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CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (CLAE, HPLC)

Yaned Milena Correa Navarro Docente Universidad de Caldas

Cromatografa lquida de alta eficiencia


La fase estacionaria es slida La fase mvil es lquida

Particin o reparto por Adsorcin Intercambio inico Exclusin molecular

Cromatografa lquida de alta eficiencia


Caractersticas y ventajas Trabaja con partculas muy pequeas (< 10 m) Presiones de 1000 - 6000 psi (pounds square inch = libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7) Rpida Picos angostos (alta eficiencia) Separa compuestos no-voltiles o trmicamente inestables

Esquema del equipo de HPLC


INYECTOR BOMBA
DESGASIFICADOR

GUARDA-COLUMNA

COLUMNA

DETECTOR

Parmetros de separacin
Seleccin de la fase estacionaria de la columna Longitud y dimetro de la columna Composicin de la fase mvil Temperatura Rata de flujo Tamao de la muestra

Solventes utilizados como fase mvil Solventes orgnicos, agua/solventes miscibles, agua/soluciones reguladoras

Alta pureza
Tratamiento con He Sistema de Desgasificados desgasificacin al vaco Filtracin

Desgasificacin de la fase mvil

Filtracin

Sistema de desgasificacin al vaco

Funciones de los sistemas de bombeo


Tres funciones primordiales: Proveer flujo precisos y constante (libre de pulsaciones, caudales 0.1 10 mL/min) Proveer composicin precisa de la fase mvil Proveer la fuerza requerida para empujar la fase mvil a travs de la columna finamente empacada (presiones entre 1000 6000 psi) Componentes resistentes a la corrosin (acero inoxidable, tefln)

Sistemas de bombeo

Bomba dual de pistones paralelos Bomba dual de pistones en serie Bombas de diafragma

Bomba recproca o de movimiento alternado


etapa de aspiracin pistn etapa de descarga hacia la columna

fase mvil
Ventajas: pequeo volumen interno, resiste presiones mayores a 10.000 psi, permite elucin con gradiente, caudales constantes e independientes de la contrapresin de la columna y la viscosidad del solvente Desventaja: produce flujo pulsado (amortiguar)

Composicin de la fase mvil

Elucin isocrtica vs elucin con gradiente


Elucin isocrtica: La composicin de la fase mvil se mantiene constante. Elucin con gradiente: Se vara la composicin de la fase mvil de modo determinado. Elucin con

Elucin isocrtica

gradiente

Elucin isocrtica vs elucin con gradiente


Elucin isocrtica Mala resolucin de picos de elucin temprana Incremento en ancho y disminucin de altura de picos, para picos de elucin tarda Tiempos de anlisis largos Elucin con gradiente Optimiza la resolucin general Anchos de bandas iguales y mejor detectabilidad para picos de elucin tarda Tiempos de anlisis ms cortos

Sistemas de inyeccin de muestra

Llenado del bucle


muestra

Inyeccin de muestra en columna

eluyente columna

eluyente columna

Sistemas de inyeccin de muestra

Sistemas de inyeccin de muestra

Tratamiento de la muestra
Filtracin con filtros microporo Extraccin en fase slida

Pre-columna y Guardacolumna

Guarda-columna

Composicin similar a la columna cromatogrfica

Elimina materia en suspensin y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria Se usa para mejorar la vida de la columna. Se reemplaza cuando se contamina.

Columna

Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente de vidrio resistente Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i. Tamao partculas de relleno: 510 m Columnas termostatizadas: en general se trabaja a temperatura ambiente. La temperatura constante mejora el cromatograma

Columna

Columna
Rellenos
Relleno pelicular. Esferas de vidrio o polmero no porosas de 30 40 m de dimetro. En la superficie de las esferas se deposita una capa delgada y porosa de slica, almina, polmero.

Relleno de partculas. Micropartculas porosas de slica, almina o polmero de 3 10 m de dimetro. Se recubren con pelculas orgnicas que unen qumicamente o fsicamente a la superficie.

Eficiencia de la columna

Tamao partculas de empaque

Tamao de muestra

Ensanchamiento extracolumna

Detectores
Basados en la medida de una propiedad del eluyente (ndice de refraccin, constante dielctrica, densidad)

Basados en la medida de una propiedad del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente lmite) Requisitos Sensibilidad adecuada Respuesta lineal amplia Respuesta rpida y reproducible Manejo sencillo

Necesidad de mas de un detectores

Selectividad

Detector de longitud de onda variable

Detector de arreglo de diodos

Detector de fluorescencia

Detector de fluorescencia

Detector de ndice de refraccin

Anlisis cuantitativo en CL y CG
Uso de patrn externo
S

Uso de patrones externo e interno


S P

rea S rea Sx

rea S rea P rea Sx rea P Sx

[S]

Sx P

[S]/[P]

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