Mtodos bioqumicos

para o estudo da clula

Ao fnal desta aula, voc dever ser capaz de:
Entender como se obtm preparaes de organelas isoladas,
que assim podem ser estudadas fora do contexto celular.
Entender os princpios, e assim os resultados obtidos por
metodologias cromatogrfcas e eletroforticas.
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I) FRACIONAMENTO CELULAR
HISTRICO
Nas primeiras dcadas do sculo XX, j havia muita informao
sobre as reaes qumicas ligadas ao metabolismo celular. Nessa poca
tambm os primeiros microscpios pticos j tinham sido criados,
levando ao conhecimento de que uma clula no parecia ter s um ncleo
em seu interior, mas tambm outros componentes menores, cujo tamanho
estava quase fora da capacidade de observao daqueles microscpios.
A questo era como correlacionar esses conhecimentos anteriormente
acumulados usando diferentes abordagens.
Um bioqumico no era capaz de responder em que local da
clula se passava determinada reao enzimtica que ele conseguia
medir no espectrofotmetro. Algumas vezes, era mesmo necessrio
romper as clulas da preparao, fazendo um extrato para que certas
reaes pudessem ocorrer in vitro e serem medidas. Isso mostrava que as
enzimas que se queriam medir nesse ensaio estavam confnadas em algum
compartimento intracelular, a que os reagentes adicionados externamente
no tinham acesso.
De modo recproco, um morfologista no era capaz de responder
que etapas do metabolismo celular ocorriam nas vrias partes da clula
que ele podia ver, especialmente ao se aproximar a metade do sculo, em
que os microscpios eletrnicos comeavam a ser usados para observar
material biolgico.
Nessa poca, dois grupos trabalhavam intensamente para conhecer
melhor o contedo das clulas: o do Dr. Keith Porter, no Instituto
Rockefeller, em Nova York, Estados Unidos, e o grupo da Universidade
de Louvain, Blgica, formado por Albert Claude, George Hogeboom e,
pouco depois, Christian De Duve.
O grupo do Dr. Porter estava criando, com sucesso, mtodos
adequados ao preparo de material biolgico para observao de
amostras biolgicas ao microscpio eletrnico, mtodos que, alis, so
usados at hoje (veja Aula 2). A nova metodologia mostrou, no interior
de clulas eucariticas, muitos compartimentos internos envolvidos por
membrana, muitos grnulos e muitos flamentos. O grupo da Blgica
estava, desde meados da dcada de 30, realizando experimentos em que
clulas de fgado de rato eram rompidas e seu contedo assim liberado
era separado por centrifugao em vrias fraes, ditas subcelulares.
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Depois de separada, cada frao era observada ao microscpio ptico
e ensaiada em vrias caractersticas bioqumicas. Assim, em 1940, o
grupo belga publicou um trabalho muito importante em que descrevia
os primeiros resultados de fracionamento celular: as clulas do fgado
de rato rompidas podiam ser divididas em quatro fraes. A frao
mais densa continha os ncleos; a prxima, em ordem decrescente de
densidade, era formada por grandes grnulos e consumia oxignio
produzindo CO
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; a seguinte era formada por pequenos grnulos e
hidrolisava protenas em pH cido; a menos densa continha protenas
solveis, sendo provavelmente o citoplasma.
Como correlacionar as fraes descritas por Claude e colaboradores
com as observaes de Porter ao microscpio eletrnico? A sada foi a
colaborao direta entre os dois grupos, dando um novo impulso ao
conhecimento do contedo celular e levando descrio de vrias organelas.
importante destacar que o avano espetacular da Biologia Celular nesse
perodo no foi s resultado do esforo de mdicos, bilogos, qumicos
e fsicos. Houve importante colaborao de engenheiros e tcnicos que
trabalhavam nas ofcinas das universidades e dos institutos de pesquisa. A
ultracentrfuga e o ultramicrtomo, por exemplo, foram criados nas ofcinas
do Instituto Rockefeller nesse perodo.
