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EVALUACIN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA in vivo DE

AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO


FITOPATOGENO Rhizoctonia solani











JULIO CSAR TOVAR CASTAO










PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA AGRICOLA Y VETERINARIA




Bogot D.C
2008








EVALUACIN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA in vivo DE
AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO
FITOPATOGENO Rhizoctonia solani








JULIO CSAR TOVAR CASTAO




TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al titulo de


Microbilogo Agrcola y Veterinario




PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA AGRICOLA Y VETERINARIA


Bogot D.C
Enero 2008





























NOTA DE ADVERTENCIA


Artculo 23 de la Resolucin N
o
13 de Julio de 1946


La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada
contrario al dogma, y a la moral catlica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se ve en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia.








EVALUACIN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA in vivo DE
AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO
FITOPATOGENO Rhizoctonia solani







JULIO CSAR TOVAR CASTAO






_____________________________
JOSE SALVADOR MONTAA MSc.
DIRECTOR.




PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA AGRICOLA Y VETERINARIA


Bogot D.C
Enero 2008






EVALUACIN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA in vivo DE
AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO
FITOPATOGENO Rhizoctonia solani







JULIO CSAR TOVAR CASTAO







______________________________ ________________________
Gerardo Moreno Durn MSc. Luis David Gomez MSc.
JURADO JURADO







PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA AGRICOLA Y VETERINARIA

Bogot D.C
Enero 2008




































A dios por darme la libertad de vivir, A mi madre Mery quien con
su hermoso ejemplo de honestidad y fortaleza alienta siempre mi
corazn, por su amor de madre y comprensin infinita, a mi padre
Julio Csar, por su incondicional apoyo, por sus invaluables
consejos que fortalecieron mi alma y encaminaron mi vida, y a
Anglica Maria y Jairo Humberto por su aliento de hermanos y por
el hermoso regalo de existir en mi vida .



AGRADECIMIENTOS


A Jose salvador Montaa por su calidad humana y enseanzas, por su apoyo y
orientacin constante e incondicional, por su comprensin y por la confianza
brindada para culminar exitosamente este proyecto de mi vida.

Al Doctor Gerardo Moreno por su orientacin y consejos en la realizacin de los
ensayos de la investigacin en la Estacin experimental de la Pontificia
Universidad Javeriana.

Al Laboratorio de Microbiologa ambiental y de suelos por el suministro del
aislamiento T3 y por la colaboracin durante la realizacin de esta
investigacin.

Al CIIA por el suministro del hongo fitopatgeno Rhizoctonia solani para el
desarrollo de la investigacin.

Al LESYHT por el suministro del hongo nativo de Trichoderma T235 para el
desarrollo de la investigacin.

A flor Amrica por el suministro de los esquejes de clavel enraizados y el
aislamiento Trichoderma Tsp5, Tv1, Tc1 y Ti1.


A Claudia Patricia por su aliento y apoyo incondicional.













RESUMEN

Trichoderma es un hongo de gran importancia a nivel agrcola gracias a las
diversas ventajas que ofrece como agente de control biolgico, para la
proteccin de plantas frente al ataque de fitopatgenos causantes de
enfermedades de importancia econmica, como es el caso de los cultivos
hortcolas.

En el presente estudio se evalu la capacidad antagonista de 6 aislamientos de
Trichoderma (T3, Tsp5, Tv1, Tc1, Ti1 y T235), frente a Rhizoctonia. solani, un
fitopatgeno causante de muchas enfermedades en plantas. Se empleo para
ello la tcnica de cultivo dual, donde los aislamientos T235 Y T3 mostraron los
mayores valores de crecimiento libre desde las 24h y los mas altos porcentajes
de inhibicin micelial PIM Curiosamente el aislamiento comercial Tc1 presento
la menor tasas de crecimiento.

Con el fin de confirmar la capacidad antagonista in vivo de los 6 aislamientos
de Trichoderma, se realizaron ensayos en esquejes enraizados de clavel de la
variedad everest susceptibles a R. solani bajo condiciones de invernadero,
Confirmando los resultados obtenidos en los ensayos de antagonismo in vitro,
se observo que el tratamiento silvestre T235 result tener la mejor capacidad
antagonista, reflejado en mayores valores de crecimiento de la parte area, raiz
y peso de los esquejes de clavel, adems de una mejor apariencia de los
mismos y ausencia de signos o sntomas de la enfermedad.

Contrario a lo observado en el ensayo in vitro, donde el aislamiento Tc1 mostro
tasas de crecimiento libre y porcentajes de inhibicin micelial bajos, en los
ensayos de invernadero este aislamiento presento una buena capacidad
antagonista y promocion del crecimiento vegetal indicando que no
necesariamente la capacidad antagonista de un aislamiento observada in Vitro
sea un indicativo de cmo se va a comportar en condiciones de invernadero o
campo

INDICE GENERAL


1. INTRODUCCIN..... 1
2. MARCO TERICO Y ESTADO DEL ARTE 3
2.1 BIOLOGIA DE Trichoderma .. 5
2.2 Mecanismos de biocontrol de Trichoderma.. 6
2.2.1. Biocontrol por competencia. 7
2.2.2 Competencia por nutrientes 8
2.2.3 Antibiosis..8
2.2.4 Micoparasitismo.. 9
2.2.5 Sinergismo.........10
2.2.6 Biofertilizacin y mecanismos de defensa en plantas.. 10
2.2.7 Modificacin de la rizosfera . 10
2.3 Trichoderma en el biocontrol..13
2.4 Trichoderma como biofertilizante.. 15
2.5 Rhizoctonia solana...16
2.5.1 BIOLOGA de Rhizoctonia solani.. 17
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN...20
4. OBJETIVOS..22
4.1. Objetivo General. 22
4.2 Objetivos especficos.. 22
5. MATERIALES Y METODOS. 23
5.1 Diseo de la investigacin.. 23
5.1.1 Ubicacin.23
5.1.2 Microorganismos23
5.1.3. Material vegetal ... 24
5.1.4. Elaboracin del banco de trabajo de aislamientos de Trichoderma... 24
5.1.5 Preparacin del inoculo de aislamientos de Trichoderma .... 25
5.1.6 Preparacin del inculo de Rhizoctonia solani.... 25
5.1.7 Prueba de antagonismo in-vitro .... 26
5.1.8 Elaboracin de la prueba de antagonismo. .26
5.2 Evaluacin de la capacidad antagonista in vivo... 27
5.3 Diseo experimental ... 28
5.4 Variables de estudio. .. 29










6. RESULTADOS Y DISCUSIN.30
6.1 Evaluacin Macro y Microscpica de aislamientos de Trichoderma .. 31
6.2 Crecimiento libre de aislamientos de Trichoderma... 33
6.3 Evaluacin de crecimiento del patgeno R. solani 34
6.4 Actividad antagonista de las cepas de estudio .. 35
6.5 Evaluacin del antagonismo in vivo de aislamientos de Trichoderma 38
7. CONCLUSIONES ...59
8. BIBLIOGRAFIA .. 61








































INDICE DE FIGURAS



Figura 1. Crecimiento en placa de los Aislamientos de Trichoderma T3,
TSP5, Tv1, Tc1, Ti1, y T235 en agar PDA durante 48 horas a 30C....31

Figura 2. Porcentajes de crecimiento libre evaluado a las 24,36,48 y 60 horas
para 6 aislamiento de Trichoderma.34

Figura 3. Curva de Crecimiento de Rhizoctonia solani.. 34

Figura 4. Tcnica de enfrentamiento: A la derecha de cada caja, aislamientos
T3, Tsp5, Tc1, Ti1, Tv1, y T235 de Trichoderma a la izquierda Rhizoctonia
solani. Fotografa tomada 72 horas despus del inicio de la prueba36

Figura 5. Porcentaje de inhibicin micelial de los 6 aislamientos de
Trichoderma a las 24, 48 y 72 horas...37

Figura 6. Aspecto del material vegetal previo a la inoculacin con el Hongo
Rhizoctonia solani. 39

Figura 7. Aspecto del material vegetal luego de la inoculacin en campo con
el patgeno ... 40

Figura 8. Aspecto del material vegetal 7 das despus de la inoculacin con
el patgeno 40

Figura 9. Aspecto del material vegetal 11 das despus de la inoculacin
con el patgeno ... 41

Figura 10. Aspecto del material vegetal 15 das despus de la inoculacin
con el patgeno ..42

Figura 11. Evaluacin de la longitud de la parte area de esquejes de clavel
En respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con
R. solani.. 42

Figura 12. Sntomas iniciales visibles en Tsp5 y Control Rhizoctonia solani...43

Figura 13. Aspecto del material vegetal 19 das despus de la inoculacin
con el patgeno .. 44

Figura 14. Evaluacin de la longitud foliar de esquejes de clavel en respuesta
a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani44

Figura 15. Evaluacin del peso fresco de esquejes de clavel en respuesta
a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani.46

Figura 16. Aspecto del material vegetal 23 das despus de la inoculacin
con el patgeno ...48

Figura 17. Evaluacin del peso seco areo de esquejes de clavel en
respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R.
solani 49

Figura 18. Evaluacin del peso seco raz de esquejes de clavel en respuesta
a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani50

Figura 19. Sintomas visibles de la enfermedad en el material vegetal. 51

Figura 20. Evaluacin del peso seco total de esquejes de clavel en respuesta
a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani... 52

Figura 21. Incidencia de Muerte de esqujes de clavel en los tratamientos
por accin patognica de R. solani .52

Figura 22. Evaluacin de las races en los diferentes tratamientos
durante el desarrollo del ensayo . 54

Figura 23. Evaluacin de la longitud de raiz de esquejes de clavel en
respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R.
solani ... 55

Figura 24. Aspecto del material vegetal 27 das despus de la inoculacin
con el patgeno.. 56







INDICE DE TABLAS




Tabla 1. Tratamientos para la evaluacin de antagonismos in vivo 28

Tabla 2. Evaluacin macroscpica de los 6 Aislamientos de Trichoderma 31

Tabla 3. Resultados obtenidos al evaluar el crecimiento libre de
Trichoderma a las 24, 36, 48 y 60 horas.. 32

Tabla 4. Resultados obtenidos al evaluar el porcentaje de inhibicin
micelial de los 6 aislamientos de Trichoderma a las 24, 48 y 72 horas .. 37





































INTRODUCCIN


El aumento de la poblacin mundial, el deterioro del medio ambiente y calidad
de vida del hombre, son slo algunos de los tantos factores que han motivado
al ser humano a buscar nuevos procesos de produccin agrcola que permitan
cubrir la demanda, cada vez ms creciente, de alimento y materias primas a
travs de procesos donde se aprovechen los recursos naturales de manera
sostenible e integrando as los conceptos de conservacin y desarrollo para la
plena satisfaccin de las necesidades humanas. No obstante las actividades
agrcolas extensivas y la ampliacin de sus fronteras han trado consigo
problemas fitosanitarios en los sistemas naturales, especialmente en el suelo,
que es considerado el soporte principal de la agricultura.

Uno de los aspectos importantes en la produccin agrcola es el control de
plagas y enfermedades; medidas fitosanitarias que minimicen las perdidas
econmicas ocasionadas por diferentes efectos como son los agentes qumicos
o biolgicos.

La utilizacin extensiva de compuestos qumicos para el control de
enfermedades, la emergencia de patgenos resistentes a fungicidas, y el
deterioro en la salud de productores y consumidores, han promovido la
bsqueda de alternativa viables que garanticen una mayor sostenibilidad en la
produccin agrcola, minimizando el impacto sobre el medio ambiente.

