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CONTAMINACIN DEL PROCESO


DE FERMENTACIN ALCOHLICA
POR DEKKERA

1,2
Gusils C.;
1
Aroz Martnez J. L.;
3
Guzmn P.;
3
Gonzalez G.;
3
Pereira J.;
3
Sustaita G. y
1
Ruz, M.
1
Estacin Experimental Agroindustrial Obispo Colombres. Av. Williams Cross 3150, Las Talitas, Tucumn (CP 4101),
R. Argentina;
2
CONICET;
3
Ca. Azucarera Los Balcanes - Ingenio y Destilera La Florida. microbiologia@eeaoc.org.ar

Abstract
In the ethanol industry and research community, Saccharomyces cerevisiae is regarded as the most
competitive fermentation yeast, so industrial yeast populations are rarely studied. The Dekkera species
has been considered as the main contaminant yeast in bioethanol production, showing a surprising growth
capacity and better adaptation than S. cerevisiae. The aim of this study was to analyze the various
measures that can be taken to eradicate this yeast contaminant in distilleries. Modifications were
introduced to the fermentation process: yeasts were treated at pH 2, fermentation time was shortened, air
was not fed into the prefermenter, and the power system was replaced. It was possible to control Dekkera
presence and improve the fermentation process. It also became evident that factory staff needs to be
appropriately trained to detect contamination early.




2
Introduccin
La va fermentativa de produccin de etanol es hoy competitiva porque es sostenible y porque
en esta industria, se busca fundamentalmente trabajar con materias primas baratas y una
mayor eficiencia en los procesos de fermentacin. La fermentacin alcohlica consiste en la
transformacin de azcares en etanol, gas carbnico y energa, por accin cataltica de
microorganismos, especialmente levaduras (Garca Camus et al., 2006).
Las levaduras son los microorganismos ms utilizados para la produccin de etanol por va
fermentativa, ya que presentan una alta productividad en la conversin de azcares a bioetanol
y se separan mejor despus de la fermentacin. Entre las especies ms utilizadas, se
encuentran: Saccharomyces cerevisiae, S. ellipsoideus, Candida seudotropicalis,
Kluyveromyces marxianus, Candida bytyrii, Pichia stipatis, Schizosaccharomyces pombe y P.
membranaefaciens.
Las condiciones de acidez, temperatura, concentracin de sustratos y higiene, as como los
procedimientos industriales (preparacin de pie de cuba y de mosto, limpieza, etc.), pueden
permitir el desarrollo de otros tipos de microorganismos que compiten por los azcares,
produciendo compuestos orgnicos indeseables para la calidad final del alcohol, que a su vez
resultan ser txicas para las levaduras (Camargo et al., 1990).
La contaminacin microbiana en el proceso de fermentacin de debe a la presencia de
bacterias lcticas y bacterias productoras de polisacridos. Muy poco se conoce sobre
levaduras contaminantes. La levadura Dekkera bruxellensis es considerada como una de las
principales contaminantes de diferentes procesos fermentativos, entre ellos, el de la produccin
de etanol combustible.

Objetivo
El objetivo de este trabajo fue analizar las diferentes medidas que se pueden llevar a cabo en
una destilera para lograr la erradicacin de la levadura contaminante Dekkera bruxellensis.

Materiales y mtodos
El estudio se llev a cabo en una destilera de la provincia de Tucumn, cuya produccin anual
de alcohol hidratado (96GL) es de 63 millones de litros y 60 millones de litros de alcohol
anhidro. Se realiz un relevamiento y control del proceso de fermentacin alcohlica que se
lleva a cabo all, tomndose diferentes muestras (levadura recuperada, crema de levaduras,
mosto inicio y final, vino) y analizando los siguientes parmetros microbiolgicos y
fisicoqumicos:
Recuento en cmara de Neubauer: se utiliz la tcnica detallada por Copersucar (1987) para
cuantificar y distinguir las levaduras viables (vivas) de las inviables (muertas).
Porcentaje de slidos solubles (Brix): se us un refractmetro automtico Leica AR 600.
Porcentaje de levadura: por centrifugacin (3000 rpm, 10 minutos), se obtiene la
sedimentacin de las levaduras presentes en la muestra (da Silva et al., 2003).
Azcares reductores totales (% ART): se utiliz el Mtodo de Eynon-Lane (da Silva et al.,
2003).
Tenor alcohlico: se realizaron destilaciones en un equipo de Kjeldahl y se determin el tenor
alcohlico, expresado en grados Gay-Lussac (GL), mediante la utilizacin de un densmetro
digital (Planalsucar, 1980). El valor determinado represent la cantidad de alcohol (litros)
existente en 100 l de una mezcla hidroalcohlica a 20C (da Silva et al., 2003).