Preparando a amostra
Para obter preparaes de organelas isoladas e purifcadas
preciso evidentemente romper as clulas. No entanto, se nossa amostra
formada por clulas de diferentes tipos, devemos pensar que depois de
rompermos as clulas no temos mais condies de identifcar de que tipo
celular veio uma mitocndria, por exemplo. Por isso, antes de comear
a pensar em como romper as clulas, temos de pensar em como tornar
a amostra uma preparao homognea, ou seja, formada por apenas
um tipo celular. Essa tarefa vai ser diferente para cada tipo de material.
Vamos considerar alguns exemplos:
Exemplo 1 Amostra de exsudato peritonial. Para obter
amostras de clulas do sistema imune que residem aderidas na parede
interna do peritnio, injetamos pequena quantidade de lquido nessa
cavidade de um animal anestesiado (geralmente um camundongo) e
massageamos levemente para que as clulas se soltem da parede. Em
seguida, retiramos o lquido que vem com uma mistura de clulas.
esse lquido que chamamos de exsudato ou lavado peritoneal. A mistura
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formada principalmente por macrfagos e vrias classes de linfcito.
Eventualmente, dependendo das condies fisiolgicas do animal,
tambm pode haver nmero signifcativo de neutrflos. Para vrias linhas
de pesquisa na rea de Parasitologia, necessrio estudar a interao
de patgenos com macrfagos, j que estas clulas so as primeiras a
interagir com agentes invasores de nosso organismo.
Para separar os macrfagos das outras clulas dessa preparao e
fazer uma cultura primria (veja aula de Cultura de Clulas), podemos
explorar uma atividade biolgica natural, a adeso a substratos. Todas
as clulas retiradas no exsudato aderem a substratos, mas fazem isso
em velocidades diferentes. Os macrfagos aderem a substratos como
vidro ou plstico em cerca de 15 minutos, se estiverem em meio de
cultura e a 37
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C, enquanto os linfcitos levam mais de meia hora nas
mesmas condies. Assim, podemos obter uma preparao homognea
de macrfagos usando a sua atividade biolgica natural. Mas, na maioria
das vezes, isso no possvel. Veja os prximos exemplos.
Exemplo 2 Separao de clulas do sangue. As hemcias e os
leuccitos circulantes (linfcitos, neutrflos, moncitos, eosinflos,
basflos etc.) podem ser separados uns dos outros e do plasma por
diferena de densidade. Se deixarmos um tubo com sangue heparinizado
em repouso sobre a bancada, depois de algum tempo haver separao
de seus elementos, que se depositaro no fundo do tubo. A deposio
dos elementos do sangue nessas condies ser muito lenta.
!
Ateno! No confunda com o processo de coagulao! Faz parte do plasma
sangneo uma srie de protenas da coagulao: quando retiramos sangue
de um vaso, ou lesamos um vaso, forma-se uma rede protica cujo principal
componente a fbrina, que retm todas as clulas e deixa escapar o lquido. A
rede protica contendo as clulas chamada de cogulo e o lquido chamado
de soro. Assim, a diferena entre plasma e soro que o primeiro ainda contm
as protenas da coagulao e o segundo no. Esse processo fsiolgico e pode
ser inibido in vitro por algumas substncias como heparina e citrato de sdio,
entre outras. Quando retiramos sangue para exame, por exemplo, o processo
de coagulao inibido para que, alm do plasma, as clulas tambm possam
ser examinadas.
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Se o tubo com sangue heparinizado for centrifugado, essa deposio
ocorrer em poucos minutos, colocando as hemcias no fundo porque so
mais densas; sobre elas se forma uma fna camada esbranquiada (buffy coat)
que contm os leuccitos e, no sobrenadante, o plasma sem clulas.
Que fque clara ento a defnio dos termos: precipitado o
material que se depositou no fundo no tubo que foi centrifugado e
sobrenadante o material que no se depositou. Na linguagem de
laboratrio, ns nos referimos ao precipitado de uma centrifugao pelo
nome em ingls, pellet, talvez para no confundir com o precipitado
resultante de uma reao qumica. Esse mtodo bom para separar
as hemcias das outras clulas do sangue, porque a densidade dela
muito diferente. Mas como fazer para separar clulas de densidade
muito prxima?
