Está en la página 1de 3

ORI GI NALES

Di agnósti co r ápi do de l a meni ngoencefal i ti s her péti ca
medi ante PCR
Carmen Muñoz-Al magro, Aracel i Gonzál ez-Cuevas, Franci sco José Cambra
a
, Teresa Juncosa, Aurea Mi ra y Cri sti na Latorre
Servi ci os de Mi crobi ol ogí a y
a
Pedi atrí a. Hospi tal Sant Joan de Déu. Espl ugues de Ll obregat. Barcel ona. España.
clinical suspicion of viral meningoencephalitis or to rule
out a possible herpetic etiology were evaluated. In
addition to classical methods, the diagnostic technique
used was PCR amplification of a highly preserved region of
the DNA polymerase gene common to herpes virus 1 and
2. All patients were administered acyclovir on admission
and until the results of PRC were known. If the result was
negative, withdrawal of acyclovir was considered after
clinical reexamination. If the result was positive, the
therapy was continued for 20 days.
RESULTS. Herpes simplex DNA was detected in four
patients. In all patients, clinical outcome confirmed the
results of PCR, whether positive or negative. PCR results
were available within 6.30 and 72 hours (mean: 18 hours).
CONCLUSION. This simple and rapid PCR technique can be
applied in the daily routine of the microbiology laboratory.
It allows early diagnosis of herpetic meningocephalitis or,
when lacking, exclusion of Herpes simplex etiology.
Key words: PCR. Meningoencephalitis. Herpes simplex.
Pediatrics.
Introducción
La meni ngoencefal i ti s her péti ca es una enfer medad
poco fr ecuente en nuestr o medi o per o con una el evada
morbi mortal i dad
1
. Debi do a su gravedad y al benefi ci o que
puede obtenerse medi ante un tratami ento temprano, ante
l a sospecha cl í ni ca de esta enfer medad se r ecomi enda
i ni ci ar el tratami ento precoz con aci cl ovi r. Esta medi da es
cara y no está exenta de efectos secundari os, por l o que es
de gr an i nter és di sponer de una técni ca de di agnósti co
r ápi da, sensi bl e y especí fi ca que ayude al cl í ni co en l a
toma de deci si ones según el resul tado.
En el pr esente estudi o eval uamos l a uti l i dad de un
método de PCR rápi do y senci l l o apl i cado al di agnósti co de
l a meni ngoencefal i ti s herpéti ca en l a pobl aci ón pedi átri ca.
Pacientes y método
Durante el perí odo de estudi o, comprendi do entre el 1 de marzo de
1996 y el 31 de abr i l de 2000 se pr ocesar on 123 muestr as de l í qui do
cefal or r aquí deo de 114 paci entes pedi átr i cos, que fuer on todos l os
atendi dos en el Hospi tal Sant Joan de Déu de Barcel ona por sospecha
cl í ni ca de meni ngoencefal i ti s ví ri ca o i nterés en descartar l a eti ol ogí a
her péti ca. En este hospi tal exi ste una uni dad de mi cr obi ol ogí a
mol ecul ar que apl i ca l a tecnol ogí a PCR en más de 4.000 muestras al
año por di fer entes enfer medades (pr i nci pal mente i nfecci ón por el
vi r us de l a i nmunodefi ci enci a humana [VI H]). En l os 114 paci entes
se i nstauró tratami ento en el momento del i ngreso con 20 mg/kg cada
OBJETIVO. Evaluar la utilidad de un método de PCR rápido y
sencillo aplicado al diagnóstico de la meningoencefalitis
herpética en la población pediátrica.
PACIENTES Y MÉTODO. Se procesaron 123 muestras de líquido
cefalorraquídeo de 114 pacientes pediátricos atendidos en
el Hospital Sant Joan de Déu de Barcelona con sospecha
clínica de meningoencefalitis vírica o interés en descartar
la etiología herpética. Se utilizó como técnica diagnóstica
la amplificación por PCR de una región altamente
conservada del gen ADN polimerasa común a herpes 1 y 2,
además de los métodos clásicos. En todos los pacientes se
instauró tratamiento en el momento del ingreso con
aciclovir en espera de los resultados de la PCR. Si el
resultado era negativo, tras una adecuada revaluación
clínica se consideraba la retirada del tratamiento con
aciclovir; si era positivo se continuaba el tratamiento
durante 20 días.
RESULTADOS. El ADN de herpes simple se detectó en
4 pacientes. La evolución clínica de los enfermos confirmó
los resultados de la PCR en todos los casos, tanto en los
negativos como en los positivos. La entrega de los
resultados de PCR se realizó en un rango de tiempo de
6,30 a 72 h (media, 18 h).
