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Partes del microscopio compuesto moderno

El microscopio compuesto de uso comn tambin se


conoce con el nombre microscopio ptico en base a
que sus propiedades derivan del empleo de lentes
pticas. Est constituido por cuatro grupos de
dispositivos o sistemas articulados de tal manera que
garantizan un funcionamiento ptimo y ergonmico
(19) (ver fig. 4-3):
Sistema mecnico: Conjunto de piezas que sirven
de soporte a las lentes y dems elementos (pie o
base, columna, mecanismo de enfoque, platina,
revolver, tubo).
Sistema ptico: Conjunto de lentes responsables del
poder de aumento y resolucin (objetivos y ocular)
Sistema de Iluminacin: Elementos que producen
las radiaciones (luz visible o no) y transmiten, reflejan y
regulan tanto la intensidad como la cantidad de
rayos que van a incidir sobre el espcimen (lmpara
o fuente de iluminacin, espejo, condensador y
diafragma).
Accesorios: Son aditivos que permiten extender las
capacidades del instrumento (cmaras fotogrficas,
de video, computadoras, accesorios para dibujar, entre otros).
4.3.-Sistema mecnico del microscopio
La parte mecnica del microscopio tambin se denomina montura y es de forma y dimensiones muy
variables, dependiendo del fabricante y el precio del instrumento.
De manera general se describen modelos grandes, medianos y pequeos o porttiles. Los modelos
grandes poseen todos los aditamentos que garantizan un trabajo profesional y permiten el intercambio de
piezas y accesorios para realizar los trabajos ms variados y su costo es el ms elevado. Los modelos
medianos no convienen a todo tipo de investigacin pero son ms prcticos puesto que su precio es
menor gracias a su construccin ms simple. Los microscopios porttiles responden a necesidades ms
restringidas y producen aumentos menores, conviniendo para observaciones someras.
Toda montura, por complicada que sea posee los siguientes elementos: pie o base, mecanismo de
enfoque, la platina, el revlver y el tubo del ocular.
4.3.1- Pie o base
Generalmente en herradura o en Y, aunque tambin puede ser rectangular, con un peso considerable
que garantiza la estabilidad del instrumento. La base aloja la fuente de iluminacin y puede contener un
mecanismo para regular la intensidad luminosa.
Sirve de soporte a una columna o brazo sobre el cual reposa el resto del aparato. La columna puede ser
inclinada; en su parte ms inferior se dispone el condensador y la parte superior posee una cremallera que
permite desplazar en sentido vertical el condensador, la platina o el revlver y el tubo. Las ventajas que
procura el microscopio inclinado son mltiples y la posicin es ms confortable para el observador
(actividad que es muy incmoda cuando el tubo del microscopio es vertical).
4.3.2.-Mecanismo de enfoque
Se logra desplazando en sentido vertical ya sea la platina donde se coloca el espcimen o ya sea el
revlver donde estn colocados los objetivos, de modo que se pueda centrar el punto focal del objetivo
que se est utilizando es ese momento. Se logra mediante dos mecanismos, primero uno rpido del tornillo
macromtrico y segundo, otro lento del tornillo micromtrico.
La cremallera que permite el movimiento rpido del tornillo macromtrico posee dientes que se engranan
y producen un movimiento tosco para lograr un enfoque aproximado. Se utiliza para enfocar con los
objetivos de poco aumento y para subirlos rpidamente con la finalidad de colocar o retirar de la platina
el preparado histolgico.
El tornillo micromtrico por el contrario posee una graduacin tal que cada divisin de la rosca permite un
movimiento vertical imperceptible en el orden de 0,001 mm. Esta disposicin permite evaluar de manera
aproximada el espesor de los objetos, considerando el nmero de vueltas que realiza el tornillo al enfocar
su parte ms superficial y luego la ms profunda.
El movimiento del tornillo micromtrico tiene una extensin de 5mm aproximadamente y est limitado.
Permite un enfoque fino y se utiliza con los objetivos de mayor aumento (11).
4.3.3.-La platina
Es el soporte horizontal donde se colocan las preparaciones histolgicas. Presenta en el centro un orificio
circular por donde pasa el rayo de luz producido por la fuente luminosa y proveniente del condensador.
Generalmente es de forma cuadrada y posee un sistema de fijacin e inmovilizacin de la lmina porta-
objeto compuesto por pinzas o una pieza articulada que esta fija a otro dispositivo, el carro.
Este dispositivo permite el examen metdico y completo de la preparacin al proporcionar un
desplazamiento hacia adelante o hacia atrs y de derecha a izquierda y viceversa.
Otra pieza, el vernier (denominado as gracias al nombre de su inventor en 1631), tambin llamado nonius,
consiste en dos pequeas reglas graduadas en milmetros cuya finalidad es la de obtener coordenadas
aproximadas que sirven de referencia para localizar una estructura determinada en la preparacin. En la
prctica, el uso del vernier no es frecuente, se hace un poco complicado anotar las cifras y ms difcil an
colocarlas en las reglas y localizar la estructura en cuestin. Adems, estas cifras solo son vlidas para el
microscopio en el cual se obtuvieron. Hay otros procedimientos ms simples para tal fin (11, 64).
