1er Encuentro de Jvenes Investigadores en Ciencia y Tecnologa de Materiales Buenos Aires 28-29 Septiembre 2006

INFLUENCIA DE LA MICRO-NANO ESTRUCTURA SUPERFICIAL DEL SUSTRATO SOBRE LA PRODUCCIN DE MATERIAL POLIMRICO EXTRACELULAR Y LA DISTRUBUCIN DE BACTERIAS ADHERIDAS
C. Diaz1(*), M.C. Cortizo1, P.L. Schilardi1, S. Gomez de Saravia1,2, and M. Fernndez Lorenzo de Mele1,3

INIFTA, Fac. de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata (UNLP), Casilla de Correo 16, Sucursal 4, 1900 La Plata, Argentina, Tel 54 221 4257291. 2 CICPBA. 3Fac. de Ingeniera, UNLP. (*) cdiaz@inifta.unlp.edu.ar RESUMEN Frecuentemente se asocian las fallas en biomateriales a la formacin de biopelculas en las superficies de los mismos. El objetivo del presente trabajo es estudiar la adhesin de Streptococcus consortia (bacteria mvil) y Pseudomonas Fluorescens (bacteria no mvil) sobre superficies de diferente naturaleza qumica y con diversas caractersticas topogrficas. Las superficies con micro y nanotopografa fueron realizadas con tcnicas de micro-nanofabricacin. Se investig la influencia de las caractersticas superficiales en la adhesin bacteriana usando microscopa ptica y de epifluorescencia, microscopa electrnica de barrido (MEB) y microscopa de fuerza atmica (AFM). Los resultados mostraron una gran influencia con la naturaleza de la superficie. En el caso de superficies microrugosas, la adhesin bacteriana inicial fue ms significativa que en las lisas, sin embargo las muestras nanoestructuradas mostraron menor adherencia bacteriana. Tambin pudo notarse un cambio significativo en la morfologa y orientacin de las bacterias adheridas a la superficie nanoestructurada. Los resultados muestran el efecto de la naturaleza y topografa del sustrato en la adhesin bacteriana, que depende de la relacin entre la dimensin caracterstica de la rugosidad y el tamao de las bacterias, dando lugar a distintas respuestas biolgicas de importancia qumica. Palabras clave: Biopelcula, Material polimrico extracelular, Adhesin bacteriana, Micro/nanotopografa. INTRODUCCIN La mayora de las reacciones biolgicas no ocurren en solucin sino en las interfases [1]. Las interfases de inters mdico e industrial incluyen la interaccin bacteria/superficie metlica. Las clulas asociadas a una biopelcula se diferencian de aquellas en solucin debido a la produccin de material polimrico extracelular (MPE). Las caractersticas ms significativas y peligrosas de las biopelculas son su ubicuidad y notoria resistencia ante diversos agentes microbianos [2]. La adherencia de bacterias a una superficie es un proceso complejo, regulado por caractersticas del medio de cultivo, el sustrato y la superficie de la clula. Las tapas iniciales en la formacin de una biopelcula bacteriana parecen estar influenciadas por la movilidad de las clulas. Las propiedades superficiales afectan significativamente los primeros pasos en los procesos de adherencia microbiana. La rugosidad y la composicin de la superficie del sustrato pueden ser modificadas a travs de tcnicas de micro/nanofabricacin. Estas tcnicas le permiten al investigador disear con control micro y nanomtrico, la composicin bioqumica y la topografa del sustrato [3, 1]. El objetivo de este trabajo fue estudiar la influencia de las caractersticas superficiales de diversos sustratos en la fijacin de bacterias durante las etapas tempranas del desarrollo de las biopelculas bacterianas. Se utiliz para los ensayos, sustratos con distinta rugosidad, y tambin metales nanoestructurados. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Bacterias y medios de cultivo Para determinar la respuesta de las bacterias ante diversos sustratos de inters, un consorcio de Streptococcus obtenido a partir de cavidades orales de varios pacientes con estado periodontal normal fue utilizado en las experiencias. Un cultivo puro de Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) aisladas de un ambiente industrial, tambin fue usado en los ensayos para investigar el efecto de la movilidad en la fijacin microbiana. P. fluorescens fue mantenido en Cetrimide agar a 28 C. El inculo de P. fluorescens fue preparado suspendiendo un pico de flauta de agar Cetrimide (crecido durante 24 h) en 2 ml de medio