Desde 1980 Rhizhobacterias y hongos biocontroladores han sido investigados
como posible alternativa de produccin limpia. El empleo de agentes de control
biolgico (BCAs) ha permitido una reduccin en la aplicacin de fungicidas
qumicos y por lo tanto un control ms eficiente de patgenos causantes de
enfermedades, al ser incorporados a los programas de manejo integrado.

El hongo Trichoderma sp es un eficiente controlador biolgico que est siendo
ampliamente usado en agricultura como agente de biocontrol debido a su
habilidad para colonizar sustratos rpidamente, inducir resistencia sistmica
adquirida en plantas, promover el crecimiento vegetal y poseer actividad
antagonista contra un amplio rango de hongos patgenos. El efecto inhibitorio
de sus antibiticos y la degradacin de componentes de la pared celular de
patgenos de plantas, es citado como aspecto importante de su actividad
antagonista.

Las especies de Trichoderma tienen una gran actividad antagonista sobre
patgenos como Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Pythium ultimum y
Fusarium oxisporum, causantes de enfermedades importantes en cultivos de
rbano, clavel, crisantemo, frjol, cafeto, haba, tomate y ctricos entre otros.
Durante los ltimos aos, varios investigadores y algunas empresas han
mostrado gran inters en estudiar el potencial de Trichoderma como
controlador biolgico de patgenos de suelo.

En este contexto, el presente trabajo evalu bajo condiciones de invernadero,
la capacidad antagonista de aislamientos nativos y comerciales de Trichoderma
spp frente al hongo fitopatgeno Rhizoctonia solani. Los resultados de esta
investigacin ayudaron en la obtencin de informacin tanto en laboratorio
como en campo sobre la accin potencial biocontroladora de este gnero.


2. MARCO TERICO Y ESTADO DEL ARTE

El control biolgico de enfermedades en plantas o insectos con agentes
microbianos es una posibilidad atractiva, si se tiene en cuenta que los costos
respecto al uso de otras prcticas de control tradicionales pueden resultar
menores y de mayor eficiencia, pues, aunque los antagonistas pueden actuar
en forma ms lenta y en menor escala, su accin puede ser ms estable y
duradera que el control qumico (Papavizas y Lewis, et al.1984).

El conocimiento concerniente al comportamiento de algunos hongos como
antagonistas es esencial para su efectivo uso, debido a que pueden actuar
contra organismos blanco de varias formas constituyndose en una alternativa
biolgica al empleo de compuestos qumicos convencionales, considerados
nocivos para el medio ambiente (Jeffries y Young, 1994).

Mediante el uso de hongos y bacterias antagonistas se han podido conocer
estrategias con mayor potencial para el control de enfermedades ocasionadas
por patgenos del suelo (Cook y Baker, 1983). Muchas especies saprofitas
como Trichoderma harzianum., Gliocladium spp., y Verticillium lecanii son
antagonistas de varios organismos plaga, incluyendo patgenos de plantas,
malezas e insectos (Gonzlez et al., 1998). De otra parte sobreviven durante
periodos relativamente largos como formas de resistencia, haciendo
innecesaria la reinfeccin continua con el agente biocontrolador (Wainwright et
al., 1995)

Las especies de Trichoderma han sido investigadas como agentes de control
biolgico (BCAs) de enfermedades fngicas por cerca de 70 aos (Hjeljord y
Tronsmo, 1998), pero es solo recientemente que las cepas han comenzado ha
ser comercialmente aprovechables. El xito de las cepas de Trichoderma como
(BCAs) es debido a su alta capacidad reproductiva, habilidad para sobrevivir
bajo condiciones ambientales desfavorables, eficiencia en la utilizacin de
nutrientes, capacidad para modificar la rizsfera, fuerte agresividad contra
hongos fitopatgenos y eficiencia en promocin de crecimiento en plantas e
induccin de mecanismos de defensa (Bentez y Rincn 2004). Estas
propiedades han hecho que Trichoderma se presente en cualquier hbitat en
una alta proporcin.

Las diferentes especies de Trichoderma se caracterizan por tener un
crecimiento micelial rpido y una abundante produccin de esporas que ayuda
a la colonizacin de diversos sustratos y del suelo. As mismo pueden producir
enzimas extracelulares, antibiticos antifngicos, ser competidores contra
hongos patgenos, promover el crecimiento en plantas, e inducir resistencia
(Zimand et al., 1996) Adems compiten muy bien por nutrientes, son
micoparasitos muy activos y son competidoras muy eficientes de la rizosfera
(Papavizas et al., 1985; Ahmad y Baker, 1987).

Liu y Baker en 1980 y Chet y colaboradores en 1987, demostraron que
especies de Trichoderma harzianum y T. hamatum fueron especialmente
eficientes en el control de patgenos como Rhizoctonia solani.

Varios aislamientos de Trichoderma harzianum se han utilizado exitosamente
en el control de algunas enfermedades ocasionadas por Rhizoctonia solani
como: damping off en tomate (Rodrguez, 2002), pudriciones radiculares en
plantas de frjol (Gutirrez et al., 2006), podredumbre negra de la raz en fresa
(Baldarrago,1999), pudricin del tallo en clavel ( Garca et al.,1998),
pudrimiento de las races en habichuela ( Cardoso, et al., 1987 ) y mal del
talluelo o damping off en el cafeto (Castro et al., 2005 ).

Adems, se ha encontrado que algunas especies de Trichoderma,
especialmente Trichoderma harzianum tienen el potencial de aumentar el
crecimiento y desarrollo de las plantas; esto parece deberse a la inhibicin de
patgenos menores y a la produccin de factores que estimulan el crecimiento
de la planta y favorecen la toma de nutrientes (Widham et al., 1986; Chang et
al., 1986; Chet, 1987; Baker, 1990).


Los procedimientos por los cules se promueve la actividad de biocontrol
contra fitopatgenos fngicos se fundamenta sobre la activacin de mltiples
mecanismos entre los que se encuentran: la inactivacin de las enzimas del
patgeno, la competencia por el espacio y nutrientes, la secrecin de
metabolitos secundarios con efecto antibitico y el ataque directo a otro hongo
o micoparasitismo. Adems indirectamente Trichoderma, es capaz de proteger
a la planta del patgeno, mediante la induccin de sus sistemas de defensa (
Benitez, 2004 ).


2.1 BIOLOGIA DE Trichoderma spp

Trichoderma sp, es un habitante natural del suelo, caracterizado por un
comportamiento saprfito o parsito, propiedades que benefician su actividad
antagnica. (Camargo, 2005). Es considerado un colonizador secundario dado
su frecuente aislamiento a partir de materia orgnica en descomposicin,
tambin es aislado comnmente a partir de la superficie de races de varias
plantas de madera y parasitando estructuras de diferentes hongos patgenos,
debido a la competencia por nutrientes y micoparasitismo (Camargo et al.,
2005).

Las colonias de Trichoderma presentan crecimiento rpido, que va formando
una colonia delgada de sobre la superficie del agar, debido a la conidiacin que
presenta a travs de su desarrollo. Las colonias al comienzo son lisas o casi
transparentes y algunas veces blancas, posteriormente se presentan penachos
blancos y algodonosos, de micelio blanco, conformando una red densa,
responsable del pigmento caracterstico. (Barnett, y Hunter, 1982).

Las especies del gnero Trichoderma presentan conidiforos complejos y
altamente ramificados en forma piramidal o cnica dando origen a esterigmas,
con extremos ahusados. Al microscopio las filides se observan ms estrechas
en la base que en la parte superior, permitiendo una buena correlacin entre el
sistema de ramificacin del conidiforo y la disposicin de estas. (Barnett, y
Hunter, 1982).
Microscpicamente muchas especies del gnero crecen rpidamente en
cultivos artificiales y produce un largo nmero de pequeas conidias verdes o
blancas de clulas conidiogenas situadas al final de conidioforos extensamente
ramificados. Esta caracterstica permite una relativa fcil identificacin de
Trichoderma como gnero, pero el concepto de especies son difciles de
interpretar, y all hay una considerable confusin sobre la aplicacin de
nombres especficos. Rifai dividi el gnero Trichoderma en nueve especies
sobre la base de caractersticas morfolgicas. Bisset, revis el gnero y
adems incluy algunas Hypocrea anamorfas en el gnero, resultando en el
establecimiento de cinco nuevas secciones (Hermosa et al., 2000).

La abundancia de Trichoderma spp en varios suelos, junto con su habilidad
para degradar varios sustratos orgnicos, su versatilidad metablica y su
resistencia a inhibidores microbianos, sugiere que este hongo puede poseer la
habilidad para sobrevivir en varios nichos ecolgicos, dependiendo de las
condiciones que prevalezcan y sobre las especies involucradas. (Riegel y
Nielsen, 1996).

Trichoderma spp se encuentra clasificado segn Alexopulus et al., 1996 como:

Divisin: Eumycota
Subdivisin: Deuteromycotina
Clase: Hypomicetes
Orden: Hyphales
Familia: Monilaceae
Gnero: Trichoderma
Especie: Harzianum, hamatum, viride, longibranchiatum, entre otras.


2.2 Mecanismos de biocontrol de Trichoderma

El entendimiento de la diversidad gentica de cada cepa dentro de las especies
de Trichoderma y sus mecanismos de biocontrol ha permitido mejorar la
aplicacin de las diferentes cepas. Estos mecanismos son diversos, complejos
y pueden actuar sinergicamente para lograr el control de enfermedades
(Howell et al., 2003).

Las diferentes especies de Trichoderma ejercen el biocontrol de una manera
indirecta bien sea por competencia por nutrientes o espacio, antibiosis
(produccin de metabolitos), modificando las condiciones ambientales o
mediante la produccin de sustancias promotoras del crecimiento vegetal y de
una forma directa por micoparasitismo (Bentez, 2004).

Algunas especies del gnero Trichoderma son muy comunes en diversos
suelos, principalmente en suelos cidos y ricos en materia orgnica. Estas
especies son fciles de aislar, de cultivar y de propagar en diversos sustratos y
la mayora presentan un buen micoparasitismo (Bentez, 2004).

A pesar de la cantidad creciente de investigaciones dedicadas a estudiar la
actividad antimicrobial de Trichoderma spp in vitro, el conocimiento de los
mecanismos exactos responsables de la reduccin en la incidencia de las
enfermedades, despus de la aplicacin de Trichoderma spp. es an
insuficiente. (Yedidia et al., 1999).


2.2.1. Biocontrol por competencia

Fungistasis. Un buen antagonista es capaz de superar el efecto fungisttico
que resulta de la presencia de diferentes metabolitos producidos por otras
especies, incluyendo plantas, y sobrevive bajo condiciones adversas o
competitivas (Bentez, 2004).

Las cepas de Trichoderma crecen rpidamente cuando se inoculan en suelo ya
que son naturalmente resistentes a muchos compuestos txicos incluyendo
herbicidas, fungicidas y pesticidas tales como DDT, y compuestos fenlicos
(Chet,1997) adems recuperan muy rpidamente despus de la adicin de
dosis subletales de algunos de estos compuestos.
La resistencia a compuestos txicos puede estar asociada con la presencia en
cepas de Trichoderma de sistemas de transporte ABC (Harman et al., 2004).
Por esta razn son muy eficientes en el control de muchos patgenos como R.
solani, Pythium ultimum o Sclerotium rolfsii, cuando se aplica en combinacin
con fungicidas qumicos como el bromuro de metilo, benomyl, captan u otros
qumicos (Vyas et al., 1995).


2.2.2 Competencia por nutrientes

La inanicin es la causa mas comn de muerte para microorganismos, la
competencia por nutrientes limitantes, resulta en un control biolgico de hongos
fitopatgenos, antagonistas y micoparasitos (Chet et al., 1997).