4.3.4.-El revlver
Considerado como un accesorio del tubo. Es un implemento muy importante que permite el intercambio
rpido de objetivos mediante un movimiento de rotacin. El revlver est constituido por una semi-esfera
que posee una serie de anillos en los cuales van atornillados los objetivos. Esta pieza gira alrededor de un
eje que est colocado en la parte inferior del tubo. Puede ser de diversas formas y de igual manera, alojar
un nmero variable de objetivos (dos, tres, cuatro o ms).
4.3.5.-El tubo
Soporta la porcin ptica del microscopio. Es un cilindro hueco de longitud variable, cuyo interior est
pintado de negro mate y posee un diafragma para impedir la formacin de reflejos y facilitar la
observacin. El tubo puede ser doble y alojar dos lentes oculares (microscopio binocular). En los modelos
de microscopios grandes destinados a la microfotografa, hay un tercer tubo accesorio, generalmente ms
largo y vertical que sirve para conectar una cmara fotogrfica sin necesidad de lente ocular.
4.4.-Sistema ptico del microscopio
Sistema ptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y resolucin (objetivos y ocular)
Los microscopios modernos estn diseados para proporcionar imgenes aumentadas y ntidas de los
especmenes que se observan. Los componentes pticos estn colocados en una base estable que
permite un intercambio rpido y un alineamiento preciso. El sistema ptico est constituido por dos juegos
de lentes: El objetivo y el ocular.
4.4.1.-Los objetivos
Representan el componente ptico ms importante del microscopio. Su principal funcin consiste en
colectar la luz proveniente del espcimen y proyectar una imagen ntida, real, invertida y aumentada
hacia el cuerpo del microscopio.
Constituyen un sistema ptico formado por una o varias lentes, las cuales deben estar centradas y los ejes
pticos de cada una deben coincidir exactamente para formar el eje ptico del sistema. Sus lentes estn
hechas a partir de cristales (espatos, fluorita, entre otros) con un alto grado de calidad y funcionamiento;
su precio depende del poder de aumento, resolucin y de la correccin de las aberraciones. Muchos
fabricantes elaboran objetivos que pueden ser intercambiados y empleados en microscopios de otras
marcas comerciales.
Clasificacin:
Tomando en cuenta el grado de correccin de las aberraciones hay dos categoras de objetivos para el
microscopio, los objetivos acromticos y los objetivos apocromticos. En cada categora se distinguen an
dos grupos, los objetivos secos y los objetivos de inmersin (64, 65, 66):
Objetivos acromticos: Presentan correccin cromtica para la luz azul y roja. Correccin de esfericidad
para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de color verde y son ideales para microfotografa
blanco y negro. Se asume que un objetivo es acromtico cuando no posee ninguna denominacin.
Objetivos semi-apocromticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen para el azul, el rojo y
en cierto grado para el verde. La correccin de esfericidad es para dos colores, el verde y el azul. Dan
buenos resultados con luz blanca y estn mejor diseados para la microfotografa en colores.
Objetivos apocromticos: Poseen el ms alto nivel de correccin de aberraciones y por ello, son ms
costosos. Presentan correccin cromtica para cuatro colores (azul oscuro, azul, rojo y verde); correccin
de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores objetivos para microfotografa y video a color.
Debido a su alto grado de correccin, estos objetivos poseen mayores aperturas numricas que los
acromticos y las fluoritas. Esto puede ser un inconveniente puesto que el campo de observacin se
presenta un poco curvo.
Los tres tipos de objetivos proyectan imgenes con cierta distorsin que se manifiesta como curvaturas y al
ser corregidos para este defecto se denominan plan-acromticos, plan-fluoritas o plan-apocromticos.
Objetivos secos y objetivos de inmersin:
Estos objetivos difieren entre s por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubre-objeto de la lmina
histolgica y la lente frontal del objetivo.
En los objetivos secos el medio interpuesto es el aire cuyo ndice de refraccin (n=1) es muy diferente del
ndice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario, en los objetivos denominados de inmersin el
medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un lquido cuyo ndice de refraccin es
lo ms prximo al del vidrio. Este lquido puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor an aceite de cedro,
que posee un ndice de refraccin (n=1,515) casi idntico al del vidrio.
La ventaja de los objetivos de inmersin consiste en la disminucin o eliminacin de la refraccin de los
rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la luminosidad de la imagen est aumentada,
mientras que en los objetivos secos, est disminuida. El empleo de la inmersin aumenta el ngulo de
apertura del objetivo y permite mayor resolucin gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos
luminosos refractados (11, 64) (ver fig. 3-5) y solo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento.
ptica finita y ptica infinita: Figura 4-4.-Esquema que muestra el principio de los objetivos con correccin al infinito.
Modificado de Microscope objetives. Olympus Microscopy Resource Center (66).
La microscopia de luz o fotnica ha experimentado cambios radicales en
sus sistemas pticos en los ltimos aos. El tubo que soporta tanto el revlver
por un extremo, como el ocular por el otro, se confeccionaba con una
determinada longitud y los fabricantes elaboraban objetivos que
funcionaban para esa longitud (longitud finita) que fue estandarizada a
160mm y en algunos casos (Leitz) a 170mm. En muchos modelos de
microscopios modernos el tubo no es rectilneo y los rayos de luz transmitidos
desde el objetivo hacia el ocular son desviados por prismas, especialmente
en los microscopios trinoculares para fotografa. Emplear objetivos
diseados para una determinada longitud de tubo en otro microscopio que
no corresponda produce incremento en las aberraciones de esfericidad,
ocasionado por una longitud de tubo diferente.
