobre la
superficie la prueba se acompaa de controles de: viabilidad del microorganismo,
pureza de la materia orgnica (si es el caso) y un procedimiento paralelo en el que se
reemplaza el desinfectante por agua destilada estril (AOAC, 2006).

2.7.3 Pruebas en superficie In Vivo
Este tipo de prueba se maneja en condiciones reales, tiene como objetivo verificar la
dilucin de uso del desinfectante bajo condiciones reales en la industria. La prueba
consiste en contaminar la superficie (segmento de acero inoxidable) con un inculo
del microorganismo (concentracin conocida), despus del tiempo de exposicin al
desinfectante se de determina el numero de microorganismos sobrevivientes por
contacto directo con agar nutritivo (caja de petri) o por la tcnica de lavado, en la cual
la parte es lavada con un diluyente y el nmero de bacterias es determinado en
solucin residual. La tcnica puede ser reemplazada directamente por la toma de
muestras del proceso de limpieza realizado en la industria (Reybrouck, 1998).

2.8 Limpieza
Se entiende por limpieza como el proceso de empleo correcto de productos qumicos

(antimicrobianos) en una secuencia dada para disminuir la suciedad y los agentes
39
contaminantes de forma que no se afecte la calidad del producto; teniendo en cuenta
los factores que influyen directamente como la concentracin, temperatura, tiempo de
exposicin y utilizacin de herramientas. Para realizar la limpieza se utilizan los
agentes qumicos anteriormente mencionados que disminuyen la carga residual y
microbiana a lmites aceptables. Esta ltima puede ser neutralizada inhibiendo el
crecimiento bacteriano con agentes bacteriostticos o eliminndolos con los agentes
bactericidas (Gerhard, 2000).

Con el fin de realizar un buen proceso de limpieza se deben seguir cierto orden bsico
citado a continuacin: (Office of Environmental Health, 2004; Schimdt, 2008)

Lavado
Limpiado
Relavado
Sanitizacin/ desinfeccin

2.8.1 Limpieza manual de equipos
Es la limpieza que realizan los operarios en la cual se emplea un esfuerzo fsico,

utilizando cepillos, trapos y esponjas (accin mecnica). El personal debe tener la
capacitacin adecuada para realizar este tipo de procedimientos y de igual manera se
debe brindar una supervisin al proceso manual de limpieza; este tipo de limpieza es
considerada como la de mayor riesgo debido a que los equipos o partes de los equipos
entran en contacto directo con el operario, adems que requiere el desarme total de la
mquina lo que conlleva a un mayor tiempo muerto (desarmado, lavado y
ensamblado) de la mquina, lo que se ve reflejado en costos de produccin. (Cdigo
de Regulacin Federal, Capitulo 21 parte 111).
Debido a las variaciones que el o los operarios puedan tener durante el desarrollo del
proceso de limpieza, no se puede llevar a cabo la validacin de este, debido a que
40
una de las principales caractersticas de una validacin es la repetibilidad que debe
tener el proceso; es por esto que solo es conveniente evaluar el proceso. En algunos
casos estos son considerados como el caso o condicin crtica de una industria
(Agalloco, 1992; Morales, 2006).

2.8.2 Limpieza Automatizada de equipos
2.8.2.1 COP (Clean-Out-of- Place)
Sistema automtico o semi-automtico de limpieza que requiere un desarme parcial

de los componentes mayores de los equipo, estas son llevadas a cuartos de lavado en
donde un tanque lava las partes por ciclos, utilizando diferentes agentes de limpieza
(detergentes y desinfectantes) a presin y a una temperatura determinada.
Actualmente es utilizado principalmente en industrias farmacuticas, nutracuticas y
de alimentos. Este tipo de limpieza minimiza los riesgos de contaminacin debido a
que no hay contacto directo con el operario durante el proceso. Por la robustez que el
proceso confiere a la limpieza COP puede ser evaluado y validado (Office of
environmental Health, 2004).

Fuente: Sanimatic, 2008
Figura 8 Clean Out of Place
41
2.8.2.2 CIP (Clean-In-Place)
El sistema Clean In Place (Limpieza in situ) es un procedimiento automtico,

reproducible, con un lavado y enjuague confiable de las soluciones de limpieza a
travs de los equipos y tuberas del rea de manufactura; hasta el momento ha
demostrado que mejora tanto la calidad del producto como la limpieza de los equipos
y la planta. (A&B Process Systems, 2008)
Adems, este sistema tiene la capacidad de limpiar sin necesidad de desmontar la
totalidad de las partes de un equipo, es un sistema integrado de: tanque, vlvulas,
filtros, unidades de intercambio de calor, tuberas, entre otros. Consiste bsicamente
en ciclos consecutivos de lavados utilizando: limpiadores (alcalinos, cidos e
intermedios), desinfectantes, seguido de un lavado con agua purificada. Este sistema
reduce la mano de obra (limpieza manual) y tiempo; adems, garantiza el
mejoramiento de la limpieza y desinfeccin con respecto a la limpieza manual
(Bremer, et al. 2005; Anderson, 2007).
Tipos de sistemas CIP: (Bremer, et al. 2005; Anderson, 2007)
Sistema simple: la solucin de limpieza es introducida en al sistema,
terminado el proceso se descarga y por ltimo se enjuaga.
Sistema de recirculacin: este sistema de limpieza implica la preparacin de la
solucin de limpieza en un tanque externo, debido a que la solucin se re
circula hasta el punto que los ciclos de limpieza hayan finalizado.
Este tipo de sistemas de limpieza son empleados por industrias farmacuticas,
nutracuticas, alimentarias, bebidas y biotecnolgicas.
42

Fuente: Anderson, 2007
Figura 9 Clean in Place
2.9 Descripcin del proceso de limpieza manual

Ver ANEXO J .
2.10 Mecanismos de resistencia de los microorganismos
Los microorganismos tienen variabilidad en la resistencia a los desinfectantes, a

continuacin (figura #10) se encuentran en forma decente, de los ms resistentes a
43
los de menor resistencia: (Russell, 1998)

Fuente: Russel, 1998
Figura 10 Resistencia de los microorganismos a los desinfectantes.
2.10.1 Intrnseca
2.10.1.1 Bacterias
La composicin en la pared celular de las clulas bacterianas vara entre un grupo y

otro, lo que explica en parte la diferente actividad de un biocida frente a los distintos
+

R
e
s
i
s
t
e
n
c
i
a

-

44
microorganismos. (Russell, 1997). A continuacin en la tabla 3 se observan los
mecanismos de resistencia de las bacterias a diferentes desinfectantes

Tabla 3 Mecanismos de resistencia intrnsecas de las bacterias a los desinfectantes.
Tipo de resistencia
Ejemplo(s) Mecanismos de resistencia
Impermeabilidad
Bacterias gram-negativas QACs, triclosan, diaminas Barrera presentada por la membrana externa que
puede prevenir la toma de antispticos o
desinfectantes; el glicocalix puede estar
involucrado
Micobacterias Clorhexidina, QACs

Glutaraldehido
Cera de la pared celular previene adecuadamente
la entrada del biocida
Razn para la resistencia de algunas especies de
M. chelonae
Esporas bacteriales Clorhexidina,
QACs, fenlicios
La cubierta de las esporas y corteza presenta una
barrera a los antispticos y desinfectantes
Bacterias gram-positivas Clorhexidina El glicocalix/mucoexopolisacarido presenta una
barrera asociada con la reduccin de la difusin
del antisptico
Inactivacin
(mediada cromosomalmente)
Clorhexidina El rompimiento de la molcula de clorhexidina
puede ser responsable de la resistencia
Fuente: Mac Donell, 1999.

Las esporas bacterianas son el estado de latencia de las bacterias vegetativas, no hay
sntesis de macromolculas, su contenido de agua es bajo (10-15%), el pH es una
unidad menor que el de las bacterias vegetativas, no poseen metabolismo. Tienen
estructuras de resistencia (intrnsecas) diferentes a los dems microorganismos que
les confieren resistencia a altas temperaturas, radiacin y agentes qumicos como el
45
Alcohol isoproplico, el cual pierde su efecto frente a estas debido a que poseen una
serie de capas impermeables protectoras que impiden el paso de las molculas de
Alcohol isoproplico. Estas capas estn conformadas por una membrana interna igual
a la de las clulas vegetativas, una pared celular con un peptidoglicano deshidratado
(esporo especfico) llamado cortex, una membrana exterior tambin llamada capa
cortical formada por protenas ricas en cistena y finalmente un recubrimiento
delgado formado por queratina llamado exosporio (Russell, 1998). En la figura 11 se
observan las principales estructuras de resistencia de una espora bacteriana.

Fuente: Wampler, 2005
Figura 11 Estructuras de resistencia de las esporas bacterianas.
2.10.1.2 Mohos y levaduras
Las paredes celulares representan una barrera natural para reducir y excluir la entrada
de un desinfectante. Uno de los grandes factores que afecta la resistencia intrnseca de
los mohos y levaduras es la edad del cultivo ya que a mayor edad las capas externas
adquieren un mayor grosor aumentando la probabilidad de resistencia a agentes
antimicrobianos. A continuacin (tabla 4) se muestran los posibles mecanismos de
46
resistencia intrnseca que tienen los mohos y levaduras (Russell, 1998; Mac Donell,
1999).
Tabla 4 Mecanismos de resistencia - Levaduras y Mohos
Tipo de resistencia Posible mecanismo Ejemplos

Intrnseca
Exclusin Clorhexidina
Inactivacin enzimtica Formaldehdo
Modulacin fenotpica Etanol
Adquirida
Mutacin Algunos preservativos
Respuesta mediada por los
plsmidos
No demostrado a la fecha

Fuente: Mac Donell, 1999.

2.10.2 Adquiridas
Son las resistencias que se dan por mutaciones genticas, plsmidos y transposones
que les confieren caractersticas nicas de resistencia a algunos microorganismos, la
mayora se observan en los biofilms (Russell, 1998).

47
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA

3.1 Problema
La evaluacin de un proceso de limpieza manual de equipos es realizado con el fin de

garantizar la identidad, potencia y pureza de los suplementos nutricionales a travs de
los procesos de manufactura y empaque.
La evaluacin de este proceso optimizara otros que dependen o estn
interrelacionados. La limpieza de equipos es un proceso que busca disminuir la
concentracin microbiana y residual a lmites aceptacin establecidos por la
compaa y por organismos reguladores en cada pas que garantizan la seguridad al
consumidor final.
Es necesario evaluar el proceso de limpieza manual de una industria nutracutica
para asegurar y certificar que sus productos cumplen con la regulacin establecida y
son aptos para el beneficio del consumidor final?

3.2 Justificacin

Durante la manufactura, empaque, etiquetado y sellado de un suplemento nutricional
se utiliza una gran variedad de equipos y utensilios que facilitan estos procesos. Los
equipos de mayor importancia son los utilizados en el rea de manufactura debido a
que es aqu donde se: pesan y mezclan las materias primas y donde se fabrican las
tabletas, capsulas o softgels que van a salir al mercado. A su vez es el rea donde el
producto tiene el mayor tiempo de exposicin a las condiciones ambientales de
fabricacin incluyendo el contacto directo con las superficies de los equipos y los
operarios.

48
La limpieza adecuada de los equipos del rea de manufactura es uno de los factores
que ayudan a evitar la contaminacin por microorganismos y el paso de residuos de
un producto a otro. El origen natural de los suplementos nutricionales implica la
ausencia de preservantes o sustancias artificiales para el control de la contaminacin.
En consecuencia, se deben realizar controles, evaluaciones y anlisis del o los
procesos de limpieza, siendo estos ms continuos y rigurosos en el caso de un
proceso de limpieza manual, debido a que este tipo de procesos no pueden ser
validados.

Al mantener el proceso de limpieza manual y sus componentes evaluados
peridicamente se garantiza la seguridad del producto en cuanto a su identidad,
pureza y composicin, cumpliendo de esta manera con las normas de las Buenas
Prcticas de Manufactura para los suplementos nutricionales y con las
especificaciones de calidad expuestas por la FDA.

49
4. OBJETIVOS

4.1 General

Evaluar el proceso de limpieza manual utilizado en la fabricacin de suplementos
nutricionales cumpliendo con los requerimientos establecidos para la limpieza de
equipos en el rea de manufactura segn la CFR 21 parte 111.

4.2 Especficos
Evaluar la efectividad antimicrobiana del desinfectante y detergente empleado

en la compaa
Evaluar la efectividad de la remocin de material orgnico por parte del
detergente.
Evaluar la actividad antimicrobiana de la concentracin del desinfectante
empleado en la compaa en presencia de microorganismos patgenos.
Evaluar la actividad antimicrobiana del desinfectante en presencia de materia
orgnica.
Evaluar la afinidad del desinfectante sobre la superficie de trabajo (acero
inoxidable tipo 304).
Establecer los lmites de aceptacin fsicos, qumicos y microbiolgicos
parmetros de evaluacin.
Emplear los parmetros para la evaluacin de la limpieza manual en los
equipos de manufactura.
Evaluar el proceso de limpieza manual en condiciones crticas (Worst Case).

50
5. HIPOTESIS

La hiptesis manejada en el trabajo de grado solo hizo referencia a una concentracin
especfica de desinfectante (70% v/v), debido a que esta es la solucin utilizada en la
compaa para la inhibicin del crecimiento microbiano en los equipos de
manufactura.
Hi: La solucin de alcohol isoproplico al 70% v/v es efectiva para la desinfeccin de
equipos del rea de manufactura.
Ho: La solucin de alcohol isoproplico al 70% v/v no es efectiva para la
desinfeccin de equipos del rea de manufactura.

51
6. MATERIALES Y MTODOS
6.1 Identificacin de los microorganismos prueba.

Los microorganismos empleados en cada una de las tcnicas provienen de cultivos
liofilizados (Lyfocults) reconocidos por las colecciones de la American Type Culture
Collection (ATCC) organizacin privada sin nimo de lucro dedicada a la
recoleccin, conservacin y distribucin de los cultivos autnticos de
microorganismos existentes, virus, DNA, plantas, clulas de animales y el hombre.

Figura 12. Lyfocults (Fuente: MSL Microbiologicals)

Los cultivos fueron almacenados a una temperatura (Nevera VWR #R414GA14) de
2 a 8c como lo sugieren las especificaciones de uso, teniendo en cuenta que no se
pueden congelar para ser utilizados nuevamente; estos se encuentran conformados
por: Terminal con asa estril, asa de inoculacin, fluido para rehidratar, cultivo
liofilizado del microorganismo.

Una vez reconstituidas las cepas liofilizadas fueron transferidas a cajas de petri
(Spectrum, Cat # 960-35563) con agar nutritivo para ser preservadas. La
conservacin consista en repiques mensuales a un agar nutritivo (Agar tripticasa de
soya TSA, BD #221283) teniendo en cuenta que cada nuevo pase se incub
(Incubadora Boekel N132000) por 48 horas (bacterias) y 72 horas (levadura) a una
t
c
L
s
u
T
P
O
l
(
temperatura
coloracin d
La identidad
siembra en
utilizados.
Tabla 5 Agar
Microo
Escher
Salmone
Pseudomon
Staphyloco

Posteriormen
Oxi/ferm tub
152) en el c
levadura (C
(Dextrosa, M
de 35C
+/-
de Gram (Kit
d de los mic
agares sele
res Selectivos
organismo
richia coli
ella enterica
nas aerugino
occus aureus
nte se realiz
be II* (BD,
caso de Stap
Candida albic
Manitol, Lac
2C
. El contr
t Gram, BD
croorganism
ectivos B
Mac Co
Xilosa L
Hecktoe
Eosina A

Mac Co
Xilosa L
Hecktoe
Eosina A
osa Cetrimi
Vogel J
z identifica
Cat #90000
hylococcus
cans) con u
tosa, Sacaro
Figura
52
rol de calida
#212539) e
mos se confir
Bacterias. La
onkey (EMD
Lisina Desox
en (EMD #1
Azul de Met
onkey (EMD
Lisina Desox
en (EMD #1
Azul de Met
ide (BD #1.0
J ohnson (EM
acin de bac
0-496), prue
aureus y sie
una posterior
osa).
a 13 Oxi Ferm
ad de las cep
en cada uno d
rm median
a Tabla 5
Medio de cu
D #1.05465)
xicolato X
.05287)
tileno - EMB
D #1.05465)
xicolato X
.05287)
tileno - EMB
05284)
MD #1.05284
cterias Gram
eba de la coa
embra en ag
r prueba de
m tube II
pas se realiz
de los repiqu
nte coloraci
da a conoc
ultivo
XLD (EMD #
B (EMD #1
XLD (EMD #
B (EMD #1
4)
m negativas p
agulasa (BD
gar nutritivo
fermentaci

z mediante
ues realizado
n de Gram,
cer los agar
#1.05405)
.01342)
#1.05405)
.01342)
por el sistem
, Cat #9000
(TSA) para
n de azcar
la
os.
, y
res
ma
03-
la
res
53
*Oxi/Ferm tube II es un tubo plstico con divisiones, conformado por doce medios de
cultivo diferentes, que permiten la determinacin de un total de quince reacciones
bioqumicas. Est creado para la inoculacin simultnea de los doce medios de
cultivo con una sola colonia, utilizando la aguja de inoculacin dispuesta en el centro;
la combinacin de las reacciones junto con la gua de interpretacin de resultados
permite la identificacin del microorganismo. (BBL #90000-496)

Las pruebas realizadas se dividieron tanto en pruebas in vivo e in vitro una
explicacin general de los pruebas se encuentra en el anexo K.
6.2 Agentes de limpieza.
6.2.1. Evaluacin de la efectividad antimicrobiana Desinfectante y Detergente
6.2.1.1 Pruebas en suspensin.
6.2.1.1.1 Dilucin en tubo y sensibilidad antimicrobiana (Kirby - Bauer)
Desinfectante y Detergente. (Diagrama de flujo Ver Anexo L)

En primer lugar se aislaron cada uno de los microorganismos en agar nutritivo (TSA)
con un tiempo de incubacin de 24 horas en el caso de las bacterias y 72 horas como
mnimo para la levadura a una temperatura de 35C +/- 2C. Una vez terminado el
tiempo de incubacin se prepararon 5 mL de suspensin de cada uno de los
microorganismos en agua destilada (Zephyrhills) estril, teniendo en cuenta que se
mantuvo a una concentracin aproximada de 12x10
8
ufc/mL la cual es equivalente
al tubo nmero cuatro de la escala nefelomtrica de Mac Farland. La confirmacin de
la concentracin se realiz mediante recuento en placa en agar Plate Count (EMD,
Cat #1.05463).
Para la preparacin de las concentraciones de los agentes de limpieza nicamente se
llev a esterilizar (Electric Pressure Steam, model 25x) el agua necesaria para la
preparacin de cada una de las concentraciones (Volumen final: 4.5 mL); debido a
que el Alcohol isoproplico y el Alconox no se pueden esterilizar (perdida de
propiedades). Una vez esterilizado el material se procedi a preparar las
54
concentraciones de cada agente de limpieza: Desinfectante - Alcohol isoproplico
anhdrido al 50,70 y 80%v/v (USP 99.9%) y Detergente Alconox al 0,5%; 1%; 2%
p/v (Alconox

Cat #1101) dentro de la cabina de flujo laminar, una vez listo el
material se tom un solo tubo por cada concentracin.
En la tcnica de sensibilidad antimicrobiana, la siembra de los microorganismos se
realiz masivamente en las placas de agar Mueller Hinton (BD #221177) por
duplicado, una vez que se obtuvieron listas el total de placas del ensayo se colocaron
tres pozos estriles (longitud 0,5 cm aproximadamente) en cada una de las cajas; con
la ayuda de una micropipeta (VWR-100L, Cat #40000-208) se adicionaron 100 L
del agente de limpieza (Alcohol isoproplico o Alconox) a cada uno de los pozos,
finalizado el procedimiento se incub a una temperatura de 35C +/- 2C. El empleo
de los pozos se descart debido a que la rpida evaporacin del alcohol isoproplico
no permiti observar mediante la presencia de los halos de inhibicin la accin
biocida por parte del agente qumico sobre cada uno de los microorganismos.
El empleo de los pozos fue remplazado por sensidiscos estriles (Whatman Filtro #1;
Cat #100125), cada uno de ellos se humedecieron con la solucin del agente de
limpieza correspondiente seguido de su colocacin sobre la superficie del agar con la
ayuda de unas pinzas estriles. Esto se realiz por duplicado en la misma caja con su
correspondiente control (Agua destilada Estril), teniendo en cuenta que por cada caja
se evalu una sola concentracin. Terminado el montaje, se llevaron a incubar una
temperatura de 35C +/- 2C por 24 horas para bacterias y 72 horas para levadura.