Un ejemplo claro de este mecanismo de accin se encuentra representado en
hongos filamentosos, donde la toma de hierro es esencial para la viabilidad de
los mismos. Bajo condiciones de deficiencias de hierro, el hongo excreta
agentes quelantes especficos de bajo peso molecular llamados sideroforos,
que le permiten tomar el hierro en forma reducida (Eisendle et al., 2004), citado
por (Chvez, 2004).


2.2.3 Antibiosis

La antibiosis ocurre durante la interaccin de los compuestos difusibles de bajo
peso molecular o antibiticos producidos por cepas de Trichoderma que
inhiben el crecimiento de otros microorganismos. Adems las cepas de
Trichoderma producen metabolitos txicos voltiles y no voltiles que impiden
colonizacin por microorgansimos antagonizados; entre estos metabolitos, la
produccin de cido harzianico, alameticinas, tricholinas, peptaiboiles,
antibiticos, 6-penthyl pirona, massoilactona, viridina, gliovirina, glisoperonas,
cido heptldico y otros estn siendo descritos (Howell et al., 1998).


2.2.4 Micoparasitismo

El ataque directo de un hongo a otro es un proceso muy complejo que involucra
eventos secuenciales, incluye reconocimiento, ataque y penetracin
subsecuente y muerte al husped. Trichoderma spp puede ejercer control
directo por el rango de parasitismo de hongo, detectando otros hongos y
creciendo sobre el. (Bentez et al., 2004).

El proceso de micoparasitismo ejercido por Trichoderma se produce en varias
etapas sucesivas. Comienza por el crecimiento quimiotrfico de Trichoderma
hacia el hospedador, estimulado por molculas procedentes del mismo, de
naturaleza desconocida. Las nicas que se han detectado hasta ahora son
aminocidos y azcares, por lo que no cabe esperar que la induccin sea
especfica del hospedador (Chet et al., 1981).

Los hongos del gnero Trichoderma se adhieren con carbohidratos unidos a
lectinas en la pared celular del patgeno. Una vez Trichoderma es adherido se
enrosca alrededor del patgeno y forma el apresorio (Howell, 2003). El paso
siguiente consiste de la produccin de CWDEs, peptaiboles y enzimas
hidrolticas CWDEs (Howell, 2003), lo cual facilita la entrada de la hifa de
Trichoderma dentro del lumen del hongo parasitado y la asimilacin del
contenido de la pared celular. (Bentez et al., 2004).

Degradacin de la pared celular: La lisis es el mecanismo en el cual
intervienen las enzimas hidrolticas producidas por los microorganismos
antagonistas como factores biocontroladores. Se ha observado que
Trichoderma spp, produce celulasas, glucanasas y quitinasas que degradan in
vitro la celulosa de las paredes celulares de microorganismos oomycetes y la
quitina y B-1,3 glucanos de las paredes celulares de microorganismos
Deuteromycetes como Gliocladium spp (Elad et al., 1982).

El sistema quitinoltico de Trichoderma comprende muchas enzimas y la lista
de estos componentes inicia con la actualizacin de nuevas enzimas y genes
reportados. Las quitinasas son divididas dentro de 1,4--
acetylglucosaminidasas (glucanasas ), endoquitinasas y exoquitinasas. De
igual forma las (glucanasas) -1,3-glucanasas, as como las quitinasas actan
sinrgicamente, e inhiben la germinacin de la espora y el crecimiento de
algunos patgenos (Bentez, 1998; El-Katatny, 2001).

Se ha mostrado que 1,3 glucanasas inhiben la germinacin de esporas o el
crecimiento de patgenos en cooperacin sinrgica con quitinasas (Bentez, et
al., 1998) y antibiticos (Harman et al., 2004).


2.2.5 Sinergismo

El sinergismo entre la actividad de enzimas lticas y antibiticos, es la mejor
estrategia para ser un buen controlador, adems de abrir el campo para
posibles cepas transformantes que puedan producir las diferentes enzimas
logrando un sinergismo que sea relevante (Bentez, 2004).


2.2.6 Biofertilizacin y mecanismos de defensa en plantas

2.2.7 Modificacin de la rizosfera

La habilidad para desarrollarse sobre o amplios rangos de condiciones
externas de pH es un importante componente del complejo conjunto de
caractersticas que Trichoderma, mejor adaptado a suelos cidos, encuentra
durante esta interaccin con otros organismos. (Bentez et al., 2004).

Algunas cepas de Trichoderma harzianum controlan estrictamente su pH
externo, asegurando valores ptimos para su propias enzimas secretadas
(Bentez et al., 2004). As mismo Diferentes protenas extracelulares son
sintetizadas a diferentes valores de pH.

Las cepas de Trichoderma estn siempre asociadas con races de plantas y
ecosistemas de races. Algunos autores han definido las cepas de Trichoderma
como plantas simbiontes oportunistas, organismos avirulentos, capaces de
colonizar races de plantas por mecanismos similares a los de los hongos
micorrizales y producir compuestos que estimulan el crecimiento como
citoquininas, zeatinas y giberilinas (GA3) relacionadas con GA3; as como
promover mecanismos de defensa en plantas. (Harman et al., 2004).

La colonizacin implica la habilidad para adherirse y reconocer races, penetrar
y resistir metabolitos txicos producidos en respuesta a la invasin de
organismos extraos, sean o no patgenos. (Bentez, et al., 2004). As mismo
Trichoderma frecuentemente incrementa el crecimiento de races y su
desarrollo, productividad del cultivo, resistencia a estrs abitico y la toma y
uso de nutrientes (Arora y Elander, 1992) citado por Bentez 2004). La
productividad de cultivos en campo puede incrementarse cerca del 300%
despus de la adicin de Trichoderma hamatum o Trichoderma koningii
(Bentez, 2004).

Se ha observado que muchas cepas de Trichoderma son capaces de inducir
resistencia sistmica en las plantas, ya que aplicadas en la rizosfera, producen
proteccin contra patgenos del suelo o foliares. Esta resistencia viene
acompaada en muchos casos de un aumento de actividades peroxidasa y
quitinasas en zonas distantes de la raz (Yedidia et al., 1999).

Las cepas de Trichoderma son generalmente ms resistentes a compuestos
como fitoalexinas, flavonoides y terpenoides, derivados fenlicos, agliconas
que muchos hongos: sin embargo su habilidad a colonizar fuertemente races
de plantas depende de la capacidad de cada cepa a tolerar estos. Esta
resistencia es considerada un requerimiento esencial para la colonizacin de
plantas, siendo asociada con la presencia de sistemas de transporte ABC en
cepas de Trichoderma (Harman et al., 2004).

Algunas especies de Trichoderma han sido reportadas como estimuladoras de
crecimiento en especies tales como clavel, crisantemo, pepino, berenjena,
arveja, rbano, tabaco, tomate, lechuga, zanahoria, papa, algodn, frjol y
pastos ornamentales (www.soil-fertility.com ).
Algunos autores han demostrado el efecto inductor en el crecimiento y
desarrollo de las plantas por parte de Trichoderma spp., es as como (Yossen
et al.2003), citado por (Castro y Rivillas 2006), demostraron que al incorporar T.
harzianum (TL 98) en germinadores de lechuga, adems de reducir el dao
causado por R. solani, el antagonista promovi el crecimiento de las plantas.
Igualmente, (Inbar, et al 1994), citado por ( Castro y Rivillas 2006), observaron
que aplicando T. harzianum en semilleros de pepino y de pimentn se
increment significativamente el crecimiento de las plntulas, comparadas con
aquellas que no recibieron la adicin del hongo antagonista. Estos trabajos
muestran el beneficio de aplicar hongos, como Trichoderma, desde la etapa de
germinador para obtener plantas vigorosas y sanas.

De la misma forma Se han realizado algunos estudios preliminares con
Trichoderma para la estimulacin del crecimiento sobre plantas de frjol, donde
los aislamientos seleccionados estimularon la germinacin y presentaron un
aumento en la altura de las plantas entre el 70 y 80%, y una ganancia en peso
de un 60% aproximadamente, lo que supone un incremento en los
rendimientos de este cultivo. Un ensayo similar realizado sobre pasto Estrella
demostr que la ganancia en peso seco con algunos aislamientos es cercana
al 23%, en longitud de las races y de estolones este incremento fue de un
30%. (www.soil-fertility.com ).

Se han evaluado parmetros de crecimiento y desarrollo del control de la
enfermedad de R. solani por parte de Trichoderma spp. Estudios desarrollados
(Rincn et al., 1991) demostraron el efecto antagnico de Trichoderma sobre
R. solani en semilleros de caf, obteniendo una reduccin de 55% en la
incidencia de la enfermedad cuando inocularon el sustrato con el hongo
antagonista (Trichoderma 1644).

2.3 Trichoderma en el biocontrol

El biocontrol por parte de trichoderma en el manejo integrado de enfermedades
en campo, causadas por hongos fitopatgenos, ha sido demostrada en su
capacidad antagnica frente a agentes causales de pudriciones radiculares y
marchitamientos como Rhizoctonia solani, Sarocladium sp y Sclerotinia sp en
Arroz, Flores, Papa, Hortalizas, Frutales y Frjol, Fusarium oxysporum en
Clavel, Botrytis cinerea en Flores, Colletotrichum gloesporioides, causante de
Antracnosis en Tomate de rbol, Fresa, Frjol y Flores; as como la reduccin
en la incidencia de la enfermedad llamada pata prieta , ocasionada por
Phytopthora nicotianae var. nicotianae.

En 1990, Lewis, report que bajo condiciones de invernadero y de campo T.
viride ejerca un control biolgico promisorio sobre Rhizoctonia solani en
cultivos de tomate.

Por su parte, Salmando en 1996, report que la tcnica de pregerminacin
controlada de semillas de Tomate Variedad chonto, en presencia de T. koningii,
es una alternativa promisoria para contrarestar el efecto de R. solani en
condiciones de semillero, mostrando porcentajes de proteccin del 70 %,
mientras que el tratamiento que consista en semillas no pregerminadas y
tratadas con T. koningii present slo un 15 % de proteccin.

As mismo Ochoa en 1996 determin en condiciones de invernadero que la
utilizacin individual y combinada de T. hamatum, P.fluorescens y
Sterptomyces coelicolor, ofreca un alto nivel de proteccin a claveles variedad
Nora. Barlo contra Fusarium oxysporum.

Trichoderma probablemente sea el hongo beneficioso, ms verstil y
polifactico que abunda en los suelos. No se conoce que dicho microorganismo
sea patgeno de ninguna planta. Puede desarrollarse en una amplia gama de
sustratos, lo cual facilita su produccin masiva para uso en la agricultura. Su
gran tolerancia a condiciones ambientales extremas y hbitat, donde los
hongos son causantes de diversas enfermedades, le permiten ser eficiente
agente de control; de igual forma pueden sobrevivir en medios con contenidos
significativos de pesticidas y otros qumicos. Adems su gran variabilidad se
constituye en un reservorio de posibilidades de control biolgico bajo diferentes
sistemas de produccin y cultivos ( www.infojardin.com/foro/showthread.php).
Cuando se aplica Trichoderma en campo se deben tener en cuanta varios
aspectos importantes que permitan su adecuada expresin, que se relacionan
con la interaccin planta hospedante fitopatgeno susceptible ambiente
favorable (Temperatura del suelo, humedad, presencia de oxigeno, pH),
Condiciones del suelo (estructura, contenido de materia orgnica y nutrientes) y
tiempo ( Villegas, 2005).

