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Mtodos

1.- Agrobacterium tumefaciens: La tcnica indirecta ms


usada es la transformacin de clulas mediante la
bacteriaAgrobacterium tumefaciens. Esta bacteria vive en el
suelo y produce en las plantas dicotiledneas una
enfermedad tumoral llamada "agalla de cuello". Cuando
contacta con las clulas de la planta les transfiere un
segmento de ADN del plsmido Ti (inductor de tumores) que
contiene la bacteria. Este plsmido puede integrarse en uno o
ms cromosomas de las clulas vegetales, por lo que puede
utilizarse como vector de genes que se deseen introducir en
plantas de especies dicotiledneas. La clula que recibe
genes extraos puede regenerar una planta entera mediante
la tcnica de la micropropagacin y obtener as una planta
transgnica.

Figura 5: Transferencia de ADN extrao a una clula vegetal
mediante el vector
bacteriano Agrobacterium tumefaciens
2. transformacin biolstica Entre las diversas tcnicas de
transferencia directa de material gentico una de las ms empleadas
es la "de la perdigonada" o transformacin biolstica (ver figura 6).
Se trata de disparar bolitas de oro que llevan fragmentos de ADN
adheridos, con una especie de pistola, sobre una poblacin de
clulas. Las bolitas que queden en el citoplasma pueden trasnferir el
ADN que transportan a algn cromosoma de la clula bombardeada.

Las aplicaciones agrcolas van desde el mejoramiento de procesos
bsicos como la fotosntesis y la fijacin de nitrgeno atmosfrico
por parte de las plantas, hasta la resistencia a herbicidas, agentes
patgenos y factores de estrs (salinidad del suelo, sequa, etc.), as como la obtencin de productos agrcolas de mejor
calidad y caractersticas nuevas.

Figura 6: Obtencin de una planta transgnica por transformacin biolstica

3. Electroporacion. es una tcnica que se basa en la aplicacin de un elevado voltaje a las clulas durante un
periodo de tiempo muy corto. Durante ese tiempo las clulas despolarizan sus membranas y se forman pequeos
orificios por los que penetran las molculas (protenas, DNA,) que se encuentran alrededor. Pasada la
despolarizacin muchas clulas sufren daos irreparables y mueren (en muchos casos ms del 90%) pero algunas (5
al 10% habitualmente) se recuperan y han incorporado las molculas deseadas.
La ventaja de esta tcnica es que se aplica a millones de clulas a la vez y habitualmente se obtienen eficiencias de
entrada de las molculas del 100% de las clulas que sobreviven (centenares de miles a millones). Es una tcnica que
requiere su ajuste fino para cada tipo celular, a fin de determinar las condiciones ptimas de duracin y potencia del
pulso. Se busca siempre el mejor equilibrio entre las condiciones que aseguran la entrada en la clula y las que
maximizan la viabilidad celular. La electroporacin es una tcnica que se basa en la aplicacin de un elevado voltaje a las
clulas durante un periodo de tiempo muy corto. Durante ese tiempo las clulas (en este caso los cigotos) despolarizan
sus membranas y se forman pequeos orificios por los que penetran las molculas de ADN que se encuentran alrededor.
La ventaja de esta tcnica es que se aplica a varios cigotos a la vez y habitualmente se obtienen eficiencias de entrada
del ADN del 100%. Es una tcnica que requiere su ajuste fino para cada tipo celular, a fin de determinar las condiciones
ptimas de duracin y potencia del pulso. Se busca siempre el mejor equilibrio entre las condiciones que aseguran la
entrada en la clula y las que maximizan la viabilidad celular. La eficiencia de la transfeccin por electroporacin esta
mediada por una serie de factores como la magnitud del campo elctrico aplicado, la duracin del pulso elctrico, la
temperatura, la concentracin, el tipo de ADN y la composicin inica del medio (Fig. 1.6).
La electroporacin se ha usado para transferir ADN forneo a espermatozoides bovinos para su uso en transgnesis
mediante inseminacin artificial. A partir de 1986, la electroporacin se ha empleado como el mtodo de eleccin para
la transfeccin de clulas embrionarias totipotentes (embryonic stem cells ES) tanto en experimentos de gene knock-out,
como de reemplazamiento allico y recombinacin de homlogos.