Resultados
Durante el muestreo, realizado con la intencin de hacer un relevamiento de datos y muestras
para poder realizar la determinacin de rendimiento alcohlico en la destilera bajo estudio,
observamos levaduras de morfologa diferente a la de las que se emplean en el ingenio para la
fermentacin de melaza y jugo de caa de azcar en las cubas y prefermentador. Por las


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caractersticas morfolgicas, la levadura que contaminara el proceso sera una Dekkera sp. Las
levaduras del gnero Brettanomyces, o Dekkera, su forma teleomrfica (nombre que reciben las
especies que presentan reproduccin sexual y, en consecuencia, formacin de esporas por
meiosis), fueron descritas por primera vez por Claussen en 1903 en la produccin de cerveza
(Clausen, 1903). Este gnero se conoce, desde hace tiempo, como agente contaminante en la
industria cervecera, de la sidra y de bebidas carbonatadas. En la industria enolgica, su
descripcin como alterante es ms reciente. Aunque al gnero lo constituyen cinco especies
diferentes, en vinos aparece nicamente Dekkera bruxelliensis. La morfologa celular es ojival o
cilndrica, con gemacin multipolar en reproduccin vegetativa, y tiene un tamao celular
variable (Figura 1).













Figura 1. Fotografa donde se observa la morfologa de Dekkera
(x1000). Fuente: Microvitis (http://www.microvitis.com/Microscopie.php).

Algunas caractersticas importantes de estas levaduras son las siguientes:
a) Nutrientes. Como fuente de carbono, Dekkera emplea azcares residuales presentes en el
mosto despus de la fermentacin alcohlica. En cuanto a los compuestos nitrogenados,
presenta requerimientos escasos, aunque la presencia de aminocidos y sales amoniacales
estimula la proliferacin celular. Se aconseja una nutricin adecuada en fermentacin
alcohlica, pero nunca en exceso, sobre todo en sales de amonio.
b) Tiempo. Dekkera posee un metabolismo lento, por lo que el factor tiempo es requisito
fundamental para el desarrollo de poblaciones alterantes.
c) Temperatura. La temperatura activa el metabolismo celular, pero temperaturas bajas (< 8C)
y altas (> 42C) pueden inhibir su crecimiento.
d) Oxgeno. Es una levadura capaz de desarrollar en anaerobiosis, aunque la presencia de
oxgeno favorece su desarrollo y estimula la sntesis de cidos voltiles.

Teniendo en cuenta el metabolismo de estas levaduras y los procedimientos que se llevan a
cabo en la fermentacin, se realizaron las siguientes modificaciones al sistema:
1) Disminucin del pH de tratamiento de levaduras en el prefermentador.
2) Disminucin del tiempo de fermentacin.
3) Eliminacin del agregado de aire en el prefermentador.
4) Modificaciones en el sistema de alimentacin.
En las siguientes figuras, se puede observar la evolucin del proceso de fermentacin con las
diferentes modificaciones realizadas.

En la Figura 2A observamos el tipo de alimentacin que se suministr diariamente al proceso
fermentativo: mielaza, mosto y/ o jugo de segunda presin clarificado. Es importante destacar
que a partir del da 21 de octubre, no se aliment con jugo de caa de azcar. Esto es


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A
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Mielaza Jugo 2 Pr Mosto Vino
1,0
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2,0
2,5
3,0
p
H
importante ya que, al no suministrar jugo, se disminuye el aporte de nitratos a la alimentacin,
sustancias que estimulan el desarrollo de la levadura contaminante.
En la Figura 2B, podemos observar la incorporacin de azcares reductores al sistema, as
como tambin los valores obtenidos en el vino centrifugado, posterior al proceso de
fermentacin.