La tcnica de dilucin en tubo es una modificacin de la tcnica original, en la cual se
evalu el efecto de los agentes de limpieza con respecto a los microorganismos a tres
tiempos de exposicin (1, 5,15 minutos).

Durante esta tcnica se utilizaron diecinueve tubos con Caldo BHI (Difco, Cat #
211057), 500 mL de agar TSA, cuarenta cajas de Petri (VWR, Cat #960-35563), un
paquete con veinte pipetas estriles (VWR, Cat #14670-201), un cronmetro (VWR)
55
y una gradilla. Teniendo en cuenta que el material anterior era por cada
microorganismo a evaluar.
Los tubos con la concentracin del agente de limpieza (Alcohol isoproplico o
Alconox) fueron inoculados con el microorganismo de prueba con la ayuda de la
micropipeta (0.5 mL), cada vez que se cumpla uno de los tiempos de contacto se
tomaban 3 mL con la ayuda de una pipeta estril; 1mL para adicionarlo en el tubo de
BHI y los 2 mL restantes se adicionaban en cajas de petri para realizar siembra en
profundidad.

El control de los microorganismos se realiz sembrando 1mL de la suspensin patrn
en una caja de petri seguido de la adicin del agar nutritivo. Terminado el ensayo se
incubaron las cajas de petri a una temperatura de 35C +/- 2C por 24 horas para
bacterias y 72 horas para la levadura.

La lectura de los resultados se llev a cabo cualitativamente en ambas tcnicas,
teniendo en cuenta que para la tcnica de sensibilidad antimicrobiana se evalu la
presencia o ausencia de halos indicando de esta manera la sensibilidad o resistencia
del microorganismo.

Por otra parte, la tcnica de dilucin en tubo se evalu por la presencia de turbidez en
los caldos de BHI o el crecimiento en las cajas de petri con respecto a la caja control
del microorganismo, teniendo en cuenta que cada resultado positivo (presencia de
turbidez) se confirm mediante coloracin de Gram y siembra en agares selectivos.

6.2.1.1.2 Mtodo del Coeficiente Fenlico para el Alcohol isoproplico USP
segn la AOAC 955.11. (Diagrama de flujo Ver Anexo M)

La metodologa descrita a continuacin es una modificacin del mtodo de la AOAC
955.11.
56
Al igual que en la tcnica de dilucin en tubo nicamente se llev a esterilizar el agua
necesaria para la preparacin de las diluciones de Alcohol isoproplico y Fenol
(Labchem, Cat #LC 18195-2) teniendo en cuenta un volumen final de 5 mL. Las
concentraciones de los desinfectantes (Alcohol isoproplico: 20% a 80% v/v y Fenol:
1/60 a 1/100) se prepararon en la cabina de flujo con las precauciones necesarias (uso
de mscara North 7700-30L). Es necesario tener en cuenta para el almacenamiento
de las soluciones oscuridad, ventilacin y una temperatura aproximada de 18
C
aproximadamente.

Para esta metodologa se utilizaron los siguientes materiales: Suspensin del
microorganismo con 24 horas de incubacin para el caso de las bacterias y 72 horas
para la levadura, diecisis tubos con caldo BHI, un tubo por cada concentracin de
Alcohol isoproplico y fenol, un paquete de asas plsticas estriles (VWR, Cat #
12000-810), cronmetro y gradilla.

Las concentraciones de Alcohol isoproplico y fenol se distribuyeron de la siguiente
forma:

Tabla 6 Concentraciones de Alcohol isoproplico y fenol (empleadas)
Concentracin (v/v)
Microorganismo Fenol Alcohol
Escherichia coli
1/80,1/90,1/100
20%,30%,50%,60%,70%, 80%
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella Typhi
20%,30%,50%,70%, 80%
Staphylococcus aureus 1/60,1/70, 1/90, 1/100
Candida albicans 1/70, 1/80, 1/90, 1/100 30%,50%,60%,70%, 80%

57
Cada uno de los microorganismos fue evaluado mediante un set que contena dos
diluciones del fenol, tres del alcohol isoproplico y diecisis tubos de caldo BHI.

A los tubos con las diluciones del fenol y alcohol isoproplico se le adicion 0.5 mL
(500L) del microorganismo de prueba. Una vez fue adicionado el microorganismo
se agit manualmente.

El contacto entre el microorganismo y el desinfectante se evalu a los 5, 10 y 15
minutos, terminado el tiempo de contacto se inocul a partir de la solucin (Fenol o
alcohol isoproplico y microorganismo) al caldo nutritivo BHI (agitar los tubos
suavemente) con la ayuda de una asa estril, finalizado el procedimiento se llevaron a
incubar los tubos (VWR, Model 1510E) a una temperatura de 35C +/- 2C.

La lectura de los tubos se realiz cualitativamente por la presencia (Positivo:
crecimiento) o ausencia (Negativo: inhibicin del crecimiento) de turbidez, los tubos
positivos se identificaron y confirmaron por las pruebas nombradas anteriormente. La
metodologa se realiz por triplicado para la verificacin de resultados. Obtenidos los
resultados se procedi a calcular el nmero del coeficiente de la siguiente manera:

Numero Coeficiente Fenlico =
Mayor dilucin del desinfectante que inhiba al microorganismo en 10min pero no en 5min
Mayor dilucin del fenol que inhiba al microorganismo en 10min pero no en 5min

Ecuacin 2 Nmero del coeficiente fenlico
6.2.1.2 Prueba en soporte Carrier.

6.2.1.2.1 Mtodo de la dilucin de uso - AOAC 955.15. (Diagrama de flujo ver
Anexo N)

El mtodo a continuacin es una modificacin del Use Dilution Method de la AOAC
955.15.
58

Para la evaluacin de superficies fueron necesarios dos frascos de vidrio con su tapa
respectiva, veintin soportes de acero inoxidable tipo 304 que fueron cortados a partir
de un tubo de 30 cm de largo y un dimetro de 5 mm dejando cada uno de ellos con
una longitud de 5 mm de ancho por 5 mm de largo aproximadamente; posteriormente
los soportes fueron limados utilizando un esmeril (Dayton #4Z123H), gancho estril,
30 mL de materia orgnica (Suero Bovino) al 0.01g/mL (1%p/v), 0.125g/mL
(12.5%p/v) nicamente para Escherichia coli y 0.25 g/mL (25%p/v) para ambos
microorganismos; 60 mL de suspensin de Escherichia coli y Staphylococcus aureus
con 54,48 y 24 horas de incubacin, tubos de plstico con tapa estriles, 20 tubos con
la solucin de Alcohol isoproplico al 70%, 11 tubos con 2,5 mL de agua destilada
estril, 3 contenedores plsticos estriles de 100mL (VWR #15004-012), Solucin de
NaOH 1N, Veintin tubos de 5 mL con Caldo Letheen modificado (AOAC 955.11),
veintitrs tubos de 5 mL con Caldo BHI, dos cajas de petri con papel filtro,
micropipeta, puntas estriles (VWR #83007-380), pipetas estriles, cronmetro,
gradillas.

La metodologa para la evaluacin de superficies se dividi en cinco segmentos, en
los cuales se evalu la interferencia de la materia orgnica en la accin bactericida del
alcohol isoproplico al 70%

A. Preparacin de los soportes:

Para dar inicio al mtodo fue necesario contar con al menos veintin cilindros por
microorganismo. Los soportes fueron sumergidos en una solucin de 30 mL de
NaOH al 1N en un contenedor de 100 mL durante 12 horas a temperatura ambiente.
Terminado el tiempo, estos se lavaron con agua destilada estril; por cada lavado se
tom una muestra de 5 mL del proceso a la cual se le agregaron de dos a tres gotas de
fenolftalena al 1% para la verificacin de residuos de NaOH. La presencia de estos
residuos se evidencia por el cambio de color que genera la fenolftalena en el agua
59
(color fucsia). El nmero de lavadas puede variar hasta que la muestra de agua
residual no presente cambio de color en presencia de fenolftalena (incoloro).
Terminado el lavado de los cilindros fueron depositados en dos frascos de vidrio
pequeos; diez cilindros en uno (frasco #1) y once en el otro (frasco #2). Se adiciono
agua destilada a los frascos hasta cubrir completamente. Los cilindros se llevaron
autoclavar durante 15 minutos a 15 libras de presin y 121
o
C.
B. Preparacin del cultivo prueba:
Los microorganismos fueron seleccionados en base a las caractersticas morfolgicas
presentadas por las bacterias, Escherichia coli (bacteria Gram Negativa) y
Staphylococcus aureus (bacteria Gram positiva).
Para la preparacin del cultivo prueba fueron necesarios: Cajas con cultivo estndar,
quince tubos de BHI con 5 mL por cada microorganismo teniendo en cuenta que se
necesitaban cultivos estndar con 24,48 y 54 horas de incubacin.

Cada uno de los microorganismos estndar que se evaluaron estaban conservados en
cajas de petri, a partir de cada una de las cajas se realizaron repiques a caldo BHI
teniendo en cuenta los tiempos de incubacin. Por cada uno de los periodos de
incubacin se realizaron pases del cultivo a cinco tubos con 5 mL de caldo BHI. Un
total de 25 mL de caldo BHI por cada tiempo de incubacin. La primera serie se llevo
a incubar durante 54 horas, la segunda serie durante 48 horas y la tercera durante 24
horas; los tiempos fueron estimados de acuerdo con la hora destinada para la
realizacin del test.

Terminado el tiempo de incubacin se realiz una mezcla de los quince tubos de cada
microorganismo formando una solucin stock con un volumen final de 75 mL de
suspensin microbiana. (30 mL para el test, 45 mL para controles positivos y
negativos.)
60
Los materiales se asignaron teniendo en cuenta que en se realizaron cinco pruebas, en
las cuales fueron evaluados los siguientes parmetros:

Tabla 7 Parmetros a evaluar en la evaluacin de superficies.

En cada una de las pruebas los materiales se asignaron de la siguiente manera:
Tabla 8. Distribucin del material Evaluacin de superficies

C. Desarrollo del mtodo:
Prueba #1
a. De la mezcla de microorganismos se tomaron 30 mL y se adicionaron a los 30 mL de
la solucin de materia orgnica, se mezclaron cuidadosamente y se incubaron 1 hora
a 35C +/- 2C.
b. Terminado el periodo de incubacin se adicionaron 5 mL de la mezcla a cada uno de
los diez tubos (estriles) requeridos para esta prueba.
Microorganismo Materia Orgnica Solucin de Alcohol isoproplico 70% Soporte
Prueba 1 X X X X
Prueba2 X X X
Prueba 3 X X
Prueba 4 X
Prueba 5 X
Caldo BHI Caldo Letheen Soportes estriles
Solucin de
Alcohol al 70%
Tubos estriles
Prueba #1 10 10 10 10 10
Prueba #2 10 10 10 10 10
Prueba #3 1 1 - - 1
Prueba #4 1 - - - -
Prueba #5 1 - 1 - -
61
c. Se extrajeron los cilindros del frasco #1 con un gancho estril y se depositaron con
cuidado en la solucin de microorganismo y materia orgnica para formar la solucin
prueba (2). Se incubaron por 30 minutos a 35C +/- 2C.
d. Posteriormente el soporte fue extrado, utilizando el gancho, de la solucin para ser
colocado en una caja de petri con papel filtro (3), se incubaron a una temperatura de
35C +/- 2C por 30 minutos (Secado). No ms de cinco cilindros por cada caja.
e. Terminado el tiempo de secado se colocaron los soportes durante un periodo de 10
minutos en la solucin de Alcohol isoproplico al 70% (4).
f. Finalizado el tiempo de contacto, el soporte se adicion durante 30 minutos al caldo
Letheen (5) para la neutralizacin de la solucin de Alcohol isoproplico
g. Para una completa confirmacin del test el soporte se coloco en caldo BHI (6)
despus del contacto entre el soporte y el caldo Letheen.

1. Cilindro estril. 2. Solucin Prueba. 3. Caja de petri con papel filtro. 4. Solucin de alcohol
isoproplico al 70%v/v. 5. Caldo neutralizador (caldo Letheen). 6. Caldo BHI.
Figura 14 Metodologa general para la prueba #1 del mtodo de superficies.
Tener en cuenta que durante el pase de los cilindros a cada uno de los tubos (Caldo
Letheen y BHI) se debe evitar el contacto con las paredes de estos para evitar falsos
positivos. En caso que un cilindro entre en contacto con las paredes de los tubos el
tubo debe ser marcado. Si ms de un cilindro de las pruebas 1 y 2 o el cilindro de la
prueba 3 entran en contacto con las paredes del tubo el mtodo se debe repetir.

Prueba # 2 (Control negativo)

a. De los 45 mL de solucin de microorganismo restante se adicionaron 2.5 mL a
cada uno de los 10 tubos estriles restantes. (25 mL)
1. 2. 3.
4. 5.
6.
62
b. A cada uno de los tubos con microorganismo se adicionaron 2.5 mL de agua
destilada estril para formar la solucin prueba (2).
c. Terminado el proceso de preparacin de la solucin prueba se siguieron los
mismos parmetros de la prueba #1.

Prueba # 3 (Viabilidad de los microorganismos prueba)

a. La solucin de prueba consiste en 5mL de la solucin del microorganismo
nicamente.
b. Se procedi bajo los mismos parmetros de la prueba #1, teniendo en cuenta que
en esta no se emplea la solucin de Alcohol isoproplico (4).

1. Cilindro estril. 2. Solucin del microorganismo. 3. Caja de petri con papel filtro. 4. Caldo
neutralizador (caldo Letheen). 5. Caldo BHI.
Figura 15 Metodologa para la prueba #3 del mtodo de superficies
Prueba # 4 (Control microbiolgico de la materia orgnica)
a. Se tom 1 mL de la solucin de materia orgnica (1) y se sembr en caldo BHI
(2).
b. Se incubo a 35C durante 24 horas.

1. Solucin de materia orgnica (Suero Bovino). 2. Caldo BHI.
Figura 16 Metodologa para la prueba #4 del mtodo de superficies.
1.
1. 2.
2. 3. 4. 5.
63

Prueba # 5 (Control microbiolgico de los cilindros)
a. Con la ayuda del gancho estril se transfiere el soporte a caldo BHI. (evaluacin
microbiolgica).

D. Lectura de resultados:

a. Una vez terminadas las pruebas, se llevaron a incubar los tubos con caldo Letheen
y BHI 35C +/- 2C por 48 horas.
b. Las lecturas se realizaron por la aparicin de turbidez en cada uno de los caldos.
c. Los resultados (Tabla 9 ) se informaron de la siguiente manera:
Tabla 9. Interpretacin de resultados. Evaluacin de Superficies.

Numero de tubos Interpretacin
>8 tubos positivos
La materia orgnica interfiere
en la accin bactericida del
desinfectante sobre la
superficie.
5 a 7 tubos positivos
La actividad del desinfectante
se ve afectada, para mayor
seguridad repetir la prueba o
aumentar la concentracin de
materia orgnica.
<5 tubos positivos
La materia orgnica no
interfiere en la actividad
bactericida del desinfectante
sobre la superficie.
64
Todos los tubos de la prueba #2 tienen que ser negativos al igual que los controles
microbiolgicos (pruebas 4 y 5). Por otra parte la Prueba #3 tiene que arrojar
resultados positivos confirmando que la viabilidad del microorganismo sobre el
acero inoxidable.
d. Se realiz un repique en agar TSA para los tubos positivos (turbios) de las pruebas 1
y 3 para la confirmacin de los microorganismos. Se incubo a 35C por 48 horas.
e. Teniendo en cuenta el tipo de microorganismo que se evaluaba se realizaron pases a
agares selectivos desde el agar TSA. Para el caso de Escherichia coli a agar EMB y
Staphylococcus aureus a Vogel J ohnson seguido de la prueba de la coagulasa. Se
incubo a 35C por 48 horas. Los resultados de la coagulasa fueron observados 4
horas despus de haber sido incubados.

6.2.2 Evaluacin de la efectividad del detergente para la remocin del material
orgnico. (Diagrama de flujo - ver Anexo O)
El propsito del estudio de la efectividad de la limpieza es demostrar que los agentes

de limpieza que se utilizan son efectivos en la remocin de residuos despus del
proceso de manufactura. Tpicamente un nivel de residuo remanente menor a un 0.1%
p/p es aceptado para el caso de productos con alrgenos alimentarios. (OMS, 2002)

a. Se prepar una solucin de Alconox al 1% (solucin recomendada), lista la
solucin de 1mg/mL del detergente se procedi a realizar la solucin de materia
orgnica.
b. Para la preparacin de la solucin de materia orgnica se pes 1 gramo del
producto sea tableta o polvo de la capsula y se adicion a 10 mL de agua destilada.
c. Listos los materiales se pesaron los soportes (Ci) -Cilindros de Acero inoxidable
tipo 304, se le adicion con la micropipeta 0.5 mL (500 L) de la solucin de
materia orgnica y se dej secar a temperatura ambiente.
65
d. Secos los soportes se pesaron nuevamente para obtener lo que conocemos en los
datos como cilindro sucio CS, luego se procedi a llevar cada uno de los
soportes al desintegrador (Vankel 35-1200) aproximadamente por 50 veces dentro
de la solucin de Alconox.
e. Terminado el tiempo de exposicin al agente de limpieza se extraen de la solucin
y se dejaron secar a temperatura ambiente para luego pesarlos nuevamente lo cual
se conoce en los datos como cilindro limpio CL.
f. Obtenidos los datos en el ensayo se remplazaron los valores en la siguiente
ecuacin:

%Rex|duu rextante = 1uu%
Pcso CI -Pcso Ci
Pcso CS -Pcso Ci

Ecuacin 3 Evaluacin de la efectividad de Alconox Porcentaje de Residuo

El residuo restante no deber ser mayor a 0.1% para que el uso del detergente sobre la
superficie sea aceptado.
6.3 Proceso de limpieza manual
6.3.1 Evaluacin del proceso de limpieza segn limites fsico, qumicos y
microbiolgicos.
6.3.1.1 Condiciones Normales.
Durante 4 meses se monitoreo la limpieza manual de los distintos equipos utilizados

en las reas de manufactura y empaque de la compaa, revisando las posibles causas
que afectan el proceso de limpieza. Para realizar el monitoreo se tuvieron en cuenta
las mquinas que tienen mayor rea de contacto con el producto. Dentro de los
equipos monitoreados en el rea de manufactura se encuentran mezcladores en V
(V-Blenders), tableteadoras, encapsuladoras, aplicador de recubrimiento y en el rea
de empaque se encuentran las mquinas de llenado de botellas.
66

En cada una de las mquinas se evaluaron los lmites fsicos, qumicos y
microbiolgicos previamente establecidos:

La evaluacin del lmite Fsico consisti en revisar las mquinas despus de haberse
realizado la limpieza tipo A (Limpieza total del equipo incluyendo desensamble),
para este procedimiento no se requiere material solamente consisti en revisar
visualmente el equipo.
El lmite Qumico fue evaluado tomando una muestra lote posterior de produccin en
bolsas estriles, al cual por mtodos qumicos como HPLC (PE Nelson Elmer) y
Absorcin atmica (240 - FS fast sequential atomical, Varian. Inc) se analiz el
ingrediente activo del producto anterior y los residuos de detrgete Alconox. Los
resultados obtenidos se compararon con los lmites establecidos.
Por otra parte, el lmite Microbiolgico se evalu el recuento en placa de bacterias
mesfilas aerobias, mohos y levaduras, teniendo en cuenta que la toma de cada una
de las muestras se realiz en los puntos crticos de limpieza que entran en contacto
directo con el producto. Para la toma de muestra se emplearon escobillones estriles
hmedos con medio de transporte (BBL, Cat # 18740002) los cuales fueron
correctamente marcados con el nombre de la mquina (para ser almacenados a una
temperatura de 2 a 8C), lugar de muestra, nombre del producto retirado, tiempo
(antes o despus de la limpieza); para la toma de muestra se emple la tcnica de
zig-zag dentro de un rea de 24 cm
2
a 30 cm
2
.