En trminos generales la mayor desventaja de la electroporacin es su costo, ya que la mayora de los equipos
comercialmente disponibles (electroporadores) y los accesorios como cubetas y adaptadores tienen un precio elevado
4. TRATAMIENTO QUIMICO.Es una de las metodologas ms empleada para la introduccin de DNA forneo en
protoplastos y en clulas intactas. Se basa en el uso de compuestos qumicos que induzcan permeabilidad en la
membrana. Para esto, las clulas vegetales deben ser tratadas con la sustancia qumica en las concentraciones y en las
condiciones pre-establecidas. Entre los compuestos qumicos ms empleados tenemos: Polietilenglicol (PEG), Fotostato
de calcio y Poly-L-omotina. Estas sustancias ayudan a inducir permeabilidad en las membranas, mediante la induccin de
poros transitorios o dao reversible de la membrana, lo que permite o favorece el paso del DNA forneo y de
macromolculas, a travs de la membrana hacia el interior de la clula. Esta fue la primera tcnica alternativa que se
emple para transformar gramneas, en la dcada de los 80 (Chakrabarty et al. 2008; Danilova, 2007).
El ms empleado de los compuestos qumicos es el Polietilenglicol (PEG), un agente de fusin que modifica
qumicamente las membranas al interaccionar con los fosfolpidos que las componen. Durante el tratamiento con PEG,
la membrana de la clula es deformada por fuerzas de tensin superficial, causadas por las diferencias de densidades
entre la solucin de PEG y la solucin que contiene los protoplastos a transformar y el DNA forneo que se desea
introducir. Es comn que se emplee un pH alcalino, que contribuye al dao en la membrana; tambin se adicionan iones
de calcio, que facilitan la entrada del DNA forneo al interior de la clula. Pese a que este sistema presenta algunas
desventajas, como baja eficiencia, poca reproducibilidad, requerimiento de protoplastos y toxicidad para las clulas, se
contina empleando intensivamente (Danilova, 2007).
5. Microinyecciones: es una de las tcnicas ms precisas para la introduccin de DNA forneo o de macromolculas
dentro de los compartimentos intracelulares especficos de las clulas. La microinyeccin utiliza microcapilares o
microagujas de vidrio y sistemas de microscopia para depositar el DNA forneo, en el interior de clulas vegetales.
Adems, el hecho que junto al DNA desnudo se puedan inyectar otros elementos genticos, como plastidios,
mitocondrias y cromosomas, hace de la microinyeccin una tcnica interesante y muy til para la transformacin de
plantas. El equipo que se requiere para realizar el proceso de microinyeccin es llamado micro manipulador, compuesto
por un microscopio y por los accesorios de gua, para realiza desplazamientos (Sharma et al. 2002; Holm et al. 2000).
Entre las ventajas que presenta esta tcnica, se han reportado: se puede optimizar la cantidad de DNA descargado; se
puede escoger la clula a transformar; la descarga del DNA forneo es precisa y predecible; el proceso se realiza bajo
control visual; se emplean cantidades micro. Pero tambin presenta algunas desventajas, tales como: solamente una
clula recibe el DNA por cada inyeccin; el manejo de la tcnica requiere personal entrenado y mayor instrumentacin
(Mohan Babua et al. 2003; Larik et al. 2004).
Uno de los grandes avances que se han logrado con este mtodo ha sido la implementacin de microinyeccin de
liposomas, en los que se ha depositado el DNA de inters, facilitando as la descarga o introduccin del DNA forneo en
la clula (Gutirrez et al. 2002; Larik et al. 2004; Rao et al. 2009).

6. Fibras de carburo de silicona Es una metodologa recientemente descrita, en la que se emplean fibras de carburo de
silicona de 10 a 80 m de longitud, con un dimetro de 0,5m, mediante, la cual, el DNA forneo es introducido en las
clulas vegetales, a travs de los poros o agujeros que hacen las fibras de carburo de silicona, que actan como
microagujas. El tamao, la forma y la composicin qumica de las fibras de carburo de silicona es lo que permite que
penetren directamente al interior de la clula, sin ocasionarle dao alguno (Danilova, 2007; Lutsenko, 2005).
