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LA ACETILCOLINESTERASA COMO LA DEL MSCULO ESQUELTICO EN

EL MSCULO LISO REINERVADO POR UN NERVIO MOTOR





Los msculos esquelticos contienen varias formas moleculares de acetilcolinesterasa
(AChE) caracterizadas por diferentes coeficientes de sedimentacin
1-4
. En los msculos de rata
1. 2

(pero no en msculos humanos
3
ni de gallina
5
) la intensa forma de AChE est presente
exclusivamente en las regiones de la placa motriz terminal. En contraste, la intensa forma de AChE
no ha sido detectada en msculos lisos de gatos
6
ni rata
2
. La placa terminal AChE de msculo
esqueltico de rata es selectivamente separada por tratamiento de colagenasa
1. 7
, una enzima que ha
sido demostrada especficamente para digerir la cola de tipo colgeno de la intensa forma de AChE
de varas fuentes
8. 9
La presencia de placa terminal de AChE es neuronalmente regulada
10
y hay
evidencia que este efecto est parcialmente mediado por la actividad muscular
11
y por un factor
trfico transmitida por el transporte exoplasmtico
12. 13
. Resultados previos de nuestro laboratorio
han demostrado que la reinervacin de la membrana nictitante del msculo liso de gato por un
nervio motor resulta en un aumento de la actividad de AChE
14
. Reportamos aqu que el tratamiento
de colagenasa separa el AChE del msculo liso reinervado de gato por un nervio motor colinrgico,
y que una nueva forma de AChE con un gran coeficiente de sedimentacin es inducido en estos
msculos. Nuestros resultados sugieren que la presencia de los nervios motores determina, en
msculos lisos reinervados, la aparicin de un AChE similar a aquel encontrado en msculos
esquelticos.

El ganglio simptico cervical superior fue retirado de gatos adultos, el nervio hipogloso fue
seccionado y el tronco central suturado a las fibras postganglionares del ganglio cervical superior.
Detalles del procedimiento experimental figuran en otra parte
14
. Siete meses despus de la
operacin, tanto el nervio hipogloso como el nervio preganglionar fueron estimulados para
confirmar que los msculos lisos fueron reinervados exclusivamente por el hipogloso. En todos los
casos, la membrana nictitante y la pupila respondieron solo a la estimulacin del hipogloso. La
musculatura lisa de las dos membranas nictitantes fueron removidas para ensayo de AChE
15
. En una
serie, msculos reinervados y de control fueron incubados in vitro a 37 en un medio
6
conteniendo
colagenasa a 0.2 mg ml
-1
(preparacin de tipo III, 400 U mg
-1
, Sigma). Usamos la tcnica de
digestin con colagenasa la cual es conocida por separar selectivamente la AChE de las placas
motrices terminales, dejando la AChE de la placa no terminal intacta
7
. En otra serie de
experimentos, homogeneizados de msculo liso reinervado y normal fueron sedimentados en una
gradiente lineal (5-20%) de sacarosa siguiendo el mtodo de Martin y Ames
17
. Se usaron soluciones
de sacarosa (Schwarz-Mann, grado de enzima especial) conteniendo NaCL-Triton X-100
1
. La
actividad especfica de AChE en msculos de control fue de 0.57 nmol
3
H-acetato por min por mg
de protena, mientras que en msculos reinervados incremento a 1.23. Los msculos lisos
reinervados por un periodo ms largo (10 meses) mostraron un ms alto nivel de AChE, alcanzando
una actividad especfica de hasta 3.1 (ref.18).
Los msculos lisos reinervados incubados con colagenasa liberaron una cantidad de AChE
proporcional al tiempo de incubacin mientras que los msculos de control no mostraron ninguna
actividad de AChE solubilizado (Fig. 11). Es conocido que la colagenasa interrumpe la membrana
basal de la fibra muscular
19, 20
, y libera AChE de la placa motriz terminal la que se localiza
parcialmente dentro de la lmina basal en la unin neuromuscular
21
. El desprendimiento enzimtico
de la AChE activa de los msculos lisos reinervados sugiere que la nueva forma enzimtica es
probablemente anclada a un material como lmina basal - como ha sido propuesto para las formas
de AChE que presentan sensibilidad a la colagenasa
8
y corresponderan a una forma de alto
coeficiente de sedimentacin, similar a la forma de AChE especfica para la placa motriz terminal
de rata
1
. Los experimentos de liberacin de AChE, sin embargo, no entregaron informacin
estructural definitiva ya que la colagenasa comercial estn contaminadas con varias proteasas
22
. Las
formas moleculares de AChE presentes en msculos lisos reinervados fueron por consiguiente
identificadas por anlisis de velocidad de sedimentacin. La Figura 2 muestra que una nueva
intensa forma de AChE aparece en los msculos lisos reinervados por un nervio motor colinrgico.
Esta forma intensa de AChE que probablemente corresponde a la forma asimtrica A
12
de Bon et
al.
8
, que cuenta como el 9% de la actividad total y representa ~25% del aumento total de AChE en
los msculos reinervados. Como la forma intensa de AChE no est presente en los msculos lisos
normales
6
, es probable que las especies separadas por la colagenasa correspondan a estas formas de
alto coeficiente de sedimentacin
23
. Los presentes resultados muestran que un nervio motor puede
inducir en el msculo liso una forma de AChE similar a aquel encontrado en el msculo
esqueltico. Como innervacin por un nervio motor colinrgico es un factor comn para msculos
lisos reinervados y msculos esquelticos, nuestros resultados sugieren que el nervio motor es capaz
de regular la AChE en cualquier musculatura que inerva.