C. Diaz, M.C. Cortizo, P.L. Schilardi, S. Gomez de Saravia y M.Fernndez Lorenzo de Mele

nutritivo estril. Luego, el inculo fue vertido en un recipiente Erlenmeyer conteniendo 300 ml de caldo nutritivo como medio de cultivo y mantenido en un agitador rotatorio (200 rpm) durante 3 h a 28 C. La muestra de microorganismos orales fue dispersada por sonicacin durante 10 segundos en un medio de cultivo estril. Cada dos meses fueron completamente reemplazados por nuevas muestras obtenidas a partir de los mismos pacientes. El consorcio fue cultivado en agar Mitis-Salivarius para aislar Streptococcus mitis y S. Salivarius. Los microorganismos aislados fueron mantenidos en Mitis-Salivarius modificado como medio de cultivo lquido como se describe en [4]. Despus de 24 horas de crecimiento, se colocaron los diferentes sustratos dentro del medio de cultivo con los microorganismos con el objeto de que se formara una biopelcula bacteriana sobre los mismos. Las muestras se retiraron despus de tiempos de exposicin que variaron entre los 30 minutos y las 2 horas. Superficies Los materiales usados en los experimentos fueron: lminas de Ti pulidas con papel esmeril de diferentes grados (320 a 800), Si (plano 100 y rugoso), y Cu y Au (lisos y nanoestructurados). Las superficies de Cu y Au presentan una nanoestructura que consiste en canales de 90 nm de altura y 900 nm de ancho (Fig. 1). Estas superficies fueron preparados de acuerdo a Schilardi, P.L. (2001) [5]. Las pelculas evaporadas de Cu y Au sobre vidrio, que presentan una estructura lisa a nivel micromtrico, fueron usadas como control en las experiencias. Las lminas de Ti fueron pulidas con papel esmeril de distintos grados y luego tratadas con solucin 60 g/l HCl + 30 g/l NaF + 20 g/l NaCl con el objeto de generar superficies con distinta rugosidad. La muestra de silicio rugoso presentaba microestructuras de 8 m de ancho y 2 m de alto, medidas con AFM, (Fig. 2). La superficie lisa del silicio (obleas de Si (100) comercial) fue utilizado como control.

Figura 1. Imagen STM (10x10m2) de una superficie nanoestructurada de Cu. Idem para Au.

Figura 2. Imagen AFM (50x50m2) de la superficie rugosa de silicio.

Observaciones microscpicas Las biopelculas bacterianas fueron observadas a travs de microscopa ptica de epifluorescencia. Las bacterias fueron coloreadas con diacetato de fluorescena y bromuro de etidio. Se realizaron tambin observaciones con el microscopio electrnico de barrido (MEB). Para preservar las estructuras biolgicas, las muestras fueron fijadas en 2 % de glutaraldehdo en saliva estril o en un medio fosfato buffer, deshidratadas a travs de una serie de soluciones de acetona hasta llegar al 100% y secado hasta el punto crtico. El efecto de la topografa del sustrato fue tambin analizado utilizando un microscopio de fuerza atmica Nanoscope IIIa AFM (Digital Instruments). RESULTADOS Y DISCUSIN El efecto de la composicin superficial del material fue analizado mediante comparacin de las etapas iniciales en la formacin de una biopelcula entre muestras lisas de Au y Cu. Para el mismo perodo de inmersin las superficies de cobre resultaron con una adherencia significativamente menor que las de oro (Fig. 3a y Fig. 3b). En concordancia con resultados previos [6], hay un perodo de induccin mayor en las muestras de cobre, y la velocidad de adherencia es menor que en el resto de los materiales ensayados para los mismos perodos de inmersin.

Fig. 3a. MEB de una superficie de Cu cristalina (30 min en un cultivo de P. fluorescens).

Fig. 3b. MEB de una superficie de Au (30 min en un cultivo de P. fluorescens).

C. Diaz, M.C. Cortizo, P.L. Schilardi, S. Gomez de Saravia y M.Fernndez Lorenzo de Mele

El cobre y sus aleaciones presentan una menor formacin de depsitos biolgicos (biofouling) probablemente debido a las caractersticas txicas de los iones Cu (II) provenientes de la disolucin del metal [7, 8]. Por lo tanto, cuando el material es txico para los microorganismos, se observa una mayor produccin de sustancias polimricas extracelulares que en muestras no txicas, como por ejemplo, el oro (Fig. 4). El material polimrico fue encontrado alrededor y por debajo de las bacterias adheridas, quizs, para evitar el contacto directo con el material txico. Las propiedades superficiales fueron severamente modificadas cuando la muestra fue cubierta con MPE.

Figura 4. Microfotografa de una superficie de Cu nanoestructurada expuesta durante 30 minutos a un cultivo de . Pseudomonas fluorescens.

Existen varias diferencias en las etapas iniciales de la adherencia microbiana entre las superficies lisas y aquellas que presentan nanoestructura. Se encontr una alineacin significativa de bacterias en la superficie nanomoldeada de oro y mayor adherencia microbiana que las muestras de control lisas. Las cepas bacterianas mviles, como muchas especies de Pseudomonas, se ubican fcilmente en surcos o grietas como se muestra en la Figura 5. La mayora de las bacterias ubicadas en los canales se encontraron aisladas y no hubo evidencia microscpica de produccin de material polimrico extracelular en superficies de oro nanoestructurados. La distribucin de bacterias en superficies lisas fue uniforme.

Figura 5. 40 m x 40 m Imagen AFM vista de arriba de una superficie de oro nanoestructurada expuesta durante 30 minutos a un cultivo de Pseudomonas fluorescens.

