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TRABAJO PRCTICO N 1 MICROSCOPIA



I. OBJETIVOS
a) Distinguir las partes del microscopio.
b) Aprender a usar el microscopio.
c) Conocer la forma de entrega de informes de prctico

La evolucin de una ciencia generalmente se desarrolla paralela a la invencin de
instrumentos que extiendan los sentidos humanos hasta nuevos lmites. Desde la
invencin del microscopio en el siglo 17 hasta nuestros tiempos se ha logrado progresar
enormemente en el estudio de la clula. Los primeros microscopios usados por
cientficos renacentistas eran MICROSCOPIOS DE LUZ. Sin embargo, los microscopios
de aquella poca eran considerados simples, debido a que tenan un solo lente, como
en las lupas; en los actuales se alcanza una mayor magnificacin con un sistema de
dos lentes, y por ello se denominan compuestos. En estos microscopios de luz, la luz
visible pasa a travs de lentes de vidrio. Las lentes refractan (cambian de direccin) la
luz de tal modo que la imagen del espcimen se magnifica al llegar al ojo humano.

En esta actividad de laboratorio, usted se familiarizar con el microscopio, y luego
observar diversos organismos mientras aprende el uso apropiado de este instrumento
bsico y esencial para un bilogo celular, histlogo, o patlogo.

Existen dos factores importantes en microscopa y son: MAGNIFICACION y
RESOLUCION.

MAGNIFICACION (o aumento) se define como las veces que un objeto se agranda en
relacin a su tamao real.

RESOLUCION es una medida de la distancia mnima que existe entre dos puntos para
ser distinguidos como dos puntos separados. Por ejemplo, lo que pareciera ser una
estrella cuando se mira al cielo puede ser en realidad dos estrellas con ayuda de un
telescopio. Por lo tanto, el telescopio tiene mayor capacidad de resolucin.
Sin embargo, as como el ojo humano es limitado, el poder de resolucin de un
microscopio o telescopio tambin es limitado. Los microscopios pueden disearse para
magnificar objetos tanto como sea posible, pero la luz del microscopio nunca podr
resolver detalles ms finos que 0.2 m, el tamao de una pequea bacteria o de una
mitocondria. Esta resolucin no se puede mejorar, est limitada por la LONGITUD DE
ONDA DE LA LUZ VISIBLE usada para iluminar el espcimen. Los microscopios de luz
slo pueden magnificar objetos efectivamente hasta 1500 veces, ms magnificacin
implicara que el objeto se viera borroso. Lo que se ha ido mejorando en microscopa
de luz es el CONTRASTE de aquellos objetos que puedan ser resueltos por el
microscopio en uso.

La mayora de las estructuras subcelulares, u organelos, son muy pequeos para ser
resueltos con el microscopio de luz. La biologa celular avanz rpidamente desde la
dcada del 50 con la introduccin del microscopio electrnico. En vez de usar luz
visible, el MICROSCOPIO ELECTRONICO enfoca un haz de electrones a travs del
espcimen. Microscopios electrnicos modernos pueden alcanzar una resolucin de
aproximadamente 0.2 nanmetros (nm), mil veces mejor que el microscopio de luz. Los

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bilogos usan el trmino ULTRAESTRUCTURA CELULAR para referirse a la anatoma
celular resuelta por un microscopio electrnico. Una foto obtenida con un microscopio
de luz a veces se llama FOTOMICROGRAFIA, y una foto que resulte del microscopio
electrnico se llama MICROGRAFIA ELECTRONICA DE TRANSMISION o de
BARRIDO segn sea el microscopio electrnico que se use.

Existen dos tipos de microscopio electrnico: el MICROSCOPIO ELECTRONICO DE
TRANSMISION (TEM) y el MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO (SEM). El
TEM dirige un haz de electrones a travs de una seccin muy delgada del espcimen,
similar a lo que sucede en un microscopio de luz. Sin embargo, en vez de usar lentes
de vidrios, los cuales son opacos a los electrones, el TEM usa electroimanes. Los
electroimanes actan como lentes que enfocan y magnifican la imagen cambiando la
direccin de los electrones cargados. La imagen ltimamente se enfoca en una pantalla
para examinarla o en un film fotogrfico para tener un registro permanente. Para
aumentar el contraste en la imagen, secciones muy delgadas del espcimen se tien
con tomos pesados de metales, los cuales se adhieren a ciertos lugares en las clulas.
Los bilogos celulares usan el TEM principalmente para estudiar la ultraestructura
interna de las clulas.