Asi mismo existen algunos principios bsicos de vital importancia para el xito
del control biolgico con ciertos hongos como Trichoderma. Esto incluye la
importancia de un propgalo efectivo ( jven, hifa de activo crecimiento ) en
tenencia a una base de alimento, edad de la preparacin, habilidad de los
hongos de biocontrol a invadir y tener una base de alimento ocupada por el
patgeno; la consideracin de la cantidad de preparacin y el tiempo de
aplicacin, y prevalencia de las condiciones ambientales, durante y despus de
la aplicacin. ( Lewis and Papavizas ). Varios Autores han realizado estudios
tendientes a evaluar la capacidad antagonista in vivo de Trichoderma frente a
R. solani. Rodriguez, en 2002 evalu la eficiente accin inhibitoria de la
utilizacin de cepas de Trichoderma y Pseudomonas Como antagonistas
contra R.solani, mediante pruebas in vitro y comparadas con su capacidad
biocontroladora en un cultivo de tomate en invernadero.

La adicin de hongos tales como Trichoderma y gliocladium antes de realizar la
siembra, en suelos infestados por R. solani, disminuye de manera considerable
la incidencia y severidad de las enfermedades que ocasiona este patgeno en
la mayora de los cultivos como la zanahoria, el frijol, el tomate, el clavel y la
papa, en los cuales se ha intentado controlar el hongo. Al parecer el mtodo da
buenos resultados en el aumento de las poblaciones de Trichoderma y otros
microorganismos que son antagonistas de Rhizoctonia solani y, quiz la
liberacin de algunos compuestos qumicos fungitxicos ( Agrios G, et
al.,1998). De la misma manera Cook y Baker distinguen varias especies de
Trichoderma: T hamatum, T viride, T harzianum, T. koningue y T. polyspermun,
en el control de hongos fitopatgenos ( Chet I, et al.,1980).


2.4 Trichoderma como biofertilizante

En Colombia se han realizado algunos estudios enfocados a la optimizacin de
parmetros para la produccin de Trichoderma. Chvez, (2006) evalu la
produccin de este hongo mediante fermentacin slida, lquida o bifsica
empleando diferentes sustratos como arroz, avena, soya, trigo, cebada, entre
otros y diferentes condiciones de temperatura y fotoperodo. Los resultados
indicaron que el proceso de fermentacin slida empleando como sustrato
arrozagua destilada a 25C y la exposicin constante a la luz permiti mayor
recuperacin (45x10
18
conidios/mL), con 88 y 96% de germinacin a las 18 y
24 horas respectivamente y una pureza estimada de 92.1%.

Este proceso representa una alternativa viable para produccin tanto industrial
como artesanal de un inoculante biolgico de buena calidad a base del
Trichoderma; con buenos resultados en campo. Estudios preliminares indican
que al aplicar este hongo a las semillas, sustrato en vivero, plantas en vivero,
recin transplantadas o plantas establecidas, produce efectos positivos en el
crecimiento y desarrollo de las mismas.

Algunas industrias agrcolas y biolgicas en Colombia como: agrobiolgicos del
campo Ltda, biolgicos y ecolgicos de Colombia y Orius biotecnologa entre
otros, han desarrollado productos biolgicos para el agro, como biofertilizantes
y biocontroladores de organismos fitopatgenos. Cepas especficas a base de
hongos como Trichoderma harzianum (exporaxx wp) desarrollada por Orius
Biotecnologa, as como (Fitoripen wp) a base del hongo Trichoderma spp
como agente microbial, desarrollado por saber agrobiolgicos y Trichode wp de
Orius biotecnologa, han permitido la activacin de mecanismos antagonistas
frente a hongos fitopatgenos que afectan los cultivos de importancia agrcola.

Ahora bien, el conocimiento de estos nuevos biofertilizantes a base de
concentracin de esporas a partir del hongo Trichoderma spp ha permitido el
desarrollo de estudios in vivo para la induccin de respuesta en plantas e
incremento en la produccin de cultivos.

Brunner y Zeilinger, en 2005), en estudios in vivo, demostraron los progresos
del hongo de biocontrol Trichoderma atroviridae para la induccin de
respuestas de defensa en plantas de frjol, frente al patgeno foliar B. cinerea,
conteniendo 1x10
8
esporas/ml tipo salvaje.

Reynoso y colaboradores (2006), demostraron en estudios de biocontrol bajo
condiciones de cultivo, que la aplicacin de diferentes concentraciones de
inculo de T. harzianum (10
2
y 10
6
), produjo un notable incremento en la
cosecha de man. Se encontr un incremento en el porcentaje de 45 a 76% en
zonas naturalmente infestadas y de 57 a 95% en suelos artificialmente
infestados, cuando las semillas fueron tratadas con T. harzianum 10
6
.


2.5 Rhizoctonia solani

Es uno de los hongos ms importantes reconocido como patgeno de plantas.
Por lo general causa enfermedades en una amplia gama de hospederos,
afectando tanto partes areas como subterrneas. Usualmente se le conoce
como hongo estril, debido a que durante muchos aos se pens que era
incapaz de producir algn tipo de espora, ya fuera sexual o asexual.
Actualmente se sabe que Rhizoctonia solani produce basidiosporas que hacen
que esta especie sea un basidiomiceto al que se le denomin Thanatephorus
cucumeris (Agrios, 2004). Un considerable nmero de aislamientos de
Rhizoctonia son saprtrofos, aunque otros son micorrizales sobre orqudeas u
otras plantas.


2.5.1 Biologa de Rhizoctonia solani

Rhizoctonia solani segn Agrios (2004) ha sido clasificado como:

Hongo superior
Subdivisin: Deuteromycotina
Clase: Agonomycetes
Orden: Agonomycetales (Myceliales)
Gnero: Rhizoctonia

La especie R solani, fue definida por Candolle (1815), Sobre la base de la
produccin de esclerocios de textura uniforme con hilos hifales emanantes de
estos, y la asociacin del micelio con races de plantas vivas. (Sneh, et al,
1991). Es la especie ms conocida dentro del gnero Rhizoctonia sp. Fue
originalmente descrito en 1858 por Julis Kuhn (Barnett y Hunter 1982).

Dentro de las caractersticas que permiten clasificar taxonomicamente
aislamientos de R.solani son: tendencia de pigmentacin hifal caf, ramificacin
prxima al septo distal de clulas en hifas vegetativas jvenes, estrechamiento
de hifa y formacin de septos a una distancia corta del punto de origen a la
ramificacin hifal, Septo dolpora y clulas multinucleadas en hifa vegetativa
joven (Parmeter y Whitney, 1970).

El anamorfo es denominado Rhizoctonia solani y su teleomorfo Thanatephorus
cucumeris, es un basidiomiceto no productor de esporas asexuales (conidios) y
productor ocasional de basidiosporas (esporas sexuales). En la naturaleza se
reproduce asexualmente y se encuentra en forma de micelio vegetativo y/o
esclerocios (Agrios, 2004). Macroscpicamente las colonias jvenes de
Rhizoctonia solani se caracterizan por ser incoloras, algodonosas y planas
aunque dependiendo de la especie, pueden llegar a tornarse cremosas o
amarillentas. Al producirse la maduracin, la colonia toma una coloracin
marrn (Ceresini et al., 1999).

Microscpicamente el micelio est constituido de hifas fraccionadas en clulas
individuales polinucleadas y comunicadas entre si a travs de un poro septal
que permite el movimiento del citoplasma, las mitocondrias y los ncleos de
una clula a otra (Ceresini et al., 1999). Caractersticas tales como clulas
moniliales, esclerocio, hifas ms grandes a 5 um en dimetro, rpida tasa de
crecimiento y patogenicidad estn usualmente presentes. Aunque puedan estar
ausentes en algunos aislamientos.

Este hongo, parasiticamente no especializado forma escleorcios en el suelo
sobrevive por largos periodos de tiempo en ausencia de hospederos, mediante
tales estructuras o por medio de hifas de pared gruesa sobre residuos de
plantas; al conservar estas caractersticas de patgeno no especializado, es un
buen competidor saproftico, puede colonizar muchos sustratos y puede tolerar
cambios amplios de ambiente; esta condicin le favorece tanto para su
supervivencia como para su accin patognica sobre tejidos juveniles o en
stress fisiolgico inadecuado (Gonzlez et al., 1989 ; Contreras et al., 1996).

La especie fitopatgena Rhizoctonia solani ocasiona perdidas importantes, en
la mayora de plantas perennes y anuales, incluyendo casi todos los cultivos
hortcolas que se desarrollan dentro o sobre el suelo. Entre las enfermedades
ms comunes causadas por este fitopatgeno est el llamado damping-off o
cada de las plntulas, como consecuencia del estrangulamiento y necrosis del
tallo a nivel de cuello en plntulas recin emergidas. Produce una reduccin
Significativa del vigor de las plantas y de la produccin de tubrculos en
cultivos de papa (Cedeo, 2001).

En clavel el marchitamiento lento fungoso causado por una raza de R. solani
produce una enfermedad que se caracteriza por la reduccin en el crecimiento
de la planta y la presencia de tallos y brotes delgados, los cuales se amarillan
posteriormente y la planta se marchita y muere. Al hacer un corte del tallo, se
observa a nivel vascular una coloracin marrn.
http://www.ica.gov.co/publicaciones/plagas/clavel/endemica/clavel35.htm

Para entender la relacin que se establece entre patgenos y antagonistas, es
necesario realizar estudios in vivo e in Vitro , que permitan por una lado
conocer a fondo los aspectos biolgicos, bioqumicos y ecolgicos de la
interaccin y por otro lado monitorear la actividad de los microorganismos
biocontroladores en campo para enfocar de manera ms precisa el control y
manejo de la enfermedad.





3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN


3.1 Formulacin del problema

El incremento de enfermedades en plantas, causadas por un gran nmero de
hongos fitopatgenos ha obligado a los agricultores a la aplicacin de grandes
cantidades de fungicidas e insecticidas qumicos durante dcadas. Este uso
plantea una grave amenaza para la salud de los humanos y el medio ambiente,
provocando la aparicin de organismos resistentes a estos productos. La
accin nociva de fungicidas qumicos sobre los cultivos agrcolas ha originado
entre otros problemas resistencias de plagas y patgenos, contaminacin de
los suelos y aguas de riego, de los animales y de los mismos seres humanos.


3.2 Justificacin

La utilizacin de fungicidas qumicos durante dcadas para el control de
enfermedades en cultivos agrcolas ha hecho inminente la bsqueda de
alternativas amigables, que contribuyan a minimizar el impacto negativo sobre
el medio ambiente. Este deterioro ambiental en el tiempo ha llevado al hombre
a buscar metodologas de control, que contribuyan en la prevencin o
reduccin de los efectos a corto o a mediano plazo de estos compuestos frente
al dao ambiental.

El desarrollo basado en la conservacin, debe proteger la estructura, funcin y
la diversidad biolgica de los sistemas naturales agrcolas, buscando mantener
un equilibrio y un control de nuestro medio ambiente y los recursos naturales.
Uno de estos recursos es el suelo que se constituye en el principal soporte de
la agricultura. El manejo biolgico y controlado de los cultivos, se presenta
como una alternativa ecolgica y eficaz frente a los numerosos y crecientes
problemas causados por microorganismos patgenos presentes en nuestro
agro ecosistema.

Los hongos biocontroladores como Trichoderma spp ofrecen buenas
posibilidades como antagonista de hongos patgenos de plantas, actuando
como hiperparasitos competitivos, de la misma manera debido a su ubicuidad,
facilidad de aislamiento y cultivo, crecimiento rpido en gran nmero de
sustratos esta presente en todos los suelos agrcolas; sumado a la resistencia y
persistencia de estos hongos en cultivos y cosechas, promueve una continua y
progresiva investigacin y anlisis en estudios de control biolgico de
enfermedades en plantas.