Tambin, vale la pena remarcar que fueron observados cambios en la morfologa de P. fluorescens adheridas a las superficies nanoestructuradas. Se han medido los largos de las bacterias usando las imgenes de AFM. En las superficies de oro nanomoldeadas, el largo promedio fue 1.446 m [ 0.120 m ], mientras que en las muestras de oro lisos fue 1.996 m [ 0.123 m ]. Estos resultados son significativamente diferentes, mostrando una reduccin en el tamao de las clulas en las muestras presentando estructuras a nivel nanomtrico. Todos los datos fueron analizados por t-tests estndar con diferencias estadsticas entre medias determinadas con un nivel de significancia de p < 0.05. Por otra parte, los ensayos en superficies de Ti microrugosas mostraron que la distribucin de bacterias adheridas no era uniforme y que los Streptococci se ubican preferentemente en los valles. La forma de las colonias se ve marcadamente afectada por la rugosidad de la superficie en el caso de los Streptococci. La forma de las colonias en superficies lisas es diferente de aquellas rugosas en donde las colonias son largas y angostas (Fig. 6).

Figura 6. Microscopa de epifluorescencia de una superficie rugosa de titanio donde las hileras de streptococci con direcciones preferenciales pueden ser vistas dentro de los valles. Magnificacin=400X

C. Diaz, M.C. Cortizo, P.L. Schilardi, S. Gomez de Saravia y M.Fernndez Lorenzo de Mele

En contraste con los resultados descriptos anteriormente relacionados con la mayor adherencia bacteriana en sustratos nanoestructurados de oro, la densidad superficial de bacterias en sustratos lisos de silicio fue mayor que en aquellas muestras microrugosas. El silicio microrugoso presenta una topografa superficial caracterizada por pequeas cajas de 2 m de alto y 8 m de largo como se muestra en la Fig. 2. Durante el tiempo de exposicin los hoyos son cubiertos progresivamente de una gran cantidad de material polimrico extracelular en el caso de cultivos de Pseudomonas. Este incremento en la produccin de material polimrico puede observarse comparando las Figuras 7a, 7b y 7c. El material polimrico tiende a alisar la microrugosidad de la superficie de silicio, como ha sido reportado previamente [9, 7]. a) b) c)

Figura 7. Microfotografas MEB de Si despus de diferentes perodos de exposicin: a) t=0, b) t=30 min, c) t=1 h.

CONCLUSIONES 1. La composicin superficial del material, rugosidad y topografa juegan roles importantes en las etapas iniciales de la formacin de las biopelculas. 2. La distribucin de bacterias es irregular en superficies lisas pero sigue direcciones preferenciales en superficies rugosas. 3. Existe una relacin entre la dimensin caracterstica de la rugosidad y el tamao de la bacteria que afecta no solo la adherencia bacteriana sino tambin la produccin de material polimrico extracelular. Cuando los parmetros que caracterizan la topografa y rugosidad son del orden de la dimensin de la bacteria, se encontr que la bacteria se adhiere fcilmente y se produce menos cantidad de material polimrico extracelular. 4. Se encuentra claramente que las bacterias actan en respuesta a la nanotopografa debido a que eligen una direccin preferencial, cambian su morfologa y modifican la produccin de MPE. REFERENCIAS
1. Castner D.G., Ratner B.D., (2002). Biomedical surface science: Foundations to frontiers. Surface Science 500, 2860. 2. Stewart P.S., Mc Telers G. A. And Huang C. (2000). Biofilm control by antimicrobial agents. Bryers J. (Ed.) Biofilm II, Chapter 11. Process Analysis and applications, pp 373-405. 3. Mrksich, M., (2002). What can surface chemistry do for cell biology ?. Current Opinion Chemestry and Biology 6, 794-797. 4. Cortizo, M.C., Fernndez Lorenzo de Mele, M., (2003). Microstructural characteristics of thin biofilms through optical and scanning electron microscopy. World Journal of Microbiology and Biotechnology 19, 805-10. 5. Schilardi, P.L., Azzaroni, O., Salvarezza, R.C., (2001). A Novel Application of Alkanethiol SelfAssembled Monolayers in Nanofabrication: Direct Molding and Replication of Patterned Conducting Masters. Langmuir, 17, 2748-2752. 6. Fernndez Lorenzo de Mele M.,. Cortizo M.C: (2000) Biodeterioration of Dental Materials: Influence of Bacterial Adherence; Biofouling, Vol. 14, pp 305-316. 7. Gmez de Saravia S. G.,.Fernndez Lorenzo de Mele M, Videla H.A.: (1990) Interaction of biofilms and inorganic passive layers in the corrosion of Cu/Ni alloys in chloride environments; Corrosion, Vol 46, pp. 302-306. 8. Gmez de Saravia S. G,. Fernndez Lorenzo de Mele M,. Videla H.A: (1993) The interaction of corrosion products and biofouling on 70/30 cupronickel in polluted seawater; Biofouling, Vol 7, 141-155. 9. Zelver N., Roe F.L. y Characklis W.G.: (1985) Potential for monitoring fouling in the food industry. In Fouling and Cleaning in the Industry, Madison WI ed.