Exemplo 3 Nos ltimos anos, tem sido necessrio separar as
diferentes classes de linfcito para realizar estudos de interao com o
vrus HIV ou mesmo procedimentos clnicos em que apenas a classe de
linfcito que o vrus infecta tratada e depois devolvida circulao
sangnea do paciente.
Apesar de exercerem funes bastante diversas na defesa de um
organismo (voc vai aprender mais adiante no curso), as diferenas entre
as classes de linfcitos que nos permitem separ-los so principalmente
molculas de sua membrana plasmtica expostas ao meio extracelular.
Quando essas molculas foram descritas e foram produzidos anticorpos
contra elas, uma importante ferramenta fcou disponvel. Assim, podemos
incubar a mistura de linfcitos com anticorpos que s reconhecem uma
das classes. Se esses anticorpos estiverem conjugados com fuorocromos,
podemos separar os linfcitos em um aparelho que reconhea molculas
fuorescentes. Veja na Figura 5.1 um esquema deste aparelho, o citmetro
de fuxo, ou FACS (fuorescence activated cell sorter).
Colocamos a mistura de linfcitos que j foram incubados com
anticorpos fuorescentes numa entrada do aparelho que parece um funil.
A ponta do funil muito fna e est submetida a uma vibrao que faz
com que pinguem gotculas regulares e de tamanho to pequeno que
s comportam uma clula (ou nenhuma). As gotculas passam em fla
indiana entre um laser (que vai excitar o fuorocromo) e um detector
(que vai ler se aquela gota tem clula, de que volume, se ela fuorescente
ou no, e qual a intensidade da fuorescncia). Associado ao detector h
um sistema que coloca carga negativa nas gotas que contm uma clula
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fuorescente (colocando ons no lquido da gota, no nas clulas) e positiva
nas que contm clulas no fuorescentes. As gotas que contm mais de
uma ou nenhuma clula no recebem carga. Todas as gotas passaro
por um campo eltrico que desviar as
gotas positivas para um recipiente e as
negativas para outro, separando assim
os linfcitos marcados em um recipiente
e as outras clulas em outro recipiente.
Os citmetros de fuxo eram aparelhos
raros (e caros!) no incio da dcada de 90,
mas hoje j so encontrados em vrios
institutos de pesquisa, nos grandes
hospitais e em alguns laboratrios de
anlises clnicas.
Exemplo 4 E se ns quisssemos
trabalhar com um rgo como o fgado?
Para conseguir uma preparao homo-
gnea de hepatcitos, por exemplo, seria
necessrio primeiro soltar as clulas que
esto unidas entre si e matriz extracelular
(voc vai saber detalhes desse assunto
em Biologia Celular II). A unio das
clulas com a matriz e com outras clulas
pode ser de vrios tipos, mas tem duas
caractersticas em comum: so ligaes proticas, estabilizadas por clcio.
Se quisermos solt-las, ento vamos retirar o clcio, usando quelantes
(substncias que ligam ons metlicos, tornando-os indisponveis para
outras ligaes) como EDTA ou EGTA, e quebrar as ligaes proticas,
usando enzimas proteolticas, como a tripsina. Esses tratamentos devem
ser controlados para no romper as prprias clulas. Depois de soltas,
as clulas podem ser separadas por diferena de densidade, usando
centrifugao.
Assim, de alguma das maneiras acima, conseguimos uma
preparao homognea, o que nos permite comear o fracionamento
celular propriamente dito, rompendo as clulas.
Figura 5.1: Citmetro de fuxo (FACS).