La metodologa por la que se realiza el proceso de transformacin empleando las fibras de carburo de silicona es
bastante sencilla; mediante una fuerte agitacin del cultivo celular en suspensin, en presencia del DNA plasmdico y las
fibras de carburo de silicona, se logra que por fuerzas hidrodinmicas penetre a las clulas el DNA forneo y las fibras de
carburo de silicona. Esta tcnica es rpida, sencilla y poco costosa. Aunque es necesario aclarar los mecanismos
moleculares que actan en estas transformaciones, as como ensayar nuevos materiales fibrosos que mejoren los
resultados obtenidos y permitan eliminar el uso del material carburo de silicona que es toxico (Mizuno et al. 2005;
Rao et al. 2009).
7. LASER.
Microlser
El objetivo de esta metodologa es la permeabilizacin de las membranas, que se lleva a cabo mediante la utilizacin de
un chorro de microlser enfocado en el sistema de iluminacin de un microscopio, permitiendo as abrir orificios o poros
transitorios en la pared celular y en la membrana plasmtica de las clulas vegetales, que se desean transformar. As, se
facilita la posterior entrada del DNA forneo hacia el interior de las clulas. Como en este sistema no requiere de
vectores o portadores del DNA de inters, para el proceso de transformacin, se pueden emplear molculas de DNA
lineales (Kajiyama et al. 2007; Mohan Babua et al. 2003).
No hay datos concluyentes acerca de la eficacia de este mtodo. Pero en combinacin con el sistema de biobalstica, se
han obtenido logros importantes en procesos de transformacin. As se emplea este mtodo para abrir poros en los
tejidos vegetales, para que posteriormente los microproyectiles cargados con el Dna forneo, penetre las clulas
vegetales (Kajiyama et al. 2007; Mohan Babua et al. 2003).
3. MODIFICACIONES GENETICAS MS UTILIZADAS PARA LA PRODUCCION DE ALIMENTOS.
En los cultivos genticamente modificados los caracteres expresados con mayor frecuencia son la resistencia a insectos y
la tolerancia a herbicidas. En la prctica agrcola se utiliza desde hace ms de 40 aos la toxina de Bacillus thiringiensis
(Bt) que es una bacteria comn en el suelo31 y tiene la virtud de producir, en su fase de esporulacin, una enorme
cantidad de una protena que se acumula en forma de un cuerpo de inclusin llamada 0 endotoxina. Esta protena tiene
la capacidad de activarse en el intestino de los insectos y resulta altamente especfica contra larvas de ciertos tipos de
insectos.
Se han descrito una gran cantidad de cepas distintas de Bt que generan diferentes endotoxinas cuyos genes han sido
identificados y aislados, por lo que su informacin puede ser fcilmente insertada en plantas. Entre los genes ms
utilizados y que se encuentran presentes en los granos comercializados a granel en el mundo se encuentran: Cry1Ab,
Cry1Ac y CryIIIA.
Los nuevos materiales generados se denominan eventos de transformacin, debido a que se trata de organismos que
provienen de una sola clula transformada genticamente, que tienen insertado el ADN forneo en un sitio particular en
su genoma. En el cuadro 14.3 se presentan tanto los principales cultivos transformados genticamente como los eventos
comerciales de transformacin. Cuando se habla de maz Bt que expresa la toxina Cry1Ab, se encuentran varios eventos
de transformacin, como los denominados Bt11, Bt176 o MON810 que corresponden a distintos disparos de
biobalstica y/o distintas clulas transformadas cada uno realizado en una variedad particular de maz. Es lgico pensar
que en la prctica comercial esos eventos originales de transformacin puedan utilizarse en fitomejoramiento y se
utilicen para hacer retrocruzas. De hecho, en el caso del algodn Bollgard de Monsanto, se utiliz un hbrido
manipulado con Agrobacterium para transferir el gen Cry1Ac con accin contra lepidpteros en la variedad Coker C312.
El evento resultante se denomina MON0531-6 una vez que ha sido retrocruzado, de esta forma es posible generar
variedades comerciales de buen rendimiento y utilidad, ya que stas han sido adaptadas a condiciones ambientales
especficas, y han heredado el carcter transgnico pero conservan el fenotipo til que se busca con la retrocruza. Las
nuevas variedades se consideran como el mismo evento de transformacin, siempre y cuando el inserto se mantenga en
el mismo sitio del genoma donde originalmente se insert.