CONCLUSIÓN. La aplicación de esta técnica de PCR, con un
formato sencillo y rápido, adecuado a la rutina diaria de un
laboratorio de microbiología contribuye a realizar un
diagnóstico precoz o, en su defecto, exclusión de la
etiología por herpes simple de la meningoencefalitis.
Palabras clave: PCR. Meningoencefalitis. Herpes simple.
Pediatría.
Rapi d di agnosi s of herpeti c meni ngoencephal i ti s by PCR
OBJECTIVE. To evaluate the usefulness of a rapid and simple
PCR method in the diagnosis of herpetic
meningoencephalitis in a pediatric population.
PATIENTS AND METHODS. One hundred twenty-three
cerebrospinal fluid samples from 114 pediatric patients
attending the Hospital Sant Joan de Déu in Barcelona for
Correspondenci a: Dra. C. Muñoz-Al magro.
Servi ci o de Mi crobi ol ogí a. Hospi tal Sant Joan de Déu.
P.º Sant Joan de Déu, 2. 08950 Espl ugues de Ll obregat. Barcel ona.
Correo el ectróni co: cma@hsjdbcn.org
Manuscri to reci bi do el 15-06-2001; aceptado el 5-09-2001.
110 Enferm I nfecc Mi crobi ol Cl i n 2002;20(3):110-2
Documento descargado de http://zl.elsevier.es el 11/03/2014. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.
8 h por ví a i ntravenosa de aci cl ovi r en espera de l os resul tados de l a
PCR y de l a evol uci ón cl í ni ca.
El di agnósti co de l os paci entes se basaba en datos cl í ni cos,
car acter í sti cas del l í qui do cefal or r aquí deo (LCR) y del
el ectr oencefal ogr ama, estudi os de neur oi magen y estudi o
mi crobi ol ógi co medi ante PCR herpes vi rus 1 y 2.
Si el r esul tado de l a PCR er a negati vo, se consi der aba l a r eti r ada
del tr atami ento con aci cl ovi r tr as efectuar una r eval uaci ón cl í ni ca
por pedi atras i ntensi vi stas, que val oraban l a evol uci ón cl í ni ca de estas
pr i mer as hor as del paci ente, el r esul tado negati vo de l a PCR y l os
r esul tados del r esto de l as pr uebas r eal i zadas. En l os paci entes
posi ti vos se conti nuaba el tratami ento durante 20 dí as.
Técnica de PCR
Transporte y conservación de las muestras
Las muestras de LCR se procesaron i nmedi atamente después de l a
extracci ón o se conservaron a 4 °C durante un máxi mo de 3 dí as.
Extracción y amplificación del ADN
Se añadi er on 50 ␮l de LCR a 150 ␮l de una sol uci ón de r esi na
Chel ex 100 al 20% (ADN extr acci ón Reagent
®
Labor ator i os Per ki n
El mer).
Los ADN extraí dos fueron ampl i fi cados según el método descri to por
Kessl er et al
2
, sel ecci onando l os primers marcados con di goxi geni na
5Ј -ATCACCGACCCGGAGAGGGAAC y
5Ј-GGGCCAGGCGCTTGTTGGTGTA que ampl i fi can un producto de
91 pares de bases de una regi ón al tamente conservada del gen ADN
polimerasa común a herpes 1 y 2.
Se añadi eron 20 ␮l del extracto de ADN a 80 ␮l de mezcl a maestra
(PCR ELI SA DI G l abel i ng R, Boehr i nger Mannhei n) que contení a
10 mmol /l de Tr i s-HCL (pH 8,3), 50 mmol /l de KCL, 1,5 mmol /l de
MgCl
2
, 0,2 mmol /l de dATP, 0,2 mmol /l de dCTP, 0,2 mmol /l de dGTP,
0,19 mmol /l de dTTP y 0,01 mmol /l de DI G-dUTP, 0,5 ␮mol /l de cada
primer y una uni dad de Taq pol i mer asa. La ampl i fi caci ón consi sti ó
en 30 ci cl os de desnatural i zaci ón a 95 °C durante 30 s, ani l l ami ento de
l os primers a 50 °C durante 30 s, y extensi ón a 72 °C durante 15 s. El
ci cl o fi nal i ncl uí a una extensi ón a 72° durante 7 mi n.
Detección por hibridación colorimétrica
Se uti l i zó el equi po de PCR ELI SA DI G detecti on
®
, Boehr i nger
Mannhei n, empl eando l a sonda bi oti ni l ada:
5Ј-GAGTTTGTCCTCACCGCCGAACTGAGCAG. Se consi der ó como
r esul tado posi ti vo absor banci as super i or es a 0,500 OD, negati vo
absor banci as i nfer i or es a 0,200 OD y r esul tado i ndeter mi nado
absorbanci as entre 0,200 y 0,500 OD.