El SEM es especialmente til para el estudio detallado de la superficie del espcimen.
El haz de electrones cubre (o barre) la superficie de la muestra, la cual generalmente
est recubierta con una pequea lmina de oro. El haz de electrones excita electrones
sobre la superficie de la muestra, y estos electrones secundarios se colectan y se
enfocan en una pantalla, formando una imagen de la topografa del espcimen. Un
atributo importante del SEM es su gran profundidad de penetracin, la cual resulta en
una imagen tridimensional.

El microscopio electrnico revela muchos organelos, imposible de resolver con el
microscopio de luz. Sin embargo, el microscopio de luz ofrece muchas ventajas,
especialmente para el estudio de clulas vivas. Una desventaja del microscopio
electrnico es que los mtodos qumicos y fsicos usados para preparar el espcimen
no slo mata clulas, sino que tambin introduce artefactos, estructuras fsicas que se
ven en la micrografa que no existen en la clula viva.

En este laboratorio usaremos el microscopio compuesto. Las principales partes de un
microscopio compuesto son:

Sistema Mecnico
a. Pi: es la base de sustentacin.
b. Columna: regin articulada del pi.
c. Platina: plataforma horizontal que sustenta al espcimen o preparacin.
d. Tubo: lleva en su extremo superior la lente ocular y en el inferior el objetivo.
e. Revlver o tambor: pieza giratoria que lleva los objetivos.
f. Tornillos de focalizacin: al rotarlos cambian el enfoque del microscopio, lo cual lo
logran variando la distancia entre el objetivo y la platina. Existen dos movimientos,
macromtrico (enfoque aproximado y grueso), micromtrico (enfoque de precisin).




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Sistema de iluminacin
a. Fuente luminosa: puede ser natural o artificial. Si es natural se utiliza un espejo de
cara plana. Si es artificial puede o no haber espejo, si hay espejo se utiliza por el lado
cncavo.
b. Condensador: dispositivo formado por un sistema de lentes que concentra los rayos
luminosos en el espcimen. Su mayor utilidad la presta cuando se encuentra a una
distancia de ~2 cm del espcimen. Ubique el mejor punto por ensayo y error.
c. Diafragma: est ubicado en el condensador y sirve para regular la cantidad de luz
que llega a la preparacin. Su dimetro se puede variar por medio de una placa
horizontal que se cierra o abre a voluntad del operador.
d. Anillo porta filtro: generalmente se utiliza un filtro de color verde pues as descansa
ms la vista. La longitud de onda modificada con el uso del filtro influye en la resolucin
del microscopio (ver resolucin ms adelante).

Sistema de amplificacin
a. Lentes oculares: son sistemas pticos ubicados en la parte superior del tubo, prximo
al ojo del observador. Los oculares estn formados por dos lentes planas, convexas,
simples o compuestas separadas por un diafragma interno. El lente inferior se llama
lente de campo, su propsito no es aumentar la imagen sino recoger la mayor cantidad
de rayos divergentes que vienen del objetivo. Este tiene su foco en el diafragma y ah la
imagen es aumentada por la parte superior. Los oculares ms usados tienen un
aumento de 6X, 8X, 10X, 16X, 20X.
b. Lentes objetivos: sistemas de lentes acomodadas en el revlver. En el objetivo est
inscrita la magnificacin y la apertura numrica.

Capacidades del microscopio compuesto
1.- El microscopio compuesto tiene la capacidad de magnificar una imagen. El aumento
total es:
Aumento total= aumento objetivo * aumento ocular
Pregunta 1. Calcule el aumento de su microscopio usando todos los objetivos.

2. La resolucin de un microscopio viene dada por la siguiente frmula:
R= (0,61* longitud de onda) / AN
0,61 es una constante, la longitud de onda es la correspondiente al haz de luz que pasa
a travs del espcimen, y AN es la apertura numrica que est dada por:

AN= n (sen alpha)
Donde, n es el ndice de refraccin del medio que atraviesa la luz para llegar al
espcimen y alpha es el ngulo del haz de la luz refractada ms externa que es captada
por el objetivo.










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Ondas electromagnticas


gamma

rayos x

U.V.

luz
visible

I.R.

microondas

radio

Luz Visible


violeta (400 nm)

azul

verde (500 nm)

amarillo

naranjo (600 nm)

rojo (700 nm)


El ndice de refraccin de algunos materiales (con una longitud de onda de aprox. 550
nm)
Material n
Aire 1 atm, 0C 1,00029
Aire 1 atm, 15C 1,00028
Aire 1 atm, 30C 1,00026
Alcohol etlico 1,36
Aceite castor 1,48
Agua 1,33

Pregunta 2 Cul de los dos medios [aire o aceite] resultar en un mejoramiento de la
imagen dada por el microscopio?
Pregunta 3 Cul de todos los componentes de la luz visible resultar en una mejor
resolucin?
Pregunta 4 Cul sistema tendr mejor resolucin: uno con un R=600 nm o uno con un
R=300 nm?