Los microscopios modernos poseen un ensamble complejo de lentes,
espejos y prismas que transmiten la luz desde el objetivo al ocular y
actualmente casi todos los fabricantes estn elaborando microscopios que
puedan aceptar objetivos diseados para realizar una correccin infinita.
Tales objetivos proyectan una imagen al infinito la cual es captada por otra
lente que se introduce en el tubo y que a su vez la proyecta al punto focal del ocular. Los objetivos con
esta correccin poseen el smbolo infinito grabado en la parte externa. Los sistemas corregidos al infinito
son significativos porque corrigen la aparicin de imgenes fantasma que con frecuencia se observa en
microscopios anteriores, no obstante estos nuevos modelos son de mayor tamao (66) (fig. 4-4).
Estructura de los objetivos:
Generalmente es un tubo cilndrico que contiene en su interior
un revestimiento anti-reflejos y las diversas lentes colocadas en
serie y alineadas (fig. 4-5). En la parte externa posee grabadas
las especificaciones y caractersticas. Figura 4-5.-Tipos de objetivos. (a)
Objetivo acromtico que contiene una lente frontal y dos pares internos, (b)
objetivo semi-apocromtico o fluorita, con cuatro pares de lentes y (c) objetivo
apocromtico que contiene un triplete, dos pares, un menisco y una lente
esfrica frontal. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy (15).
Nomenclatura de los objetivos:
Figura 4-6.-Nomenclatura del objetivo. Las
propiedades pticas especiales en este objetivo
denotan que puede emplearse en Interferencia de
contraste diferencial (DIC differential interference
contrast) y la H significa que puede emplearse en
microscopios con platina caliente (heating stage).
Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).
La identificacin de las propiedades
individuales de los objetivos es posible
gracias a la nomenclatura grabada en la
parte exterior y contiene todas las
especificaciones necesarias para su uso
apropiado (11, 15). La minuciosa
informacin, generalmente en el idioma ingls, puede contener (fig. 4-6):
Nombre del fabricante: Casa comercial
Aumento linear: Con un rango que puede ir desde 0,5x hasta 200x
Correcciones pticas: Achro, Achromat (acromticos); Fluar, Neofluar (semi- apocromticos); Apo
(apocromticos); Plan, Plano (corrige curvatura de campo); ICS (infinity corrected system), UIS (universal
infinity system); N, NPL (normal field o view plan); CF, CFI (chrome-free, chrome free infinity) y muchas otras
especificaciones cuya nomenclatura depende del fabricante.
Apertura numrica: Es un valor que indica el ngulo de apertura del cono luminoso.
Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente en milmetros (160, 170, 220) o
con el smbolo (8) para objetivos con correccin infinita.
Espesor del cubre-objeto a emplear: Ha sido estandarizada a 0,17mm pero hay diversos espesores lo cual
produce aberraciones. Algunos objetivos poseen un collar de correccin en las lentes internas para realizar
la correccin y se denominan CR, Corr, w/corr, o pueden tener una escala graduada mvil para el ajuste.
Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del objetivo, expresada en milmetros.
Propiedades pticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas condiciones tienen resultados
ptimos (para luz polarizada, contraste de fase, entre
otros).
Rosca del objetivo: La mayora de objetivos estn
estandarizados de acuerdo a la Royal Microscopy Society
para garantizar una compatibilidad universal y se
designan con las siglas RMS, sin embargo, algunos
fabricantes tiene sus propias dimensiones. El dimetro
general es de 20mm, pero los objetivos Leica y Nikon son
de rosca ms amplia y slo funcionan en sus
microscopios. M25 y M32 designan roscas de 25 y 32 mm
respectivamente.
Medio de inmersin: Algunos objetivos ameritan el uso de
medios de inmersin y para ello se emplea un cdigo de colores
o las abreviaciones Oil, Oel (aceite); HI (homogeneous
immersion); W, Water, Wasser (agua) y Gly (glicerol).
Cdigo de colores: Algunos fabricantes marcan sus
objetivos con anillos de colores para facilitar la identificacin del aumento
Tabla 4-1.-Cdigos de color en los objetivos microscpicos. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15)
4.4.2.-El ocular
El ocular (del latn oculus = el ojo) est formado por lentes que generalmente son separadas por un
diafragma, montadas en las extremidades de un cilindro que va introducido en la parte superior del tubo.
El ocular sirve para observar la imagen real e invertida que produce el objetivo, ejerciendo dos funciones:
Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con respecto a la imagen del
objetivo, pero aun invertida, con respecto al objeto. Posteriormente el ojo endereza la imagen.
Aplana y aclara el campo ptico o plano circular en el que aparece el objeto.
La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el aumento de la imagen real del objetivo;
la lente inferior tambin se denomina colectora y es la que aplana y aclara el campo (fig. 4-7).
Clasificacin: Figura 4-7.-Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular compensador y (c) ocular de Ramsden. Los
oculares negativos (a y b) poseen el diafragma entre las dos lentes (colectora y ocular) y los oculares positivos poseen el diafragma
por debajo de las lentes (c). Modificado de Digit Life (67).