Una vez obtenidos los escobillones se procedi a sembrar los escobillones en agar
nutritivo PC para bacterias y PDA para mohos y levaduras. Se incubaron a 35C +/-
2C por 48 horas para bacterias y 5 das para la levadura a una temperatura de 18C
+/- 2C.

67
Pasado el tiempo de incubacin se realizaron los recuentos que presentaban
crecimiento. Con ayuda de los escobillones almacenados se les realizaron pases a
tubos con caldo BHI y Caldo Lactosa, los cuales se incubaron a 35C +/- 2C por 48
horas; terminado el tiempo de incubacin los tubos que presentaron turbidez se
sembraron en agares selectivos con la ayuda de un asa estril para evidenciar si
exista la presencia de microorganismos patgenos (Escherichia coli, Salmonella
enterica, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus).
6.3.1.2 Condicin crtica

La evaluacin de la limpieza manual se realiz durante la produccin de un
suplemento diettico que tiene como funcin la remocin de toxinas del cuerpo, este
producto contiene como ingrediente activo microorganismos del gnero Lactobacillus
sp en concentraciones de 1 billon de UFC/g capsula, entre otros.

Este suplemento diettico fue escogido para la evaluacin de la limpieza debido a su
ingrediente activo (microorganismo) y el tamao del lote. condicionamientos
extremos

Los parmetros evaluados durante la evaluacin fueron lmite fsico, qumico y
microbiolgico.

Lmite fsico: La evaluacin del lmite fsico se realiz siguiendo las especificaciones
de visualmente limpio al igual que durante los controles de la limpieza manual.

Lmite Qumico: Para evidenciar la efectividad del proceso de limpieza se tomo una
muestra del siguiente lote en produccin al suplemento diettico. El siguiente
producto fue identificado como Glucosamina.

68
Lmite microbiolgico: se tomaron muestras con escobillones estriles en: Blender
V-60 (mezclador) y Bosch #2 (Encapsuladora)
Control fsico: Inspeccin visual
Control Qumico: Las capsulas de Glucosamina se abrieron para adicionar el polvo a
un contenedor estril, se pesaron aproximadamente 8 gramos, una vez pesados se
adicionaron 80 mL de agua peptonada al 0.1% (Difco #218071) - Dilucin 1/10, se
llev a incubar durante 30 minutos a 35C. Terminado el tiempo de incubacin se
realiz una dilucin 1/10 de la solucin del contenedor tomando una alcuota de 1 mL
y adicionndola al tubo con agua destilada estril (Tubo #1). Se realiz la misma
secuencia para realizar una segunda dilucin. (Tubo #2). De cada uno de los tubos 1 y
2 se tom una alcuota (1 mL) para sembrar en las cajas de petri (dos cajas por cada
dilucin). Finalizado el procedimiento se adicion agar MRS (BD #1.10660) a las
cajas de petri.
Una vez listas las cajas de petri, se colocaron dentro de la cmara de anaerobiosis
(BD #260672) con los respectivos sobres (BD #260678) e indicadores de oxido
reduccin (BD #251051). Se incub a 35C +/- 2C por un periodo de 4 das.
Concluido el tiempo de incubacin se extrajeron las cajas de la cmara y se realiz el
recuento de cada una de ellas.
Control microbiolgico: Se tomaron muestras por zig-zag antes y despus del
proceso de limpieza en las superficies de contacto directo con el producto en cada
una de las mquinas empleando escobillones estriles en un rea aproximada de 24-
30 cm
2
. Una vez obtenidos los escobillones se sembraron (Masivo) en agar nutritivo
TSA y PDA. Incubndose a 35C +/- 2C por 48 horas para bacterias y 18 C +/-
2C por 5 das (Mohos y Levaduras). Finalizado el tiempo de incubacin se realiz
el recuento de los microorganismos. En el caso de que haya crecimiento en el agar PC
se siembra el escobilln en caldos nutritivos Lactosa y BHI para la verificacin de
patgenos incubndose a 35C por 48 horas.
69
En el caso de que se haya evidenciado turbidez en los caldos se realizan pases de la
siguiente manera:
1. Caldo Lactosa: Agar McConkey, XLD, Hecktoen y EMB. Identificacin de
Escherichia coli y/o Salmonella sp.
2. Caldo BHI: Agar Cetrimide y Vogel J ohnson. Identificacin de Pseudomonas
aeruginosa y Staphylococcus aureus respectivamente. Si el crecimiento es
positivo para Staphylococcus aureus se debe realizar la prueba de la coagulasa.
3. Los escobillones fueron almacenados de 2 a 4C para un posterior uso.
La lectura de resultados se realiz segn los lmites microbiolgicos establecidos por
la compaa.
Igualmente, el control de la limpieza tambin se le realiz recuentos en placa del
ingrediente activo (Lactobacillus sp).
Los escobillones almacenados fueron cortados a una altura aproximada de 5 cm de
longitud para ser insertados en la solucin de agua peptonada al 0,1%, terminado el
procedimiento se llevaron a incubar por 30 minutos a 35
0
C+/- 2C.

Finalizado el tiempo de incubacin se tom una alcuota de 1 mL de la solucin de
agua peptonada y se adicion al tubo de agua destilada estril, por cada uno de los
tubos se tomaron 2 mL para ser adicionados en las cajas de petri recuento en
profundidad (1mL por cada caja). Luego, se adicion agar MRS a cada una de las
cajas de petri a una temperatura aproximada de 45
0
C aproximadamente, realizndose
los movimientos adecuados para una completa mezcla entre la alcuota y el agar
nutritivo especfico para el gnero de Lactobacillus.

Las cajas se insertaron dentro de la cmara de anaerobiosis, con sus respectivos
sobres e indicadores de oxido reduccin, la cmara con las cajas se incub a una
temperatura de 35C +/- 2C por 4 das, terminado el tiempo de incubacin se
realizaron los recuentos en cada una de las cajas.
70

Todos los resultados obtenidos durante la metodologa fueron escritos en las
tablas respectivas para cada caso. (Ver anexo Q).

71
7. RESULTADOS Y DISCUSIN DE RESULTADOS.
La confirmacin de los microorganismos mediante la identificacin por coloracin de

Gram corresponde a las morfologas descritas en el manual de Bergeys (tabla #10)

Tabla 10 Identificacin Microscpica Coloracin de Gram

Fuente: Bergeys Manual (1994)

La siembra de los microorganismos en agares selectivos logr identificar a cada uno
de ellos por las reacciones bioqumicas generadas a partir de las fuentes de carbono y
nitrgeno disponibles.

Figura 17 Escherichia coli en agar EMB
Microorganismo Morfologa
Escherichia coli Bacilos Gram negativos
Salmonella enterica Bacilos Gram negativos
Pseudomonas aeruginosa Bacilos Gram negativos
Staphylococcus aureus Cocos Gram Positivos
Candida albicans Formas Levaduriformes
72

Figura 18 Pseudomonas aeruginosa en agar Cetrimide

Figura 19 Salmonella enterica en agar Hecktoen

Figura 20 Staphylococcus aureus en agar Vogel Johnson

73
La prueba sistemtica Oxi/ferm tube II de cada uno de los microorganismos Gram
negativos (tabla # 11) comparadas con el manual Bergeys confirman las
caractersticas bioqumicas y la identidad de estos microorganismos.
Tabla 11 Resultados Oxi/Ferm Tube II

7.1 Agentes de Limpieza
7.1.1 Evaluacin de la efectividad antimicrobiana de los agentes de limpieza
7.1.1.1 Pruebas en suspensin
7.1.1.1.1 Dilucin en tubo y sensibilidad antimicrobiana (Kirby Bauer)
Desinfectante y Detergente.
La sensibilidad antimicrobiana se evalu con la utilizacin de pozos y sensidiscos
estriles como medio de transporte para el agente de limpieza, la utilizacin de este
material se aboli para el caso del alcohol isoproplico debido a la evaporacin.
La evaporacin es el cambio de un material de forma lquida a vapor, este cambio se
evala con la tasa de evaporacin que para el alcohol isoproplico al 70% y 99% es
de 1.70 con respecto a la del acetato de butiro =1 (material de referencia) a una
temperatura de 20 C y 0.05 atmsferas de presin segn el documento de seguridad
del material (MSDS). Este tipo de medida no posee unidades logartmicas debido a
que depende de variables como la temperatura, presin atmosfrica, humedad,
velocidad del viento, entre otros. (Riveras, 2003)
La tasa de evaporacin est relacionada directamente con la temperatura, presin y
humedad e inversamente con la concentracin y volumen. En ensayos realizados por
Microorganismo Gram Citrato Urea Fenilalanina Manitol Maltosa Glucosa/gas Xylosa Indol Sacarosa Lactosa/N2 Lisina Arginina Ana/Glu Oxidasa
Escherichia coli
Bacilos Gram
Negat ivos
- - - + + + + + + + + - + -
Salmonella Typhi
Bacilos Gram
Negat ivos
+ - - + + + + - - - + + +
Pseudomonas
aeruginosa
Bacilos Gram
Negat ivos
+ + + - + + + - - - - + - +
Oxi / Ferm tube II
C
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L
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e
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A
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c
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del
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75

Figura 22 Evaluacin de la efectividad antimicrobiana de Alconox frente a Escherichia coli.

La presencia del sulfato dodecilbenceno sulfonato (SDBS) surfactante aninico y
EDTA (potenciador bactericida) en el Alconox ha demostrado que cada uno de ellos
poseen actividad biocida (fluidizacin de la membrana). Segn estudios de Glover en
el ao 1999, la fluidizacin de la membrana representa alteraciones graves que estn
correlacionadas con los cambios en la fluidez de la membrana debido a la accin de
los surfactantes con actividad biocida. El poder biocida depende claramente del tipo
de microorganismo en evaluacin. La alteracin en la fluidez de la membrana no es la
76
nica responsable del efecto biocida en los microorganismos segn el estudio, pero si
es la responsable de la prdida de funcin. (Glover, 1999).

Nicas y Hancock en el ao de 1980, exponen que las clulas bacterianas ofrecen tres
sitios para la interaccin biocida: la pared celular, la membrana citoplasmtica y el
citoplasma. El acceso de los agentes biocidas a estos lugares estn determinados por
el material extracelular, la morfologa y la composicin qumica; lo cual explica el
porqu de los mecanismos de resistencia (presencia de LPS) en las bacterias Gram
negativas al ataque con surfactantes (Alconox) tal y como se observ en la figura #
22.
Los resultados obtenidos se presentan a continuacin en porcentajes con respecto a
los microorganismos, concentraciones y tiempo, teniendo en cuenta la reduccin de la
concentracin inicial de la poblacin microbiana descrita anteriormente.

Figura 23 Evaluacin de la efectividad antimicrobiana del alcohol isoproplico y Alconox frente a
Escherichia coli.
77
Con las concentraciones evaluadas de los agentes de limpieza se observ que
Escherichia coli a concentraciones de 50, 70 y 80% de alcohol isoproplico es
inhibida durante los tiempos evaluados; por otra parte, la evaluacin con el detergente
nicamente influy en la disminucin de la concentracin inicial.

Pseudomonas aeruginosa.

La evaluacin de la actividad antimicrobiana de los agentes de limpieza con respecto
a Pseudomonas aeruginosa fue equivalente al comportamiento de Escherichia coli a
las concentraciones de Alconox. Las concentraciones de Alcohol isoproplico por su
parte presentaron un 20% de crecimiento al primer minuto de exposicin seguido de
una reduccin a un 10% a los diez minutos de contacto. La presencia de crecimiento
a esta concentracin por parte de Pseudomonas se deba presuntivamente por sus
caractersticas morfolgicas. (Mac Donell, 1999; Russell, 1998).

78

Salmonella enterica.

Por su parte Salmonella enterica presenta un comportamiento similar al obtenido por
Escherichia coli, inhibicin del crecimiento a las concentraciones del alcohol
isoproplico y crecimiento en las concentraciones de Alconox.

Staphylococcus aureus.
79

En la evaluacin de la efectividad antimicrobiana de los agentes de limpieza para
Bacterias Gram positivas como es el claro ejemplo de Staphylococcus aureus, se
observ que este microorganismo es sensible a una concentracin de 2% de Alconox
en un tiempo de exposicin de 5 y 15 minutos a diferencia de las bacterias Gram
negativas anteriormente mencionadas.

Figura 27 Evaluacin de la efectividad antimicrobiana del alcohol isoproplico y Alconox frente
a Candida albicans.

El efecto biocida de los agentes de limpieza sobre Candida albicans es equivalente al
comportamiento observado con Escherichia coli en cuanto a la inhibicin de
crecimiento a concentraciones de 50,70 y 80% de alcohol isoproplico y crecimiento
a las concentraciones de Alconox.
Al encontrarse la presencia de EDTA en el Alconox hace que este agente limpiador
con caractersticas biocidas no tenga accin nicamente frente bacterias Gram
80
positivas y levaduras, sino que tambin sea efectivo frente a bacterias Gram negativas
tal y como lo explica Russell y Chopra (1996) en sus ensayos.
La integridad de la membrana externa de las bacterias Gram negativas como P.
aeruginosa es mantenida por las interacciones hidrofbicas entre los
lipopolisacridos (LPS) LPS y LPS y protena. La presencia de cationes divalentes
como Mg
+2
es esencial para la estabilidad de las cargas negativas del ncleo de los
oligosacridos presentes en las cadenas de molculas de los LPS. EDTA une a estos
cationes liberando as hasta un 50% de las molculas de los LPS, y causando
fosfolpidos no polares asociados con la membrana interna para ser expuestos en la
superficie celular para que molculas hidrofbicas puedan entrar a la clula. (Russell
y Chopra, 1996).
Por otra parte, la accin antimicrobiana del Alcohol isoproplico se evidenci desde
el primer minuto de contacto entre el desinfectante y el microorganismo a
concentraciones desde el 50% v/v como se observ en cada una de las figuras.
Segn un estudio de B. van Kingleren de 1995, en el cual se realiz un test de
superficie (sin materia orgnica) empleando alcohol isoproplico a concentraciones
de 30 a 70% y utilizando Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa como
microorganismos de prueba, se logr estimar que la concentracin mnima a la cual el
alcohol isoproplico acta eficazmente contra los microorganismos es del 40%;
concentraciones menores a esta no inhiben eficazmente a los microorganismos a lo
largo del tiempo, presentando en muchos casos crecimiento.
Los resultados obtenidos confirman la efectividad y rapidez del alcohol isoproplico
para inhibir el crecimiento de bacterias Gram positivas, Gram negativas y levaduras,
a partir de la concentracin del 50% v/v a un minuto de exposicin. Los resultados
anteriores confirman los observados en la tabla 1 del estudio realizado por Fraise en
1999, acerca del mtodo de eleccin de desinfectantes, la cual da a conocer que el
tiempo de exposicin mnimo para la inhibicin del crecimiento de bacterias
81
vegetativas y levaduras es de 1 minuto para una solucin de Alcohol isoproplico al
70%.
7.1.1.1.2 Mtodo del Coeficiente fenlico para el alcohol isoproplico USP
AOAC 955.11
En la figura #28 se observan los resultados obtenidos durante los ensayos a

diferentes concentraciones de alcohol isoproplico y fenol durante el tiempo con
respecto a la inhibicin de crecimiento de Escherichia coli.

Figura 28 Mtodo del coeficiente fenlico para Escherichia coli
82
Para el clculo del nmero del coeficiente fenlico fue necesario determinar la
concentracin a la cual el desinfectante de prueba y el fenol inhiben a los
microorganismos a los 10 y 15 minutos de exposicin. En el caso de Escherichia coli
la concentracin de un 30% de alcohol isoproplico y 1.25%(1/80) de fenol fueron
necesarias.

Figura 29 Mtodo del coeficiente fenlico para Salmonella enterica.
Una concentracin de un 30% de alcohol isoproplico y 1.25% (1/80) de fenol fue
necesario para inhibir el crecimiento de Salmonella enterica durante los tiempos de
exposicin evaluados y con las condiciones para la seleccin de la concentracin.
83

Figura 30 Mtodo del coeficiente fenlico para Pseudomonas aeruginosa.

Por otra parte, la concentracin de fenol para Pseudomonas no presento ningn
cambio con respecto a Escherichia coli y Salmonella enterica. Sin embargo, la
concentracin de un 50% de alcohol isoproplico fue necesaria para cumplir con los
parmetros de seleccin.
84

Figura 31 Mtodo del coeficiente fenlico para Staphylococcus aureus

Las bacterias Gram positivas como es el caso de Staphylococcus aureus presentan
una mayor sensibilidad a los agentes qumicos (alcoholes y fenoles) de acuerdo a las
caractersticas morfolgicas descritas en el marco terico. Para la inhibicin de
crecimiento de S. aureus a 10 y 15 minutos de exposicin fue necesaria una
concentracin de un 30% de alcohol isoproplico y de 1.67% (1/60) de fenol.
85

Figura 32. Mtodo del coeficiente fenlico para Candida albicans.
Candida albicans por su parte evidenci que es necesaria una concentracin de un
30% de alcohol isoproplico y de 1.42% (1/70) de fenol para la inhibicin de
crecimiento a los 10 y 15 minutos como tiempo de exposicin.
86
El nmero del coeficiente Fenlico para cada uno de los microorganismos es el que
se cita a continuacin, siguiendo las normas establecidas por la AOAC para su
respectivo clculo.
Tabla 12. Nmero del coeficiente fenlico
Microorganismo
Alcohol
isoproplico Fenol
Numero
Coeficiente
fenlico
Escherichia coli
30% 1/80 1.25% 24
Pseudomonas aeruginosa
50% 1/80 1.25% 40
Salmonella enterica
30% 1/80 1.25% 24
Staphylococcus aureus
30% 1/60 1.67% 17.96
Candida albicans
30% 1/70 1.42% 21.11

En la tabla #12 se observ la efectividad del alcohol isoproplico con respecto a la
actividad biocida del fenol. Dando como resultado que el desinfectante es dieciocho
veces ms efectivo que el fenol con respecto a bacterias Gram positivas para el caso
de Staphylococcus aureus, veintin veces ms efectivo para levaduras (Candida
albicans), veinticuatro veces ms efectivo para Escherichia coli y Salmonella
enterica y cuarenta veces ms efectivo para Pseudomonas aeruginosa. El orden de
los resultados obtenidos coincide directamente con el grado de resistencia que tienen
cada uno de los microorganismos estudiados y que fue claramente explicado en el
marco terico.
Segn el anlisis estadstico realizado despus de las pruebas in vitro se rechaza la
hiptesis nula (Ho), debido a que el alcohol isoproplico demostr tener una rpida
actividad bactericida y fungicida a la concentracin de 70% v/v. Ningn
microorganismo durante todo el estudio in vitro presento crecimiento despus de ser
expuestos a esta concentracin de desinfectante. Las desviaciones estndar y las
varianzas mostradas en la tabla (Anexo R) permiten evidenciar que la accin del
87
alcohol isoproplico al 70% v/v es constante. Los nicos microorganismos que
presentaron crecimiento fueron E.coli y S. aureus en las pruebas carrier debido a la
presencia de materia orgnica.
7.1.1.2 Pruebas soporte Carrier.
7.1.1.2.1 Mtodo de la dilucin de uso AOAC 955.15.
En la evaluacin de superficies, no se evidenci interferencia de la actividad

bactericida del alcohol isoproplico al 70% sobre el acero inoxidable utilizando
pequeas concentraciones de materia orgnica (suero bovino) 0.01g/mL y
0.125g/mL. Esto confirma los resultados obtenidos por Bloomfield en 1993, en donde
se analiz el efecto de la albmina bovina a una concentracin de 0.03g/mL como
interferente ante la actividad bactericida de una solucin al 70% de alcohol
isoproplico, sobre lminas de acero inoxidable. Los resultados de ese estudio
presentan una disminucin en la actividad bactericida del alcohol isoproplico pero,
esta se considera an dentro de los lmites de aceptacin (reduccin de ms de 3
unidades logartmicas de la carga microbiana). La figura #33 muestra los resultados
ms detalladamente

Figura 33 Seleccin de la concentracin de materia orgnica. evaluacin de superficies.
88
Varios autores reportaron que el alcohol isoproplico se inactiva o reduce su actividad
bactericida cuando se expone frente a moderadas concentraciones de material
orgnico. Tanto en el estudio realizado por Bloomfield en 1993 como en el presente
trabajo, se debe tener en cuenta que los cilindros fueron sumergidos dentro de las
soluciones de alcohol isoproplico. Es posible que la interferencia de materia orgnica
en la actividad bactericida del alcohol isoproplico al 70% se vea reducida si se
utiliza un mayor volumen de esta solucin durante la limpieza, de esta forma se evita
la rpida evaporacin de la sustancia, se incrementa su potencia y lo ms importante
su tiempo de exposicin a la superficie; algunas bibliografas recomiendan sumergir
los materiales que requieren desinfeccin en soluciones de alcohol isoproplico al
70%( Rutala, 1996).
Por otra parte en el ensayo de superficies, utilizando los cilindros de acero inoxidable
y una concentracin de materia orgnica de 0.25g/mL, se observ crecimiento
bacteriano en la mayora de los diez cilindros dentro de los tubos de caldo BHI.
Escherichia coli y Staphylococcus aureus fueron identificados en los tubos positivos
de las pruebas siguiendo los procedimientos propuestos. El mtodo se realiz por
triplicado a esta concentracin con el fin de confirmar los resultados, los resultados se
dan a conocer en la figura #34.