En este contexto el presente trabajo evalu la capacidad biocontroladora de
algunos aislamientos nativos y comerciales de Trichodema spp. Frente al
hongo fitopatgeno R. solani bajo condiciones de invernadero. Los resultados
del presente estudio permitirn apoyar los programas de manejo integrado de
plagas empleando tecnologas limpias y amigables con el medio ambiente.



















4. OBJETIVOS


4.1. Objetivo General

Evaluar la capacidad antagonista in vivo de 6 aislamientos Trichoderma
frente al hongo fitopatgeno Rhizoctonia solani


4.2 Objetivos especficos

Confirmar la patogenicidad de un aislamiento de R solani sobre plantas de
clavel.

Obtener inculos de 6 aislamientos de Trichoderma y confirmar su viabilidad y
pureza

Verificar la capacidad antagonista de 6 aislamientos de Trichoderma sobre el
fitopatgeno R solani bajo condiciones in vitro

Evaluar en condiciones de invernadero la capacidad antagonista de 6
aislamientos de Trichoderma sobre el hongo patgeno Rhizoctonia solani.

Comparar los resultados obtenidos en las pruebas de antagonismo in vivo con
resultados obtenidos en condiciones in vitro









5. MATERIALES Y METODOS


5.1 Diseo de la investigacin:

5.1.1 Ubicacin

Este proyecto se desarroll en la estacin experimental San Francisco Javier
ubicada en la vereda el Mortio, municipio de Cogua Cundinamarca 61 Km al
norte de la ciudad de Bogot y las instalaciones del laboratorio de Microbiologa
ambiental y de suelos del Departamento de Microbiologa de la Pontificia
Universidad Javeriana.


5.1.2 Microorganismos

Se utiliz un aislamiento nativo de Trichoderma ( T3 )aislado en trabajo previo
el cual fue suministrado por el cepario de micologa del Departamento de
Microbiologa de la Pontificia Universidad Javeriana, 4 aislamientos
provenientes de suelo de cultivos de flores de la sabana de Bogot ( Tsp5
Tc1,Tv1,Ti1, y un aislamiento nativo procedente de bosque alto andino,
suministrado por la Doctora Amanda Varela del Laboratorio de Ecologa Suelos
y Hongos Tropicales (LESYHT).del departamento de biologa

Para las pruebas de antagonismo se evaluaron aislamientos del patgeno
Rhizoctonia solani suministrados por el laboratorio de fitopatologa del Centro
de Investigaciones Agroindustriales (CIAA) de la Universidad de Bogot Jorge
Tadeo Lozano. Se seleccion un aislamiento por la capacidad de infectar
esquejes de clavel de la variedad Everest.



5.1.3. Material vegetal

Para el desarrollo de las pruebas de antagonismo in vivo se utilizaron
esquejes enraizados de clavel Dianthus caryophyllus suministrados por la
compaa Amrica flor.


5.1.4. Elaboracin del banco de trabajo de aislamientos de Trichoderma
spp

Con el fin de determinar la estabilidad de las cepas durante el estudio y el
mantenimiento de las condiciones iniciales, se realiz un banco de trabajo a
partir de 6 aislamientos de Trichoderma evaluados por Chves 2004 y que se
encuentran conservados a -70
o
C. A partir de los aislamientos, se realizaron
repiques sobre agar papa dextrosa (PDA).

De cada uno de los aislamientos se prepar una suspensin con una
concentracin igual a 10
8
esporas/ml, en un volumen final de 10ml en PBS.
Esta suspensin se utiliz posteriormente como inculo 10% para la
fermentacin discontinua de 24-48 horas, 100rpm, y una temperatura de 25
O
C
en caldo papa dextrosa, en un volumen efectivo de trabajo de 50 ml.

La evaluacin del crecimiento, viabilidad y evaluacin de cada una de las
cepas, se realiz mediante cultivo en placa, tincin con azul de lactofenol, y
microcultivo de acuerdo al mtodo propuesto por Sergey et al., 2000.

Guevara y Urcia en 2002 demostraron que se puede realizar la fermentacin
discontinua, en un Erlenmeyer de 250ml conteniendo caldo papa dextrosa con
10 ml de una suspensin conidial en una concentracin de 10
8
conidias/ml. El
cultivo se incub a una temperatura de 28C por 48 horas con agitacin a 100
rpm logrando as un volumen efectivo de trabajo de 50 ml.



5.1.5 Preparacin del inoculo de aislamientos de Trichoderma.

Para evaluar el crecimiento libre de cada uno de los 6 aislamientos del
antagonista, a partir de los aislamientos crecidos en tubos de vidrio de
(16X150), se realiz un repique en cajas de PDA hasta obtener un crecimiento
radial de 90mm aproximadamente. Posteriormente se tomaron discos de 0.5cm
de dimetro de zonas de crecimiento similares y sern sembradas sobre PDA
(Cundom, 2003)

Para cada cepa de Trichoderma en estudio se tomaron por triplicado datos
sobre el crecimiento radial en mm a las 24, 48, 60 y 72h.

5.1.6 Preparacin del inculo de Rhizoctonia solani

Para la preparacin del inculo de Rhizoctonia solani se tuvieron en cuenta su
crecimiento en agar papa dextrosa durante 7 das. El micelio del hongo se
resuspendi en agua destilada esterilizada, hasta obtener 10
3
UFC/ml en PDA.

5.1.7 Prueba de antagonismo in-vitro

Previo al enfrentamiento del patgeno y el antagonista Trichoderma spp, se
evalu el crecimiento libre en el centro de la caja de petri con agar PDA del
patgeno Rhizoctonia solani y los seis aislamientos del antagonista
Trichoderma spp ( T3, Tsp5, Tv1, Tc1, Ti1, T235 ). Se inocul por triplicado en
cada caso en el centro de la caja de petri.

5.1.8 Elaboracin de la prueba de antagonismo

Para determinar la capacidad antagonista de los diferentes aislamientos de
Trichoderma, sobre el patgeno Rhizoctonia solani, se aplic un diseo
completamente al azar, con tres repeticiones. La unidad experimental
correspondi a una caja de Petri con agar PDA.


Para las pruebas de enfrentamiento se tomarn discos de 0,5cm de dimetro
obtenidos a partir de propgulos del patgeno (crecimiento libre), y se
sembraron en la superficie de las cajas de Petri con PDA, a un centmetro del
borde de la caja (Cundom, et al., 2003).

Este procedimiento se realiz por triplicado. Despus de 24 horas de
incubacin a una temperatura de 28C el patgeno Rhizoctonia solani fue
sembrado a 1cm del borde de la caja pero en posicin opuesta un disco de
0,5cm de dimetro del antagonista (Cundom, et al., 2003; Holmes, et al., 2004).

5.2 Evaluacin de la capacidad antagonista in vivo

Esta prueba se llev a cabo bajo condiciones de invernadero en un sustrato de
Cascarilla/Turba 3.1. Se utilizaron los aislamientos Trichoderma T3.
TrichodermaTsp5, TrichodermaTc1, TrichodermaTV1, Trichoderma Ti1 y
TrichodermaT235.

Para evaluar la capacidad antagnica de los 6 aislamientos de Trichoderma se
utilizaron esquejes enraizados de clavel. Est prueba se llev a cabo bajo
condiciones de invernadero en materos con Cascarilla/Turba humedecida.

Los esquejes fueron inicialmente inoculados por inmersin de las races
lesionadas levemente en una suspensin de Rhizoctonia solani por 5 minutos.
Posteriormente cada uno de los esquejes de clavel infectados con el patgeno,
fueron colocados individualmente en materos con la mezcla de cascarilla:
turba.

Una vez inoculado el patgeno, despus de 48 h, se realiz la aplicacin al
suelo con una suspensin de 10
8
conidias/ml de cada uno de los aislamientos
de Trichoderma spp. (Tabla 1). La concentracin de conidias se ajust
utilizando la cmara de Neubauer.

Luego de ser inoculado el material vegetal con el patgeno y el sustrato con el
antagonista, cada cuatro das se realizaron registros de: altura de la planta,
incidencia de la enfermedad (% de plantas vivas), longitud de la raz, peso seco
de la parte area y de raz, nmero de hojas, color y apariencia de las plantas.

El peso seco total, de la parte area y de raz del material previamente medidio,
se determin mediante secado en un horno sin flujo de aire a 55
O
c durante 48
horas.
La humedad del suelo fue mantenida en el 60 % de la capacidad de campo,
durante todo el ensayo.

5.3 Diseo experimental

El ensayo de antagonismo in Vitro se realiz por triplicado para cada uno de
los tratamientos.

El ensayo de antagonismo in vivo se desarroll empleando esquejes de clavel
(Dianthus caryophyllus) La metodologa del ensayo se desarrollar con un diseo
completamente al azar con 3 repeticiones para cada tratamiento.
Cada tratamiento constar de 24 plantas de clavel para cada uno de los 9
tratamientos.

Tabla 1. Tratamientos para la evaluacin de antagonismos "in vivo

Tratamiento nomenclatura Controlador Patgeno
1 T
3
Aislamiento nativo (PUJ) R. solani
2 Tsp
5
Cultivo de Flores R. solani
3 Tv
1
Cultivo de Flores R. solani
4 Tc
1
Cultivo de Flores R. solani
5 Ti
1
Cultivo de Flores R. solani
6 T-235 Aislamiento nativo ( LESYHT) R. solani
7
Control
infeccin -------------------- R. solani

8
Control
Trichoderma Trichoderma Tsp -------------
9 control Ccto -------------------- ------------

5.4 VARIABLES DE ESTUDIO

Con el fin de evaluar la capacidad antagonista de los 6 aislamientos de
Trichoderma frente a R. Solani en plantas de clavel, se tomaron cada 4 das
registros de:

Altura de la planta
Longitud parte area
Longitud raz
Incidencia de la enfermedad (% plantas vivas)
Sntomas: Amarillamiento, marchitamiento, necrosis de tejidos.
Peso fresco total
Peso seco parte area
Peso seco de raz
Peso seco total

Los tratamientos control corresponden a:

Control de infeccin: Plantas con el patgeno Rhizoctonia solani
Control de crecimiento: Plantas sin patgeno ni antagonista
Control Trichoderma: Plantas con el aislamiento T235

Con los valores obtenidos durante el estudio para las variables medibles se
llev a cabo un anlisis de varianza ANOVA y la comparacin entre los
tratamientos mediante la prueba de tukey, tanto para los anlisis in Vitro
como para los in vivo .






























Figura 4. Tcnica de enfrentamiento: A la derecha de cada caja, aislamientos T3,
Tsp5, Tc1, Ti1, Tv1, y T235 de Trichoderma a la izquierda Rhizoctonia solani.
Fotografa tomada 72 horas despus del inicio de la prueba.


La expresin de necrosis (muerte del tejido) sugiere la presencia de
metabolitos difusibles y altamente txicos de carcter enzimtico (Celulasas,
Quitinasas y Proteasas) acompaados por otros compuestos encargados de la
inhibicin del crecimiento como acido harzianico, alamenticinas, peptaiboles,
antibiticos, 6-pentil--pirona, massoilactona, viridina, gliovirina, glisoperinas,
acido hepteldico y otros (Benitez, et al., 2004; Harman, et al., 2004; Limn, et
al., 2004; Rey, et al., 2000; Cook y Baker, 1983 ; Cundom, 2003),afirman que la
velocidad de crecimiento presentadas por las especies de Trichoderma son
motivos para la utilizacin de este microorganismo como antagonista, para el
control de fitopatgenos.










Tabla 4. Porcentaje de inhibicin micelial de los 6 aislamientos de Trichoderma a
las 24, 48 y 72 horas.