A B












Figura 2. Alimentacin del proceso de fermentacin; A) slidos solubles y B) azcares
reductores totales.

En la Figura 3, se observa el proceso de acidificacin con cido sulfrico en el prefermentador.
A partir del da 18 de octubre, se decidi disminuir el pH entre valores de 1,8 y 2,0 para poder
controlar esta levadura contaminante, ya que tiene poca resistencia a las condiciones cidas, a
valores de pH menores a 2,2. No se pudo reducir ms el pH (hasta 1,5) por la baja viabilidad de
Saccharomyces (20%), ya que el proceso podra verse afectado por completo. El da 3 de
noviembre, se normaliz el tratamiento cido, ya que se logr controlar la contaminacin.














Figura 3. Valores de acidificacin del prefermentador.



En la Figura 4, se muestra la cantidad de slidos solubles presentes en todas las cubas de
fermentacin del sistema continuo, durante el perodo de control del proceso. El da 20 de
octubre, se transfiri el mosto de fermentacin directamente desde la cuba 3 a la cuba 5,
porque se observ que la cuba N 4 presentaba valores de slidos solubles (Brix) constantes,
lo que permiti una disminucin del tiempo de fermentacin. Esto puede representar una


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L
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(
%
)
S. cerv Dekkera
ventaja frente al desarrollo de la levadura contaminante, al presentar una velocidad de
crecimiento y de fermentacin mucho menor que la de Saccharomyces.
















Figura 4. Slidos solubles (Brix) en las diferentes cubas de
fermentacin.

En la Figura 5, se observa la viabilidad de las levaduras en estudio, Saccharomyces y la
contaminante tipo Dekkera. En el da 17 de octubre, la viabilidad de Saccharomyces se
encontraba muy disminuida (20%) con respecto al valor normal que se espera en la cuba de
fermentacin. Por el contrario, Dekkera presentaba un valor de viabilidad del 45%, que aument
al 70% el da 19 de octubre. La misma tendencia se observ cuando se realiz el recuento de
las levaduras, lo cual nos indicaba el grado de contaminacin del sistema de fermentacin.
Luego de tomarse las medidas anteriormente mencionadas para tratar de mejorar el proceso,
observamos que a partir del da 27 de octubre, comenzaron a disminuir los valores de viabilidad
de la levadura contaminante y a acrecentarse la viabilidad de Saccharomyces.

















Figura 5. Viabilidad de Saccharomyces y Dekkera en la cuba de
fermentacin N 5.

Por otra parte, en los diferentes das que se analizaron las muestras correspondientes a cubas
de fermentacin, se detect la presencia de levaduras de morfologa oval con formacin de


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6
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A
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c
o
h
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l

G
L
)
pseudohifas, morfologa correspondiente a Candida, otro tipo de levadura contaminante del
proceso. El recuento de este tipo de levadura fue muy bajo y las medidas tomadas para el
control de Dekkera evitaron su proliferacin.
Por ltimo, podemos observar en la Figura 6 que la produccin de alcohol disminuy entre los
das 19 y 22 de octubre. A partir de esta fecha, se produjo un aumento paulatino en la
produccin de alcohol, debido a un mejoramiento del proceso de fermentacin principalmente
por el aumento de la viabilidad y recuento de Saccharomyces.



















Figura 6. Determinacin de alcohol en muestra de vino.

Conclusiones
Es importante destacar que, en conjunto, se logr realizar el control y manejo de la levadura
contaminante, lo que nos servir de experiencia para poder afrontar futuras contaminaciones en
la fermentacin alcohlica.
Es necesario capacitar al personal de las industrias para que sean capaces de detectar una
contaminacin en forma temprana, lo cual permitir controlarla en forma ms rpida, sin
alteraciones importantes en la capacidad de produccin de alcohol.

Citas bibliogrficas
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