Oculares de Huygens: Empleados con los
objetivos acromticos y formados por dos
lentes plano-convexas cuya convexidad est
dirigida hacia el objetivo y el diafragma se
ubica entre ambas. Tambin denominado
ocular negativo porque la imagen se forma
entre las dos lentes. Muy comn en modelos
de microscopios antiguos (11).
Oculares de Ramsden: Conocido como
ocular positivo, formado por varias lentes
unidas entre s y colocadas por encima del
diafragma. Generalmente corrigen aberraciones y funcionan de manera ptima con los objetivos
corregidos al infinito (15).
Oculares compensadores: Son oculares que corrigen la diferencia de aumento para los diversos colores
(diferencia cromtica de aumento) que se aprecia en los objetivos apocromticos. No tiene buen
rendimiento con objetivos acromticos secos.
Oculares de proyeccin: Posee una lente que permite la proyeccin de la imagen en una pantalla
colocada a cierta distancia del ocular, ideal para dibujar o para exhibicin (11).
Oculares aplanticos: Tienen la propiedad de formar un campo perfectamente plano y el poder de
resolucin es igual tanto en el centro como en la periferia del campo ptico (11).
Oculares peri-planticos: Aplanan la curvatura de campo que se produce con objetivos de mayor
aumento. Son semejantes a los oculares de tipo Huygens pero con una doble lente ocular (11).
Uno de los diseos de oculares ms avanzados es el ocular Periplan (38) (fig. 4-8) que contiene siete lentes
que corrigen las aberraciones cromticas, la curvatura de campo y su empleo ptimo es en combinacin
con objetivos de gran poder de aumento.


Cdigo de color de inmersin Medio de inmersin
Negro Aceite
Naranja Glicerol
Blanco Agua
Rojo Especial o multiuso
Cdigo de color de aumento Aumento
Negro 1x, 2.5x
Marrn 2x, 2.5x
Rojo 4x, 5x
Amarillo 10x
Verde 16x, 20x
Azul turquesa 25x, 32x
Azul celeste 40x, 50x
Azul cobalto 60x, 63x
Blanco, crema 100x, 250x, 200x

Los modelos de microscopios ms simples poseen un solo
ocular (mono-oculares), sin embargo hay microscopios
binoculares y algunos modelos ms modernos son
trinoculares, especiales para la microfotografa. Los
binoculares tienen los objetivos dispuestos con una
inclinacin de 45 para realizar la observacin
cmodamente.
Campo del microscopio:
Se denomina campo del microscopio al crculo visible que
se observa en el ocular. Tambin podemos definirlo como
la porcin del plano visible observado a travs de las lentes.
Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere
decir que el campo es inversamente proporcional al
aumento del microscopio. La forma del campo est determinada por el diafragma fijo del ocular, que
generalmente es de forma circular, no obstante el campo puede ser cuadrado y esta forma es muy til al
realizar estudios de coprologa o hematologa, en donde se requiere reconstruir la totalidad del campo de
observacin de la preparacin, lo cual se dificulta con un campo circular clsico al quedar zonas
superpuestas (11).
El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el objetivo. El valor de este
aumento est inscrito en la superficie del ocular y generalmente es de 10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x. Otro valor
es el nmero de campo que consiste en el dimetro en milmetros de la apertura fija del diafragma, la cual
puede variar desde 18mm hasta 26.5mm.
Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus caractersticas:
UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio.
H: Para un alto punto focal del observador que usa lentes durante la observacin microscpica.
K, C, comp: Para oculares compensadores.
Plan-comp: Objetivos que corrigen curvatura de campo y dan campos planos.
Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificacin o medicin de estructuras del espcimen
en estudio. En ciertos casos es relevante conocer el nmero, tamao o dimensiones de las clulas y dems
elementos del tejido.
Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una pieza circular de vidrio con una
escala o gradilla (fig. 4-9), la cual aparece enfocada y superpuesta a la imagen del espcimen al
encontrarse en el plano de formacin de la misma. Los oculares para la medicin poseen un mecanismo
de enfoque mediante rotacin. Se debe calibrar la escala de medicin del ocular con cada objetivo que
se use (15). En la actualidad se puede emplear algn software de computacin para realizar mediciones
sobre las imgenes digitales y obtener datos muy precisos, no obstante, el mtodo ms econmico y de
uso ms generalizado es la medicin con los oculares.
En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa (alambre, pestaa, cerda)
denominada sealador, con la finalidad de indicar de manera especfica alguna estructura en particular
en el campo de observacin. El sealador se aprecia como una lnea oscura que parte del borde del
campo hacia el centro del mismo.
Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es, por una parte colocar los ojos a
la distancia correcta de observacin y por otra, impedir la formacin de reflejos luminosos que dificulten la
visualizacin. Algunos microscopios binoculares poseen un mecanismo de enfoque del ocular que ajusta
las dioptras en caso que el observador posea una disminucin de su agudeza visual. El ajuste se realiza por
separado tanto para el ojo derecho como para el izquierdo; de igual manera se ajustan a la distancia
interpupilar del observador (usualmente entre 55 y 75 mm).