AISLAMIENTO 24 HORAS 48 HORAS 72 HORAS
T3 15,33 56,33 62,33
TSP5 14,00 36,33 48,67
TV1 12,00 27,67 42,00
TC1 11,00 30,33 40,00
Ti1 14,33 33,67 41,00
T235 24,00 61,67 63,67






Figura 5. Porcentaje de inhibicin micelial de los 6 aislamientos de Trichoderma a
las 24, 48 y 72 horas.













13
1S3 1v1 1C1
1l1 1233
24 PC8AS
48 PC8AS
72 PC8AS
0
10
20
30
40
30
60
70
24
PC8AS
48
PC8AS
72
PC8AS











FIGURA 10. Aspecto del material vegetal 15 das despus de la inoculacin con el
patgeno

Estos resultados muestran el alto grado de patogenicidad que puede ejercer
este hongo fitopatgeno cuando encuentra accin directa sobre sin la
eficiente accin biocontroladora por parte de hongos antagonistas ( Figura 13).
Barrera et al.,1997, afirman que la aparicin de los primero sntomas, se ve
influenciado por la agresividad del aislamiento del patgeno.
Durante la tercera semana de evaluacion se presentaron diferencias significativas
entre los tratamientos: control de crecimiento. control de infeccion y control con
Trichoderma. Las plantas de clavel en el control de crecimiento presentaron un
crecimiento a nivel radicular y de la parte area progresivo en el tiempo y mayor
al control de infeccion (Figura 13I), sin embargo el crecimiento de las plantas fue
menor, en comparacin con todos los tratamientos de Trichoderma excepto para
el tratamiento con Tsp5 ( Figuras 13 y14).

Figura 11. Evaluacin de la longitud de la parte area de esquejes de clavel en
respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani.




Figura 12. Sntomas iniciales visibles en Tsp5 y Control Rhizoctonia solani.

Por otra parte, la accin positiva ejercida por el hongo antagonista, se ve
reflejada en el control Trichoderma, donde se observa una mejor apariencia y
calidad en los esquejes, as como un mayor crecimiento total, al ser
comparada con los controles ( Figuras 13H y 14). A su vez, el control de
infeccion present los menores niveles de crecimiento, (Figura 13G),
amarillamiento y marchitamiento progresivo en los esquejes.

Los tratamientos con el aislamiento T3 y el Control Trichoderma, mostraron los
mejores resultados en cuanto al crecimiento total y apariencia de las races de
las plantas evaluadas al final de la tercera semana, si se compara con los
dems tratamientos de Trichoderma y controles de crecimiento e infeccion
(Figuras 13 y 13H). Esto confirma adems los resultados obtenidos al evaluar
el crecimiento libre in vitro donde se observ que los aislamientos T3 y T235
tuvieron un mayor crecimiento y un alto PIM sobre el patgeno R.solani (Tabla
3, Figura 3).











FIGURA 13. Aspecto del material vegetal 19 das despus de la inoculacin con el
patgeno.





Figura 14. Evaluacin de la longitud total de esquejes de clavel en respuesta a la
aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani





En general todos los tratamientos con Trichoderma, a excepcin de Tsp5,
muestran una buena apariencia, calidad en los esquejes, un mayor crecimiento
areo y radicular, as como ausencia de signos o sntomas de la enfermedad
por R .solani. Estos resultados confirman los obtenidos en las pruebas de
antagonismo in vitro ( Figura 4-5), que demuestran la excelente actividad
antagonista ejercida por las especies de Trichoderma sobre el hongo R.solani.
Estos son indicativos favorables de la actividad del hongo como promotor del
crecimiento y agente antagonista en campo, sobre R.solani en esquejes de
clavel variedad Everest. El aumento de vigor observado en las plantas
inoculadas con Trichoderma, se ve reflejado en el crecimiento de la parte area y
radicular en el control con Trichoderma, el cual muestr un crecimiento de 16,1
cms y 6,1 cms respectivamente, si se compara con los obtenidos con el control
con el patgeno el cual mostr para estas mismas variables, resultados de 15,3
cm y 4,9 cms respectivamente ( Figura 13 -14) ( Anexo 1). Estos resultados
coinciden con los descritos por Lpez et al., 1999, el cual establece que
Trichoderma produce sustancias estimuladoras del crecimiento y desarrollo de las
plantas, que actan como catalizadores o aceleradores de los tejidos
meristemticos primarios ( los que tienen potencial de formar nuevas races) en
las partes jvenes de stas, acelerando su reproduccin celular, logrando que las
plantas alcancen un desarrollo ms rpido que aquellas plantas que no han sido
tratadas con dicho microorganismo.

De la misma forma que lo observado al da 15, en el da 19, la patogenicidad
del hongo se mantiene en las plantas con los tratamientos Control R. solani y
Tsp5. Esto fue evidenciado por una apariencia dbil de los esquejes y una
menor tasa de crecimiento, adems se present amarillamiento,
marchitamiento progresivo, necrosis de tejidos y muerte en plantas ( Figura 19).
Estas observaciones concuerdan con los resultados obtenidos para este
tiempo, respecto a la longitud de la parte area, ( Figura 10), donde se
manifiesta que la accin patgenica sobre el control R.solani y Tsp5 , queda
reflejada en el menor valor de crecimiento de los esquejes (Figura 13B-13G ).
Los sntomas observados en las plantas de clavel en el da 19, han sido
reportados anteriormente por otros investigadores como Garibaldi et al.,1978,
quien define que la enfermedad causada por Rhizoctonia solani incluye el
marchitamiento lento fungoso que se caracteriza por la reduccin en el
crecimiento de la planta y la presencia de tallos y brotes delgados, los cuales
se amarillan posteriormente, causando que la planta se marchite y muera.

En la figura 15 se muestran los efectos de la aplicacin de los diferentes
aislamientos de Trichoderma sobre el peso fresco de los esquejes de clavel,
as como de la accin antagonista ejercida por los diferentes tratamientos
frente al hongo fitopatgeno R.solani. Las plantas con el tratamiento T3 y el
control con Trichoderma T235 presentaron diferencias significativas 8 p<0.05)
con relacin al control de infeccin.



Figura 15. Evaluacin del peso fresco de esquejes de clavel en respuesta a la
aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani

Las plantas con el tratamiento T3 y el control con Trichoderma presentaron los
mayores valores de longitud de la parte area, longitud total y peso fresco total
(Figuras 10 y 13 y 15) as como altos valores en cuanto a la longitud radicular
(Anexos 1A, 1B y 1C) estos resultados se ven reflejados en esquejes con
mejor apariencia y crecimiento, follaje abundante y una mayor biomasa
radicular (Figuras 13 y 18). Por otra parte el tratamiento con el aislamiento Tc1,
present valores significativamente altos para las variables de peso fresco (
Figura 15)(Anexo 1C ). Varios autores han demostrado que la adicin de
aislamientos especficos de Trichoderma en la rizsfera pueden resultar en
promocin de crecimiento en plantas ; Bailey et al., 1998; Bjorkman et al., 1998;
Yedidia et al., 1999; Harman, 2000; Naseby et al., 2000; Rojo, et al., 2006). Es
interesante anotar que a partir de la tercera semana se observa un crecimiento
significativo en la longitud y el peso de las plantas de clavel con el tratamiento
TC1, logrando alcanzar niveles similares para los observados en el control
Trichoderma y el aislamiento T3 (Figura 15). Al parecer la accin promotora del
crecimiento de Tc1 sobre los esquejes de clavel es un poco ms lenta en el
tiempo, si se compara con las dems cepas de Trichoderma utilizadas, ya que
solo a partir de la segunda a tercera semana se evidencia una real actividad de
crecimiento de los esquejes de clavel, Estos resultados difieren notablemente
de los obtenidos in vitro, donde se estableci que la menor tasa de crecimiento
libre de las sps de Trichoderma cultivadas en el tiempo perteneci a la cepa
TC1 (Figura 2, Tabla 3). Se confirma lo observado por otros autores (McLeod et
al., 1995; Smith et al., 1990) respecto a que la seleccin previa de antagonistas
mediante cultivos duales es til, pero no garantiza el comportamiento de stos en
invernadero.

En la cuarta semana se confirma la capacidad antagonista in vivo en los
tratamientos con Trichoderma donde se observ un desarrollo normal de las
plantas, con hojas, tallos y races saludables (Figura 16). Los esquejes de
clavel en los tratamientos T235 y control Trichoderma siguen presentando el
mayor ndice de crecimiento (Figura 16E-16F), reflejado en mayores valores de
peso seco de raz y parte area (Figuras 17,18 ). Yedidia, et al., en 1999, en
trabajo con Trichoderma harzianum afirman que esto es debido posiblemente a
que Trichoderma penetra y se desarrolla en la epidermis exterior, estimulando
el sistema de defensa de la planta por cambios metablicos. por otra parte,
Arora et al. en 1992, afirma que la colonizacin de raz por cepas de
Trichoderma frecuentemente incrementa el crecimiento de raz en muchos
cultivos de plantas bajo condiciones de invernadero.















Figura 16. Aspecto del material vegetal 23 das despus de la inoculacin con el
patgeno

Vale la pena resaltar que entre los das 19 y 23, se encuentran los resultados
de mayor relevancia respecto al aumento en el crecimiento. Se observa que
para los tratamientos Control Trichoderma, T3 y T235, se encontraron
aumentos cercanos al 43%, 40% y 39% respectivamente (Anexo 1C), mucho
mayores al encontrado en el control del patgeno que mostr un rendimiento
negativo a nivel de crecimiento para este tiempo. Estos resultados son
concordantes a los encontrados para la variable de peso fresco, que mostraron
aumentos de 35,7%, 32% y 34% para el control con Trichoderma, T3 Y T235
respectivamente. Por otra parte los resultados obtenidos para peso fresco en
el Control de crecimiento y control R.solani 20% y 11.7% respectivamente,
fueron mucho menores a los encontrados en los aislamientos con el hongo de
Trichoderma. Estos resultados confirman an ms la accin promotora del
crecimiento vegetal en esquejes de clavel por parte de las diferentes
aislamientos de Trichoderma, as como el efecto antagonista ejercido por el
hongo, sobre el fitopatgeno R .solani. Benitez et al., 2004; Sunil et al., 2005,
determinan que la productividad de cultivos en campo puede incrementarse
cerca del 300% despus de la adicin de Trichoderma hamatum o Trichoderma
koningii.






Figura 17. Evaluacin del peso seco areo de esquejes de clavel en respuesta a la
aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani

El peso seco de la parte area y de las races de las plantas inoculadas con
Tc1 y el control con Trichoderma, se diferenci claramente de las inoculadas
slo con el patgeno, observndose un desarrollo significativo de races y parte
area en presencia de estos tratamientos( Figuras 17-18) ( Anexo 1,Tabla 1E-
1F). Harman et al., en 1998, determina que la promocin del crecimiento
vegetal por parte de Trichoderma se manifiesta como una potenciacin de la
germinacin de las semillas, una floracin ms abundante y temprana y
aumentos de altura y peso de las plantas ( Vhang y Baker, et al.,1986).
Por otra parte el Control con R.solani evidenci la presencia activa del
patgeno sobre la base del tallo, asi como procesos de amarillamiento,
marchitamiento y valores de mortalidad alta sobre los esquejes de clavel
( Figura 19-21).