Figura 34. Resultados de la evaluacin de superficie.
89
A pesar que el tiempo de exposicin al desinfectante fue prolongado (10 minutos) el

microorganismo creci, esto confirma la necesidad de complementar el proceso de
limpieza de los equipos con sistemas de extraccin de polvo (aspiradoras) y
posteriormente el empleo de algn agente de limpieza (detergente) con el fin de
remover la mayor cantidad de materia orgnica acumulada despus de haberse
manufacturado un producto.
Despus de este procedimiento el uso de un desinfectante es conveniente ya que se
reduce la probabilidad de inactivacin de su actividad bactericida al no haber materia
orgnica que interfiera con su mecanismo de accin, en este caso denaturacin de
protenas (Frey, 2007).
Grandes concentraciones de material orgnico sobre una superficie de un rea
limitada como los cilindros provocar una mayor probabilidad de interferencia frente
a la accin bactericida de un desinfectante, promoviendo el crecimiento de los
microorganismos y su adherencia a la superficie de estudio, en este caso el acero
inoxidable tipo 304. Los mecanismos por los cuales la materia orgnica puede
interferir con la actividad de los desinfectantes son la adsorcin del desinfectante a
coloides de protena, formacin de complejos inertes poco activos y mediante la
unin de los grupos activos del desinfectante, en este caso el grupo funcional (-OH) a
protenas extraas propias del material orgnico. La inactivacin del desinfectante y
el fomento del crecimiento microbiano debido a la materia orgnica facilitan la
formacin de biofilms sobre las superficies. (Wirtanen et al, 2001)
El mtodo se llev a cabo satisfactoriamente debido a que en los controles se
obtuvieron los resultados esperados. En la prueba #2 (control negativo) del mtodo
de superficies con E. coli y con S. aureus se observ la ausencia de crecimiento en
todos los cilindros sumergidos en Caldo BHI, de igual manera, tampoco se evidenci
crecimiento en el Caldo Leethen (medio neutralizante para el alcohol isoproplico).
Los resultados de este control no se pueden ver por aparte sin tener en cuenta las otras
90
tres pruebas realizadas; La prueba #3 (viabilidad de los microorganismos) permite
comprobar que la presencia de los soportes no interfiere en el crecimiento de los
microorganismos pero si funciona como un medio de transporte. Finalmente, las
pruebas 4 y 5 de control microbiolgico constatan que no hubo ninguna clase de
contaminacin microbiana (microorganismos ajenos al estudio) por parte de la
materia orgnica y el soporte.
De igual manera se decidi realizar un test de superficies in vivo con el Alcohol
isoproplico preparado por los operarios en el rea de manufactura; los resultados que
se obtuvieron se observan en la figura #35

Figura 35. Evaluacin de superficies (In Vivo) Alcohol isoproplico rea de manufactura.
Al observar el anlisis de superficies con el Alcohol isoproplico del rea de

manufactura se obtuvo un 100% de crecimiento, el cual es causa principalmente de
una preparacin errnea en la dilucin del Alcohol isoproplico e inclusive como se
logr constatar en la evaluacin con la dilucin en tubo est tuvo que estar en una
concentracin inferior a un 50%, debido a que con los estudios realizados se ha
91
demostrado que esta concentracin de Alcohol isoproplico es el lmite critico en el
cual se presenta crecimiento microbiano y que concentraciones superiores a esta no
ha sido evidente hasta el momento presencia de un microorganismo en forma
vegetativa.
7.1.2 Evaluacin de la efectividad del detergente para la remocin de material
orgnico.

La figura #36 de control de monitoreo de la efectividad de Alconox muestra que para
ciertos productos la limpieza con el detergente se dificulta haciendo que no se cumpla
con los lmites establecidos por la compaa.

Para que una limpieza sea aceptable no debe quedar ms del 0.1% p/p del producto
sobre la superficie teniendo en cuenta que este primer parmetro es para productos
que contienen en sus componentes productos derivados de protenas de alimentos
considerados como alrgenos alimentarios. Estas sustancias ocasionan reacciones
fsicas y qumicas en el cuerpo humano por lo que su limpieza se convierte en un
punto crtico para los procedimientos de limpieza. (Validation Success, 2008)

Un estudio realizado por Frey en el 2007 se establece que los residuos de los
productos libres de alergnicos deben tener como mximo una concentracin de
1/100 (1% p/p) y para los productos con alergnicos debe ser entre 1/1000 (0.1%p/p)
y 1/10000 (0.01%p/p) dependiendo del tipo, teniendo en cuenta que el anlisis se
realiza despus de un procedimiento de limpieza adecuado.

92

Figura 36. Efectividad de la limpieza con Alconox.
Los productos que mayor resistencia presentaron a la limpieza por el detergente
despus del procedimiento fueron los productos que poseen extractos botnicos y
vitaminas tal y como se observ en la figura anterior. Posiblemente esto se deba a que
la densidad de las partculas de extractos botnicos y vitaminas es mayor a la del
Alconox impidiendo que el surfactante (dodecil-benceno-sulfonato) realice
adecuadamente el procedimiento de remocin.
Cuando la materia orgnica es hidratada adquiere una contextura mucilaginosa que se
adhiere fcilmente a cualquier superficie, la cual despus de seca es difcil de
remover, aumentando el tiempo de limpieza de la parte del equipo o material con
suciedad. Segn Alconox cuando estos casos se presentan es mejor aumentar la
concentracin del detergente a un 2%p/v y lavar con agua corriente caliente (60 a
70C) (presin moderada) y no con agua estancada. Los ensayos realizados a esta
concentracin de trabajo frente a extractos botnicos y vitaminas fueron
satisfactorios.

93
7.2 Proceso de limpieza manual.
7.2.1 Evaluacin del proceso de limpieza segn limite fsico, qumico y
microbiolgico.
7.2.1.1. Condiciones normales.
La evaluacin de la limpieza manual de los equipos de la compaa mediante un

monitoreo peridico permiti observar la importancia de una limpieza adecuada de
los equipos. La FDA aclara en su gua para la inspeccin de la validacin de los
procesos de limpieza del 2005, que no es necesario realizar una limpieza minuciosa
cuando se manufacturan lotes consecutivos del mismo producto y no es necesaria su
validacin. Sin embargo, segn la gua los procesos mayores de limpieza que
requieren el desarme y empleo de agentes de limpieza si deben ser validados. Todas
las muestras tomadas fueron de procesos de limpiezas mayores.
Las Tableteadoras (J CMCO, Manesty Xpress y Betapress) y las Encapsuladoras
(Bosch, Zanazi 40F y Model 10) fueron seleccionadas para realizar este monitoreo
debido a que en estas se lleva a cabo uno de los principales pasos para la manufactura
de los suplementos nutricionales. En consecuencia, su frecuencia de limpieza es
mayor a las dems mquinas utilizadas en la compaa.
LMITE FISICO
Como parmetro principal se observaron las partes de las mquinas que tuvieron
contacto directo con el producto. En general no se observaron residuos fsicos sobre
las superficies de las mquinas limpias a excepcin de la Model 10 y Zanazi F40. La
FDA no establece una cantidad o concentracin especfica para este lmite. (FDA,
2005)
LMITE MICROBIOLOGICO
Los lmites microbiolgicos establecidos por la compaa para las superficies fueron
seleccionados siguiendo los parmetros de la Federal Standard 209E y de USP NF-
94
2007, los cuales son de 100 ufc/24-30cm
2
para bacterias y de 10 ufc/24-30cm
2
para
mohos y levaduras. En la industria Nutracutica no es necesario trabajar en reas
estrictamente limpias como las clase 100 de las industrias farmacuticas, pero si con
una poblacin microbiana baja, por eso se toman como lmites las clases 10.000 y
100.000 de la Federal Standard 209E para las reas de produccin, adyacentes y de
soporte de la industria Nutracutica (USP-NF, 2007).
En la figura #37 se observa la efectividad del proceso de limpieza en consecuencia a
la reduccin de la poblacin bacteriana por debajo de los lmites de aceptacin
despus de realizado el procedimiento.

Figura 37. Control Microbiolgico - Bacterias
En general se observ una disminucin de la carga microbiana sobre las superficies
de la mquina despus del proceso de limpieza manual. A cada una de las colonias
diferentes macroscpicamente se les realizaron tinciones de Gram dando como
resultado bacilos Gram negativos y bacilos Gram positivos esporulados. Estos
ltimos activan su mecanismo de resistencia (formacin de esporas) cuando se
encuentran en condiciones de estrs, como por ejemplo a la exposicin a agentes
qumicos (alcohol isoproplico). Los mecanismos de resistencia de las esporas
bacterianas al alcohol isoproplico y otros desinfectantes de clase intermedia son
95
citados por Russell (1998) donde se explican las caractersticas del recubrimiento de
las esporas y la resistencia intrnseca que estos recubrimientos confieren a estas
estructuras de resistencia. De igual forma los resultados se confirman con el estudio
realizado por Fraise (1999), en el cual se dan a conocer las caractersticas generales
de la actividad bactericida de la solucin de alcohol isoproplico al 70% incluyendo
su inefectividad frente a esporas bacterianas.

Figura 38. Control microbiolgico Mohos y Levaduras

Por otra parte en la figura #38 se observa que hay una leve presencia de estructuras
levaduriformes antes del proceso de limpieza sobre las tableteadoras. La eliminacin
de la levadura despus de la limpieza permiti evidenciar nuevamente la efectividad
de los agentes de limpieza y de igual manera el buen procedimiento realizado por los
operarios a cargo.
Los agentes de limpieza empleados durante el proceso son efectivos frente a este tipo
de microorganismo, posiblemente debido a que su metabolismo y crecimiento no es
tan acelerado como el de las bacterias lo que hace que no se puedan adaptar
96
rpidamente o adquirir resistencia frente al desinfectante. Segn McDonnell (1999,)
Los mohos y levaduras tambin poseen mecanismos de defensa intrnsecos que
parecen no afectar la rpida accin biocida del alcohol isoproplico.

Figura 39. Grfica de Control Microbiolgico Bacterias, Mohos y Levaduras.
97
En la figura # 39 se observa el monitoreo realizado a las encapsuladoras tanto de
bacterias como de mohos y levaduras. A cada una de las colonias diferentes
macroscpicamente en las cajas de petri se les realizaron tinciones de Gram. En
general se observaron bacilos Gram positivos esporulados y estructuras
levaduriformes.
En uno de los muestreos programados (Model 10) el cual presento un elevado
recuento de microorganismos, se identificaron microscpicamente bacilos Gram
positivos esporulados y estructuras levaduriformes.
La presencia de una alta carga de microorganismos que supera los lmites de
aceptacin despus de un proceso de limpieza manual, puede deberse a los residuos
del producto anterior o a un error durante el proceso de limpieza manual. Es por esto
que las buenas prcticas de manufactura para suplementos nutricionales considera de
vital importancia la capacitacin, tcnica y compromiso por parte del operario
durante el proceso de limpieza. (CFR, Capitulo 21 parte 111)
Los factores que pudieron haber influenciado para obtener resultados microbiolgicos
por encima de los lmites de aceptacin pueden ser: falla en la preparacin de la
solucin de alcohol isoproplico, higiene personal deficiente, empleo de utensilios
sin lavar o instrumentos indebidos para el proceso de limpieza. Los operarios deben
estar en capacidad de diferenciar las limpiezas mayores de las menores y cuando cada
una de estas debe ser realizada.
En la mayora de las observaciones realizadas la supervisin del proceso de limpieza
era inexistente durante la limpieza de las piezas removibles de la mquina en el rea
de lavado, y poco frecuente cuando se realizaba la desinfeccin de los equipos. Las
BPMs (2007) ordenan que debe existir una supervisin frecuente a lo largo de todo
el proceso de limpieza con el fin de asegurar la calidad de esta; ms an si se trata de
un proceso de limpieza manual.
98
Otra de las partes que pueden afectar el proceso de limpieza son el origen y pureza de
los ingredientes de los productos manufacturados dentro de la compaa. Para el caso
de la Model 10 el suplemento nutricional se caracteriza por tener un extracto botnico
dentro de sus ingredientes. Segn la USP-NF (2007) las materias primas, excipientes
y sustancias activas de los suplementos alimenticios pueden ser la primera fuente de
contaminacin microbiana teniendo en cuenta que una gran parte de sus productos
usan extractos de origen botnico. Estos productos contienen una carga
microbiolgica natural principalmente formada por mohos y bacilos Gram positivos
esporulados que pueden haber ocasionado la contaminacin de la superficie de la
mquina (USP-NF, 2007).
Otro aspecto a tener en cuenta es que el proceso de limpieza de la compaa no est
creado para la eliminacin de esporas bacterianas. Para eliminar esporas bacterianas
es necesario un tratamiento complejo. (Peng et al, 2002)
En el estudio realizado por Peng es necesario el empleo de detergentes cidos,
alcalinos y desinfectantes como el hipoclorito de sodio, compuestos de amonio
cuaternario a presin para una adecuada eliminacin de esporas. Adems, este afirma
que los microorganismos esporulados y las levaduras aumentan su resistencia cuando
logran adherirse a una superficie Biofilms.
La formacin de un biofilm en la mquina podra reducir o anular la actividad del
desinfectante, propagando as el crecimiento bacteriano y la consecuente
contaminacin del producto.
LMITE QUIMICO
La cuantificacin del lmite qumico se llevo a cabo ex situ. Los mtodos utilizados
para la cuantificacin de residuos deben estar validados para dar una completa
seguridad a los resultados. Los resultados de la tabla #13 muestran los resultados
obtenidos durante los anlisis de cuantificacin.

99
Tabla 13. Lmite Qumico en base al producto anterior

*ND: No Detectable.
Hay que tener en cuenta que las p.p.m obtenidas no son nicamente parte del residuo
del producto anterior si no que por el contrario este resultado puede estar alimentado
por los componentes del producto en anlisis teniendo en cuenta que los elementos
cuantificados pertenecen a cada uno de ellos en forma natural. Es por esto que la
cuantificacin de la mayora de los residuos obtenidos est por encima del lmite de
aceptacin.
Sin embargo, es necesario que para la cuantificacin de un elemento se deban tener
en cuenta parmetros como la naturaleza del producto en anlisis y las del producto
anterior para as obtener un resultado especfico.
La cuantificacin de los residuos del detergente se llev a cabo mediante la
cuantificacin del fsforo perteneciente a los fosfatos del surfactante. En la tabla #14
se observan los resultados.

Producto (Toma de
Muestra)
Producto
Anterior
Elemento
analizado
p.p.m./Producto
Extracto Botnico
Suplemento
Mineral
Cr ND*
Fe 1,67
Multivitamnico para J venes Extracto Botnico Ca ND*
Multivitamnico para Mujeres
Suplemento
Mineral
Cr 0.02
Vitamina-B6
cido Flico +
APAB
cido Flico 8.55
Multivitamnico para Perros
Multivitamnico
para nios
Piridoxina 29.67
Riboflavina 14.9
Tiamina 38.72
100
Tabla 14. Cuantificacin del fsforo. Alconox
Producto mg Fosforo/Tab o Cap
Extracto botnico 37.43
Multivitamnico/Multimineral 16.26
Complejo Vitamnico 13.63
Glucosamina 0.2995
Complejo vitamna B 7.24

En las pruebas realizadas no se encontraron residuos de fsforo por tableta o capsula
analizada; las pequeas cantidades encontradas pertenecen a las concentraciones que
debe tener la tableta normalmente por sus excipientes (fosfato dicalcico).
No obstante, en las observaciones que se realizaron durante el proceso de limpieza
cabe destacar que no se tienen en cuenta las concentraciones de uso recomendadas
por Alconox (2007) para realizar la limpieza de los equipos. Posiblemente la falta de
informacin en cuanto a la preparacin por parte de los operarios al realizar el
proceso de limpieza hace que no sea preparado el detergente como el suplidor lo
indica. Se debe tener en cuenta que estas concentraciones de uso recomendado estn
direccionadas hacia sistemas automatizados de limpieza CIP y COP como lo indica
Bremer et al. (2006) que represent un sistema CIP a escala de laboratorio usando
lavados con detergentes cidos y bsicos con similares preparaciones a las de
Alconox.

7.2.1.2 Condiciones crticas

Este mtodo se aplica para la evaluacin in vivo del proceso de limpieza de la
compaa. Se escogi como producto un suplemento nutricional basado en la
presencia de microorganismos benficos (Lactobacillus sp.) La mquina en la cual se
101
llevo a cabo todo el proceso de produccin fue la BOSCH, la cual tiene capacidad
de producir entre 2000 y 2500 cpsulas por minuto.
En la evaluacin del proceso de limpieza se evaluaron lmites fsicos, qumicos y
microbiolgicos. Para el lmite fsico tal y como se estableci, nicamente se utiliz
la herramienta de visualmente limpio, Lmite qumico toma de muestra del
siguiente producto en proceso con su respectiva evaluacin del ingrediente activo del
producto anterior y por ltimo, la evaluacin del lmite microbiolgico. Terminado
los procedimientos de limpieza se procedi a evaluar cada uno de los lmites.
En el lmite fsico se tuvo en cuenta aquellas partes que entran en contacto directo con
el producto como por ejemplo el tanque de almacenamiento de producto en polvo y
capsulas vacas, estacin de llenado de las cpsulas vacas, y la bandeja de salida del
producto.
En cada una de las partes evaluadas se encontr despus del procedimiento de
limpieza residuo del producto en partes como la estacin de llenado y el tubo de
conexin entre el tanque de almacenamiento del producto y las estaciones de llenado.
Esto se debe posiblemente a que aquellas partes no removibles de la mquina
nicamente se les retira el producto con el empleo de una aspiradora seguido del
empleo del desinfectante.
Durante el control del lmite qumico se tom una muestra del siguiente producto en
produccin al evaluado (Glucosamina) para la evaluacin de la concentracin del
ingrediente activo (Lactobacillus sp) del producto anterior. Aunque la evaluacin del
ingrediente activo se le realice nicamente para sustancias qumicas durante este
trabajo se realiz la evaluacin a la presencia de los microorganismos del gnero de
Lactobacillus en las cpsulas de Glucosamina debido a que este es el ingrediente
activo del producto anterior. El recuento que se obtuvo en las capsulas de
Glucosamina fue de 1x10
1
UFC/mL, la presencia de este tipo de de microorganismos
aunque no es perjudicial, esta no se encuentra declarada en la etiqueta del producto lo
cual va en contra de las leyes establecidas por la FDA.
102
Para el control del lmite microbiolgico se tuvieron en cuenta la presencia de
bacterias, mohos, levaduras y Lactobacillus, especficamente en aquellas partes de
contacto directo con el producto. Los resultados que se obtuvieron se observan en la
tabla #15.
Tabla 15 Resultados Recuento de Bacterias, Mohos y Levaduras Lmite microbiolgico.