Figura 4-9.-Microfotografa de un frotis de sangre perifrica en la que se observa un
campo rectangular con una escala de divisiones precisas, que en este caso son en el
orden de 1/10 mm. Para determinar el tamao de una clula se cuenta el nmero de
divisiones que ocupa y la cifra se divide entre el aumento del objetivo empleado,
dando como resultado un valor que corresponde al tamao de la misma. Si la clula
mide 7 divisiones, corresponde a 7/10mm; si el aumento del objetivo es 100x, se divide
0.7mm:100 = 0.007mm = 7m. Tomado de Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining. 2 ed. (13).

4.5.-Sistema de iluminacin
El sistema de iluminacin est constituido por las partes del
microscopio que producen o captan, reflejan y regulan la intensidad
de la luz que se utiliza para la observacin microscpica. Uno de los
aspectos crticos a considerar en la microscopa ptica es la fuente de luz que se emplea para iluminar el
espcimen. Si la muestra es iluminada de manera inadecuada, la calidad de la imagen que se obtiene se
ver afectada, aun cuando se disponga de un excelente sistema ptico. La iluminacin ptima debe ser
brillante, sin resplandores y en lo posible debe dispersarse de manera uniforme en el campo de
observacin.
Si se emplea luz visible (fotones) es usual que al microscopio se le denomine fotnico. En sus inicios, la
microscopa se practicaba con iluminacin por reflexin; se utilizaba un espejo que se orientaba para
recoger la luz solar o en su defecto, luz artificial (la luz de una vela, mechero a gas, lmparas de aceite o
petrleo) y la desviaba hacia la preparacin. Este mtodo se mantuvo durante mucho tiempo, en parte
debido al lento perfeccionamiento de las bombillas incandescentes, que consisten en un globo de cristal
en el que se ha hecho el vaco y dentro del cual va colocado un hilo de metal (platino, carbn, tungsteno,
entre otros) que al paso de una corriente elctrica se pone incandescente y sirve para alumbrar (50).
Con el uso de la bombilla elctrica se suprime este espejo y los microscopios pueden utilizarse en cualquier
lugar. Sin embargo, algunos modelos de microscopios actuales, desde los ms sencillos y econmicos
hasta los ms sofisticados, an poseen un espejo que sirve para desviar la luz producida por la bombilla, en
el caso que sta no se encuentre alineada con la platina.
El sistema de iluminacin est constituido por la fuente de luz, el condensador y un diafragma o iris. Como
regla general, el sistema de iluminacin est colocado debajo de la platina y la finalidad es de iluminar
mediante luz transmitida. En la mayora de los casos el estudio de las preparaciones histolgicas se hace
por transiluminacin. En otros casos muy especficos se emplea el mtodo de luz reflejada, en el cual se
ilumina la superficie del espcimen mediante epi-iluminacin (ver captulo 3). La fuente de luz emite una
radiacin que es recogida por un dispositivo denominado condensador, que a su vez forma un cono
luminoso necesario para la visualizacin con objetivos de mayor aumento.
4.5.1.-Fuentes de luz
Aparte de la luz solar, empleada en microscopios sencillos con espejo, existen numerosas fuentes de
iluminacin artificial, tanto para la observacin rutinaria como para la microfotografa. La luz artificial
presenta numerosas ventajas tales como la constancia, la uniformidad y la intensidad; adems es muy
favorable para los mayores aumentos. Existen varios tipos de fuentes de luz artificial:
Bombillas de tungsteno y halgenas: La mayora de microscopios de luz estn dotados de lmparas de
este tipo cuyo poder oscila entre 10W y 100W. Se emplean como fuentes principales o accesorias. Estas
lmparas son radiadores trmicos que emiten una luz continua en un espectro comprendido entre 300
1200 nm. Estn constituidas por un bulbo de cristal relleno de un gas inerte y un filamento de tungsteno que
es activado por una corriente elctrica produciendo una importante cantidad de luz y calor. Varan
mucho en tamao, diseo y forma (68). Producen una luz blanca pero incrementan la intensidad del azul
al rojo. La luz puede ser muy brillante para la observacin y se reduce con filtros que disminuyen la
intensidad, denominados filtros de densidad neutra, disminuyendo la intensidad sin alterar los colores.
Tambin se emplean filtros de colores que compensen el color rojo, de manera que se pueda observar la
imagen del espcimen sobre un fondo iluminado neutro, blanco y claro. El vidrio azul corrige el tinte
amarillo que tiene la luz incandescente y se obtiene una luz suave y agradable que aumenta la definicin.
Lmparas de arco elctrico: Son lmparas que pueden contener gases (vapor de mercurio, xenn o
circonio) y son empleadas para proveer una luz monocromtica con filtros apropiados, ideal para
microfotografa en blanco y negro o a colores. Tambin se utilizan en microscopios especiales
(fluorescencia).
Lser: En los ltimos aos se ha incrementado el uso de lser (Light Amplification by Stimulated Emission of
Radiation, Amplificacin de Luz por Emisin Estimulada de Radiacin) (42), que consiste en un dispositivo
que genera un haz de luz con caractersticas de tamao, coherencia, forma y pureza controladas. El lser
de argn es uno de los ms utilizados, cuya emisin est en el orden de 488-514 nm. Su costo es muy
elevado y se emplea principalmente en microscopa confocal.
