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Espectrofotometra: Cuantificacin

LABORATORIO N NOMBRE

1 Carolina Espinoza E.

Objetivos

General: Cuantificar protenas ocupando tcnicas espectroscpicas como el mtodo de Lowry y el mtodo de Biuret.

Especficos: Obtener la regresin lineal con los datos de la absorvancia y concentracin para luego poder obtener la curva de calibrado y por ende obtendremos tambin el intercepto y la pendiente, para as finalmente obtener la concentracin de la muestra problema

Lograr la reaccin adecuada para as obtener la absorvancia entre los rangos experimentales.

edir la absorvancia y obtener la concentracin de la muestra problema en cada mtodo !Biuret y Lowry"

Cuantificar protenas a travs de las tcnicas de espectrofotometra como el mtodo de Biuret y el mtodo de Lowry

#istinguir $ue mtodo es mas eficiente y efica% para la cuantificacin de protenas

Introduccin
La espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales m&s utili%adas para la deteccin especfica de molculas. 'e caracteri%a por su precisin, sensibilidad y su aplicabilidad a molculas de distinta naturale%a y estado de agregacin. Los fundamentos fsico($umicos de la espectrofotometra son relativamente sencillos. Las molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma de energa interna. )sto permite $ue se inicien ciclos vitales de muc*os organismos, entre ellos el de la fotosntesis en plantas. La mec&nica cu&ntica nos dice $ue la lu% est& compuesta de fotones cada uno de los cuales tiene energa. Ley de Lambert + Beer ,elacionan La medida de absorcin )l espesor de la sustancia absorbente La cantidad de sustancia $ue absorbe

Observando )l crecimiento exponencial de la absorcin de radiacin

)n funcin de )spesor de la regin absorbente La cantidad de esa especie.

etodo de Lowry )s un mtodo colorante de valoracin cuatitativa de las protenas. - la muestra se a.ade un reactivo $ue forma un comple/o coloreado con las protenas siendo la intensidad de color proporcional a la concentracin de protenas, seg0n ley de Lambert( Beer -1 alc

etodo de Biuret )l ,eactivo de Biuret es a$uel $ue detecta la presencia de protenas, pptidos cortos y otros compuestos con dos o m&s enlaces peptdicos en sustancias de composicin desconocida. Bas&ndose en la formacin de un comple/o coloreado )l reactivo, de color a%ul, cambia a violeta en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con polipptidos de cadena corta. La intensidad de la coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas !enlaces peptdicos" y la reaccin es bastante especfica, de manera $ue pocas sustancias interfieren.

Resultados
todo de Biuret Ovoalbmina TUBO () 3 Blanco 6 : 5 9 8 ; 2 4,4 3,4 4,7 4,8 4,5 4,6
,,,

m!"

#$O m!" 2 ((( ((( ((( ((( ((( (((

R% BIURET

&bsorbanci a

'oncentraci n Ovoalbumina

m!" 3,4 4,4 4,6 4,5 4,8 4,7 4,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4

(*+ nm 4 4,789 4,;73 4,87: 4,9<7 4,57; 4,<75

) ((( 3,4 4,7 4,8 4,5 4,6 (((

-.+ /0-

'1lculos de concentracin C- x =- 1 C$ x =$"

!3"4> x 3 mL 1 C6 x 9mL 4> !6"9> x 3mL 1 C6 x 9mL 3> !:"5> x 3mL 1 C6 x 9mL 4,7> !5":> x 3mL 1 C6 x 9mL 4,8> !9"6> x 3mL 1 C6 x 9mL 4,5>

!8" 3> x 3mL 1 C6 x 9mL 4,6> !; 2" 4> x 3mL 1 C6 x 9mL 4>

?ntercepto !a" 1 (4,3:3 2endiente !b" 1 3,34< ,elacin de datos !r" 1 4,<6 )cuacin de la recta y 1 mx @ b m1 3,34< b1 (4,3:3 2or lo tanto la ecuacin $ueda y 1 3,34<x + !(4,3:3"

cx =

A X Ao

Observando $ueA Cx 1 concentracin final muestra problema -x 1 -bsorvancia -4 1 ?ntercepto B x l 1 2endiente ,eempla%ando obtenemos uestra 2roblema