Figura 18. Evaluacin del peso seco raz de esquejes de clavel en respuesta a la
aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani

En los tratamientos con el control con Trichoderma, asi como con los
aislamientos T3 Y T235 se obtuvo una mayor respuesta en cuanto a niveles de
crecimiento de la parte area y radicular de los esquejes de clavel, comparado
con el control de crecimiento y con el control de infeccin ( Figura 9 ) ( Figura
23). Se pudo evidenciar entonces, el alto grado de biocontrol ejercido por parte
de las cepas de Trichoderma sobre el hongo R. solani, excepto el aislamiento
Tsp5. Esto se confirm por la apariencia saludable de las plantas, ausencia de
sntomas de la enfermedad y valores superiores de las variables de longitud de
la parte area y peso evaluadas, con relacin a los tratamientos control de
crecimiento y control de infeccin hacia el da 23 del ensayo. Algunos autores
han demostrado el efecto inductor en el crecimiento y desarrollo de las plantas
por parte de Trichoderma spp., es as como Yossen et al.,en 2003 demostraron
que al incorporar T. harzianum (TL 98) en germinadores de lechuga, adems
de reducir el dao causado por R. solani, el antagonista promovi el
crecimiento de las plantas. Igualmente Inbar et al., en 1994., observaron que
aplicando T. harzianum en semilleros de pepino y de pimentn se increment
significativamente el crecimiento de las plntulas, comparadas con aquellas
que no recibieron la adicin del hongo antagonista. Estos trabajos muestran el


beneficio de aplicar hongos, como Trichoderma, para obtener plantas vigorosas
y sanas ( Castro 2005).














Figura 19. Sintomas visibles de la enfermedad por R. solani en el material vegetal.

La apariencia y calidad de los esquejes, sntomas visibles de amarillamiento, y
marchitamiento, as como tejidos necrosados, la disminucin en la calidad y
cantidad de las races y muerte en los esquejes de clavel (Figura 19- 21),
confirma la actividad del hongo fitopatgeno , durante los ensayos en
invernadero, para los tratamientos con el control R.solani (Figura 19 A y B) y el
Tratamiento con el aislamiento Tsp5 ( Figura 19 CyD). Benitez et al., 2004,
establece que las cepas de Trichoderma pueden colonizar races de plantas en
crecimiento y proteger contra infecciones. La colonizacin implica la habilidad
para adherirse y reconocer races de plantas, penetrar la planta y resistir
metabolitos txicos producidos por las plantas en respuesta a la invasin de
organismos extraos, sean o no patgenos.




Figura 20. Evaluacin del peso seco total de esquejes de clavel en respuesta a la
aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani

Se pudo determinar que las plantas con mayor peso seco fueron aquellas que
crecieron en los diferentes aislamientos con Trichoderma, especialmente con
el control de Trichoderma y T235 (Figura 20) ( Anexo 1G). Ahora bien, La
evaluacin del nivel de dao radical, mostr que este fue menor en presencia
de los tratamientos con el hongo antagonista, que en el tratamiento con el
control de infeccin (Figura 20-22). Un ensayo realizado sobre pasto Estrella
demostr que la ganancia en peso seco con algunos aislamientos de
Trichoderma es cercana al 23%, en longitud de las races y de estolones este
incremento fue de un 30% ( www.infojardin.com/foro/showthread.php).



Figura 21. Mortalidad de esquejes de clavel en los tratamientos por accin
patognica de R. solani
La buena actividad biocontroladora ejercida por parte del hongo Trichoderma
sobre el fitopatgeno R. solani (Figura 21, 24), qued demostrado con la
ausencia de sngos y sntomas de la enfermedad, asi como la baja incidencia
de muerte de los esquejes bajo la accin de las diferentes especies de
Trichoderma a travs del tiempo, a excepcin de Tsp5, que a lo largo del
ensayo demostr una baja accin antagonsita sobre R .solani ( Figura
19C,19D- 21). Tal y como lo establece Meera et al ., en 1994, quien determina
que la accin de biocontrol ejercida por el hongo antagonista, puede ser debido
a que muchas cepas de Trichoderma son capaces de inducir resistencia
sistmica de plantas, ya que aplicadas en la rizosfera producen proteccin
contra patgenos del suelo o foliares.

No obstante al excelente antagonismo ejercido por Trichoderma, se pudo
determinar una clara actividad patognica del hongo R. solani en los esquejes
de clavel, cuando este se aplico como tratamiento control ( Figura 19A,19B-
21). Castro y Osorio en 2005, demostraron el efecto antagnico de
Trichoderma sobre R. solani en semilleros de caf, obteniendo una reduccin
de 55% en la incidencia de la enfermedad cuando inocularon el sustrato con el
hongo antagonista (T1664).

Es interesante notar que los resultados obtenidos durante la experiencia para el
desarrollo radicular de los esquejes de clavel muestran que existi una
actividad directa de Trichoderma como promotor del crecimiento vegetal en los
esquejes de clavel y del aumento de la zona rizosfrica ( Figura 22-23-24). La
habilidad de cepas de Trichoderma para proteger plantas contra patgenos de
races esta siendo atribuido a su efecto antagnico contra patgenos invasivos,
Sin embargo esta asociacin hongo-raz adems estimula mecanismos de
defensa en plantas. ( Benitez., et al 2004)









T3 TSP5 Tc1

Tv1 Ti1 T235

Control Trichoderma Control R. solani Control de crecimiento


Figura 22 Apariencia de las races en los diferentes tratamientos.

De igual manera se observ que los tratamientos con el aislamiento T235 y el
control Trichoderma ( Figuras 22E, 22G y 23) mostraron los mayores valores
de longitud de raz, adems de una excelente apariencia de sus races. As
mismo el tratamiento Tc1 mostro valores significativos a nivel radicular durante
las ultimas dos semanas de evaluacion. El mayor tamao de races influye de
manera directa en el crecimiento areo de la planta, tal y como quedo en el
crecimiento de los esquejes con el control de Trichoderma demostrado en
diferencias mayores al 25% respecto al control de crecimiento y del 75%
aproximadamente para el control con R. solani (Figuras 22C,D y E y Figura 23)


Figura 23. Evaluacin de la longitud de raiz de esquejes de clavel en respuesta a la
aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani

Benitez et al., 2004 en estudios con Trichoderma demostraron que la
colonizacin de races por este hongo frecuentemente incrementa el
crecimiento y desarrollo de races, productividad de cultivos, resistencia a
estrs abiticos y la toma y uso de nutrientes. De igual forma Bjorkman et al.,
en 1998 estableci una hiptesis en la que propone que Trichoderma es capaz
de limitar el efecto del dao oxidativo en la raz.

Para el dia 27 despus de la aplicacin del antagonista se confirm el efecto
ejercido por Trichoderma como promotor del crecimiento vegetal en plantas y
antagonista del hongo fitopatogeno R .solani ( Figura 24). Se observa una
excelente apariencia y calidad de los esquejes, as como un gran desarrollo de la
parte area y radicular. Por otra parte para la ltima semana se hace mas
evidente la accin patognica de R. solani, sobre las plantas, evidenciado por el
aumento en el nmero de marchitamientos y necrosamiento de tejidos, as como
la muerte de esquejes ( Figura 19 y 21).
No obstante estos sntomas estuvieron ausentes durante el desarrollo del ensayo
en las plantas bajo la accin del hongo Trichoderma, a excepcin del aislamiento
Tsp5











Figura 24. Aspecto del material vegetal 27 das despus de la inoculacin con el
patgeno
.
Benitez et al., 2004, Yedidia et al., 2000 establecen que el rpido desarrollo y
colonizacin de Trichoderma de las zonas adecuadas para la infeccin, como
reas de necrosis, heridas o partes concretas de la planta, impiden fsicamente
el acceso y establecimiento del patgeno en su hospedador.

Es claro que a pesar de la inoculacin del hongo patgeno Rhizoctonia solani
sobre los esquejes de clavel, el antagonista ejerci un biocontrol efectivo sobre
el hongo fitopatgeno en condiciones de invernadero a lo largo del la
investigacin. Se encontr que el tratamiento con el control con Trichoderma,
mostr los mejores resultados respecto a crecimiento de la parte area y
radicular (Figura 22)(Anexos1A-1B), evidenciado por un mayor crecimiento y un
aumento en el crecimiento total de cerca del 46% respecto al control de
crecimiento ( Figura 14) ( Anexo 1C); de igual manera reflejados en las
mayores rendimientos en peso fresco y peso seco total frente a los controles
del patgeno y de crecimiento ( Figura 15 y 20). Por otra se pudo confirmar que
los mejores resultados en todas las variables evaluadas se obtuvieron en los
aislamientos de Trichoderma ( T235 y T3). Estos resultados son consistentes
con los obtenidos en los estudios in vitro ( Figura 2) ( Tabla 3), que
demostraron que los aislamientos T235 y T3 presentaron las ms altas tasas
de crecimiento libre en el tiempo, del mismo modo el aislamiento T235
present el mayor PIM en las pruebas de antagonismo in vitro frente al hongo
fitopatogeno R .solani. Vale la pena resaltar que el aislamiento con Tc1 mostr
una buena actividad bajo condiciones de invernadero a partir de la segunda
semana, convirtindose junto al control con Trichoderma, T235 y el T3 en los
mejores aislamientos. No obstante a los buenos resultados obtenidos en
campo para el aislamiento Tc1, estos difieren notablemente a los desarrollados
in vitro ( Figura 2) ( Tabla 3), donde Tc1 mostr los menores valores de
crecimiento libre en el tiempo. Estos resultados confirman lo dicho por Macleod,
quien establece que los resultados in vitro de especies de Trichoderma no
garantiza plenamente su actividad y antagonismo sobre hongos fitopatgenos
en condiciones de campo o invernadero. Por otra parte se puede inferir que el
que el tratamiento Tsp5 no ejerci un biocontrol efectivo en esquejes de clavel
para el control de enfermedades ocasionadas por el hongo fitopatgeno R.
solani ( Figura 19,21); Siendo Tsp5 un hongo utilizado en cultivos de flores en
la sabana de Bogot, debera ejercer una accin efectiva sobre el fitopatgeno
en cultivos de clavel, situacin por la cual es evidente buscar alternativas
tendientes a mejores rendimientos en pro del control de organismos
fitopatgenos tales como R. solani, y que pudieran encontrar solucin en el
aislamiento nativo T235, el cual mostr los resultados ms relevantes para el
control del hongo patgeno en condiciones de invernadero y en la promocin
del crecimiento vegetal en esquejes de clavel variedad Everest.

Los resultados demuestran, la actividad antagonista diferencial de los
aislamientos de Trichoderma estudiados frente a la accin patog`+enica
ejercida por el hongo fitopatgeno R. solani, y su accin en la promocin en el
crecimiento vegetal en esquejes de clavel variedad Everest .

En este trabajo de investigacin se demostr que 5 de los 6 aislamientos de
Trichoderma aplicados en la rizsfera de esquejes de clavel de la variedad
Everest en condiciones de invernadero ejercen una buena accin antagonista
frente al fitopatgeno R. solani.




Los aislamientos (Control Trichoderma, T3 y T235) adems de mostrar una
excelente capacidad de biocontrol, confirmaron los mayores valores en cuanto
a todas las variables evaluadas en el ensayo, asi como la mejor apariencia de
las plantas comparada con los controles. Estos resultados corroboran los
obtenidos por varios autores con relacin a la habilidad de Trichoderma para
promover el crecimiento vegetal.










































CONCLUSIONES


Se logr evaluar la capacidad antagonista in vitro de seis aislamientos de
Trichoderma frente al fitopatgeno Rhizoctonia solana. Donde el aislamiento
nativo T235 mostr los mayores valores de crecimiento libre y porcentaje de
inhibicin micelial ( PIM).

Bajo las condiciones evaluadas, los aislamientos control Trichoderma, asi como
T235 y T3 pueden ser considerados los de mayor importancia en la promocin
del crecimiento vegetal y en pro del control biolgico del hongo fitopatgeno R
.solani y la reduccin de los sntomas de la enfermedad en esquejes de clavel
variedad Everest en condiciones de invernadero.