LED: De las siglas en ingls Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz) es un dispositivo emisor de luz con
caractersticas muy prximas a la luz monocromtica (espectro reducido). La luz se produce cuando una
corriente elctrica pasa a travs del material semiconductor (arseniuro de galio-aluminio) del que estn
hechos (69). Se utilizan en una amplia gama de artefactos y lmparas. En comparacin con las bombillas
incandescentes, son ms interesantes porque permiten ahorro de energa con un mayor rendimiento
lumnico. Para microscopa se emplean LED de larga duracin que proveen una luz muy brillante y fra; esto
ltimo es una gran ventaja, puesto que no genera calor y la observacin es ms cmoda para el usuario.
En la actualidad se producen combinaciones de diodos que emiten una luz blanca.
4.5.2.-Condensador
Es un dispositivo que tiene por finalidad formar conos luminosos grandes, con aperturas mayores,
necesarios para ver con los objetivos de mayor aumento. El trmino condensador puede considerarse
inadecuado, ya que no produce una condensacin de los rayos luminosos, por el contrario, produce un
aumento de la seccin del cono luminoso (11) que a su vez forma una imagen ms clara.
El condensador est conformado por una o varias lentes situadas debajo de la platina del microscopio,
colocadas entre la fuente de luz y el espcimen. El primer condensador que se fabric en 1838 (por
Dujardin) posea tres lentes acromticas. Al igual que en los objetivos, las lentes del condensador poseen
poder de aumento y tambin producen aberraciones, sin embargo, stas tambin pueden corregirse.

Tipos de condensadores de acuerdo al grado de correccin de aberraciones pticas (15):
Condensador de Abbe: Es el ms simple, sin correccin de aberraciones y el ms econmico. Compuesto
de dos o ms lentes. Puede llegar a tener una apertura numrica de 1.4 en modelos de tres lentes. Se
emplea para observacin de rutina y con objetivos de modesta apertura numrica y amplificacin. Una
de las ventajas es el amplio cono de iluminacin que puede producir.
Aplantico: Corrige aberraciones de esfericidad.
Acromtico: Corrige aberraciones cromticas. Contiene tres o cuatro lentes corregidas para el azul y el
rojo. Este condensador es til para observaciones de rutina con objetivos secos y para microfotografa
(blanco y negro o color).
Aplantico-Acromtico: Poseen el ms alto nivel de correccin y es el condensador de eleccin para
microfotografa a color con luz blanca. Puede contener ocho lentes y su uso es ptimo con inmersin y
objetivos de mayor aumento.
Figura 4-10.-Condensador tipo Abbe y objetivo adaptado. Se observa un condensador con dos lentes y el trazado del haz de luz en
un microscopio fotnico. El medio de inmersin, en este caso aceite, se puede colocar tanto entre la lente frontal del condensador y
el preparado histolgico como entre el preparado y la lente frontal del objetivo. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus
Microscopy Resource Center (15).
El cono de luz que produce el condensador debe
ajustarse de manera apropiada para optimizar la
intensidad y el ngulo de apertura. Cada vez que se
cambia un objetivo se debe realizar un ajuste para
obtener el cono de luz conveniente a la apertura
numrica del nuevo objetivo. A menudo no es
prctico utilizar el mismo condensador para un
amplio rango de objetivos (2x hasta 100x). Para
objetivos de bajo poder de aumento (menor a 10x)
algunos condensadores poseen una lente frontal
adicional que es abatible. La altura del
condensador es regulada mediante un mecanismo
activado con un tornillo que lo baja o lo sube,
acercndolo o no a la platina donde est colocado el espcimen (fig. 4-10).
Adems de los condensadores empleados en los microscopios de campo claro, existe una variedad de
modelos de condensadores especializados que se utilizan en diferentes aplicaciones, cuya finalidad
principal es el incremento del contraste entre los detalles de la estructura del espcimen. Se han
desarrollado condensadores especiales para microscopa de campo oscuro, contraste de fase, luz
polarizada, contraste de interferencia diferencial.
4.5.3.-Diafragma o iris
Es un dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina. Debe
permitir cambios en la apertura y con dimetros variables cuya finalidad es la de
obtener conos luminosos cada vez ms estrechos y eliminar los rayos de luz
sobrantes. Los primeros diafragmas consistan en un disco de metal con agujeros
de diferente dimetro, el cual se rotaba segn la necesidad. Estos discos fueron
substituidos por el iris, otro dispositivo ms elaborado y con un diseo que le permite cambiar de dimetro.
La apertura del diafragma se regula en relacin con el tipo de objetivo que se est utilizando. El diafragma
o iris est pintado de negro con la finalidad de eliminar los rayos de luz reflejada que pueden interferir con
la iluminacin del objeto. (11, 70, 71). (fig. 4-11).
Figura 4-12.-Iluminacin Khler. Se debe iluminar el espcimen siguiendo el esquema. La lmpara posee un filamento (S)
incandescente cuya luz es captada por la lente colectora L1 y regulada por el diafragma de campo D1. La imagen S del filamento
de la lmpara es proyectada al plano del segundo diafragma D2. Este primer paso se realiza con D1 completamente abierto. La
altura del condensador L2 se regula de manera que su punto focal est en el plano D2. La imagen del diafragma de campo D1 es
proyectada en el plano de la preparacin por el condensador. Tomado de Estudio de diafragmas de campo y apertura. Microscopio (72).