Fig. 1 Liberacin de AChE de los msculos lisos inferiores de la membrana nictitante como una funcin de tiempo de
incubacin. Condiciones experimentales: msculo liso normal de la membrana nictitante con colagenasa () y sin
colagenasa (), msculo liso reinervado de la membrana nictitante con colagenasa () y sin colagenasa (). Muestras de
msculo liso (15-20 mg) fueron incubados a 37C en 300 l de un medio conteniendo 138 mM NaCl, 4mM KCl, 1 mM
MgSO
4
, 50 mM fosfato de sodio (pH 7.5), 0.1 mg ml
-1
cloranfenicol, y 0 o 5 M BW 284C51 dibromida. Colagenasa (0.2
mg ml
-1
) fue agregada al medio de incubacin de algunas muestras musculares. En distintos tiempos, alcotas duplicados
de 10 l medios de incubacin fueron removidos para ensayos de AChE
15
. Subsecuentemente, las muestras musculares
fueron homogeneizadas 1/15 (w/v) en buffer congelado pH 7.3 (1 M NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.05 M Tris-HCl, 0.2 mM
EDTA) para determinar la actividad de la AChE. El monto absoluto de AChE en muestras incubadas no es la misma para
las diferentes situaciones experimentales estudiadas, por lo tanto para evaluar comparativamente la liberacin de AChE en
cada caso
16
la cantidad inicial de enzima presente en las muestras debe considerarse. % flujo salida de AChE:













AChE activity (%efflux)
Actividad AChE (% flujo de salida)

