TIPAJE HLA DE CLASE I POR MICROLINFOCITOTOXICIDAD

1.- INTRODUCCIN

El mtodo de microlinfocitotoxicidad es el ms empleado para la determinacin de molculas de
histocompatibilidad de clase I. Las molculas de clase II han dejado prcticamente de clasificar por este
mtodo y actualmente se identifican por PCR-SSO o procedimientos similares. La tcnica se basa en la
incubacin en pocillos de las clulas problema con una batera de antisueros que contienen anticuerpos
anti molculas HLA especficas. Los anticuerpos se unirn a las molculas HLA de la superficie de las
clulas, en caso de reaccin positiva, y activarn el sistema del complemento. El depsito de
complemento sobre la membrana de las clulas producir su lisis.

Para determinar si las clulas estn lisadas (reaccin positiva) o vivas (reaccin negativa) se
aaden dos fluorocromos que se intercalan en el DNA de las clulas: bromuro de etidio (BE), que penetra
slo en las clulas muertas y emite fluorescencia roja, y el naranja de acridina (NA), que penetra en todas
las clulas y emite fluorescencia verde. Al observar los pocillos con un microscopio de fluorescencia
invertido, se podr determinar en cada uno de ellos si las clulas estn vivas (FL verde) y por tanto
reaccin negativa, o lisadas (FL roja que enmascara a la FL verde) y por tanto reaccin positiva.

Las clulas que se emplean habitualmente en los estudios de histocompatibilidad son los
linfocitos. La razn es que se aslan fcilmente de sangre perifrica, o de bazo y ganglios linfticos si se
trata de donantes cadveres, y mantienen su viabilidad varios das in vitro. Los anticuerpos para tipaje
proceden de multparas y con frecuencia reconocen ms de una especificidad HLA, aunque cada vez est
ms extendido el uso de anticuerpos monoclonales. Debido al alto polimorfismo allico, para determinar
el tipaje HLA de un individuo, se suelen utilizar 200 o ms antisueros distintos, empleando siempre ms
de uno para cada especificidad.

2.- OBJETIVOS

Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de:

- Distinguir clulas viables y lisadas en un ensayo de citotoxicidad
- Identificar los alelos expresados segn los patrones de reaccin
- Reconocer la reactividad cruzada
- Establecer un tipaje de clase I

3.- EQUIPAMIENTO Y REACTIVOS

- Microscopio invertido de fluorescencia
- Placas Terasaki
- Batera de antisueros anti molculas HLA de clase I
- Control negativo (suero AB diluido en medio de cultivo)
- Control positivo (poliespecfico)
- Tubos de poliestireno de 5ml y gradilla.
- Pipetas de 2-20l y puntas (alternativamente, Dispensador Hamilton)
- Tubos eppendorf
- Parafina lquida
- Complemento
- Mezcla Hemoglobina/BE/NA/EDTA
- Sangre perifrica anticoagulada o clulas ya aisladas

4.- PROCEDIMIENTO

1.- Aislar linfocitos ms monocitos de sangre perifrica por centrifugacin en Lymphoprep (Ficoll-
Hypaque, ver protocolo) y ajustar a 3*10
6
clulas/ml.

2.- En una placa Terasaki de 60 pocillos pipetear (*) 6 l de parafina lquida en los pocillos que se van a
usar, segn la planilla que facilita el Profesor

3.- Pipetear 3.5 l de cada antisuero en su pocillo respectivo, segn la planilla. La punta de la pipeta debe
colocarse a 45 grados y tocar el fondo del pocillo.

4.- Pipetear 4 l de clulas por pocillo cuidando de que se mezclen con la "gota" de antisuero.

5.- Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.

6.- Pipetear 6 l de complemento por pocillo, cerciorndose de que se mezcla con las clulas y el
antisuero.

7.- Incubar 1 hora a temperatura ambiente o 30 minutos a 37C.

8.- Pipetear 5 l/pocillo de la mezcla BE/NA diluida en hemoglobina/EDTA

9.- Leer al microscopio de fluorescencia a bajo aumento (100x).

(*) Todos lo pipeteos deben hacerse hasta el primer golpe para evitar burbujas.

5.- INTERPRETACIN

Muchos de los antisueros que se emplean en histocompatibilidad dan reacciones dbiles, de modo
que no lisan a todas las clulas positivas para la molcula HLA en cuestin. Al leer los pocillos al
microscopio se asigna a cada uno una "puntuacin" de acuerdo con el siguiente criterio:

% de clulas lisadas
en el pocillo Puntuacin Interpretacin

0-10 1 Negativo
10-20 2 Negativo dudoso
20-50 4 Positivo dbil
50-80 6 Positivo
80-100 8 Positivo fuerte

En esta prctica se simplificar la lectura asignando a los pocillos la calificacin:
POSITIVO (mayora de clulas lisadas), NEGATIVO (mayora de clulas viables) o DUDOSO.

HLA-A HLA-B HLA-C
A B C D E F A B C D E F A B C D E F
1 AB
(C-)
POL
(C+)
A1 A2 A2
+ 28
A3 1 AB
(C-)
POL
(C+)
B7 B8
+ 59
B12 B13 1 AB
(C-)
POL
(C+)
Cw1 Cw2 Cw2
+ 6
Cw3
2 A30
+ 31
+ 74
A11 A10
+ 34
+ 66
A25 A23 A9 2 B57
+ 58
B51
+ 52
B35 B40
+ 48
B27
+ 57
+A3
B18 2 Cw1
(N)
Cw6
+4
(N)
Cw6
+4
Cw5 Cw4 Cw4
+2
3 3 3
4 4 4
5 5 5
6 6 6
7 7 7
8 8 8
9 9 9
10 10 10