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Rompimento celular
No fracionamento celular, o que se deseja fazer romper a
membrana plasmtica sem romper as membranas das organelas. difcil
conseguir isso, e para cada tipo celular existem mtodos de rompimento
mais adequados que outros. Alm disso, as clulas de uma preparao
no se rompem todas simultaneamente; o processo progressivo e
precisa ser acompanhado ao microscpio ptico. Dentre os mtodos
mais usados esto:
a) choque osmtico: as clulas so colocadas em meio hiposmtico,
aumentando de volume at arrebentar. o mtodo de escolha para
romper hemcias, por exemplo. Em outras clulas, temos de nos
preocupar em restaurar a osmolaridade ideal rapidamente para
que as membranas das organelas no se rompam tambm.
b) choque trmico: as clulas devem ser congeladas e descongeladas
rapidamente, alternando-se, por exemplo, imerso em nitrognio
lquido (-196
o
C) e banho de 37
o
C.
c) macerao: pode ser realizada com homogeneizadores parecidos
com um liquidifcador, ou de modo mais delicado com homoge-
neizadores de vidro, que se parecem com um copo onde um mbolo
entra justo, forando as clulas a sofrer o atrito entre os vidros.
Seguindo o mesmo princpio, alguns pesquisadores usam pequenas
prolas de vidro misturadas preparao. Agitando a preparao,
as prolas se chocam, rompendo as clulas.
d) sonicao: todas as estruturas, biolgicas ou no, possuem uma
freqncia de ressonncia caracterstica. Uma vibrao nessa
freqncia que tenha grande intensidade pode romper a estrutura.
a mesma histria da ponte que vibra com a marcha dos soldados
ou do estdio lotado que vibra com os gritos e pulos da torcida.
Teoricamente, possvel usar ultra-som com uma freqncia de
vibrao e intensidade adequadas para romper apenas a membrana
plasmtica e deixar as estruturas intracelulares intactas. Na prtica
porm, os sonicadores (aparelhos que emitem ultra-som) no tm
um controle de intensidade, freqncia e amplitude to bom que
permita esse ajuste. Mesmo assim, a sonicao um dos melhores
mtodos para o rompimento de clulas.
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Figura 5.2: Esquema da produo de vesculas de membrana.
vesculas inside-in
vesculas inside-out
e) tratamento com detergente no inico: como as molculas de
detergente no inico so anfpticas, elas conseguem substituir
as molculas de fosfolipdio na membrana plasmtica, causando
o rompimento. Os detergentes so usados em concentrao
muito baixa e por pouco tempo.
Depois do rompimento, os fragmentos de membrana logo se
resselam para esconder da gua a poro hidrofbica da bicamada
lipdica, formando pequenas vesculas. Os fragmentos de membrana
podem resselar mantendo para fora o folheto da membrana que estava
voltado para o meio extracelular, formando vesculas do lado direito (inside-
in), ou do lado do avesso (inside-out) quando o folheto que era virado para
o citoplasma fca voltado para fora na vescula resselada (Figura 5.2).
Com o rompimento adequado, conseguimos obter um
homogeneizado total, isto , uma preparao em que a maioria das
clulas est rompida, as organelas esto ntegras mas espalhadas
na preparao, e o contedo solvel do citoplasma est misturado
com o lquido onde as clulas foram rompidas.
Centrifugao diferencial
A maneira de separar o contedo celular em vrias fraes
explorar as diferenas de densidade (relao massa/volume) entre os
componentes celulares, usando uma ultracentrfuga.
Centrifugando o homogeneizado a baixa velocidade (cerca de
1.000g, 10 min), conseguiremos colocar no pellet os componentes mais
densos da mistura, que so as clulas no rompidas e os ncleos. Se
vertermos o sobrenadante em um novo tubo de centrfuga, podemos
centrifug-lo a uma velocidade maior (cerca de 10.000g, 10 min) e assim
colocar no pellet mitocndrias, peroxissomos, lisossomos (e cloroplastos,
se estivermos trabalhando com vegetais). Se mais uma vez passarmos
o sobrenadante para um novo tubo e centrifugarmos em velocidade
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Uma centrfuga um aparelho em que um motor faz um eixo girar em grande velocidade (como numa mquina de
furar). Essa velocidade medida em rpm (rotaes por minuto). Ao eixo que gira se adapta uma pea, o rotor, onde
colocaremos tubos com o material a ser centrifugado. Durante a centrifugao, forma-se um campo gravitacional
cuja intensidade (medida em gravidades - g) proporcional velocidade da centrifugao. Assim, a fora centrfuga
empurra o material para o fundo do tubo numa velocidade que depende da centrifugao, da densidade do
material e do meio em que ele se encontra.