4.5.4.-Iluminacin Khler
La iluminacin es una variable crtica
que hay que considerar al poner en
funcionamiento el microscopio. Con
frecuencia el uso incorrecto de la
iluminacin, an en equipos sofisticados,
conduce a la obtencin de imgenes
defectuosas. El espcimen debe ser
iluminado mediante una fuente de luz
artificial, la cual puede producir artificios
en la imagen que se observa.
En el ao 1893, el profesor August Khler
propuso un mtodo de iluminacin para
optimizar la observacin microscpica y la microfotografa (15), que permite aprovechar al mximo las
capacidades de las lentes (objetivos) iluminando la muestra en estudio con un campo de luz uniforme
cuyo dimetro sea igual al del rea de captura del objetivo. Los microscopios modernos estn diseados
para aplicar la iluminacin Khler y los requerimientos son (figs. 4-12 y 4-13):
Condensador que sube y baja para enfocar el cono de luz.
Bombilla con lente colectora.
Dos diafragmas, un diafragma de campo situado a nivel de la lmpara y un diafragma de apertura,
colocado debajo del condensador.
El condensador se desplaza verticalmente hasta obtener una imagen
ntida del diafragma de campo. La iluminacin ideal se consigue
cundo el condensador se encuentra lo ms cerca de la
preparacin. El diafragma de campo regula el dimetro de la
apertura de la iluminacin y al cerrarlo se incrementan los contrastes
(15). Una vez ajustada la iluminacin Khler no se debe regular la
intensidad de la luz o el brillo bajando el condensador o cerrando la
apertura de diafragma-iris, por el contrario, se regula la intensidad de
la lmpara mediante un ajuste de voltaje.
4.6.-Formacin de la imagen
en el microscopio compuesto
Figura 4-14. Las lneas dibujadas desde el
ojo a A y R forman un ngulo, el cual es
dos veces ms grande que el ngulo de
las lneas O-W. De igual manera, la
distancia del ojo a la flecha OW es dos
veces la distancia del ojo a la flecha AR.
La flecha en AR aparece dos veces ms
grande que la flecha en OW. Las
proporciones se mantienen al alejar o
acercar la flecha. Tomado de Hogg J. The Microscope:
Its History, Construction and
Con la finalidad de facilitar la comprensin de la propiedad de
aumento que tienen las lentes y en consecuencia el microscopio para observar objetos minsculos, es
necesario conocer algunos aspectos del fenmeno de la visin. El ojo humano est constituido de tal
manera que slo puede tener una visin clara cuando los rayos luminosos incidentes son paralelos o
ligeramente divergentes, debido a que la retina requiere la participacin del cristalino para enfocar los
rayos en su superficie.
El lmite para visin cercana es la mnima distancia a la cual se puede observar claramente un objeto;
varia de un individuo a otro y se estima entre 15 y 25 cm (6 y 10 pulgadas respectivamente), depende de
la edad y otros factores. El valor considerado normal es de 25 cm. El tamao aparente de un objeto
depende del ngulo formado por dos lneas proyectadas desde el centro del ojo a las extremidades de
dicho objeto (fig. 4-14)
Este ngulo as formado se conoce como ngulo de visin o ngulo visual (73). La
utilidad de una lente convexa interpuesta entre el ojo y un objeto cercano consiste
en la reduccin de la divergencia de los rayos luminosos emanados del objeto, de
manera que puedan entrar al ojo en un estado de moderada divergencia, como si
emanaran de un objeto situado ms all del lmite de visin cercana y en
consecuencia se forma la imagen en la retina (fig. 4-15).
Figura 4-15. Diagrama que representa una lente bi-convexa cercana al ojo y a una flecha pequea
(objeto en estudio) cuyos conos dibujados representan parte de los rayos de luz divergentes emanados de
varios puntos. Los rayos emanados del objeto muy cercano, al incidir en la pupila, son an tan divergentes
que no permiten formar una imagen enfocada en la retina; pero al pasar primero por la lente son
desviados para formar lneas casi paralelas que si pueden ser captadas por el ojo si ste est a su vez muy
cercano a la lente. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Applications (73).
Esos rayos luminosos emanados del objeto cercano y desviados por la lente son recibidos por el ojo como si fuesen
emanados directamente por una flecha (objeto) ms grande, aparentemente situada en el lmite de visin cercana del
observador (aprox. 25 cm del ojo). La diferencia de tamao entre la flecha real y la flecha imaginaria estar
determinada por el poder de aumento de la lente. La imagen formada no es real, no puede ser proyectada en una
pantalla o recogida en una placa fotogrfica; es una imagen mental. Por esta razn
la imagen se denomina virtual y la distancia desde la lente hasta la imagen formada
se denomina distancia focal virtual (74,75).
Al interponer una lente bi-convexa entre un objeto y el ojo se incrementa el ngulo
de visin y en consecuencia el objeto se ver ms grande (fig. 4-16)
Figura 4-16. Sin la lente colocada en fg el ojo ver la flecha con el ngulo formado por las
lneas punteadas b y c, formando la imagen bc. Los rayos bf y cg emanados de las
extremidades de la flecha son refractados por la lente hacia el ojo en direccin f y g, los cuales
crean un ngulo visual mayor que hace que la fecha se vea ms grande (d-e). Tomado de Hogg J.