Los caracteres de inters insertados en los eventos de transformacin comerciales permiten clasificarlos en dos
generaciones de materiales transgnicos, y ambas se encuentran actualmente en el mercado: la primera generacin de
OGMs se ha diseado para obtener un mejor comportamiento agronmico como los cultivos Bt y los resistentes a
herbicidas, que de hecho actualmente dominan el mercado de granos a granel de soya, canola, algodn y maz (cuadro
14.3). Un carcter importante en los eventos de primera generacin lo constituye la resistencia a virus. La primera
estrategia desarrollada fue la expresin de las llamadas protenas de la cubierta viral, que le confieren a la planta
resistencia a la infeccin, y recientemente se manej la modificacin del movimiento sistmico real de las partculas
vricas a travs de toda la planta (cuadro 14.4). Los ejemplos ms comunes de esta estrategia son las papas resistentes a
los virus PVX y PVY, que se analizarn en el apartado 14.7.2. En la primera generacin tambin puede incluirse a los
OGMs que contienen toxinas diferentes de las mencionadas arriba y que confieren resistencia a tipos distintos de
insectos. As mismo, se encuentran ya en el mercado los cultivos que tienen la combinacin de ambas caractersticas:
resistencia a insectos y tolerancia a herbicidas (anexo 1). La segunda generacin tiene por objeto mejorar las variedades
desde un punto de vista nutritivo y sensorial, de lo cual se hablar ms adelante.
Para tener una idea de la popularidad de los granos transgnicos, se puede mencionar que en 2004 se calcularon 81
millones de hectreas cultivadas con estos materiales.
4. PRIMER ALIMENTO GENETICAMENTE MODIFICADO: FlavrSavr
En mayo de 1994 se puso en mercado el primer alimento transgnico. El desarrollo hecho por la compaa
norteamericana Calgene, Inc., tuvo por objeto ofrecer una alternativa a los consumidores no satisfechos con los tomates
disponibles fuera de temporada, cuya apariencia y sabor eran poco atractivos. El tomate es un fruto climatrico en el
que el mecanismo enzimtico de degradacin sedesencadena sbitamente cuando es removido de la planta. Una de las
principales enzimas involucradas en el proceso de decaimiento es la poligalacturonasa, enzima que degrada las paredes
celulares, que provoca un ablandamiento del tejido y, por lo tanto del fruto. Este proceso sucede rpidamente en los
frutos climatricos por lo que es fcil perder su valor comercial. El objeto de la modificacin gentica fue reducir la
expresin normal del gen que codifica para esta enzima, para hacer la maduracin del tomate mucho ms lenta, y
favorecer su comercializacin, al poderse almacenar por largo tiempo. La marca registrada por Calgene fue Flavr Savr.
La construccin gentica presentaba un gen de tomate (Lycopersicon esculentum), que era un fragmento de ADN
antisentido con respecto al gen normal, esto quiere decir que posea una orientacin contraria y una secuencia
complementaria respecto a una porcin del gen fisiolgico, de modo que el producto de este antign sinttico, su ARN
mensajero, se une especficamente al ARN mensajero correspondiente al gen normal de la poligalacturonasa causando
su bloqueo. Al bloquearlo se impide su traduccin, anulando la sntesis de la enzima. La construccin de Calgene
contena como marcador de seleccin un gen de resistencia a kanamicina que, aunque no es un antibitico recetado con
frecuencia, debido a sus efectos colaterales, s podra transferirse la resistencia a bacterias patgenas de importancia en
salud humana, lo que puede suceder con bajsimas probabilidades. Como el primer alimento transgnico fue pionero en
muchas situaciones. La agencia encargada,
en los EUA, de la autorizacin de alimentos, la Food and Drug Administration (FDA), debi desarrollar nuevas tcnicas
analticas y adoptar una serie de medidas pues no podan realizrsele evaluaciones como si fuera un medicamento, pero
tampoco como un tomate natural. En este sentido, la FDA decidi evaluar toxicidad, inocuidad y alergenicidad del
tomate per se, ya que no exista en este caso una protena expresada, sino la expresin bloqueada de una enzima