Controles positivos y negativos
En cada ser i e se i ncl uyó un contr ol negati vo (50 ␮l de suer o
fi si ol ógi co) y un control posi ti vo. Para el control posi ti vo se procesaron
50 ␮l de una sol uci ón cuanti fi cada de un cul ti vo posi ti vo par a vi r us
herpes si mpl e [VHS]-1 (TCDI D/50/0,1 ml = 21).
Duración de la técnica
La extr acci ón dur ó 25 mi n, l a ampl i fi caci ón 90 mi n y l a detecci ón
180 mi n.
Resultados
El ADN del her pes si mpl e se detectó en cuatr o de l os
114 paci entes estudi ados. En l os 4 casos el r esul tado se
confi rmó con una segunda muestra. En l os 110 paci entes
r estantes todas l as muestr as pr ocesadas r esul tar on
negati vas. La evol uci ón cl í ni ca de l os enfer mos confi r mó
l os r esul tados de l a PCR en todos l os casos, tanto en l os
que se excl uyó l a eti ol ogí a por herpes si mpl e como en l os
cuatr o posi ti vos. La entr ega de l os r esul tados de PCR se
r eal i zó en un r ango de ti empo de 6,30 h a 72 h (medi a,
18 horas).
Discusión
Numerosos estudi os aval an l a uti l i dad de l a PCR para el
di agnósti co de l a meni ngoencefal i ti s herpéti ca, l a cual es
consi derada como técni ca de referenci a por su sensi bi l i dad
y especi fi ci dad
3-5
. En este estudi o r etr ospecti vo hemos
uti l i zado una técni ca de PCR que ha contr i bui do a
descartar l a eti ol ogí a por herpes si mpl e en 110 paci entes a
l as pocas hor as del i ngr eso. El di agnósti co pr ecoz de l os
4 ni ños con encefal i ti s her péti ca fue de evi dente uti l i dad
par a el pedi atr a. Es de destacar que esta i nfor maci ón
pr ecoz ha contr i bui do a r aci onal i zar el uso de aci cl ovi r
compl etando el tratami ento sól o l os paci entes en l os que se
confi rmó l a eti ol ogí a herpéti ca de l a encefal i ti s, con l o que
se evi tar on l os efectos secundar i os i nher entes al
tr atami ento con aci cl ovi r en l os enfer mos con encefal i ti s
no herpéti ca y se contuvo el coste económi co. El coste del
tratami ento i ntravenoso con aci cl ovi r es el evado; así , para
un paci ente de 30 kg, una dosi s de aci cl ovi r cuesta
19 euros, un dí a de tratami ento 57 euros y el tratami ento
compl eto dur ante 20 dí as 1.141 eur os, si n consi der ar
gastos i ndi r ectos de per sonal de enfer mer í a
(admi ni str aci ón del fár maco) o del contr ol anal í ti co del
tr atami ento. El coste de nuestr a PCR, pr ocesándose al
momento o con l a menor demor a posi bl e e i ncl uyendo
2 control es por muestra, fue de 50 euros. I ndudabl emente,
esta estrategi a de reti rada del tratami ento con aci cl ovi r se
debe real i zar con prudenci a, tras l a adecuada eval uaci ón
por pedi atras que val oran en conjunto l a evol uci ón cl í ni ca
y l os r esul tados de todas l as pr uebas r eal i zadas. No hay
que ol vi dar que esta PCR es una técni ca muy sensi bl e pero
con sus l ógi cas l i mi taci ones. Se han descr i to en l a
bi bl i ografí a casos de fal sos negati vos
6,7
, en especi al por l a
pr esenci a de posi bl es i nhi bi dor es. La detecci ón de
i nhi bi dor es en l a mezcl a de r eacci ón podr í a r eal i zar se
uti l i zando contr ol es i nter nos de l a ampl i fi caci ón, l o que
aumentarí a l a seguri dad del resul tado de l a técni ca.