La morfologa de las colonias presentes en los recuentos consistan en estructuras
levaduriformes, bacilos Gram negativos y bacilos Gram positivos esporulados y no
esporulados. Las grficas que se dan a conocer a continuacin son los valores de los
recuentos en placa obtenidos a partir de las partes evaluadas.

BOSCH
Partes PC PDA Patgenos
A
n
t
e
s

Moldes - Inyectores 0 ufc/25cm
2
0 ufc/25cm
2
Ausencia
Hopper 22 ufc/25cm
2
0 ufc/25cm
2
Ausencia
Tubo de Hopper 4 ufc/25cm
2
3 ufc/25cm
2
Ausencia
Deduster 7 ufc/25cm
2
0 ufc/25cm
2
Ausencia
D
e
s
p
u
s

Moldes - Inyectores 1 ufc/25cm
2
0 ufc/25cm
2
Ausencia
Hopper 6 ufc/25cm
2
1 ufc/25cm
2
Ausencia
Tubo de Hopper 98 ufc/25cm
2
25 ufc/25cm
2
Ausencia
Deduster 34 ufc/25cm
2
0 ufc/25cm
2
Ausencia

C
s
c
p
e
Figura 40
Con respecto
se haya real
como es el c
procedimien
encuentra es
2
4
U
F
C
2
5
c
m
2
1
U
F
C
2
5
c
m
2
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claro ejemplo
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0
20
40
Molde
Inyecto
Grfica
0
50
100
Mold
Inyect
Grfica
control microb
a de las grf
impieza tipo
o del recuen
e la limpiez
liminacin d
s
ores
Hop
decontro
(Moh
Antes De
P
des
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Antes De
P
103
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levaduras).
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de producto
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Ho
lmicrobio
hosyLeva
espues Lim
Partesmaquin
opper T
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(Bacterias
espues Lim
Partesmaquin
condiciones cr
.
res se observ
o disminuci
de Hopper. L
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en polvo).
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olgico W
duras)
mitedeaceptac
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Hopper
olgico W
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na

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v claramen
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Lo anterior r
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Deduster
WorstCase
cin
10 ufc
Deduster
WorstCase
cin
100 uf

ias, mohos y
nte que aunq
rga microbia
ratifica que l
forma que
c/25cm
2
fc/25cm
2
que
ana
los
se
104
Esto puede ser causa de la manipulacin del material en el cuarto de limpieza, el
procedimiento de limpieza de la parte, transporte del material limpio, toma y
manipulacin de la muestra. Cuando un resultado de un recuento sobrepasa los
lmites de aceptacin se realiza un reporte siguiendo los conductos regulares
estipulados en la compaa.
Los recuentos que se obtuvieron de Lactobacillus antes y despus del procedimiento
de limpieza son los que se observan en la tabla #16.

Tabla 16 Recuento de Lactobacillus sp. Lmite microbiolgico en condiciones crticas.
Worst case Partes Inicio Final

Potencia
Hopper 40 x 10
2
10x10
2

Deduster 49x10
2
15x10
1

Con respecto a los recuentos la efectividad del desinfectante fue baja, lo cual se
observ en la poco o nula reduccin logartmica de los Lactobacillus despus del
proceso de limpieza manual. Estos resultados no concuerdan con los de Bloomfield y
colaboradores (1993) en donde se observ una reduccin mayor a cinco unidades
logartmicas en bacterias Gram positivas utilizando una solucin de Alcohol
isoproplico al 70% v/v.
Adicionalmente a esto, es necesario tener en cuenta que la presencia de materia
orgnica interfiere con la actividad del desinfectante como se ha mencionado
anteriormente.
A pesar de que no se detect una reduccin logartmica significativa, los procesos de
limpieza actualmente establecidos y los controles microbiolgicos existentes durante
todo el proceso de manufactura aseguran un producto seguro para los consumidores,
105
esto se confirma mediante las pruebas de microbiologa, potencia, identidad y
residuos totales realizados al producto terminado.

106
8. CONCLUSIONES

Se valid el proceso de limpieza manual de la compaa, estandarizando las
concentraciones y los tiempos de exposicin que deben utilizarse para cada
agente de limpieza, as mismo se estableci el proceso de limpieza adecuado
para obtener resultados confiables y optimizar la limpieza de equipos
realizada en la compaa

La concentracin ptima de uso del alcohol isoproplico es de 70% v/v y el
tiempo mnimo de exposicin el cual garantiza la mxima eficiencia del
desinfectante es de 5 minutos sobre la superficie del equipo.

El detergente demostr incrementar su eficacia en cuanto a la remocin de
residuos utilizando el doble de la concentracin recomendada (2% p/v), de
igual manera esta concentracin tambin demostr tener actividad bactericida
frente a Staphylococcus aureus.

El proceso de limpieza y desinfeccin es eficaz siempre que se tengan
presentes los procedimientos citados por el Procedimiento Operativo Estndar
de la compaa, como se observ durante los monitoreos de control
microbiolgico.

Para la limpieza manual de equipos se deben tener en cuenta la capacitacin y
compromiso del operario as como el cumplimiento de las Buenas Prcticas
de Manufactura incluyendo la supervisin del proceso de limpieza.

El Alcohol isoproplico demostr ser un desinfectante eficaz en todas las
pruebas realizadas tanto in vitro como in vivo, los anlisis realizados
permitieron observar que siempre y cuando este se prepare, use y almacene de
la forma adecuada el desinfectante ser eficiente.
107

Tanto el Alcohol isoproplico como Alconox cumplen con los lmites de
aceptacin establecidos lo cual significa una reduccin en los riesgos de
contaminacin cruzada de los productos evitando tanto la contaminacin
microbiana y el paso de ingredientes de producto a producto.

Las concentraciones, temperaturas y tiempos de lavado utilizando Alconox
dependen del producto manufacturado. Los suplementos que posean
vitaminas y/o extractos botnicos se deben lavar con el doble de
concentracin recomendada de Alconox (2% p/v) y a una temperatura
aproximada de 55 a 65C segn las instrucciones del suplidor.

El monitoreo del control microbiolgico de las superficies de los equipos
soporta los resultados de eficiencia de los estudios in vitro de los agentes de
limpieza. Debido a que durante la mayora del tiempo del estudio in vivo los
lmites se mantuvieron por debajo de los lmites de aceptacin.

Es importante continuar con la cuantificacin de residuos despus del proceso
de limpieza mediante tcnicas analticas especficas validadas para obtener
resultados confiables respecto a la seguridad que ofrece el proceso limpieza.

La limpieza manual de equipos es un mtodo que inhabilita a la mquina
durante un tiempo prolongado, esto incrementa los costos y entorpece la
velocidad que pudieran tener los procesos de manufactura de suplementos
nutricionales.

No se recomienda el uso del alcohol isoproplico a concentraciones por
debajo del 50% v/v. En el trabajo se demostr la variabilidad y la poca
efectividad que poseen concentraciones menores a la mencionada.

108
Se confirmaron las caractersticas que posee el Alcohol isoproplico al 70%
v/v, inhibiendo a las bacterias, mohos y levaduras en los monitoreos de
control microbiolgico (in vivo), y a las bacterias patgenas en los estudios in
vitro.

El caso o condicin extrema realizado del proceso de limpieza permiti
observar la importancia de tener operarios calificados y con conocimientos de
en BPMs debido a que una de las posibles causas del incremento en la carga
microbiana que se presento despus del proceso de limpieza manual de
equipos se deba al contacto del personal con la mquina.

109
9. RECOMENDACIONES
El personal debe estar capacitado de acuerdo a la forma en la cual se debe

realizar el proceso de limpieza manual de equipos as como la preparacin de
los agentes de limpieza.

Se debe realizar una supervisin continua del proceso de limpieza, tanto en el
rea de lavado de piezas removibles como en el momento de realizar la
desinfeccin.

Es importante determinar el mtodo de limpieza (concentracin de los agentes
de limpieza, temperatura, tiempo de exposicin, uso de utensilios, etc.) para
cada grupo de suplementos manufacturados (vitaminas, minerales, extractos
botnicos, etc.); en este estudio se demostr que la dificultad de remocin de
los productos no es igual en todas las ocasiones.

Es conveniente realizar modificaciones y especificaciones al Procedimiento
Operativo Estndar (POE) de la limpieza manual de los equipos.

Continuar con los monitoreos peridicos de las superficies de los equipos,
esto colabora a soportar la calidad de la limpieza manual.

El alcohol isoproplico es una solucin a la cual se le pueden adicionar
sustancias que aumenten su accin bactericida; una mezcla de alcohol al 50%
v/v con una solucin de hipoclorito de sodio al 5.75% v/v (relacin 1:1)
potencia la accin bactericida, fungicida y virucida, de igual forma despus de
30 minutos de exposicin la mezcla puede llegar a tener accin esporocida.
Esta solucin puede ser utilizada cuando se manufacturen productos que
contengan microorganismos esporoformadores. (MacDonell, Russell 1999)
110

Tener elementos de transporte separados para los materiales que se van a
lavar y los materiales que estn limpios o en su defecto incluir dentro de la
limpieza del equipo, el elemento de transporte utilizado.

El cuarto de lavado requiere de mantenimiento peridico y limpiado constante
para evitar la acumulacin de residuos de productos los cuales pueden
propagar el crecimiento microbiano.

111
10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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2008).

121
11. ANEXOS
Anexo A.
Cronologa de la regulacin para suplementos nutricionales

Fuente: FDA, 2006

122
Anexo B.
Diagrama de flujo para la obtencin de un suplemento nutricional.
(Ver archivo adjunto)
123
ANEXO C.
DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO GENERAL DE UN MEZCLADOR
(BLENDER).
Recoger y pesar las materias primas

Agregar las materias primas como lo establece la frmula del producto en la
tolva del blender.
Establecer la velocidad y el tiempo de las
partes que realizan la mezcla
Descargar la mezcla de materias
primas en contenedores.
Comparar el peso terico del contenedor con
el real (la variacin no puede exceder 3%)
Solo para Tabletas
Si las partculas de la mezcla son
pequeas se debe GRANULAR
o ESLOGAR
Si las partculas de la mezcla
son grandes se debe MOLER
FIN
BARRA ESTABILIZADORA
Homogenizacin dentro de la tolva
TOLVA Movimiento circular
FIN DE LA HOMOGENIZACION
124
ANEXO D.
DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO GENERAL DE UNA
ENCAPSULADORA

Las capsulas entran al
contenedor de recepcin
El polvo pre-mezclado entra
al contenedor de recepcin
Las capsulas son llenadas con la
cantidad predeterminada de polvo (4)
El polvo es succionado por
inyectores
El polvo pasa al contenedor
de la estacin de llenado (5).
Las capsulas organizadas pasan a
segmentos (superior e inferior) que
separan las capsulas por presin
Las capsulas pasan a la estacin de
orientacin y separacin (1, 2).
Un sistema opcional Deduster ayuda a la seleccin de las capsulas
por el peso, las capsulas que no cumplan con el peso terico son
removidas por succin.
Las capsulas pasan a la estacin de sellado
donde son cerradas a presin por
los segmentos (9).
Extrae las
capsulas no
abiertas,
invertidas
Finalmente pasan a la estacin de
eyeccin (10, 11).
Las capsulas pasan a la estacin de
seleccin de capsulas (7).
Las capsulas abiertas pasan a la
estacin de llenado (3).
FIN
125

Las encapsuladoras son sistemas rotatorios de alta velocidad que pueden
manufacturar de 40.000 hasta 150.000 o ms capsulas por hora. Existen en el
mercado diferentes tipos de tamao de capsula, los tamaos ms utilizados son los
000 y los 00, estas capsulas pueden estar hechas de celulosa o de almidn.

(1)
(2)
(3)
(10)
(9)
(7)
(4)
126
ANEXO E.
DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO GENERAL DE UNA
TABLETEADORA
127
ANEXO F
DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO GENERAL DE UNA MAQUINA DE
RECUBRIMIENTOS Y PINTURAS.

Depositar las tabletas en la
tolva
Velocidad y tiempo de
rotacin de la tolva
Composicin de los
recubrimientos y pinturas
Para un buen proceso de recubrimiento se deben tener en cuenta ciertos
factores que se deben establecer previamente
La rotacin inicia y los aspersores aplican homogneamente la mezcla de
recubrimientos de lactosa, sacarosa, dextrosa o manitol a las tabletas.
Los productos finales son analizados para probar que la tableta
mantuvo sus condiciones organolpticas
La temperatura de secado fija los recubrimientos a las paredes de la
tableta para evitar que se despeguen.
Temperatura de secado
Establecer la inyeccin de
aire de secado al equipo
Presin de los aspersores
FIN
128
ANEXO G.
Buenas Prcticas de Manufactura (BPMs) para suplementos nutricionales
Cdigo de Regulacin Federal, Capitulo 21 parte 111.
Buenas Prcticas de Manufactura para la produccin, empaque, etiquetado u

operaciones de mantenimiento de los suplementos nutricionales. Las BPMs de
la Industria Nutracutica estn ms encaminadas hacia las BPMs
Farmacuticas que hacia las BPMs de alimentos (Crowley, 2006). Esta regla
final est compuesta por catorce subpartes A-P en donde se dan a conocer las
pautas y recomendaciones que se deben seguir para trabajar con BP Ms. Las
subpartes son:
- Subparte A - Generalidades
- Subparte B - Personal
- Subparte C - Planta Fsica y alrededores
- Subparte D Equipos y Utensilios
- Subparte E Requerimientos para establecer sistemas de control de
produccin y procesos.
- Subparte F Sistema de control de produccin y procesos: Requerimientos
para el control de calidad
- Subparte G Sistema de control de produccin y procesos: Requerimientos
para componentes, empaques y etiquetas, y para el producto recibido para
empacas y etiquetar como Suplemento Nutricional
- Subparte H Sistema de control de produccin y procesos: Requerimientos
para la documentacin mster de manufactura.
- Subparte I Sistema de control de produccin y procesos: Requerimientos
para la documentacin de los lotes (batch).
- Subparte J Sistema de control de produccin y procesos: Requerimientos
para las operaciones de laboratorio
129
- Subparte K Sistema de control de produccin y procesos: Requerimientos
para las operaciones de manufactura
- Subparte L Sistema de control de produccin y procesos: Requerimientos
para las operaciones de empaque y etiquetado.
- Subparte M Mantenimiento y Distribucin
- Subparte N Devolucin de Suplementos Nutricionales
- Subparte O Quejas de productos
- Subparte P Documentos y almacenamiento

1. Generalidades
La normatividad para los suplementos alimenticios comienza en Octubre 25 de 1994
con la creacin de DSHEA (Dietary Supplement Health and Education Act.) la cual
estipula que deben haber buenas prcticas de manufactura para la fabricacin de
suplementos alimenticios, tomando como gua las buenas prcticas de manufactura
en la industria alimenticia (CFR, 2007).
En el ao 2003 se lanza una nueva propuesta debido al crecimiento en el nmero de
consumidores. A las BPM actuales se agregaron una serie de tpicos importantes
como la inclusin de la obligatoriedad de la documentacin de los procesos llevados a
cabo, con el fin de llevar un registro o historial de las BPMs utilizadas en el
procedimiento. Finalmente la norma fue revisada por la FDA y finalmente en J unio
25 de 2007 publica oficialmente la norma que rige la produccin y control de calidad
de los suplementos nutricionales (CFR, 2007)
La FDA es la entidad encargada de proponer las regulaciones para BPM para los
ingredientes dietticos y suplementos dietticos, esta regulacin establece las
mnimas BPM que aseguran que el compromiso del productor en realizar cada una de
sus actividades relacionadas con el proceso de manufactura, empaque o tiempo de
espera de las materias primas o del mismo suplemento diettico hace que se asegure
que el producto no podra estar adulterado. Adems esta regulacin hace que el
130
productor evale la identidad, pureza, calidad, dureza y composicin de los
ingredientes dietticos (materias primas) y suplementos dietticos (CFR, 2007).
2. Personal
Supervisores de la compaa deben ser calificados para la toma de medidas
necesarias para excluir alguna persona de sus operaciones si esta se conoce
como fuente de contaminacin microbiana.
Las prcticas higinicas y el procedimiento que se debe seguir cuando el
personal se encuentra enfermo o infectado y as evitar la contaminacin
cruzada.
Cuando el personal se encuentre enfermo:

No debe de entrar en contacto con ninguna de las reas de almacenamiento,
produccin, etiquetado y empaque.
Debe excluirse de las reas de trabajo y operaciones hasta que se obtengan los
resultados del examen mdico que certifique al supervisor de rea que su
permanencia no traiga como consecuencia una contaminacin al producto por
origen microbiano; una vez obtenido este tipo de resultado se le hace
notificacin al supervisor y de inmediato se reintegrara al empleado.
Practicas Higinicas:
El Vestuario debe:
Evitar el contacto con componentes, producto y superficies.
Mantener una adecuada limpieza del personal.
Estar compuesto de gorro, tapa bocas, cubre zapatos y cubre barba (cuando
aplique)

131
Personal Debe:
Lavarse y sanitizar si es necesario las maos antes de volver al sitio trabajo y
cuando entre en contacto con un producto contaminado.
Retirarse las joyas u otros objetos que pueden caerse dentro de las materias
primas, equipos, reas de produccin y empaque.
Usar guantes cuando las maos vayan a entrar en contacto con el producto o
alguno de sus componentes, de la misma manera se deben usar en el momento de
la limpieza de la maquinaria implicada en la fabricacin del producto.
No debe:
Almacenar vestuario en lugares donde entre en contacto con la produccin de
suplementos alimenticios
Reutilizar el vestuario cuando es desechable
Consumir alimentos, tomar bebidas, fumar y comer chicle en las reas de
produccin
Usar maquillaje, esmalte, medicamentos para la piel o cualquier material extrao
que pueda entrar en contacto con el producto.
Calificacin del personal
Personal capacitado en las reas de manufactura, empaque, etiquetado y
despacho, adems de identificar a la persona encargada del departamento de
control de calidad y que esta a su vez tenga la capacidad de dirigir y delegar
funciones (CFR, 2007).
3. reas

Las reas se deben mantener en condiciones que eviten la contaminacin de los
suplementos alimenticios, las reas segn la norma se divide en: El campo o
alrededores, que es la zona externa de la industria y la planta fsica que es
donde se da la produccin de los suplementos alimenticios.
132
Campos alrededor de la planta fsica: Para evitar posibles riesgos y peligros la
norma ha propuesto una serie de observaciones que se deben seguir para los
alrededores de la planta fsica son: (CFR, 2007)
9. Almacenamiento apropiado de equipos, remocin efectiva de basuras y cortar el
csped (si lo hay) que este muy cerca de la planta fsica, con esto se evita la
posible llegada de plagas o la reproduccin de las mismas.
10. Mantener limpias las zonas de parqueo, las vas o patios cercanos a la planta
fsica para evitar la contaminacin.
11. Revisar que las zonas de drenaje estn en buen funcionamiento para evitar
posibles filtraciones de desechos y por ende contaminacin de los suplementos
alimenticios.
12. Se debe tener un sistema de tratamiento de basuras fuera de la planta fsica para
evitar la contaminacin con los desechos, y reducir el impacto de
contaminacin causada por la industria.
13. En el caso que la empresa tenga un terreno aledao con prados o pastos que no
cumplan con estas especificaciones se deben intensificar los controles
realizados dentro de la planta fsica.