Los resultados obtenidos en condiciones de invernadero fueron consistentes a
los obtenidos en condiciones in vitro para los aislamientos que demostraron
tener una mayor tasas de crecimiento y un mayor PIM, tal y como quedo
demostrado con los aislamientos T235 Y T3.

Los resultados presentados a travs de la presente investigacin sugieren que
la utilizacin de especies de Trichoderma para el control de R. solani en
esquejes de clavel es una estrategia promisoria para el manejo de las
enfermedades en condiciones de invernadero. Esta afirmacin esta soportada
por el factor de que todos los aislamientos de Trichoderma spp evaluados, a
excepcin de Tsp5, redujeron la severidad de la enfermedad en plantas. Tales
reducciones fueron evidentes debido al bajo nmero de plantas afectadas por
R. solani cuando se enfrentaron al hongo Trichoderma y a la baja aparicin de
signos y sntomas de la enfermedad sobre los esquejes de clavel evaluados.







RECOMENDACIONES

Para futuros estudios seria indicado la utilizacin de un mayor nmero de
especies de Trichoderma en esquejes de clavel en condiciones de
invernadero.

Sera importante el uso de camas de enraizamiento para el desarrollo de
futuros estudios con especies de Trichoderma para el control biolgico de
hongos fitopatgenos, con el fin de asegurar la confiiablidad de la investigacin.

Uno de los objetivos a futuro ser el de combinar bacterias y hongos
antagonistas como una alternativa promisoria en el control biolgico, de
patgenos con alta versatilidad ecolgica en condiciones de invernadero, tal y
como es el caso de Rhizctonia solani..

Las grandes posibilidades de uso del microorganismo en el control de
enfermedades en cultivos hortcolas, estimula las investigaciones al respecto.
Sin embargo orienta a la seleccin de un mayor nmero de especies de
Trichoderma o de lineas ms eficientes de los organismos antagnicos;
adems de la alteracin del medio ambiente de manera que el, o los
antagonistas resulten favorecidos; el aprovechamiento de las sustancias
antibiticas que producen y la aplicacin precisa de ellos de acuerdo al ciclo de
la enfermedad del fitopatgeno que se desea controlar son variables de
importancia para la mayor efectividad y confiabilidad de las especies de
Trichoderma investigadas.

Realizar pruebas entre las especies del hongo Trichoderma con otros
fitopatgenos de importancia agrcola, para identificar las posibles
interacciones y antagonismos.






ANEXOS



ANEXO 1



kLSUL1ADCS LCNGI1UD DL LA Ak1L ALkLA (cm)

1kA1AMILN1C DIA 7 DIA 11 DIA 1S DIA 19 DIA 23 DIA 27
13 16,3 16,3 16,6 17,2 17,3 18,8
1sp3 13,3 14,4 13,6 13,6 13,9 13,8
1v1 13,6 13 16,3 16,3 16,8 17,8
1c1 13,6 13,9 16,1 16,6 17,2 18,3
1l1 13,9 16,3 16,3 16,6 17 18,4
1233 13 14,8 13,3 16,1 16,9 18,2
coottol 1tlcboJetmo 13,4 13,9 16,1 16,7 17,3 19,4
coottol Je lofecclo 13 13,3 13,3 14,8 14,7 13
ConLrol de creclmlenLo 13,2 13,3 13,9 16 16,7 18




kLSUL1ADCS LCNGI1UD kAI2 (cm)

1kA1AMILN1C DIA 7 DIA 11 DIA 1S DIA 19 DIA 23 DIA 27
13 4,8 3,8 3,7 7,2 7,3 8,6
1SS 3,4 3,3 3,3 3,1 3,4 6,6
1v1 3,3 3,4 6,8 6,6 6,7 8,4
1C1 3,1 3,8 6,3 6,3 7,9 10,8
1l1 3,4 3,3 3,4 3,3 6,8 9,2
1233 3,2 3,6 3,7 6,1 8,1 10
ConLrol 1tlcboJetmo 3,4 3,9 6,1 7,3 8,6 11,1
ConLrol de lnfeccln 3,1 3,3 4,9 4,8 3 3
ConLrol de creclmlenLo 3,3 3,8 3,9 6 6,3 7,7
















kLSUL1ADCS LCNGI1UD 1C1AL (cm)

1kA1AMILN1C DIA 7 DIA 11 DIA 1S DIA 19 DIA 23 DIA 27
13 21,1 22,3 22,3 24,4 24,9 27,4
1SS 18,9 19,9 20,9 20,7 21,4 22,3
1v1 21,1 21,1 23,2 22,8 23,2 26,3
1C1 21,3 21,7 22,4 23,1 23,1 30
1l1 21,3 21,8 21,9 22,1 24,1 27,7
1233 20,2 20,4 21,2 22,2 23,2 28,4
ConLrol 1tlcboJetmo 20,8 21,8 22,2 24,1 26,2 30,6
ConLrol de lnfeccln 20,1 20,7 20,2 19,6 19,8 19,6
ConLrol de creclmlenLo 20,3 21,3 21,8 22 23,2 23,8




kLSUL1ADCS LSC IkLSCC (g)

1kA1AMILN1C DIA 7 DIA 11 DIA 1S DIA 19 DIA 23 DIA 27
13 0,98 1,36 2,01 2,93 3,9 3,7
1SS 0,8 0,96 1,39 2,04 3,1 3,86
1v1 1 1,3 2,23 2,4 3,38 3,27
1C1 0,9 1,22 1,38 2,87 4,04 6,2
1l1 0,73 1,28 2,16 2,27 4,02 3,9
1233 0,3 1,03 2,03 2,32 4,03 3,8
ConLrol 1tlcboJetmo 0,76 1,3 2,4 2,88 4,38 6,38
ConLrol de lnfeccln 0,73 1,13 2,1 1,81 3,03 3,32
ConLrol de creclmlenLo 0,72 1,23 1,77 2,3 4,18 3,1


kLSUL1ADCS LSC SLCC Ak1L ALkLA (g)

1kA1AMILN1C DIA 7 DIA 11 DIA 1S DIA 19 DIA 23 DIA 27
13 - 0,33 0,33 0,36 0,6 0,73
1SS - 0,43 0,46 0,46 0,49 0,33
1v1 - 0,46 0,47 0,49 0,34 0,39
1C1 - 0,43 0,47 0,33 0,64 0,77
1l1 - 0,33 0,36 0,36 0,61 0,74
1233 - 0,42 0,43 0,47 0,61 0,73
ConLrol 1rlchoderma - 0,3 0,33 0,38 0,72 0,88
ConLrol de lnfeccln - 0,46 0,43 0,41 0,4 0,39
ConLrol de creclmlenLo - 0,46 0,31 0,32 0,38 0,62




kLSUL1ADCS LSC SLCC kAI2 (g)

1kA1AMILN1C DIA 7 DIA 11 DIA 1S DIA 19 DIA 23 DIA 27
13 - 0,04 0,09 0,1 0,11 0,14
1SS - 0,04 0,06 0,06 0,08 0,11
1v1 - 0,03 0,06 0,08 0,1 0,12
1C1 - 0,04 0,08 0,1 0,12 0,13
1l1 - 0,03 0,06 0,08 0,11 0,13
1233 - 0,04 0,08 0,11 0,12 0,16
ConLrol 1rlchoderma - 0,03 0,08 0,11 0,13 0,17
ConLrol 8. Solanl - 0,03 0,07 0,07 0,08 0,08
ConLrol creclmlenLo - 0,03 0,08 0,1 0,11 0,13





kLSUL1ADCS LSC SLCC 1C1AL (g)

1kA1AMILN1C DIA 7 DIA 11 DIA 1S DIA 19 DIA 23 DIA 27
13 0,36 0,39 0,61 0,66 0,76 0,97
1SS 0,46 0,48 0,32 0,33 0,6 0,66
1v1 0,48 0,3 0,36 0,61 0,63 0,71
1C1 0,47 0,3 0,33 0,63 0,73 0,94
1l1 0,3 0,39 0,61 0,6 0,73 0,92
1233 0,42 0,46 0,32 0,36 0,76 0,91
ConLrol 1rlchoderma 0,31 0,33 0,63 0,67 0,86 1,04
ConLrol 8. Solanl 0,42 0,31 0,3 0,48 0,46 0,43
ConLrol creclmlenLo 0,48 0,32 0,39 0,39 0,69 0,76


















ANEXO 2


TIEMPOS TEMPERATURAS
MXIMAS (
O
C )
TEMPERATURAS
MINIMAS (
O
C )
6 de octubre 32 14
7 de octubre 33 13
8 de Octubre 33 13
9 de octubre 32 14
10 de octubre 32 14
11 de octubre 31 13
12 de octubre 31 14
13 de octubre 32 13
14 de octubre 31 13
15 de octubre 34 12
16 de octubre 30 14
17 de octubre 31 12
18 de octubre 30 13
19 de octubre 31 13
20 de octubre 30 12
21 de octubre 30 13
22 de octubre 29 13
23 de octubre 27 10
24 de octubre 28 11
25 de octubre 29 13
26 de octubre 29 13










ANEXO 3.

ANALISIS ESTADISTICO

ANALISIS DE VARIANZA PARA LAS VARIABLES DE CRECIMIENTO

ANOVA


Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 21,395 8 2,674 1,076 ,408
Within Groups 67,093 27 2,485
Long
parte
area
Total 88,487 35
Between Groups 84,259 8 10,532 3,237 ,010
Within Groups 87,838 27 3,253
Long
raz
Total 172,096 35
Between Groups 1,191E-02 8 1,488E-03 2,519 ,035
Within Groups 1,595E-02 27 5,907E-04
Long
total
Total 2,786E-02 35
Between Groups ,344 8 4,294E-02 2,170 ,063
Within Groups ,534 27 1,979E-02
Peso seco
Parte aerea
Total ,878 35
Between Groups 1,191E-02 8 1,488E-03 2,519 ,035
Within Groups 1,595E-02 27 5,907E-04
Peso seco
raz
Total 2,786E-02 35
Between Groups 1,191E-02 8 1,488E-03 2,519 ,035
Within Groups 1,595E-02 27 5,907E-04
Peso seco
total
Total 2,786E-02 35











TEST DE DUNCAN PARA LAS VARIABLES DE PESO




Subset for alpha .05
TRATA
N
1 2 3
8,0 4 4,250E-02
9,0 4 6,500E-02 6,500E-02
1,0 4 6,750E-02 6,750E-02 6,750E-02
3,0 4 6,750E-02 6,750E-02 6,750E-02
2,0 4 7,000E-02 7,000E-02 7,000E-02
4,0 4 7,250E-02 7,250E-02 7,250E-02
5,0 4 7,250E-02 7,250E-02 7,250E-02
7,0 4 1,000E-01 1,000E-01
6,0 4 ,108
Sig. ,139 ,086 ,051
Means Ior groups in homogeneous subsets are displayed.
a Uses Harmonic Mean Sample Size 4,000





















TEST DE DUNCAN PARA LAS VARIABLES DE LONGITUD




Subset for alpha .05
TRATA
N
1 2 3
8,0 4 4,250E-02
9,0 4 6,500E-02 6,500E-02
1,0 4 6,750E-02 6,750E-02 6,750E-02
3,0 4 6,750E-02 6,750E-02 6,750E-02
2,0 4 7,000E-02 7,000E-02 7,000E-02
4,0 4 7,250E-02 7,250E-02 7,250E-02
5,0 4 7,250E-02 7,250E-02 7,250E-02
7,0 4 1,000E-01 1,000E-01
6,0 4 ,108
Sig. ,139 ,086 ,051
Means Ior groups in homogeneous subsets are displayed.
a Uses Harmonic Mean Sample Size 4,000














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