ainda maior (cerca de 20.000g, 30 min), poderemos peletar a chamada
frao microssomal, formada por vesculas de origem variada, como a
membrana plasmtica, o retculo endoplasmtico, o complexo de Golgi e
os endossomos. Desta vez, o sobrenadante contm ribossomos, partculas
virais (se houver), e macromolculas, como DNA e grandes complexos
enzimticos. Esses componentes tambm so centrifugveis, mas para pelet-
los so necessrias altssimas velocidades (200.000g) por muitas horas.
O sobrenadante fnal, ou frao sobrenadante, uma soluo verdadeira,
que contm os componentes solveis do citoplasma (Figura 5.3).
Veja se voc entendeu: a medida rpm se refere
velocidade com que o rotor gira. A medida g
se refere intensidade do campo gravitacional
formado durante a centrifugao.
Dentre os diferentes componentes de uma
amostra submetidos s mesmas condies
de centrifugao, os mais densos vo para o
fundo primeiro, os de densidade intermediria
depois, e por fm os de menor densidade.
Claro que a prpria densidade do lquido em
que os componentes celulares esto suspensos
tambm infuencia. As primeiras centrfugas
tinham eixo horizontal e foi um grande
avano quando foram construdas centrfugas
cujo eixo girava na vertical.
As mais simples so ditas centrfugas clnicas, por
serem muito usadas em laboratrios de anlises
clnicas (existe uma no laboratrio de aulas
prticas no plo; observe-a melhor) para separar
os componentes do sangue (veja exemplo 2,
anteriormente). Essas centrfugas atingem
velocidades de at 3.000 rpm. No entanto,
para separar componentes de densidade
menor, como organelas, necessrio um campo
gravitacional mais intenso, que s conseguido
em centrifugaes de velocidade muito maior.
Isso s foi possvel quando se construram as
primeiras ultracentrfugas, na dcada de 30.
Nesses equipamentos, o rotor gira numa cmara
blindada, refrigerada e sem ar (no vcuo),
diminuindo assim as foras de atrito.
Cmara blindada
Material em
Sedimentao
Refrigerao
Vcuo
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Figura 5.4
Voc j deve ter notado que apenas com a centrifugao diferencial
no podemos obter organelas totalmente isoladas das demais. Isso acontece
porque a diferena de densidade entre lisossomos e peroxissomos, por
exemplo, no muito grande. Alm disso, nem todas as organelas do
mesmo tipo tm exatamente a mesma densidade, h pequenas variaes.
Para resolver isso, podemos recorrer a um tipo de centrifugao em que,
alm de variar a velocidade e o tempo de centrifugao, podemos variar
tambm a densidade do meio em que as organelas so centrifugadas. Depois
de fazer centrifugao diferencial, retomamos o pellet e o colocamos sobre
um gradiente de densidade previamente montado num tubo de centrfuga
(Figura 5.4). Para montar esse gradiente, usamos solues concentradas
de densidade conhecida, como sacarose para separar organelas, cloreto de
csio para separar DNA e outros meios especiais que variam de densidade
sem exercer efeito osmtico.
Figura 5.3: Esquema de uma
centrifugao diferencial.
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Neste tipo de centrifugao, o material que est a caminho do
fundo do tubo encontra densidades cada vez maiores do lquido, tendo
cada vez mais difculdade de prosseguir. Quando um componente da
mistura de organelas encontrar uma regio do gradiente que tenha
densidade igual sua, entrar em equilbrio, formando uma banda.
Essa banda poder ser recolhida cuidadosamente com uma pipeta ou
uma seringa e, assim, fnalmente, temos uma organela purifcada.