Planta fsica: La planta fsica se debe mantener en perfecto estado reparando
posibles fallas oportunamente y manteniendo limpias las instalaciones, para ello
se deben usar agentes limpiadores, sanitizadores que estn libres de
microorganismos patgenos y sean seguros bajo las condiciones de utiliz. No
se deben usar sustancias toxicas en superficies en donde este expuesto el
suplemento alimenticio, pero por otro lado estas sustancias pueden ser usadas
para las siguientes labores: (CFR, 2007)
14. Para mantener limpio y sanitizado donde no all contacto directo con el
suplemento alimenticio
15. Para realizar pruebas en el laboratorio (pruebas de potencia)
16. En el mantenimiento de los equipos y la planta fsica

133
Abastecimiento de agua y tuberas: El agua que ingresa a la planta fsica debe
ser potable y tener una temperatura adecuada, se debe revisar que la presin con
la que el agua entra por las tuberas sea optima para evitar posibles
estancamientos los cuales ayudan a la proliferacin de microorganismos que
pueden afectar y contaminar el producto. Las tuberas de agua deben tener el
ancho y largo necesario para abastecer a toda la planta fsica en cualquier
momento y para cualquier emergencia (CFR, 2007).

Por otra parte las aguas residuales deben tener su propia tubera y pasar por un
sistema de tratamiento o por sistemas de neutralizacin que reduzcan su nivel
de contaminacin. (CFR, 2007)

Manejo de basuras: Las basuras son un vector de contaminacin ya que pueden
atraer plagas y la reproduccin de las mismas, por lo que los desechos de la
compaa deben salir sellados evitando olores y derrames (CFR, 2007).

Es importante tener supervisores de salinizacin en las reas de produccin que
estn revisando constantemente que los empleados cumplan con las normas
establecidas y que todo se realice con el mnimo riesgo de contaminacin del
producto. (CFR, 2007)

3.1 Bodega

La bodega es donde se realiza la recepcin de las materias primas para la
fabricacin de los suplementos alimenticios, estos son almacenados, evaluados
y clasificados para su posterior utiliz. A cada una de las materias primas que
llegan a la bodega se les deben hacer pruebas de identidad para comprobar la
pureza y demostrar que sirven para realizar suplementos alimenticios. A parte
de los anlisis que se realizan al recibir la materia prima, los supervisores de
calidad tambin tienen que realizar un chequeo de los anlisis y los mtodos de
134
anlisis que el proveedor realizo antes de en despachar la carga, se debe tener
en cuenta los limites que maneja y las pruebas realizadas; despus de esto se
debe verificar que los resultados concuerden evidenciando de esta forma que la
materia prima es estable (CFR, 2007).

Tras aceptar el estado de las materias primas estn ya pueden ser usadas para
realizar suplementos alimenticios, aunque siempre se tienen que realizar
controles peridicos tanto fsicos (identidad, potencia, desintegracin,
estabilidad, entre otros) como microbiolgicos para verificar y certificar que no
se contamino el producto durante su proceso de produccin. (CFR, 2007)

3.2 Manufactura

En la zona de manufactura es donde se realiza la parte ms importante en la
fabricacin de un suplemento alimenticio, esta zona incluye desde el pesado, la
mezcla de las materias primas y su transformacin a capsulas, tabletas o
cpsulas liquidas. De igual forma es el sector con mayor riesgo de
contaminacin cruzada o la alteracin en las caractersticas del suplemento
alimenticio. En esta zona se encuentran las mquinas encargadas de mezclar,
comprimir, sellar, pintar el suplemento alimenticio terminado. Manufactura es
la zona en donde se tienen que llevar a cabo ms controles a nivel
microbiolgico, qumico y fsico, con el fin de monitorear el suplemento
alimenticio a lo largo del proceso (CFR, 2007).

El control de calidad en la zona de manufactura esta dictado por la norma en el
subttulo K, dice que se deben tomar todas las precauciones necesarias para el
manejo de los suplementos alimenticios con el fin de evitar la contaminacin
del producto, estas recomendaciones son: (CFR, 2007)

135
17. Realizar los procesos de manufactura bajo condiciones que eviten la
contaminacin del suplemento alimenticio y lo proteja contra la posible
contaminacin y crecimiento de microorganismos.
18. Lavar y limpiar los componentes de las mquinas que pueden contener grasas o
aceites para prevenir la contaminacin del suplemento alimenticio.
19. Para lavar, usar agua que cumpla con los estndares estatales, pare evitar que
puedan contener posibles cargas microbianas que pueden contaminar el
producto y en dado caso que el agua sea un componente del suplemento
alimenticio, tiene que ser totalmente potable.
20. Realizar pruebas fsicas, qumicas y microbiolgicas con el fin de verificar la
estabilidad del producto durante el proceso.
21. Si es necesario esterilizar, pasteurizar, congelar, refrigerar, controlar el pH, la
humedad, el Aw, con el fin de microorganismos y prevenir la descomposicin.
22. Guardar o almacenar de forma segura los componentes de los suplementos
alimenticios que son ms susceptibles a la contaminacin por microorganismos.
Para ellos se deben leer las caractersticas de cada materia prima y clasificarla
en la bodega.
23. Optimizar los procedimientos de manufactura con el fin de agilizar el proceso y
proteger el suplemento alimenticio contra la contaminacin. Algunos de los
procedimientos que se pueden optimizar son:
a. Limpiar y sanitizar las superficies de contacto con el suplemento alimenticio
b. Usar control de temperaturas para evitar afectar las propiedades organolpticas
del producto
c. Usar controles de tiempo con el fin de evitar dao en la composicin del
producto.
d. Con el fin de evitar la entrada de sustancias extraas, tales como metales, y que
puedan alterar la composicin del suplemento alimenticio, para este caso de
situaciones se pueden usar:
Filtros
Magnetos
136
Detectores de metales
24. Identificar todas las lneas de procesos y mquinas usadas durante el proceso de
manufactura indicando el numero de lote la mquina que se utiliz para el
procedimiento, todo esto debe ir debidamente documentado, con el fin de llevar
registro de las materias primas utilizadas y de cual hay exceso o deficiencia
(CFR, 2007).

3.3 Empaque y Etiquetado

El empaque y etiquetado es el ltimo proceso que se lleva a cabo, el producto
terminado ahora tiene que ser introducido en los recipientes contenedores mediante
una serie de mquinas que llevan a cabo distintos procesos, estos son: llenado,
introduccin de algodn, poner la tapa del envase, sellar con plstico la tapa y
finalmente etiquetar el envase. En el primer proceso mencionado es donde por ltima
vez el producto est en contacto directo con alguna superficie, ya que despus es
introducido al envase y solo vuelve a tener contacto directo cuando un cliente lo use
(CFR, 2007).

Lo primero que se debe tomar en cuenta para empaquetar un suplemento alimenticio
es un recipiente que asegure la calidad que lleva el producto y evite el contacto
directo de este con el medio ambiente ya que esto podra ocasionar contaminacin o
la alteracin de alguna de sus propiedades (CFR, 2007).

Otra parte importante es la etiqueta del producto, la cual informa el contenido
completo del recipiente, la etiqueta tiene que ser revisada electrnica y
electroqumicamente para comprobar su estabilidad frente a condiciones adversas
(CFR, 2007).

Antes de comenzar a empaquetar y etiquetar se tiene que hacer un revisin minuciosa
de los recipientes y las etiquetas verificando que el lote del producto que se va llenar
137
en los recipientes concuerden con las especificaciones de la etiqueta y el empaque.
Las especificaciones son rangos de control en los diferentes procesos con el fin de
asegurar la calidad de los suplementos alimenticios, y que sean empacados y
etiquetados de una forma ms segura. Ests especificaciones se dictan en la norma en
el subtitulo E 111.70:

9. Se deben establecer especificaciones en cualquier paso o procedimiento que se
lleve a cabo durante el proceso de manufactura con el fin de asegurar que se
cumplan con los estndares de calidad y para que las caractersticas que se
escriben en la etiqueta se ajusten a las llevadas en la documentacin del control en
manufactura.
10. A cada componente o materia prima que se usa en manufactura se le deben
realizar una serie de anlisis antes de comenzar a ser procesado, estos anlisis
son:

25. Establecer la identidad de la sustancia
Establecer la composicin de la sustancia, realizando para ellos anlisis de pureza,
potencia y desintegracin de la materia prima. Estas caractersticas deben ser
iguales al principio y al final del proceso de manufactura.
Se deben establecer lmites de alerta, lmites de aceptacin y lmites de accin para
los distintos tipos de contaminacin que puedan alterar las caractersticas del
producto.

11. Durante el proceso de produccin de los suplementos alimenticios tambin se
deben realizar controles para asegurarse que no se alteren las caractersticas del
producto ni se contamine, por lo tantos es determinante volver a realizar las
mismas pruebas escritas anteriormente. Todo esto tiene que ser revisado por el
personal de control de calidad quien es el encargado de aceptar o no el producto
segn los lmites previamente establecidos.
138
12. Las caractersticas que tiene el producto se deben especificar en la etiqueta para
dar informacin al usuario de lo que est consumiendo, por otra parte, los
empaques que tengan contacto directo con el suplemento alimenticio no pueden
tener caractersticas que alteren la composicin del suplemento alimenticio.
13. Para el suplemento alimenticio terminado tambin se deben establecer
especificaciones (identidad, potencia pureza y composicin final) as como los
limites y las posibles causas de contaminacin que pueden alterar el producto.
14. Si se recibe un producto de un proveedor para empacado y etiquetado, se deben
realizar los respectivos anlisis mencionados anteriormente para probar la calidad
del producto.

Para realizar un proceso de llenado, empaquetado y etiquetado en ptimas
condiciones la norma en el subtitulo L redacta una serie de pasos que se deben llevar
a cabo, estos son: (CFR, 2007)

26. Limpiar y sanitizar todos los instrumentos de llenados de las mquinas
involucradas (empaque y etiquetado) en el proceso antes y despus de correr
un producto.
27. Proteger el suplemento alimenticio de la contaminacin, especialmente de la
contaminacin por partculas de aire.
28. Establecer delimitaciones espaciales entre productos diferentes prevenir
posibles mezclas.
29. Llevar un orden en los recipientes que se van usando con el fin de prevenir
confusin entre el recipiente y el producto con que se llena, ya que el
contenedor no es el mismo en todos los casos.
30. Asignar y delimitar un nmero de lote o nmero de control, es importante para
la identificacin y el seguimiento de un producto terminado, y tambin puede ser
utilizado para establecer cul sera una muestra estadsticamente significativa del
lote para realizar los anlisis de control de calidad y de esta forma verificar si el
producto cumple con las especificaciones propuestas.
139
31. Remocin oportuna de los empaques o etiquetas que sean obsoletas para
asegurar que no se vuelvan a usa en un futuro.

Por otro lado, si en algn momento se cometi algn error durante el proceso, se
tiene que hacer un re-empacado y etiquetado, pero este debe cumplir con las
siguientes especificaciones para evitar posibles confusiones:

32. Solo se debe llevar a cabo el proceso siempre y cuando all pasado por una
revisin de control de calidad que acceda a este proceso. Si control de calidad
no est de acuerdo con el proceso el producto puede ser eliminado o se puede
realizar exmenes ms avanzados para tomar una decisin.
33. Se debe examinar una muestra representativa del lote para verificar que con esta
contaminado y que cumple con las especificaciones.
34. Los lotes que son rechazados deben ser puestos en cuarentena para verificar
posteriormente la causa de la contaminacin o la insuficiencia con el
cumplimiento de las especificaciones.

Por ltimo siempre se debe mantener una documentacin acerca de los procesos
que se llevan a cabo para llevar un control interno de los lotes y productos que
han sido empaquetados y etiquetados; la razn principal es la trazabilidad en
caso de quejas o investigaciones por efectos adversos. (CFR, 2007).

3.4 Requerimientos para las operaciones de manufactura

Todos los procedimientos que se llevan a cabo en el rea de manufactura deben estar
escritos y deben ser acatados. Los procedimientos establecidos deben asegurar que el
producto manufacturado cumpla con las especificaciones finales. Durante la
manufactura de los suplementos nutricionales se deben tener todas las precauciones
140
necesarias para prevenir la contaminacin de los ingredientes o del producto (capsula,
tableta, softgel, etc.), estas precauciones incluyen:
- Se deben desarrollar las operaciones de manufactura de tal forma que se
minimicen los riesgos de crecimiento bacteriano, bien sea en el producto o
sobre la superficie de los equipos.
- Lavar o limpiar los ingredientes que contengan residuos de suelo y otro
contaminantes.
- Utilizar agua que cumpla con las mnimas caractersticas requeridas por el
estado y que no contamine los suplementos nutricionales cuando el agua se
vuelva un ingrediente durante la manufactura de un suplemento.
- Desarrollar anlisis fsicos, qumicos y microbiolgicos para asegurar la
calidad a lo largo de todo el proceso de manufactura.
- Almacenar los ingredientes y los suplementos que sean ms sensibles a la
contaminacin microbiana en lugares especiales donde pueda ser prevenida.
- Identificar y almacenar cualquier ingrediente o suplemento que este siendo
revisado de forma tal que se prevenga la contaminacin o la mezcla con otros
ingredientes o suplementos.
- Desarrollar pasos mecnicos tales (cortar, clasificar, inspeccionar, secar,
mezclar, pulverizar, desintegrar y/o aislar). Con el fin de evitar de cualquier
forma posible la contaminacin de los ingredientes o los suplementos, algunos
de los mecanismos son:
o Limpiar y sanitizar las superficies de contacto.
o Utilizar controles de temperatura
o Utilizar controles de tiempo
o Utilizo de mtodos efectivos para detectar cualquier metal o cualquier
otra sustancia extraa que pueda entrar al ingrediente, a la mezcla o al
suplemento.
141
o Identificar todas las lneas de trabajo utilizadas durante el proceso de
manufactura con el fin de identificar el lugar y el paso del proceso que
se est llevando a cabo con el suplemento.
- Se debe tener toda la documentacin necesaria con todos los procedimientos
utilizados para asegurar la operacin de manufactura.

3.5 Equipos y utensilios

Los equipos y utensilios se deben:

Calibrar los instrumentos que son usados en el rea de manufactura o que son
utilizados para evaluar alguno de los componentes del producto.
Calibrar, inspeccionar y revisar el equipo automtico, mecnico y electrnico
Realizar un adecuado mantenimiento, limpieza y sanitizar cuando sea necesario al
equipo, los utensilios y algunas superficies que entren en contacto el producto.
Los equipos y utensilios deben tener un adecuado diseo, construccin y desempeo
para que los procedimientos de limpieza sean realizados de la manera apropiada
Los equipos deben:
Incluir una bodega para almacenar el producto no utilizado en el proceso de
manufactura
Usar aire comprimido o gas
Usar un sistema automtico, mecnico o electrnico
Tener un diseo apropiado para que el producto no entre en contacto con lubricantes,
combustibles, fragmentos metlicos o de vidrio y otros materiales extraos.
Todos los equipos y utensilios que se utilizan deben:
142
Tener una instalacin y mantenimiento que facilite la limpieza del equipo, utensilios
y de todos los espacios adyacentes a ellos.
Ser resistentes a la corrosin
Ser fabricados en materiales no txicos
Proteger durante el proceso de manufactura al producto
Estar correctamente diseados para que eviten la acumulacin de producto residual u
otros productos que se puedan acumular en reas muertas o inaccesibles y que puedan
traer como consecuencia una contaminacin cruzada.
Estar diseados y construidos en un material resistente a los componentes del
producto, a los agentes de limpieza y agentes sanitizantes.
Cada uno de los congeladores, refrigeradores y otros compartimentos que se usen
para el almacenamiento en frio del producto deben:
Tener un record de temperaturas promedio, mximas y mnimas.
Sistema de alarma automtico que indique un cambio significativo de
temperatura durante el proceso.
Los instrumentos y controles usados en manufactura, empaque, etiquetado o
que son utilizados para la manipulacin del producto y de aquellos instrumentos
que se utilizan para medir, regular o llevar el record de temperaturas, pH,
actividad del agua u otras condiciones para el control o prevencin del
crecimiento de microorganismos u otra contaminacin deben:
Ser exactos y precisos
Ser adecuadamente mantenido y numerado para los distintos propsitos para los
cuales fue creado.
143
Todo tipo de instrumentos y controles que son usados para la fabricacin del
producto se deben calibrar:
Antes de su primer uso
Frecuencia segn lo indique manual de uso de cada uno de los instrumentos
En cada intervalo de produccin o cuando sea necesario para ajustar la
precisin y exactitud del instrumento.
Cada vez que se repara o remplaza una pieza del equipo
Se deben tener limpio y sanitizado si es necesario, todo el equipo y utensilios
que son utilizados en el rea de manufactura, empaque, etiquetado y despacho
o cualquier superficie u instrumento que entre en contacto con el producto,
adems de asegurarse que todas las superficies que entran en contacto con el
producto estn debidamente limpias y sanitizadas antes de su uso y despus de
su uso.
El equipo de limpieza debe de ser porttil para que este en ningn momento
entre en contacto con superficies de trabajo.
El uso del equipo automtico, mecnico y electrnico en las reas de
manufactura, empaque, etiquetado y equipos que estn en contacto directo con
el producto deben:
Estar diseados y seleccionados adecuadamente para que las caractersticas del
producto sean constantes durante la produccin.
Determinar que el producto va a cumplir con las caractersticas que se requieren
durante el proceso cuando el equipo opere bajo lmites mximos y mnimos.
Calibrar, inspeccionar o revisar habitualmente el equipo para asegurar su buen
funcionamiento.
144
Establecer un apropiado uso del equipo automtico, mecnico y electrnico
(incluyendo su software) en las reas de manufactura, empaque, etiquetado y que el
protocolo de uso cuente con previa autorizacin del jefe de control de calidad en cada
una de las reas.
Usar adecuadamente los controles de los equipos en cada una de las reas para
asegurar un buen funcionamiento respecto al uso asignado.

3.6 Documentacin

Se debe tener documentacin por lo menos pasado un ao y medio pasado la vida til
del producto si no est especificada su vida til, por el contrario si la vida til es
descrita se deben mantener registros hasta dos aos despus de expirado el producto
(CFR. 2007).

Se debe tener tambin los documentos originales como registro escrito o electrnico.
La FDA est en capacidad de pedir cualquier documento de cualquier rea, se debe
hacer una copia de todos los documentos requeridos por la FDA y continuar con el
almacenamiento de documentacin (CFR, 2007).

145
ANEXO H
Ventajas y Desventajas de algunos desinfectantes

Fuente: Wirtanen, 2003

146
ANEXO I
Fuente: Arias, 2005

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD DE LOS ANTIMICROBIANOS

AGUA
Solvente de los productos de limpieza
y desinfeccin
Arrastra la suciedad
Aumenta el efecto letal del calor
sobre lo microorganismos
Aguas duras (Calcio y Magnesio),
reduce la capacidad antisptica.

NUMERO DE MICROORGANISMOS Y
CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Bacterias Gran negativas como
Pseudomonas sp. Son ms resistentes
a los agentes limpiadores
Las bacterias que estn en fase
logartmica son ms susceptibles a las
que se encuentran en la fase
estacionaria

TEMPERATURA

El rango de eliminacin aumenta a
medida que aumenta la temperatura

pH
Los bactericidas cidos (aninicos)
son ms efectivos a pH bajo
Los bactericidas catinicos tienden a
ser inhibidos por pH bajos y/o
aniones
Las soluciones acidas, tienen mayor
efecto bactericida si se calienta, ya
que el calor tiende a aumentar la
disociacin de los cidos.

MATERIA ORGANICA
El material orgnico puede inactivar
gran parte o todo el agente limpiador;
por esta razn se debe aadir grandes
volmenes de agente limpiador para
que acte sobre los microorganismos.