3. El microscopio tambin tiene la capacidad o poder de definicin, es decir de
proporcionar imgenes ntidas, contornos definidos.
4. Y finalmente, tiene poder de penetracin o de visualizacin de los diferentes planos
de una preparacin.

Tipos de microscopios
1. Microscopio simple o de lupa: lente biconvexa capaz de formar una imagen
aumentada de un objeto colocado en su distancia focal. Los rayos luminosos reflejados
en el objeto atraviesan la lente y forman una imagen aumentada, virtual, derecha del
objeto.

Aumento lineal= longitud de la imagen/longitud del objeto.


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2. Microscopio compuesto: definido anteriormente.
3. Microscopio de luz polarizada: microscopio utilizado en el estudio de membranas,
fibras, cristales, ya que puede proporcionar antecedentes de su estructura fsico-
qumica.
4. Microscopio de luz ultravioleta: utiliza luz UV (300 -400 nm), y el poder de
resolucin aumenta. Los lentes pticos deben ser de cuarzo o fluorita y se debe recibir
la imagen en placas fotogrficas o pantallas.
5. Microscopio de fluorescencia: utiliza luz ultravioleta y se basa en la emisin de
radiacin con diferente longitud de onda a la luz que caus la excitacin.
6. Microscopio de contraste de fase: es capaz de diferenciar contornos basado en
los diferentes ndices de refraccin del espcimen.
7. Microscopio de interferencia: es igual que el anterior pero se puede variar el
contraste y seleccionar el ms til para un objeto dado.
8. Microscopio de rayos X: Los rayos X tambin pueden ser usados en la
iluminacin para el estudio de la estructura molecular.
9. Microscopio electrnico: anteriormente explicado.


TCNICA DEL MICROSCOPIO
Todos los microscopios modernos son parafocales y paracentrales. El trmino parafocal
significa que el foco no cambia apreciablemente cuando se cambia el objetivo; slo se
requiere un toque del tornillo micromtrico para volver a ajustar el foco del espcimen.
El trmino paracentral indica que el centro del campo no cambia cuando se cambia el
objetivo. Antes que el objetivo cambie, el objeto debe ser ubicado en el centro.

Siempre comience con el objetivo de menor poder, cuidando que el cubreobjeto se
encuentre en la superficie de arriba del portaobjeto, de esa manera los objetivos de
mayor poder no chocarn con el portaobjeto. Para obtener una mejor imagen, se debe
usar un cubreobjeto, el cual no debe sobrepasar de 0.17-0.18 mm de espesor. Los
objetivos que utilizan aceite de inmersin no son tan sensibles y pueden ser usados sin
el cubreobjeto. Este objetivo trabaja a una distancia menor y pueden impactar el
portaobjeto. Luego de usar el objetivo de aceite de inmersin (el cual nunca debe
usarse sin aceite de inmersin) se debe limpiar el lente cuidadosamente para retirar
restos del aceite.

Debido a que la ptica del microscopio corrige defectos de la visin humana, los lentes
pticos no necesitan ser utilizados a menos que exista un severo astigmatismo. El lente
ocular puede limpiarse con un papel suave o pao suave que no deje pelusas,
humedecido con agua destilada.

PROCEDIMIENTOS
1. Familiarcese con el microscopio que se le asigne. El microscopio siempre se debe
manipular tomndolo con una mano por el tubo y sosteniendo el pi con la palma de la
otra mano. Coloque el microscopio en el mesn de modo que exista una distancia de al
menos 3 cm entre el borde del pi del microscopio y el borde del mesn.

Cul es la magnificacin de cada objetivo y ocular en su microscopio?
Calcule la magnificacin total con cada objetivo.
Cul es la A.N. de cada objetivo?

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2. Distinga las partes del microscopio.


ACTIVIDADES I

1. Enfoque hilos entrecruzados de colores. Con cul objetivo se logra un mayor
poder de penetracin? RECUERDE QUE EL REVLVER SLO SE GIRA EN
UNA DIRECCIN DESDE MENOR A MAYOR OBJETIVO.
2. Enfoque una muestra de mucosa bucal. Qu es lo que puede distinguir?Cmo
es la resolucin del instrumento?