Time of incubation
Tiempo de incubacin
Varios mecanismos diferentes pueden estar en regulacin neural de la AChE: (1) actividad
neuronal; (2) acetilcolina en s; (3) liberacin de AChE del nervio terminal; y (4) control
neurotrfico. Estos cuatro mecanismos son discutidos a continuacin:
(1) Actividad ha sido demostrado que juega un papel en la modulacin de AChE en el cultivo de
msculo de pollo
24
, y estimulacin de la actividad muscular puede inducir manchas de AChE en
msculos de rata
11
. La forma 16S AChE reaparece en la placa terminal original en msculos
denervados, despus de reinervar en un sitio diferente
25
. Una posible es explicacin para esto es que
la actividad muscular estimula la sntesis o estabilizacin de AChE 16S en sitios en el msculo
previamente determinados por el contacto del nervio
25. 26
. Lmo y Slater
11
sugieren que la actividad
muscular podra convertirse en sntesis de la unin de AChE adems de apagar la sntesis de los
receptores de uniones adicionales de acetilcolina en msculos esquelticos de rata. Sabemos que la
reinervacin de la membrana nictitante del msculo liso por un nervio motor colinrgico
determinan tanto una disminucin en la hipersensibilidad al acetilcolina
27
, y la induccin de una
intensa forma de AChE; por lo tanto, el efecto sugiri para la actividad muscular en msculos
esquelticos
11
puede tambin aplicarse en msculos lisos reinervados por un nervio motor.
Recientemente, sin embargo, se ha demostrado que, en la rata, la placa terminal de la forma AChE
16S est influenciada por el largo del tocn del nervio
28
. Como los msculos se vuelven inactivos
en el momento de la seccin del nervio, independientemente de la longitud del tocn del nervio, se
deduce que la placa terminal de la forma de AChE S16 tambin depende en el mecanismo de
actividad independiente
28
.
(2) Acetilcolina per se no parece ser un factor importante en la regulacin de AChE: durante la
reinervacin del msculo esqueltico con fibras preganglionares parasimpticas colinrgicas, la
AChE disminuyo y casi desapareci cuando la reinervacin fue completada, a pesar de la liberacin
de acetilcolina normal
30
.
(3) Liberacin de AChE neural ha sido demostrada en el nervio frnico hemidiafragma
31
. Aunque
el nervio motor contiene una intensa forma de AChE
32. 33
, solo la forma 10S de AChE ha
demostrado ser liberada de las terminales nerviosas. Evidencia que una forma intensa de AChE es
transportado por un flujo axonal fue obtenido estudiando la acumulacin de material en el mun
proximal de un nervio daado
32
, as que es posible que una intensa forma de AChE es producida
localmente ya sea en Schwann o en otras clulas extra-axonales, en el sitio del mun herido. En
este contexto, ha sido recientemente demostrado que la fosfato acida de clulas gliales es
transportada a axones daados
34
. En cualquier caso, como el flujo axonal es un importante mediador
en la regulacin neurotrfica de la unin de AChE
12
, el nervio motor que inerva el msculo liso de
la membrana nictitante proveera una fuente para la intensa forma de AChE.
(4) Sustancias trficas de AChE
35. 36
son llevadas por transporte exoplasmtico
12. 13
y en nervios
motores un factor trfico ha sido detectado el cual es capaz de mantener el nivel de AChE en
cultivos de msculo embriotico aneural o msculos adultos denervados de gallina
36
. Por otra parte,
un factor trfico, aparte de la AChE, aislado del nervio frnico de rata y transportado por un flujo
axonal, ha demostrado mantener el nivel de la placa terminal de AChE en los cultivos de tejido del
diafragma de rata
13
. Este descubrimiento sugiere fuertemente que una sustancia diferente de la
AChE, transportada por un flujo axonal a la terminal nerviosa, sera un factor importante en la
regulacin neurotrfica de la placa terminal de la AChE. El efecto que observamos en el msculo
liso reinervados puede ser parcialmente mediado por un factor similar. Por lo tanto, los nervios
motores regulan la AChE, pero los nervios parasimpticos
30
no poseen esta capacidad. Adems, los
nervios motores pueden inducir coeficiente de alta sedimentacin de AChE, similar a la forma
especfica de las placas terminales motoras de rata, como ha sido reportado para placas terminales
de msculos denervados
2
, segmentos no sinpticos de los msculos esqueleticos
2
, placas terminales
originales en msculos denervados despus la reinervacin en un lugar diferente
25
, cultivos
primarios de clulas musculares de rata
37
, y msculo liso (en este trabajo).