TIEMPO
El tiempo de contacto con la
superficie de aplicaron es de gran
importancia para la desinfeccin.
El tiempo necesario para desinfectar
diversas sustancias, depende del
contacto, concentracin y otros
factores.
145
ANEXO J.
2.8 Descripcin de limpieza manual de equipos.
146

147
ANEXO K - Diagrama general pruebas In Vivo e In vitro
148
ANEXO L
Susceptibilidad antimicrobiana (KIRBY-BAUER)
149

150
ANEXO M
DIAGRAMA DE FLUJO TCNICA DEL COEFICIENTE FENLICO

Preparacindesolucionesde
alcoholisoproplicoyfenol.
Vf=5mL
Preparacin de la solucin del
microorganismo.
Bacterias=24horas
Levadura=72horas
SetdeEvaluacin
DiecisistubosdecaldoBHI
Dosdilucionesdefenol
Tres diluciones de alcohol
isoproplico.
Evaluacin a tres tiempos de
exposicin5,10y15minutos.
Adicin de 0,5 mL del
microorganismo prueba a la
solucindeldesinfectante.
Cumple el tiempo de exposicin
de la solucin del
microorganismo y desinfectante
ld
Incubar a la temperatura y
tiempo adecuado dependiendo
delmicroorganismo.
151

El nmero del coeficiente fenlico se calcul despus de haber realizado la
metodologa por triplicado cumpliendo con los parmetros establecidos para su
debido clculo.

LecturadeResultados
Clculo del nmero del
coeficientefenlico
152
ANEXO N
DIAGRAMA DE FLUJO PRUEBA EN SOPORTE Carrier.
Parmetros para la evaluar en la evaluacin de superficies.

Prueba#1

Preparacin del pool de

microorganismo (Escherichia coli
yStaphylococcusaureus)con54,
48y24horasdeincubacin.
Esterilizacin de los soportes a
15 lbs de presin a 121Cpor 15
minutos.
Preparacin de la solucin de
alcoholisoproplicoal70%.
Preparacin y esterilizacin del
caldoLeethenycaldoBHI.
Preparacin de la solucin de
materia orgnica (Suero bovino)
Del volumen final del pool de
microorganismos tomar la mitad
del volumen y adicionarlo en un
contenedorestril.
En igual proporcin adicionar la
solucin de materia orgnica al
pooldemicroorganismos
Servir 5 mL de la solucin del
microorganismoymateriaorgnica
entubosestriles
10Tubos
153
Incubarpor30minutosa35C+/2
Con la ayuda de un gancho estril
tomar un soporte y adicionarlo a
solucin de materia orgnica y
microorganismo
tomar el soporte y colocarlo en la
superficie del papel filtro (caja de
petri)
solucindealcoholisoproplicopor
10minutos.
tomar el soporte y colocarlo el
caldoleethenpor30minutos.
tomar el soporte y depositarlo en
elcaldoBHI.
Incubar Caldo Leetheen y Caldo
BHI.
Tubos positivos (crecimiento)
realizarlespaseaAgarnutritivoTSA
RealizartincindeGram Pasesaagarselectivos:Escherichiacoli
=EMB;StaphylococcusaureusVogel
Johnson
TestCoagulasa:Staphylococcusaureus
154
Prueba # 2

Servir en tubos estriles 5 mL
nicamente del pool de
microorganismos.
microorganismo
petri)
solucindealcoholisoproplicopor
10minutos.
elcaldoBHI.
BHI.
10Tubos
155
Prueba # 3

Johnson
Servir en un tubo estril 5mL del
pooldemicroorganismos
microorganismo
petri)
elcaldoBHI.
BHI.
156

Prueba # 4
Prueba # 5

Johnson
Setom1mLdelaslndemateria
orgnica
AdicionarloencaldoBHI
PaseagarNutritivo
Sihaycrecimiento
TincindeGram Pasesagaresselectivos
(M.OPatgenos)
Conlaayudadeungancho
estriltomarunsoporte
TransferirloalcaldoBHI
Incubarpor35C+/2por48
Incubarpor35C+/2por48
157

La lectura de resultados se realiz con base a la siguiente tabla: (prueba #1 y 2)

Nmero de tubos Interpretacin

>8 tubos positivos
La materia orgnica interfiere
en la accin bactericida del
desinfectante sobre la
superficie.
5 a 7 tubos positivos
La actividad del desinfectante
se ve afectada, para mayor
seguridad repetir la prueba o
aumentar la concentracin de
materia orgnica.
<5 tubos positivos
La materia orgnica no
interfiere en la actividad
bactericida del desinfectante
sobre la superficie.
Lecturaporpresenciaoausenciade
turbidez
PaseagarNutritivo
Sihaycrecimiento
TincindeGram Pasesagaresselectivos
(M.OPatgenos)
158
ANEXO O
Evaluacin de la efectividad de la remocin de material orgnico por parte del
detergente
SepreparunasolucindeAlconox
1%(detergente)
Sepreparunasolucindemateria
orgnicaal1%.
Soportesaceroinoxidable(limpios)
Pesarlossoporteslimpios(Ci)
Conlamicropipetaadicionar0.5mL
alsoporte
Dejarsecar
Pesar nuevamente los soportes
(Cs)
Adicionarlos a la canasta de
disolucin
Vaso de disolucin con la solucin
deldetergente
Sumergirloaproximadamentepor
50veces
Extraerlossoportesdelacanasta
dedisolucin
Lavarlossoportesconagua
destilada
159

Dejarsecar
Pesarnuevamentelossoportes
(CL)
Calcularelporcentajederesiduo
restante
160
ANEXO P
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
Agar Plate Count (PC)
Composicin
Ingredientes Concentracin g/L
Digerido pancretico de casena 5.0 g
Extracto de levadura 2.5 g
Dextrosa 1.0 g
Agar 10.0 g

Disolver 23.5 g del polvo en 1 L de agua y mezclarlo. Calentar con agitacin
frecuente y dejar hervir durante 1 minuto. Autoclave a 121C por 15 minutos
finalmente ajuste el pH a 7.0+/-0.2.
Agar Papa Dextrosa (PDA)
Composicin
Almidn de papa 4.0 g
Dextrosa 20. g
Agar 15.o g

Suspender 39 g de polvo en un litro de agua estril y agitar para mezclar. Calentar
con agitacin y dejar hervir durante 1 minuto. Autoclave a 121C por 15 minutos.
Para promover el crecimiento de hongos y levaduras ajuste el pH a 3.5
adicionando 14 mL de una solucin de acido tartrico al 10%v/v por cada litro de
medio preparado. El medio se debe usar despus de agregado el acido ya que si
se solidifica no se puede recalentar para servir.
o Preparacin de la solucin de Acido Tartrico al 10%v/v
Pesar 9.99 g de acido tartrico al 99% teniendo en cuenta sus precauciones de
uso. Disolver en 99 mL de agua destilada estril.
161
Agar Tripticasa Soya (TSA)
Composicin
Digerido enzimtico de soya 5.0 g
Cloruro de Sodio 5.0 g
Agar 15.0 g

Suspenda 40 g de medio en un litro de agua destilada estril y mezcle
vigorosamente. Caliente con agitacin y deje hervir por 1 minuto. Autoclave a
121C por 15 minutos. Ajuste el pH a 7.0+/- 0.2
Caldo Brain Hearth Infusion (BHI)
Composicin
Infusin de cerebro corazn 6.0 g
Digerido pptico de tejido animal 6.0 g
Digerido pancretico de gelatina 14.5 g
Dextrosa 3.0 g
Fosfato di-sodio 2.5 g

Suspenda 38 g de medio en 1 L de agua destilada estril y agite fuertemente.
Caliente con frecuente agitacin y deje hervir durante 1 minuto. Autoclavar a
121C por 15 minutos. Ajuste pH a 7.4 +/-0.2 y sirva en tubos de 17x100mm.
Caldo Lactosa
Composicin
Extracto de carne 3.0 g
Lactosa 5.0 g

162
Disuelva 13 g de medio en un litro de agua destilada estril y agite vigorosamente
para mezclar. Autoclave a 121C por 15minutos. Ajuste pH 6.9 +/-0.2 Servir en
tubos de 17x100mm.

Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)
Composicin
Lactosa 5.0 g
Sacarosa 5.0 g
Fosfato di Potsico 2.0 g
Eosina Y 0.4 g
Azul de metileno 65 mg
Agar 13.5 g

Suspenda 36 g de medio en un litro de agua destilada estril, mezcle
vigorosamente. Caliente con agitacin frecuente y deje hervir durante 1 minuto.
Autoclave a 121C por 15 minutos, enfri a 44C ajuste el pH a 7.2+/-0.2 y sirva
en cajas de petri.
Agar Mc Conkey
Composicin
Digerido Pancretico de gelatina 1.5 g
Lactosa 10.0 g
Sales Biliares 1.5 g
Agar 13.5 g
Rojo Neutro 0.03 g
Cristal Violeta 1.0 mg

163
Suspenda 50 g de medio en un litro de agua destilada estril mezclar
vigorosamente. Caliente con agitacin y hierva durante 1 minuto. Autoclavar a
121C por 15 minutos, dejar enfriar hasta 50 - 55C, ajuste el pH a 7.4+/-0.2 y
sirva en cajas de petri.
Agar Hektoen
Composicin
Sales biliares 9.0 g
Lactosa 12.0 g
Sacarosa 12.0 g
Salicina 2.0 g
Tiosulfato de Sodio 5.0 g
Citrato Frrico de Amonio 1.5 g
Agar 13.5 g
Azul de Bromotimol 64.0 mg
Fuchina cida 0.1 g

Suspenda 75 g de medio en un litro de agua destilada estril y mezcle para
homogenizar. Caliente hasta ebullicin con frecuente agitacin. NO
SOBRECALIENTE Y NO AUTOCLAVE. Deje enfriar a una temperatura de
50 a 55C, ajuste el pH 7.5+/- 0.2 y sirva en cajas de petri.
Agar XLD
Composicin
Xilosa 3.5 g
L-Lisina 5.0 g
Lactosa 7.5 g
Sacarosa 7.5 g
Rojo de fenol 0.08 g
164
Desoxicolato de sodio 2.5 g
Tiosulfato de Sodio 6.8 g
Citrato Frrico de amonio 0.8 g
Agar 13.5 g

Suspenda 55 g de polvo en un litro de agua destilada estril y mezcle para
homogenizar. Calentar con frecuente agitacin hasta antes de que el medio hierva.
NO SOBRE CALENTAR NI AUTOCLAVAR. Deje enfriar de 55 a 50C,
ajuste el pH 7.2 +/-0.2. Utilcelo inmediatamente despus de alcanzar esta
temperatura sirvindole en cajas de petri.
Agar Vogel Johnson
Composicin
Triptona 10.0 g
Manitol 10.0 g
Fosfato Di potsico 5.0 g
Cloruro de Litio 5.0 g
Glicina 10.0 g
Agar 15.0 g
Rojo Fenol 25.0 mg

Disuelva 60 g del polvo en un litro de agua destilada estril y mezcle para
homogenizar. Caliente en constante agitacin y hierva durante 1 minuto.
Autoclave a 121C por 15 minutos. Enfri de 45 a 50C. Adicione 20 mL de
telurito de sodio al 1% y agite. Ajuste el pH 7.2 +/-0.2 y sirva en cajas de petri.
Agar MRS
Composicin
Peptona Proteica No. 3 10.0 g
Extracto de Carne 10.0 g
165
Dextrosa 20.0 g
Polisorbato 80 1.0 g
Citrato de amonio 2.0 g
Acetato de Sodio 5.0 g
Sulfato de Magnesio 0.1 g
Sulfato de Manganeso 0.05 g
Fosfato di potsico 2.0 g
Agar 15.0 g

Disuelva 70 g de medio en un litro de agua destilada estril y mezcle
vigorosamente. Caliente con agitacin y deje hervir por 1 minuto. Autoclave a
121C por 15 minutos. Ajuste el pH a 6.5 +/-0.2. Deje enfriar en bao
termostatado a 55 - 50C.
Agar Cetrimide
Composicin
Cloruro de magnesio 1.4 g
Sulfato de potasio 10.0 g
Cetrimide 0.3 g
Agar 13.6 g

Suspenda 45.3 g de polvo en un litro de agua destilada estril y mzclelo con
10 mL de Glicerol ultra puro. Caliente con agitacin frecuente y hierva durante 1
minuto. Autoclave a 121C por 15 minutos. Deje enfriar hasta 55 - 50C ajuste el
pH 7.2+/-0.2 y sirva en cajas de petri.
Agua de peptona 0.1%
Composicin
Peptona 10.0 g

166
Disuelva 15 g de polvo en un litro de agua destilada estril. Caliente con agitacin
frecuente y deje hervir durante 1 minuto. Autoclave a 121C por 15 minutos.
Ajuste el pH a 7.2 +/-0.2. Deje enfriar de 50 a 55C y sirva en el contenedor para
su uso determinado.
Caldo Letheen AOAC modificado
Composicin
Polisorbato 80 5.0 g
Peptona 10.0 g

Disuelva 5 g de polisorbato 80 en 400 mL de agua destilada estril y caliente con
frecuente agitacin, hierva hasta que el caldo quede translucido. Adicione 10 g de
peptona y 5 g de cloruro de sodio en 600 mL de agua destilada estril para
completar un volumen final de un litro. Caliente con agitacin frecuente y deje
hervir durante 10 minutos. Ajuste el pH a 7.0+/-0.2 y sirva en tubos de
17x100mm. Autoclave a 121C por 20 minutos.

167
ANEXO Q.
FORMATO DE TABLA DE RESULTADOS
1. Evaluacin de la efectividad de los agentes de limpieza
1.1. Tcnico de dilucin en tubo
Initial
Recount
Alconox Alcohol
Tube Plate Tube Plate

0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 50% 70% 80% 50% 70% 80%
1'
5'
15'
Initial
Recount
Alconox Alcohol
Tube Plate(ufc/mL) Tube Plate(ufc/mL)

0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 50% 70% 80% 50% 70% 80%
1'
5'
15'
Initial
Recount
Alconox Alcohol

0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 50% 70% 80% 50% 70% 80%
1'
5'
15'
Initial
Recount
Alconox Alcohol

0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 50% 70% 80% 50% 70% 80%
1'
5'
15'
Initial
Recount
Alconox Alcohol

0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 50% 70% 80% 50% 70% 80%
1'
5'
15'

168
1.2 Mtodo del coeficiente fenlico
Microorganism TimeInoculum Phenol Alcohol
1.E.Coli
Tube Tube
1/80 1/90 30% 50% 70%
5'
10'
15'
Microorganism Time Fenol Alcohol
2.Pseudomonas
Tube Tube
1/80 1/90 30% 50% 70%
5'
10'
15'
3.Candidaalbicans
Tube Tube
1/70 1/80 30% 50% 70%
5'
10'
15'
4.Staphylococcus
aureus
Tube Tube
1/60 1/70 30% 50% 70%
5'
10'
15'
5.Salmonella
Tube Tube
1/90 1/100 30% 50% 70%
5'
10'
15'

169
2. Evaluacin de superficies
Microorganims LBMod. BHI Gram MediosSelectivos
1.E.coli
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
Microorganims LBMod. BHI Gram MediosSelectivos
2.S.aureus
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10

170
3. Evaluacin de efectividad de la limpieza con Alconox.
ESTUDIO DE EFECTIVIDAD DE LA LIMPIEZA CON ALCONOX
Nombre del
Producto
Fecha AF Lot# Peso Inicial (g) Peso con producto (g) Peso Limpio (g)
171
4. Monitoreo fsico, qumico y microbiolgico

5. Evaluacin del proceso de limpieza - caso o condicin extrema

172
ANEXO R
ANLISIS DE VARIANZA DE LAS PRUEBAS IN VITRO

* Los resultados esperados se clasificaron de acuerdo a la inhibicin total del
crecimiento (Satisfactorio) y en la no inhibicin total o parcial del crecimiento (No
satisfactorio).

Piedrahita-Navarrete Diana Carolina
Forero-Vargas Rafael Alberto
1
ANALYSIS AND EVALUATION OF MANUAL CLEANING PROCESSES OF EQUIPMENT

USED IN DIETARY SUPPLEMENTS MANUFACTURING.
ANALISIS Y EVALUACION DE LOS PROCESOS DE LIMPIEZA MANUAL DE EQUIPOS
DE MANUFACTURA EN UNA INDUSTRIA NUTRACEUTICA.

-Evaluation of Manual Cleaning Process-

D. Piedrahita
1
, R. Forero
1
, J. Arias
2
, D. Congote
3
Quality Control Department
1
, Javeriana University Industrial Microbiology Career Director
2
, Quality & Regulatory
Affairs Manager
3
.
dpiedrahita@javeriana.edu.co; r-forero@javeriana.edu.co; jdcarias@javeriana.edu.co; diegocongote@hotmail.com

Arnet Pharmaceutical Corp - 2525 Davie Road, Bldg. 330 - Fort Lauderdale. Florida 33317.
United States of America.