The Microscope: Its History, Construction and Applications (73).
Lo que se conoce sobre las propiedades de las lentes permitir comprender
el principio del microscopio compuesto, denominado as, en oposicin a la lupa (microscopio simple) en
base a que est conformado por dos sistemas de lentes, los cuales deben estar centrados, es decir, tener
el mismo eje ptico.
El primer sistema, cercano al objeto en estudio, se denomina
objetivo, posee una distancia focal muy corta y es posible colocar
el objeto un poco ms all de su punto focal para obtener una
imagen real, invertida y aumentada.
El sistema de lentes a travs del cual el observador examina se
denomina ocular y funciona como una lupa que aumenta la
imagen real producida por el objetivo. La distancia entre el ocular y
el objetivo debe ser calculada de manera que la imagen real
obtenida por el objetivo se forme entre el ocular y su punto focal
(11). El aumento del microscopio depender en principio de la
longitud focal del objetivo. Mientras ms pequea sea esta longitud
y el objeto se acerque al objetivo, ms grande ser la imagen real.
El aumento tambin depende de la distancia focal del ocular y
mientras ms corta sea esta, mayor ser el aumento (fig. 4-17).
Figura 4-17. Esquema simplificado que muestra el trayecto que siguen los rayos emanados
del espcimen en estudio y su paso a travs de las lentes objetivo y ocular para la formacin
de las imgenes. La flecha ab corresponde al espcimen, que est colocado un poco por
delante del foco (f) del objetivo, el cual forma una imagen real, aumentada e invertida en ab.
Esta imagen se forma por dentro del foco (f ) de la lente ocular. El ojo del observador
percibir a travs del ocular la imagen virtual, aumentada y derecha ab de la imagen real
ab. Modificado de Langueron M. Prcis de Microscopie (
4.7.-Accesorios del microscopio
Habindose familiarizado con la estructura y funcionamiento del
microscopio compuesto, hay que considerar aquellos accesorios
que conducen a una excelente prctica microscpica y que
facilitan el trabajo, hacindolo ms rpido y efectivo o ampliando las capacidades del instrumento.
Dentro de las actividades o posibilidades se pueden citar:

Medir y cuantificar: Consiste en la micrometra (morfometra) aproximada de los especmenes observados
al microscopio. Para cuantificar longitudes, cantidades (conteo de clulas, ncleos, partculas), ngulos.
Se emplean oculares de medicin con retculos o gradillas en combinacin con micrmetros
especializados, lminas calibradas, cmaras de conteo y el vernier. En la actualidad se han desarrollado
instrumentos para morfometra que emplean tecnologa digital y los datos obtenidos pueden ser
transmitidos a un computador, permitiendo as la automatizacin, el almacenamiento de los datos y la
obtencin de variables estadsticas a partir de ellos.
Dibujar: Dibujar las preparaciones microscpicas es una actividad de las ms completas y precisas que
permite obtener una representacin fiel del espcimen en estudio tal y como el observador la percibe y
representa la suma de detalles que se observan al cambiar el plano de enfoque, obtenindose la
sensacin de relieve y profundidad. Se emplean las cmaras claras y otros dispositivos para dibujar que
estn concebidos con una serie de espejos y prismas que hacen coincidir en la retina o en una pantalla
tanto el campo observado como el plano en el cual se debe dibujar. Se sigue sobre una hoja de papel el
contorno de la imagen observada al mismo tiempo que se dibuja con un lpiz.
Fotografiar: Una manera de preservar lo observado al microscopio es mediante la microfotografa. Las
imgenes obtenidas se archivan y se emplean en publicaciones cientficas y presentaciones con fines
docentes y banco de datos. Se necesitan adaptadores para conectar la cmara a un tubo semejante al
tubo del ocular en microscopios trinoculares. Se emplean desde las cmaras fotogrficas clsicas hasta las
cmaras digitales especializadas para acoplar al microscopio y las cmaras fotogrficas digitales de uso
comn. Actualmente la fotografa clsica resulta complicada, costosa, de resultados menos atractivos y
ha sido desplazada por la fotografa digital que es de ms fcil y prctica ejecucin. Con las cmaras
digitales de alta resolucin se obtienen resultados muy satisfactorios e inmediatos que pueden ser
archivados en el computador para su posterior anlisis y procesamiento.
Filmar: La captura de imgenes en movimiento se realiza mediante cmaras de video (digitales o no)
que registran la actividad de especmenes vivos, clulas en cultivo, cmaras de perfusin, dispositivos con
motor y automatizados, entre otros, para la demostracin y anlisis de procesos fisiolgicos en
videomicroscopa.
Incrementar el contraste: Para facilitar la observacin de especmenes con una estructura particular y
clulas vivas se emplean filtros, condensadores y otros dispositivos que transforman al microscopio de
campo claro en un instrumento para tal fin, logrndose la microscopia fotnica especial (campo oscuro,
contraste de fases, polarizacin, entre otras).
Procesamiento de imgenes: Con el empleo del computador y de software especializados para captura,
administracin y procesamiento de las microfotografas, en la actualidad se ha llegado a nuevos niveles
en facilidad de uso y sofisticacin que simplifican la investigacin cientfica (76, 77)
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo4_8.htm
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MO NOWEB/capitulo3_4.htm