natural. Se evidenci la inexistencia de modelos animales o experimentales para realizar evaluaciones de riesgos a la
salud humana de este tipo de alimentos. En el caso de alimentos que expresen una toxina o una protena como es el
caso de los granos Bt se realizan experimentos con animales de laboratorio alimentados con una sobredosis de la
protena heterloga, aunque frecuentemente se les alimenta con la protena sobrexpresada en vectores bacterianos y
no la protena directamente extrada del alimento: se utiliza la protena aislada ante la imposibilidad de administrar una
sobredosis del alimento entero. Han pasado ms de 10 aos desde la salida al mercado del primer alimento transgnico,
y desde 1998 se cuenta con maz y soya transgnicos en los EUA y los pases que los importan, y para el mercado de
commodities frecuentemente se autorizan nuevos eventos de transformacin y otros desaparecen, de hecho el tomate
Flavr Savr no se encuentra ms en el mercado pues la variedad fue retirada porque al parecer su sabor no resultaba
atractivo para el consumidor. Otras variedades de tomate altas en slidos, y tiles para ahorrar energa durante la
evaporacin en la produccin de pur que eran utilizadas por la cadena Sansbury en el Reino Unido fueron retiradas del
mercado europeo, no porque fueran poco tiles, sino porque la aceptacin de los alimentos transgnicos en Europa es
difcil y las estrictas reglamentaciones han dificultado la comercializacin y el cultivo de estos materiales. Los problemas
mencionados respecto de los modelos requeridos para hacer evaluaciones no se han resuelto del todo. Ms adelante se
darn algunos detalles sobre evaluaciones de riesgos de los alimentos GM.
10. MODIFICACIONES DE INTERS PARA PRODUCTORES Y PARA EL CONSUMIDOR
Es bien conocido que el consumo de soya produce flatulencia, en muchas personas, debido a su contenido de
oligosacridos que pasan intactos a la parte baja del intestino y all la flora s los degrada produciendo metano, H2 y
otros subproductos de la fermentacin, lo que causa molestos sntomas. Esto limita el consumo de productos no slo de
soya, sino de otras leguminosas como el frijol. La posible solucin es la transformacin de bacterias lcticas (Lactococcus
lactis) con la enzima a-galactosidasa de Lactobacillus plantarum ATCC8014. Actualmente los autores de esta
investigacin evalan la eficiencia de la biotransformacin de rafinosa y estaquiosa en leche de soya con estos
microorganismos GM o in situ en la porcin alta del tracto gastrointestinal de animales al administrar oralmente un
preparado de probiticos GM.34 La industria vitivincola es, como la cervecera, una industria tradicionalista, en la que es
difcil introducir organismos novedosos o modificados genticamente. Sin embargo, la investigacin para modificar
genticamente algunas levaduras ha producido resultados interesantes. Respecto del mejoramiento de las propiedades
sensoriales de las bebidas alcohlicas, Ganga18 y colaboradores construyeron una cepa recombinante que expresaba el
gen de la b-(1,4)-endoxilanasa de Aspergillus nidulans bajo el control de un promotor del gen de actina de levadura que
lograba incrementar el aroma frutal y fue posible detectarlo organolpticamente en el vino producido con la cepa
recombinante. La industria del sake tambin podra beneficiarse de construcciones como las reportadas por Hirosawa,
24 acerca de una levadura autoclonable que sobreexpresaba el gen ATF1 que codifica para el alcohol acetiltransferasa
que mejora el perfil de sabor del sake. En cuestiones del uso de nutracuticos para mejorar la salud, el resveratrol
(cuadro 14.11) es un compuesto fenlico responsable de parte de las bondades del vino tinto en la llamada dieta
mediterrnea y que resulta interesante aadirlo en vinos que no lo contienen como el vino blanco, o en otros
productos alimenticios. Gonzlez-Candelas20 report el uso de levaduras recombinantes que expresaban el gen abfB de
Aspergillus para alfa-L-arabinofuranosidasa, o bien el gen bgIN de Candida molischiana que codifica para la beta-
glucosidasa. Los vinos fermentados con las cepas recombinantes mostraron un incremento total de resveratrol y
derivados, especialmente de sus formas no-glicosiladas.