O sucesso de um protocolo de fracionamento celular pode ser
avaliado de duas maneiras:
a) por microscopia eletrnica, processando cada etapa e
observando no microscpio que componentes da clula esto presentes
naquela frao e se esses componentes esto bem conservados ou se o
fracionamento os danifcou;
b) pela dosagem de enzimas marcadoras em todas as fraes;
para uma enzima ser considerada marcadora de uma organela, preciso
que ela esteja presente apenas nessa organela e em nenhum outro lugar
da clula e que seja encontrada nessa organela em todos os tipos
celulares. Essas enzimas foram estabelecidas nos primeiros trabalhos
de fracionamento celular e depois confrmadas por citoqumica (veja
na prxima aula).
A partir de fraes subcelulares contendo organelas purifcadas, ou
at mesmo de clulas inteiras, podemos purifcar as macromolculas que
desejamos estudar. Existem vrias metodologias, cada uma mais apropriada
para protenas ou lipdeos ou cidos nuclicos ou acares. Para exemplifcar,
vamos ver a seguir os princpios das metodologias bioqumicas mais usadas
em Biologia Celular: cromatografas e eletroforese.
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II) CROMATOGRAFIA
a) Cromatografa de partio
A cromatografa de partio adequada para separao de molculas
pequenas, como lipdeos e aminocidos. Pode ser feita em papel ou numa fna
camada de material inerte, como celulose ou slica, aplicada sobre uma superfcie
de vidro. Nesses suportes possvel conseguir particionar a amostra entre duas
fases lquidas, uma mvel e outra estacionria. Veja como funciona: colocamos
um papel ligeiramente umedecido em gua num recipiente, em contato com
um solvente orgnico (veja a Figura 5.5); o solvente subir pelo papel por
capilaridade, enquanto a gua continuar imvel.
Quando o solvente chegar perto da borda superior do papel,
retiramos do recipiente, deixamos o papel secar e borrifamos com corante
adequado para o que desejamos: para fosfolipdeos ou para aminocidos,
por exemplo. Logo veremos que os componentes da amostra foram
separados. Essa separao ocorreu porque cada componente da amostra
tem afnidade diferente, pelo solvente ou pela gua. Assim, quem tiver
mais afnidade com o solvente vai se deslocar mais e quem tiver mais
afnidade pela gua, que est imobilizada no papel, vai se deslocar mais
devagar ou mesmo fcar parado. Dizemos que os componentes da amostra
particionaram entre a agua e o solvente.
Voc pode fazer essa cromatografa em casa: use um pedao de papel daqueles de coar caf
e pingue tinta de caneta-tinteiro azul ou preta perto de uma das bordas do papel. Mergulhe
essa borda em um pouco de acetona e veja que, medida que a acetona sobe pelo papel,
ela arrasta os componentes da tinta, uns mais e outros menos, separando uma mancha
vermelha, uma amarela e outra esverdeada.
direo do
solvente
componentes
separados
aplicao da
amostra
papel
Figura 5.5: Cromatografa de partio.
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b) Cromatografas em coluna
Nestes tipos de cromatografa, usamos uma coluna de vidro (ou
plstico, ou metal) que foi preenchida com uma resina que exercer
um efeito de separao na amostra que a percorrer. Veja na Figura
5.6 como funciona.
A amostra aplicada sobre a resina, que j foi previamente
preparada na soluo-tampo adequada. Em seguida, esse mesmo
tampo adicionado continuamente sobre a resina, e recolhido na sada
da coluna, obrigando a amostra a percorrer a resina e sofrer seus efeitos
de separao. Esse processo (chamado eluio) pode levar de minutos,
se a coluna for pequena, a dias, se a coluna for grande. Atualmente,
mesmo as maiores colunas podem ser eludas em minutos graas a uma
tecnologia de eluio sob alta presso, a que se deu o nome de HPLC
(high performance liquid chromatography).
Os efeitos de separao numa cromatografia dependem da
natureza da resina e podem ser de trs tipos:
fltrao em gel: a resina formada por esferas muito pequenas,
perfuradas por poros de tamanho defnido (Figura 5.7). Conforme o
lquido vai escoando, os componentes maiores da amostra, de dimetro
maior que a abertura dos poros da resina, passam direto e saem logo
da coluna, enquanto os menores caem nos canais da resina e demoram
a sair. Assim, obtm-se uma separao por tamanho, muito usada para
separar protenas de diferentes pesos moleculares.