Abstract
The effectiveness of an anionic detergent (Alconox) and a disinfectant (Isopropyl Alcohol) utilized
during the manual cleaning of manufacturing equipment were evaluated in this study. In vitro tests
were separated in two parts: suspension and carrier test. Suspension tests were the Phenol Coefficient
(AOAC 955.11), Kirby-Bauer disk diffusion method and Tube dilution method, while carrier test was
the Use dilution method (AOAC 955.15). In vivo test was carried out by taking swab samples of the
equipments surfaces before and after the cleaning process in order to identify the residues and
microorganisms left behind the cleaning process. The process was then evaluated by the worst case
scenario. The microorganisms used were Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans.
Isopropyl Alcohol (70% v/v) solution was suitable for the inhibiting of bacterial growth even, at (1)
one minute of exposure; nevertheless, bactericidal action was inactivated by organic matter at 0.25
g/mL (Bovine Serum). Alconox showed bactericidal action against Staphylococcus aureus at 2% w/v
2
after 5 minutes of exposure. Immersion of the removable small pieces of equipment in 70% v/v
isopropyl alcohol solution as well as periodic intervals of disinfectant solutions were some feedbacks
given once the study was over. Key Words: Cleaning evaluation, Anionic Detergent, Disinfection,
Isopropyl Alcohol, and Manual Cleaning.
Resumen
Se evalu la eficacia los agentes limpiadores Alconox (detergente aninico) y alcohol isoproplico
(desinfectante) utilizados durante la limpieza manual de equipos; se llevaron a cabo pruebas in vitro
de suspensin y superficies e in vivo en donde se tomaron muestras de las superficies de los equipos
del rea de manufactura una vez finalizados los procesos de limpieza. Finalmente, se utiliz el criterio
del caso o condicin extrema. Los microorganismos que se utilizados fueron: Escherichia coli,
Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans. La
concentracin de alcohol isoproplico (70% v/v) es adecuada para el uso establecido, inhibiendo el
crecimiento de los microorganismos en suspensin desde (1) un minuto de exposicin. En la
evaluacin de superficies para el alcohol isoproplico se observ que el desinfectante es sensible a a
concentraciones de materia orgnica de 0.25 g/mL. Alconox evidenci accin bactericida frente a
Staphylococcus aureus a una concentracin del 2% p/v en un tiempo de exposicin de 5 minutos;
segn el tipo de residuo alconox debe ser utilizado a diferentes concentraciones. La inmersin de las
partes pequeas removibles de la maquina en Alcohol isoproplico 70% v/v y la rotacin del
desinfectante, son algunas sugerencias tras la finalizacin de este trabajo. Palabras clave: Evaluacin
de la limpieza, Detergente aninico, desinfeccin, Isopropil Alcohol y Limpieza Manual.
INTRODUCTION
Equipment cleaning processes are implemented as a way to improve product safety. To validate these
processes, the odds of microbial contamination as well as products carryover to the next product must
3
decrease. In its Guide to Inspections Validation of Cleaning Processes (1993) the Food and Drug
Administration (FDA) expects to have written Standard Operatives Procedures (SOPs) detailing the
cleaning processes used for various pieces of equipment. Cleaning processes used between batches of
the same product do not require validation.AS opposed to different formula products. Several authors
argue that Manual Cleaning (MC) should only be evaluated rather than validated (Morales, 2006;
Health Products and Food Branch Inspectorate, 2000) due to the inherently variability of the process.
Instead, operators carrying out the MC process should be adequately trained, monitored, and once in a
while assessed (Health Products and Food Branch Inspectorate, 2000). Cleaning agents and test
surfaces must be considered prior to initializing the development of either a validation or evaluation
plan. Suitable disinfectant validation can support equipment MC. Disinfectant validation is known as
establishing documented evidence that a disinfection process will consistently remove or inactive
known or possible pathogens from inanimate objects (Martinez, 2006). This disinfectant process
might be the only validated procedure that manual cleaning can have as long as operators perform the
preparation of the cleaning agents according to the SOP. Disinfectant validation was achieved after
some tests were performed: suspension test, carrier test, surface tests, and capacity test and practical
test if neccesary (Reybrouck, 1998). Furthermore, in order to have a successful cleaning process
microorganisms and their disinfectant resistance methods are require. The aim of this study was to
analyzed and evaluate the manual cleaning process of equipment used in Dietary Supplement
manufacturing.
MATERIALS AND METHODS
Media and Reagents: Media and Broths used were obtained from: BD BBL, BD Difco, BD
Bacto, EMD Chemicals and Sigma-Aldrich. Media and Broth were prepared and held as instructed
in their labels. Letheen Broth ingredients were modified as AOAC 955.11 (1964) and 955.15 (2006)
4
methods declare. The modified letheen broth did not have lecithin, which was not necessary for the
neutralization of the 70% v/v Isopropyl Alcohol solution as Ascenzi (1995) suggested in his study.
Test Surfaces: The surface tested was stainless steel type 304 cylinders with 5 to 7 mm of width and 5
mm of diameter. The cylinders were cut from stainless steel 30 cm bar. Subsequently, the cylinders
were polished with the Dayton 4Z123H polisher machine. The cylinders looked like the penicylinders
the AOAC Use-Dilution Method (2006) suggested for utilize.
Cleaning Agents: The disinfectants used in this study were: Phenol solution (5%v/v USP; Spectrum
Chemicals and Laboratory Products cat#LC18195-2) and 99% v/v Anhydride Isopropyl Alcohol
solution (UNIVAR-USA cat#285820).
The Phenol Coefficient Method required different dilutions of the 5% v/v Phenol Solution as well as
99% v/v Anhydride Isopropyl Alcohol solution. The procedure was achieved in a flow laminar cabinet
using: air masks (North cat#7700-30L), 5 mL, 10 mL and 25 mL pipettes (Kimax cat#37025; 37007;
Pyrex cat#7101), 10 100 L micropipette (VWR International, LLC; cat#40000-028) and
17x100 mm plastic tubes (VWR International, LLC; cat#60818-618). The sufficient amount of 5% v/v
Phenol solution was added to the test tubes to acquire the following concentrations; 1/60, 1/70, 1/80,
1/90 and 1/100, and 5 mL of Zephyrhillsdistilled was then added. Then these were submitted to the
Autoclave (Electric Pressure Steam Model 25x) for 20 minutes at 121C with 15 Lbs of pressure.
Isopropyl Alcohol solutions of 20% v/v to 80% v/v were used and measure in 10 mL dispensers
(Barnstead International; cat#9010-EA), when the suitable volume of 99% v/v Isopropyl Alcohol was
introduced to the test tubes referenced above (5 mL).
5
The Alconox preparation was done according to its instructive manual. To make a 1% w/v solution, 15
g of the powder was dissolved in 100 mL of tap or purified water and mixed thoroughly. For 5 mL test
tubes, approximately 20-fold of the weight above was weighed.
Test Microorganisms: The microorganisms used were: Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 9027), Salmonella enterica (ATCC 6539), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) y
Candida albicans (ATCC 10231). They were from Lyfocults (PML Microbiologicals).
Microorganisms were reconstituted and held as described in the product insert; storage temperature
was kept between 2-8C. Stock cultures on petri dish (Spectrum Chemicals & Laboratory Products;
cat#960-25563) with Triptone Soy Agar (TSA; BD BBL; cat#211043) were prerared for the
bacteria, while the stock Candida albicans culture was prepared in Potato Dextrose Agar (PDA; EMD
Chemicals cat#1.10130.0500).An incubation period of 2 days was carried out for bacteria and 3 days
for yeast both at 37C (Incubator Boekel model 132000). After the stocks cultures were stored as
mentioned (Refrigerator, VWR; model R144GA14) above, they were subcultured monthly as the
Association of Official Analytical Chemists International (AOAC) methods suggest.
When each microorganism was utilized, one or more colonies were pulled out of the stock culture and
isolated in TSA or PDA, depending on the microorganisms. Afterward, growth colonies were
inoculated into 5 mL tube of Brain Hearth Infusion Broth (BHI; BD Difco cat#211057) until the
turbidity was similar to the 4
th
tube inMcFarlands scale (12x10
8
cfu/mL). Culture concentrations were
checked by dilutions (10
-1
to 10
-8
) and counted on Plate Count Agar (PC; EMD Chemicals cat#
1.05463.5007).
Identification of Microorganisms: Using the stock cultures of each microorganism, Gram coloration,
selective agar isolation, as well as Oxi/ferm tube II (BD BBL; cat#212116) were used for the
identification of bacteria strain. The latter was done as described by Gilardi (1985). A coagulase
6
plasma test (BD Bacto; cat#240827) for Staphylococcus aureus strain was done as described in the
BBL coagulase plasma package insert, and assisted by the Bayliss & Hall (1965) study.
Finally, carbohydrate fermentation and Gram coloration (Mannitol, dextrose, lactose and sucrose) were
also done to identify the yeast.
Cleaning Agents Evaluation
Dilution tube method: evaluates the bacterial effectiveness of both cleaning agents in at 1, 5 and 15
minute. Isopropyl Alcohol test solutions were: 50% v/v, 70% v/v and 80% v/v. Alconox test solutions
were: 0.5% w/v, 1% w/v and 2% w/v. Each cleaning agent test tube was inoculated with 0.5 mL of
microorganism suspension (as prepared above) and hung until the test time mark. Once the testing time
was reached, it was mixed and 3 mL was taken out of each tube; 1 mL went to BHI and the other 2 mL
where for depth count using PC agar. The presence of turbidity indicated that the cleaning agent did
not totally inhibit the microorganisms and the depth count revealed many log units the microorganism
reduced at each contact time. The Disinfectant eliminated at least 3 to 5 log units (Bloomfield, et al.
1993; Gelinas, et al. 1983).
Disk Diffusion Susceptibility test (Kirby-Bauer): Made a massive spike of each microorganism over the
surface of Mueller Hintotn agar plates. Sterile filter paper disks of 5 mm diameter (Whatman Filter #1;
cat#100125) were submerged in the cleaning agents solutions and then transferred them to the surface
of the media (Guimares, et al. 2000). For each plate used two filter disks of the same concentration
and a third disk impregnated with distilled water was used as control. This modification is similar to
what Mitchell and Carter (2000) developed. An incubating period time of 24 hours at 37C for bacteria
and 72 hours at 37C for Candida albicans. The zone of inhibition showed microorganism
susceptibility; just 0.5 mm diameter onward zones were taken into account as susceptible.
7
Phenol coefficient Method (AOAC modified): was carried out as described in the AOAC 955.11 for
each microorganism and the nutrient broth was changed to BHI.
Use-dilution method (AOAC modified) was carried out as described in the AOAC and assisted by the
Guimares (2000) method. Modifications were as follow: BHI as nutrient broth and Neutralizer media
was Letheen broth without lecithin, where used since it did not affect the neutralizer effect against 70%
v/v Isopropyl Alcohol solution (Aszenci, 1995).
Alconox effectiveness test: Prepared an adequate amount of cleaning agent according to the
manufacturers directions. Spiked 100 to 500 L of formulation onto a preweighed, stainless steel
cylinder (used above) and allowed it to air dry. Weighed the coupon again and recorded the weight.
Attached the coupon to a USP disintegration apparatus and dipped the coupon about 50 times into the
cleaning agent solution. Washed the coupon in distilled/deionized water, dried and reweighed. The
limits were 0.1 w/w for products with allergenics compounds and 1.0% w/w for innocuous products.
Calculated by the equation 1 below:
% RcsiJuc Rcmoining = 1uu%
Clcon CylinJcr -PrcwcigbcJ CylinJcr
Spikc CylinJcr -PrcwcigbcJ CylinJcr

Equation 1. Percentage (%) Residue Remaining after detergent application.
Monitoring and Sampling: Different equipment was sampled in the manufacturing area (Tableting,
Encapsulating and Blending machines). Product contact parts where focus. The companys
microbiological analysis was used. Samples of the first run after cleaning were taken and analyzed by
the companys (HPLC and Atomic Absorption) in house laboratory. Another laboratory was used to
test for phosphorus in order to identify residues from: the previous product manufactured and detergent
used.
Worst case
was conduc
next produc
RESULTS

Figure 1 In v
times.

Table 1 Pheno

G
r
o
w
t
h
(
%
)
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w
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(
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)

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and after the
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Pseudomon
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Staphyloc
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0.5% 1
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% 0% 100%
% 0% 100%
% 0% 100%
Staphy
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e equipment
ubmitted to m
on Test. Alcon
ach microorga
organism
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nas aeruginosa
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da albicans
- +
% 2%
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0% 100%
0% 0%
0% 0%
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s cleaning p
microbial an
nox & Isoprop
anism.
Phenol
- +
% 50%
0% 0% 10
100% 0% 10
100% 0% 10
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Piedr
to its bacteri
process usin
alyses.
pyl Alcohol. D
l Coefficient Nu
24
40
24
21.1
17.96
- + -
70%
ALCOHOL
00% 0% 100%
00% 0% 100%
00% 0% 100%
6538 Tube di
rahita-Navar
Forero-Va
ial concentra
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Different conc
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+ -
80%
L
% 0% 100%
% 0% 100%
% 0% 100%
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rrete Diana C
argas Rafael
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Carolina
l Alberto
8
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on the test su
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(
%
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2
5
c
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2
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20%
40%
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C
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G
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t
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(
%
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0.5%
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R
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(
%
)

0
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100
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C
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/
2
5
c
m
2

2a.
2d.
2c.
tant effectiven
tainless steel
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th Growth
Inh.
Gr
Control
100% 66
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2 3 4 5
05 2/06
Enc
M
ness against (a
cylinders). (c
ntrol on the en
rowth Growth
Inh.
Test
6.7% 33.3%
thod E. coli
6 7 8 9 10
Number
Alconox e
2/07 3/08
capsulators -
Month/Day
a) E.coli and (
c)Alconox effe
capsulators s
0%
20%
40%
60%
80%
100%
%
G
r
o
w
t
h

(
%
)
0 11 12 13 14
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2b.
Piedr
(b) S.aureus in
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In
Control
% 0% 100
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4 15 16 17 18
Tests
4/30
100 UFC/25cm
2
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rahita-Navar
Forero-Va
n prescence o
ainst several k
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owth
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Growth G
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0% 76.6%
n Method S. a
19 20
A
%
In
2
Samplesa
AFTERCfu
Acceptabl
Cfu/25cm
Samplesa
BEFOREC
rrete Diana C
argas Rafael
f 0.25g/mL of
kinds of Nutr
e MC.
Growth
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23.3%
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%Residual
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average
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2
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Carolina
l Alberto
9
f albumin
raceutical
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The microor
initial part o
Kirby Bauer
due to, its
C
F
U
/
2
5
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2
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ptable Limit C
Ch
Micro
ON
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of this study
rs susceptib
quick evap
0
2
4
6
8
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C
F
U
/
2
5
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m
2

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Criteria utilize
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Physical Lim
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2/06
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Products

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2/07 3/08
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after the MC
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0.1 ppm
<100 CFU
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and

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r Isopropyl A
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2
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Piedr
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C. (USP/NF 200
table Limit C
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for allergens com
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2
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Escherichia coli,
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irmed using
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Alcohol solu
ur (Crook,
30
10 CFU/25cm
2
molds control
rahita-Navar
Forero-Va
es before and
07)
riteria
matter after MC
products.
mpounds
or bacteria.
ast and mold.
Salmonella sp,
ylococcus aureu
ans
Bergeys M
ntified using
utions for ev
2000). Thos
l
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C)

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Manual (1994
g the method
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Average
CFU/25cm2
Carolina
l Alberto
10
.
4). In the
d above.
rganism;
were not
0
11
analyzed within this study; in contrast, the isopropyl alcohols tube dilution method achieved the
expected results.
In vitro Dilution tube method (all data is not available) demonstrate that even with 1 minute of direct
exposure all test strains were inhibited with concentrations as low as 50% v/v of Isopropyl alcohol
solution (see Figure 1). On the other hand, 0.5%w/v and Alconoxs recommended concentration of
1.0% w/v did not inhibit any of the microorganisms even with the longest exposure time (15 minutes)
in this study. Despite this information there was an undersized decrease in the log final reckon
estimate. Figure 1 shows a particular behavior in the 2%w/v Alconox solution. It showed bactericide
activity against Staphylococcus aureus, possibly due to EDTA which is one of Alconoxs ingredients.
EDTA starts cell membrane fluidization at low levels (Glover, 1999), and since Gram positive bacteria
is less resistant than Gram negative or yeast (Russell, 1998), EDTA could affect the cell membrane of
Staphyloccocus aureus causing its inhibition at 5 minute of exposure.
The other suspension test (phenol coefficient) demonstrated that the disinfectant had more bactericide
activity than phenol. Furthermore, Isopropyl Alcohols preparation is easy and its risks are lower than
phenol. The phenol coefficient numbers of each microorganism are shown in table 1. The 70% v/v
Isopropyl Alcohol solution was determined to be the most advantageous concentration to use. It is less
toxic and more efficient than the 80% and 100% v/v. Concentrations of Isopropyl Alcohol above 50%
v/v but below 95% v/v recommended by Kingleren (1995) and Meyer (1996). Pseudomonas
aeruginosa was the most resistance bacteria of the study, due to the high content of Mg
2+
in the outer
membrane creating strong polysaccharide (LPS)-LPS Links (Russell, 1998).
Results observed in the Use-dilution method are shown in figures 2 (a, b). With 0.25g/mL, the 70% v/v
Isopropyl Alcohol solution lost its effect against bacteria. Bloomfield (1993) study showed that with
0.03g/mL of albumin the effectiveness of 70% v/v Isopropyl alcohol was minimally affected.
12
However, the bactericide effect remaining achieved the acceptable limits (3 to 5 log units). Even with
10 minutes of exposure time the disinfectant did not affect the microbial growth. The remaining dust
needs to be vacuumed in order to achieve a worthy cleaning process. Isopropyl Alcohol would only
work properly if there is not too much residue left on the equipments surface (Fraise, 1999).
Organic matter mechanisms to disinfectant inactivation could be the followings: disinfectant
absorption by protein colloids and the development of active less inherit systems, due to the bond of
disinfectants functional group (-OH) to organic matters foreign proteins. Disinfectant inactivation
could improve microorganism growth (MacDonell & Russell, 1999).
Analyses of Alconoxs effectiveness were shown in figure 2 (c). Greater concentration of detergent
(double to 2% w/v as recommended) was used when vitamin and herbal extracts residue were cleaned.
For Alconoxs optimum use, sterile hot water must be utilized in order to remove residues. The limits
established on the 0.1% w/w were not achieved in several test number (5, 14 and 15) and the herbal
extract tested ( test #16) was over the innocuous acceptable limit (1% w/w).
In vivo evaluation (all data is not available) confirm the effectiveness of the cleaning process on
manufacturing equipment (see figure 2d and 3). This process was done as Schmidt (2003) referenced
in his study: First the machine had to be disassembled, subsequently rinsed parts with tap water,
cleaned with detergent, rinsed again with tap water, and finally disinfected with 70% v/v an Isopropyl
Alcohol solution then let it dried and reassembled the machine. Analytical methods samples and
phosphorus quantification did not find any anomalies. Residues, as well as microbial count, were under
the limits table 2 after the cleaning process. At the same time, the next batch product did not shown
representative residue of the previous product. This could utilize as assurance for the cleaning process
(data not available).
13
The evaluation of the worst case scenario was partially achieved. The whole cleaning process showed
to be effective in removing residues. Nevertheless, the microbial depth count after the process was
high and did not achieved the acceptable limit criteria mentioned above. The latter may happened
because the visual limit was not reached during the worst case scenario, and as this study confirmed
the residual organic matter could affect the disinfectant effectiveness.
CONCLUSIONS
The company may change their disinfectant periodically in order to avoid resistance microorganisms.
Isopropyl Alcohol Solutions can be blended with other broad and more effective bactericides such as
Clorox (5.25% v/v). The companys SOP should explain cleaning agent preparation better, in order to
minimize human error. In addition frequently supervision of the MC is needed either the wash rooms
(for rinse) or the assembling room (disinfection).
ACKNOWLEDGMENTS
Thanks to Diego Congote (Companys Quality & Regulatory Affairs Manager). Our deepest
appreciations to the entire company for letting us conduct our study in the best way possible and
special thanks to the entire laboratory and manufacturing personnel.
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ANLISIS Y EVALUACIN DE LOS PROCESOS DE LIMPIEZA MANUAL

DE EQUIPOS DE MANUFACTURA EN UNA INDUSTRIA

Figura 1. Blender en forma de V ............................................................................... 8

Ecuacin 1. Nmero del Coeficiente fenlico ............................................................ 37

Los suplementos nutricionales son definidos como productos naturales compuestos

La alergia alimenticia es una reaccin que presenta el sistema inmunolgico, ante el

2.2.3.1 Mezcladores o Blenders

La funcin de estas mquinas, como su nombre lo indica, es mezclar las materias

Tabla 1. Niveles de actividad de los desinfectantes

2.6.1 Factores que influyen en la actividad de los antimicrobianos

Ecuacin 1. Nmero del Coeficiente fenlico

Se entiende por limpieza como el proceso de empleo correcto de productos qumicos

Es la limpieza que realizan los operarios en la cual se emplea un esfuerzo fsico,

2.8.2.1 COP (Clean-Out-of- Place)

Sistema automtico o semi-automtico de limpieza que requiere un desarme parcial

2.8.2.2 CIP (Clean-In-Place)

El sistema Clean In Place (Limpieza in situ) es un procedimiento automtico,

2.9 Descripcin del proceso de limpieza manual

Los microorganismos tienen variabilidad en la resistencia a los desinfectantes, a

La composicin en la pared celular de las clulas bacterianas vara entre un grupo y

2.10.1.2 Mohos y levaduras

Tipo de resistencia Posible mecanismo Ejemplos

La evaluacin de un proceso de limpieza manual de equipos es realizado con el fin de

Evaluar la efectividad antimicrobiana del desinfectante y detergente empleado

6.1 Identificacin de los microorganismos prueba.

6.2.1.2 Prueba en soporte Carrier.

El propsito del estudio de la efectividad de la limpieza es demostrar que los agentes

Durante 4 meses se monitoreo la limpieza manual de los distintos equipos utilizados

La confirmacin de los microorganismos mediante la identificacin por coloracin de

En la figura #28 se observan los resultados obtenidos durante los ensayos a

En la evaluacin de superficies, no se evidenci interferencia de la actividad

A pesar que el tiempo de exposicin al desinfectante fue prolongado (10 minutos) el

Al observar el anlisis de superficies con el Alcohol isoproplico del rea de

La evaluacin de la limpieza manual de los equipos de la compaa mediante un

Worst case Partes Inicio Final

El personal debe estar capacitado de acuerdo a la forma en la cual se debe

AGALLOCO, J . 1992. Points to Consider in the Validation of Equipment

Recoger y pesar las materias primas

Buenas Prcticas de Manufactura para la produccin, empaque, etiquetado u

Parmetros para la evaluar en la evaluacin de superficies.

Preparacin del pool de

Tubos positivos (crecimiento)

Tubos positivos (crecimiento)

Nmero de tubos Interpretacin

Tube Plate Tube Plate

Tube Plate(ufc/mL) Tube Plate(ufc/mL)

Tube Plate(ufc/mL) Tube Plate(ufc/mL)

Tube Plate(ufc/mL) Tube Plate(ufc/mL)

Tube Plate(ufc/mL) Tube Plate(ufc/mL)

ANALYSIS AND EVALUATION OF MANUAL CLEANING PROCESSES OF EQUIPMENT

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