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PRACTICA 6

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO


OBJETIVO
Adiestrar en la preparacin de los diferentes medios de cultivo utilizados
en bacteriologa.
MATERIALES

1 Baln de 500 mL
1 Probeta graduada de 500 mL
1 Trpode
1 Rejilla para mechero
Agar tripticasa soya
Caldo tripticasa soya



1 Baln de 250 mL
1 Esptula
Guantes para objetos calientes
10 tubos 15 x 125 estriles
10 mL de sangre de carnero
10 Placas Petri 100 x 15

PROCEDIMIENTO GENERAL:
Pesado de los ingredientes
El material de vidrio debe estar completamente limpio y libre de
sustancias detergentes.
Para preparar el medio de cultivo a partir de sus ingredientes, estos se
debern pesar exactamente uno a uno y colocarlos en un baln que
tenga el doble de volumen de la cantidad a prepararse.
Para preparar utilizando un medio deshidratado, se debe leer
cuidadosamente las instrucciones del fabricante y tomar exactamente la
cantidad indicada, teniendo cuidado de cerrar hermticamente el frasco
inmediatamente despus de haberlo utilizado.
Agregar el volumen del agua destilada o desmineralizada necesaria,
preferentemente en dos partes, primero la mitad del volumen y se agita
suficientemente para conseguir una suspensin homognea.
Despus se incorpora la cantidad restante, aprovechando de esta para
desprender las partculas de medio de cultivo que pudieran quedarse
adheridas a la pared interna del recipiente.
Disolucin
Si el medio contiene agar o gelatina, es necesario disolverlo con ayuda
del calor. este calentamiento se puede realizar en bao Mara, en un
mechero con la ayuda de una rejilla o utilizando un horno microondas,
hasta que se alcance su completa disolucin, esto se reconoce cuando
al agitar no se adhiere ninguna partcula de agar a la pared interna del
recipiente. No debe olvidarse que todos los medios de cultivo son
sensibles al calentamiento, por este motivo no debe calentarse ms de
lo estrictamente necesario. Los medios de cultivo que no contienen agar
o gelatina son solubles en agua fra.
Es necesario que el medio de cultivo se encuentre al pH indicado, con
los medios comerciales y utilizando agua destilada neutra no es
necesario, pero cuando se prepara por componentes es necesario
realizar la medicin, para lo cual se utiliza un potencimetro o papel
indicador de pH que tenga un ramo til de 4.0 a 8.0. El valor de pH se
ajusta a los intervalos previstos con la adicin de gotas de cido
clorhdrico 1N o hidrxido de sodio 1N.
Preparacin de los medios en tubos
Si se utilizan medios semislidos, estos deben ser distribuidos en los
tubos que se van a utilizar antes de esterilizarlos, despus de ella dejarlo
enfriar en posicin vertical.
Cuando se requiera colocar medios slidos en tubos igualmente se les
debe distribuir en los envases finales y luego de autoclavar dejarlos en
posicin inclinada o semi inclinada.
Esterilizacin
Antes de la esterilizacin es conveniente repartir el medio de cultivo en
porciones pequeas, de ser posible en los recipientes definidos en los
que posteriormente se llevara a cabo el trabajo (a excepcin de las
placas Petri).
Si las instrucciones del fabricante no indican otra cosa, la esterilizacin
se debe llevar a cabo en la auto clave a 121 C durante 15 minutos.
Vertido en Placas
Antes de verter el medio de cultivos en las placas Petri es necesario que
el medio se encuentre a una temperatura de 45 a 55C para evitar que
se formen gotas de agua de condensacin en la tapa de las placas. En
la prctica a esta temperatura es posible sostener el frasco con el medio
con la mano desnuda sin quemarse.
Se agita el recipiente que contiene el medio de cultivo en forma circular
para asegurar que haya una mezcla uniforme y flameando previamente
la boca del recipiente, se agrega el medio de cultivo a las placas Petri
que se encuentran cerca del mechero, aproximadamente 16 a 18 mL a
cada una.
Si se forma burbujas de aire en la superficie del medio, estas se pueden
eliminar flameando rpidamente la superficie con la llama del mechero
de Bunsen.
Se debe dejar que se enfre el medio de las placas a temperatura
ambiente. Si la superficie del medio quedara hmeda, puede colocarse
las placas en estufa a 37 C dejndolas tapas ligeramente abiertas y con
el lado que contiene el medio hacia arriba por 30 minutos.
Luego que el medio est listo, puede colocarse en la refrigeradora si no
se va usar de inmediato. Una placa de cada lote preparado debe
colocarse en la estufa a 37 C para verificar su esterilidad.
Guardar las placas en posicin invertidas en el refrigerador hasta el
momento de usar.
MEDIOS DE CULTIVO
Medio simple
Pesar 8 g de TSA y colocarlos en un matraz.
Aadir 200 mL de agua destilada y mezclar.
Calentar hasta ebullicin, agitando constantemente.
Autoclavar a 121 C ( 15 lb de presin) por 15 minutos.
Sacar de la autoclave y dejar enfriar a 50 C.
Preparar 3 placas y tubos en plano inclinado y semi-inclinado.
Agar sangre
Preparar el medio segn se ha descrito y esterilizarlo.
Al frasco con TSA y enfriarlo a 45 C, se le aade 5 a 10 % de sangre de
carnero desfibrinada y fresca, mezclar bien evitando se formen burbujas.
Verter en placas Petri estriles y dejar enfriar.
Controlar en la incubadora a 37 C por 24 horas.
Agar chocolate
Una vez preparado el agar sangre, y calentarlos en bao Mara a 80C,
agitando suave y constantemente hasta que el medio tome un color
chocolate. El tiempo necesario depende de la sangre que se est
utilizando y el uso que se le va a dar.
Dejar enfriar a 50 C antes de plaquear.
CUESTIONARIO
1. Qu importancia tiene el uso de los medios slidos?
2. Qu sustancia es la encargada de solidificar los medios slidos y de
donde se extrae.
Realice un esquema del procedimiento y dibuje los medios preparados.