Figura 5.6: Cromatografa em coluna.
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troca inica: as amostras percorrem uma resina formada por
microesferas sem poros, mas que tm carga em sua superfcie (Figura 5.8),
prendendo os componentes da amostra que tm carga contrria. Se forem
justamente esses os componentes desejados, possvel deslig-los da
resina com variaes de pH ou de fora inica da resina.
afnidade: a resina est revestida com um ligante especfco para o
componente da amostra que se deseja separar: um anticorpo (veja prxima
aula), por exemplo (Figura 5.9). O mesmo recurso de variao de pH ou
fora inica usado para soltar a molcula da coluna.
direo de eluio
esfera de
resina
componentes menor da
amostra
componentes maior da
amostra
direo de eluio
resina acoplada
ao anticorpo
o componente reconhecido pelo
anticorpo fica preso
o componente no reconhecido
pelo anticorpo passa direto
anticorpo fica preso
Figura 5.7 Resina de
fltragem em gel.
Figura 5.8: Resina de
troca inica.
Figura 5.9: Cromatografa
de afnidade.
direo de eluio
resina carregada
positivamente
componentes negativos
da amostra ficam presos
componentes positivos
da amostra passam direto
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Se voc achou a cromatografa de afnidade mais efciente que a de
fltrao em gel ou a de troca inica, acertou. Mas para que ela funcione
bem preciso que haja um ligante especfco para acoplar resina e
que a amostra no esteja muito sobrecarregada de contaminantes. Por
isso, geralmente usam-se as outras duas cromatografas para dar uma
limpada na amostra e s ento se usa a cromatografa de afnidade
para purifcar a protena que queremos.
III) ELETROFORESE
A tcnica bioqumica mais usada em Biologia Celular certamente
a eletroforese. Ela se baseia no estudo do comportamento de uma molcula
num campo eltrico. As macromolculas so geralmente carregadas (reveja,
em Bioqumica I): os cidos nuclicos so negativos e as protenas podem
ser negativas ou positivas, dependendo do pH em que se encontram. Por
isso, quando colocados num campo eltrico, os cidos nuclicos sempre vo
para o plo positivo e as protenas, para o positivo ou negativo, dependendo
do pH. Mas a eletroforese no feita com as molculas soltas no lquido
(apesar de ter sido inventada assim, h muitos anos). Usamos um suporte
slido, que geralmente um gel poroso.
Para cidos nuclicos, que so muito grandes, usamos amido (isso
mesmo, um mingau!) ou agarose (parece uma gelatina), que formam gis
de poro grande; e para protenas, que no so to grandes, usamos um gel
prprio para eletroforese, a poliacrilamida. Todos esses materiais permitem
que, ao prepar-los, possamos escolher o tamanho do poro do gel por onde
passaro as molculas, a caminho do plo que tem carga oposta sua.
A carga dos cidos nuclicos proporcional ao seu tamanho; quanto
maior a molcula, mais negativa. J as protenas no, existem protenas
grandes e muito carregadas, grandes e pouco carregadas, pequenas e muito
carregadas e pequenas e pouco carregadas, difcultando bastante a anlise
do resultado. Alm disso, como percorrem os poros de um gel, a forma da
molcula vai fazer diferena: uma protena em forma de basto vai passar
pelos poros com mais difculdade se estiver de lado. Por isso, as protenas
so desnaturadas antes de serem aplicadas ao gel (Figura 5.11). Assim, as
diferenas de forma no infuenciam mais a corrida eletrofortica, apenas
a carga e o tamanho da molcula contam.
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Para desnaturar uma protena, podemos ferv-la e, alm disso, so
usados dois reagentes: a) o dodecil sulfato de sdio (SDS), um detergente
inico que, alm de desnaturar, adiciona cargas negativas s ligaes
peptdicas, tornando a carga da protena sempre negativa e proporcional
ao seu tamanho (claro, porque quanto maior a protena, mais ligaes
peptdicas ela tem!); b) o 2-mercaptoetanol, poderoso agente redutor que
adiciona hidrognios s pontes dissulfeto, desfazendo-as (Figura 5.11).