Fig. 2 La velocidad de sedimentacin de los extractos de msculo liso en una gradiente de sacarosa. Perfil de actividad de
AChE de: a, control de musculo liso; b, msculo liso reinervado. Msculo liso (~10 mg) fue homogeneizado en buffer
congelado de NaCl-Triton, pH 7.3 (1M NaCl, 0.5% Triton X-100, 0.05M Tris-HCl, 0.2 mM EDTA). Despus de varias
veces de extraccin de enzima, muestras de 0.2 ml (2.4 mg de protenas) fueron capas en gradientes (5-20%) lineal de
sacarosa, en la presencia del mismo buffer como para homogeneizacin y sujeta a la velocidad de sedimentacin. Se
realiz ultracentrifugado en un Beckman L5-65 ultracentrfuga, con un rotor SW 65 a 39.000 r.p.m. por 12 horas a 20|C.
Un volumen de 0.05 ml de cada fraccin fue ensayada para actividad de AChE. La actividad fue mesurada por un
procedimiento radioqumico en el cual la liberacin de
3
H-acetato de
3
H-ACh yoduro (NEN, 50 mCi mmol
-1
) fue
cuantificado por intercambio inico cromatogrfico y espectroma de centelleo
15. 16
. La actividad de AChE es expresado
en unidades arbitraras. En nuestras condiciones de ensayo estndar la hidrlisis de acetilcolina fue inhibidor de la
actividad de AChE. La catalasa, usada como marcador de enzima (11.3S), fue determinada colorimetricmente
38
y las
protenas por el mtodo de Lowry et al.
39
. La flecha representa la posicin de la catalasa.


Agradecemos a los Dres. H. L. Fernndez, J. Koening, T. Lmo y a J. Massouli por hacer
sus resultados disponibles antes de la publicacin. Esta investigacin fue respaldada por becas de
UNDP/UNESCO, DIUC y Gildemeister Foundation.

NIBALDO C. INESTROZA
BERNARDITA MENDEZ
JOAQUIN V. LUCO

Laboratorio de Neurofisiologa,
Departamento de Biologa de la clula,
Universidad Catlica,
Santiago, Chile

INFORMACIN RELEVANTE


Reinervaciones Cruzadas y la Induccin Molecular
El cmo un nervio motor modifica la expresin molecular en un msculo liso,
con el que nunca tuvo contacto previo, es otro tema de investigacin que Luco
persigui por aos. Conceptualmente, este trabajo se inserta en el postulado de
que la adecuada funcin del Sistema Nervioso depende del desarrollo y la
mantencin de conexiones especficas entre clulas nerviosas y sus rganos
inervados. As en 1957, Christian Vera, Juan Vial y Luco publicaron en
el Journal of Neurophysiology, que la membrana nictitante del gato formada por
musculatura lisa e inervada por fibras adrenrgicas provenientes del ganglio
cervical superior, poda ser reinervada por fibras colinrgicas motoras, los
msculos lisos reinervados eran capaces de contraerse y perdan la
hipersensibilidad a la adrenalina. Diez aos ms tarde, junto a Ana Mara Lennon
mostraban que la acetilcolinesterasa aumentaba a valores no observados
previamente en un msculo liso; finalmente en 1979, quien les habla, junto a
Bernardita Mndez y Luco publicamos en la revista Nature, que el nervio motor
era capaz de inducir en el msculo liso reinervado, una forma sinptica de la
acetilcolinesterasa, llamada 16 S o forma asimtrica, que solo se encuentra en la
unin neuromuscular de los msculos esquelticos. De esta manera, tomaba
forma el concepto que Luco imaginara muchos aos antes:
El nervio motor posee propiedades inductivas que definen la expresin gnica
de macromolculas relevantes a la funcin neural en el elemento inervado.
RELAJACIN
Despus de la contraccin, dos cambios permiten que la fibra muscular vuelva a relajarse.
La acetilcolina es rpidamente degradada por una enzima llamada acetilcolinesterasa, la
AchE se encuentra en la hendidura sinptica. Cuando los potenciales de accin cesan en
la neurona motora, no se libera ms Ach, y la AchE degrada con rapidez la Ach ya
existente en la hendidura sinptica, lo que ocasiona la relajacin del msculo.




Resumen de la accin de la AchE en la relajacin muscular
Cuando una neurona motora, libera ACh, se produce una cascada de reacciones en el msculo
que acaba con el acortamiento de las fibras msculos, para que se produzca la relajacin del
msculo, es necesario que se libere una sustancia antagnica que elimina ACh, la
Acetilcolinesterasa.





La gradiente de sacarosa permite separar fracciones celulares en relacin a su densidad
En // // utilizan la colagenasa, para obtener resultados ms precisos ya
que su funcin permite degradar nicamente acetilcolinesterasa
Actividad muscular, acetilcolina presente, factor neurotrfico