'2 3 -.++( ) 'oncentracin muestra problema

/4todo de !o5r6 B7& TUBO 3B 6' :' 5' 9' 8' ; 2 m!" +.* m9:m! (((( 4,3 4.6 4,: 4,5 4,9 ((( /0 ((( ((( ((( ((( ((( ((( +.( /0#$O m!" 3,4 4,< 4,7 4,; 4,8 4,9 4,9 R%'%&% m!" 3,4 3,4 3,4 3,4 3,4 3,4 3,4 R%8% m!" 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 & ;(+ nm 4 4,4:8 4,49; 4,4;3 4,474 4,4<5 4,: 'onc% ) 4> 4,888> 3,::> 6> 6,88> :,::> 4>

C&lculos de concentracin !Ci x =i 1 Cf x =f por 344" !6'"4,5mg x 4,3ml 1 8ml x C6 8,88x34(: x 344 1 4,888> !:'" 4,5 mg x 4,6ml 1 8ml x C6 4,43: x 344 1 3,::> !5'" 4,5 mg x 4,:ml 1 8ml x C6 4,46 x 344 1 6> !9'" 4,5 mg x 4,5ml 1 8ml x C6 4,468 x 344 1 6,88> !8'" 4,5 mg x 4,9 ml 1 8ml x C6 4,4:: x 344 1 :,:: >

?ntercepto !a" 1 (4,::5 2endiente !b" 1 :9,5; ,elacin de datos !r" 1 4,<87 )cuacin de la recta y 1 mx @ b m1 :9,5; b1 (4,::5 2or lo tanto la ecuacin $ueda y 1 :9,5;x + !(4,::5"

cx =

A X Ao

Observando $ueA Cx 1 concentracin final muestra problema -x 1 -bsorvancia -4 1 ?ntercepto B x l 1 2endiente ,eempla%ando obtenemos uestra 2roblema

'2 3 +.+-<=) 'oncentracin muestra problema

>iscusiones
Biuret 2odemos observar $ue las absorvancias van aumentando entre los tubos 6 y 8, esto lo podemos atribuir a $ue las concentraciones de ovoalb0mina van disminuyendo y por otro lado las concentraciones de agua van aumentado en cada tubo respectivamente. Los resultados de absorcin #ieron en los rangos estimados !4,9 y 3,9" esto se debe a la correcta preparacin de las disoluciones Las absorvancias no dieron exactas ya $ue al comen%ar su medicin en el espectrofotmetro este comen%aba a aumentar, esto se debe a $ue no se espero el tiempo necesario para $ue la reaccin ocurriera por completo, por consiguiente esto te lleva a un cierto > de error

!o5r6

Co *ubo suficiente agua ni estuvo a la temperatura re$uerida para $ue las muestras se calentaran, de esta manera la reaccin no fue completada por falta de calor en la reaccin.

Como los rangos de absorvancia dieron menor a los rangos experimentales, deberamos *aber procedido a a.adir m&s concentracin de la solucin a la muestra esto no se pudo llevar a cabo por el tiempo y la poca solucin disponible.

2uede *aber ocurrido $ue no se espero el tiempo necesario entre $ue se verta el reactivo alcalino !,C-" y luego el reactivo Dolin ya $ue deba transcurrir 34 min.

'onclusin

2odemos concluir $ue no existe un mtodo completamente efectivo para medir la cuantificacin de protenas en una muestra determinada. Lo $ue si podemos *acer es elegir el mtodo seg0n la naturale%a de la protena la cual deseo anali%ar Luego de aplicar ambos mtodos, el de lowry y el de biuret, para la cuantificacin de protenas podemos decir $ue es muc*o m&s efica%, certero y preciso el de Llowry ya $ue tiene una gran venta/a de ser extremadamente sensible, capa% de detectar cantidades del orden de 34 microgramos de protena

Biblio9rafa

*ttpAEEocw.uv.esEocw(formacio(permanentE6.2racticaespectrofotometria.pdf *ttpAEEacasti.webs.ull.esEdocenciaEpracticasE5.pdf