Reveja, em Bioqumica I:
uma protena des-
naturada aquela que
perdeu suas estruturas
terciria e secundria,
fcando s com a primria,
ou seja, os aminocidos
ligados covalentemente
e enovelados ao acaso, o
que faz com que todas as
protenas desnaturadas
sejam aproximadamente
globulares.
!
protenas com duas
subunidades (A e B) unidas
por pontes dissulfeto
protenas com uma
subunidade
A S S B C
A B
C
A
B
C
SH
SH
sentido da corrida
cada banda corresponde
a uma cadeia protica
ELETROFORESE
Figura 5.10: Cuba de
eletroforese vertical.
Figura 5.11: Preparao das
protenas para ele-troforese.
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A eletroforese em condies desnaturantes e redutoras (conhecida
pela sigla SDS-PAGE, de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis) , portanto, uma tcnica que separa protenas de acordo
com seu tamanho, ou massa molecular. Depois que a corrida eletrofortica
terminou, o gel descolado dos vidros da cuba e corado com o corante
desejado. O mais comum, o azul de Comassie, s cora protenas. Uma
das aplicaes de SDS-PAGE pode ser procurar quantas protenas fazem
parte de uma amostra. Veja na Figura 5.12 a foto de um gel em que
foram aplicadas como amostras as etapas de purifcao de uma protena.
Da esquerda para a direita, a amostra est cada vez mais purifcada.
s vezes necessitamos testar se uma protena que foi
separada num gel reconhecida por um anticorpo especfco,
seja produzido no laboratrio ou mesmo presente no soro de
paciente (veja na prxima aula). Nesse caso, preciso retirar as
protenas do gel, j que o anticorpo no desnaturado (para poder
funcionar no podemos desnatur-lo!) uma molcula grande
demais para entrar no gel. Ao mesmo tempo, no queremos
misturar de novo as protenas. A tcnica de eletrotransferncia
(ou Western blot.) veio resolver esse problema. Depois de
correr o gel como descrito anteriormente, colocamos o gel
em contato com um papel especial, a nitrocelulose, que tem
a capacidade de ligar protenas (chamamos de membrana,
mas um papel), e fazemos passar a corrente eltrica desta
vez no sentido perpendicular ao gel (veja na Figura 5.13).
As protenas vo sair do gel ainda do jeito que estavam separadas
e grudar na nitrocelulose, ficando expostas para
qualquer ensaio.
gel gel
nitrocelulose nitrocelulose
sentido da corrente
eltrica
Figura 5.13: Eletrotransferncia.
Figura 5.12: Gel de SDS-PAGE
do acompanhamento de purif-
cao de uma protena. A mesma
quantidade de protena total foi
aplicada em todas as amostras.
15,000
40,000
100,000
molecular
weight
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Tambm os cidos nuclicos separados por eletroforese tm de
ser transferidos para um papel de nitrocelulose se for preciso testar, por
exemplo, se um fragmento de RNA (chamado sonda) complementar
a algum fragmento de DNA presente no gel. Voc vai saber mais sobre
isso em outras matrias do curso.
Outras metodologias de Bioqumica vm sendo cada vez mais
usadas em Biologia Celular para que se possa conhecer a composio
de um determinada organela, por exemplo. Se for necessrio para o seu
entendimento, essas tcnicas mais sofsticadas (e menos usadas tambm)
sero explicadas quando oportuno.
QUESTIONRIO
1. Por que preciso uma preparao homognea para comear um
fracionamento celular?
2. Quais so os mtodos mais usados para romper clulas?
3. Como se separam organelas de um homogeneizado?
4. O que centrifugao em gradiente de densidade?
5. Qual o princpio de separao da cromatografa de partio?
6. Qual o princpio de separao da cromatografa de fltrao em gel?
7. Qual o princpio de separao da cromatografa de troca inica?
8. Qual o princpio de separao da cromatografa de afnidade?
9. Quais as aplicaes da tcnica de eletroforese?
10. Quais as aplicaes da tcnica de eletrotransferncia ou Western blot.?