Debi do a que l a tecnol ogí a de PCR es muy si mi l ar para
l a mayorí a de l os agentes i nfecci osos, l a i ncorporaci ón de
esta técni ca par a el di agnósti co de enfer medades menos
fr ecuentes, como l a encefal i ti s her péti ca, no i mpl i có
gl obal mente una mayor carga asi stenci al en l a uni dad de
PCR de nuestro hospi tal . En general , l a tecnol ogí a de PCR
es r el ati vamente r ápi da, per o exi sten var i aci ones
i mportantes en l a duraci ón de l a técni ca según el método
de extr acci ón escogi do y el si stema de detecci ón del
pr oducto ampl i fi cado. El pr otocol o que hemos apl i cado
destaca por su senci l l ez y rapi dez, l a extracci ón con Chel ex
100, con una dur aci ón de tan sól o 25 mi n y mí ni ma
mani pul aci ón. Resul ta i nter esante por que r educe l a
posi bi l i dad de fal sos posi ti vos, ya que l a contami naci ón
en este ti po de técni cas se rel aci ona con el número de veces
y el ti empo en que se mani pul a l a muestra
8
. Se sel ecci onó
par a l a ampl i fi caci ón una secuenci a del gen de l a ADN
pol i merasa común a herpes si mpl e 1 y 2 debi do a que l os
dos vi rus pueden ser causa de encefal i ti s herpéti ca, si endo
si mi l ar el manejo cl i ni coter apéuti co, y por que exi ste
abundante i nfor maci ón sobr e l a sensi bi l i dad y
Muñoz-Al magro C, et al . Di agnósti co rápi do de l a meni ngoencefal i ti s herpéti ca medi ante PCR
Enferm I nfecc Mi crobi ol Cl i n 2002;20(3):110-2 111
Documento descargado de http://zl.elsevier.es el 11/03/2014. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.
especi fi ci dad de l a ampl i fi caci ón de esta zona del genoma
del vi r us del her pes si mpl e
2
. Respecto al si stema de
detecci ón el egi do, es de destacar el i ncr emento de
sensi bi l i dad que ofr ece l a hi br i daci ón del mater i al
ampl i fi cado
9
con sondas especí fi cas y l a l ectura objeti va de
l os r esul tados. En nuestr a ser i e, todos l os r esul tados
posi ti vos pr esentaban absor banci as super i or es a 2 OD y
l os negati vos i nferi ores a 0,150 OD si n que se encontraran
resul tados i ndetermi nados.
En r esumen, l a apl i caci ón de esta técni ca de PCR, con
un for mato senci l l o y r ápi do, adecuado a l a r uti na di ar i a
de un l abor ator i o de mi cr obi ol ogí a, contr i buye a r eal i zar
un di agnósti co pr ecoz o, en su defecto, l a excl usi ón de l a
eti ol ogí a por her pes si mpl e de l a meni ngoencefal i ti s,
i ncr ementando l a cal i dad de l a asi stenci a a estos
paci entes.
Bibliografía
1. Wi thl ey RJ. Vi ral encephal i ti s. N Engl J Med 1990;323:242-50.
2. Kessl er HH, Pi erer K, Weber B, Sakrauski A, Santner B, Stuenzner D, et al .
Detecti on of herpes si mpl ex vi rus DNA from cerebrospi nal fl ui d by PCR and a
rapi d, nonradi acti ve hybri di zati on techni que. J Cl i n Mi crobi ol 1994;32:1881-6.
3. Tang YW, Mi tchel l PS, Espy MJ, Smi th TF, Persi ng DH. Mol ecul ar di agnosi s
of her pes si mpl ex vi r us i nfecti ons i n the centr al ner vous system. J Cl i n
Mi crobi ol 1999;37:2127-36.
4. Mi tchel l PS, Espy MJ, Smi th TF, Toal DR, Rys PN, Ber bar i EF, et al .
Labor ator y di agnosi s of centr al ner vous system i nfecti ons wi th her pes
si mpl ex vi r us by PCR per for med wi th cer ebr ospi nal fl ui d speci mens. J Cl i n
Mi crobi ol 1997;35:2873-7.
5. Read SJ, Jeffery KJ, Bangham CR. Asepti c meni ngi ti s and encephal i ti s: the
rol e of PCR i n the di agnosti c l aboratory. J Cl i n Mi crobi ol 1997;35:691-6.
6. Geffner D, Lago A, Moreno R, Pardo F. Negati ve pol ymerase chai n reacti on i n
2 cases of herpeti c encephal i ti s.Med Cl i n (Barc) 1995;105:155.
7. Atki ns JT. HSV PCR for CNS i nfecti ons: pearl s and pi tfal l s. Pedi atr I nfect Di s
J 1999;18:823-4.
8. Kwok S. Avoi di ng fal se posi ti ve wi th PCR. Nature (London) 1989;339:237-8.
9. Li nde A, Kl apper PE, Monteney P, Echevar r i a JM, Ci nque P, Rozenber g F,
et al . Speci fi c di agnosti c methods for her pesvi r us i nfecti ons of the centr al
nervous system: a consensus revi ew by the european uni on concerted acti on
on vi rus meni ngi ti s and encephal i ti s. Cl i n Di ag Vi rol 1997;8:17-29.
Muñoz-Al magro C, et al . Di agnósti co rápi do de l a meni ngoencefal i ti s herpéti ca medi ante PCR
112 Enferm I nfecc Mi crobi ol Cl i n 2002;20(3):110-2
Documento descargado de http://zl.elsevier.es el 11/03/2014. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.