UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACuLTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

Rev. peru. biol. ISSN 1561-0837

PERuANA DE BIOLOGA

REVISTA

VOLumEN 20

MARZO, 2014
LIMA, PER

NmERO 3

Publicacin cientfica de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Rector Dr. Pedro Atilio Cotillo Zegarra Vicerrector de Investigacin Dr. Bernardino Ramrez Bautista Consejo Superior de Investigacin Dr. Manuel Gngora Prado Decana de la Facultad de Ciencias Biolgicas Mag. Olga Bracamonte Guevara Instituto de Investigacin en Ciencias Biolgicas Antonio Raimondi Mag. Ins Miriam Grate Camacho La Revista Peruana de Biologa es una publicacin cientfica arbitrada, producida por el Instituto de Ciencias Biolgicas Antonio Raimondi, Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Per, y auspiciada por el Vicerrectorado de Investigacin. La Revista es publicada tres veces al ao (abril, agosto y diciembre) y esta dedicada a la publicacin de artculos cientficos originales e inditos de las reas de biodiversidad, biotecnologa, ecologa y biomedicina. La Revista publica los trabajos realizados por acadmicos e investigadores nacionales y extranjeros, en idioma espaol o ingls. Los trabajos recepcionados son evaluados por rbitros segn criterios internacionales de calidad, creatividad, originalidad y contribucin al conocimiento. La Revista es publicada simultneamente en la pgina web de la Universidad.

REVISTA PERuANA DE BIOLOGA

Comit Editor Editor Jefe Leonardo Romero, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Editores asociados Dra. Rina Ramrez, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Dra. Mnica Arakaki-Makishi, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Dra. Diana Silva Dvila, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Dra. Blanca R. Len, Profesora Honoraria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. The University of Texas at Austin, Geography and the Environment, Faculty Member, Estados Unidos. Dr. Carlos Pea, Laboratory of Genetics, Department of Biology, University of Turku, Finlandia. Cesar Arana, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Jos Roque, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Comit consultivo en los recientes nmeros Maximilian Weigend Mnica Romo Freie Universitt Berlin- Alemania Asociacin Peruana para la Conservacin de la Naturaleza- Per Hlio Ricardo da Silva Renato Guevara-Carrasco Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Brazil Instituto del Mar del Per- Per Carlos Frederico Duarte da Rocha Reynaldo Linares-Palomino Universidade do Estado do Rio de Janeiro- Brasil Universidad Nacional Agraria La Molina- Per Fabrcio Rodrigues dos Santos Marcel Gutirrez-Correa Universidade Federal de Minas Gerais- Brasil Universidad Nacional Agraria La Molina - Per Davor Vrcibradic Gretty K. Villena Universidade do Estado do Rio de Janeiro- Brasil Universidad Nacional Agraria La Molina - Per Berta Calonge Camargo Gerardo Lamas Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, Colombia Universidad Nacional Mayor de San Marcos- Per Sergio Solari Pablo Ramrez Universidad de Antioquia- Colombia Universidad Nacional Mayor de San Marcos- Per Finn Borchsenius Juan Tarazona Aarhus University- Denmark Universidad Nacional Mayor de San Marcos- Per Julissa Roncal Armando Yarlequ Aarhus University- Denmark Universidad Nacional Mayor de San Marcos- Per Arnaud Bertrand Manuel Tantalen IRD. Institut de recherche pour le dveloppement- Francia Universidad Peruana Cayetano Heredia- Per Francis Kahn Nigel Pitman IRD. Institut de recherche pour le dveloppement, - Francia Duke University- USA Jean-Christophe Pintaud Maria del Carmen Ulloa Ulloa Institut de Recherche pour le Dveloppement- Francia University of Missouri- USA Mutsunori Tokeshi Kenneth Young Kyushu University - Japon University of Texas at Austin USA Francisco Alonso Sols Marn Paul Velazco Universidad Nacional Autnoma de Mxico- Mxico American Museum of Natural History, USA

Facultad de Ciencias Biolgicas, UNMSM- La Revista Peruana de Biologa publica artculos de acceso abierto, distribuido bajo los trminos de la Licencia de Atribucin Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 de Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.es_ES), que permite el uso no comercial, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citadas. Para uso comercial, por favor pngase en contacto con editor.revperubiol@gmail.com / decanobio@gmail.com Foto en la caratula: Krapfia weberbaueri, cortesia de Mery Suni y Beatriz Roca

Resumida/Indizada (Abstracted/Indexed) en: Peridica (ndice de Revistas Latinoamericanas en Ciencias), LIPECS (Literatura Peruana en Ciencias de la Salud), Zoological Record (BIOSIS), Scielo (Scientific Electronic Library Online), Index to American Botanical Literature (The New York Botanical Garden), BIOSIS Previews, Biological Abstracts (BIOSIS), ProQuest (Biological Science Journals), Redalyc, CABI, AGRICOLA, Scopus.

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REVISTA PErUANA DE BIOLOGA

Rev. peru. biol. ISSN-L 1561-0837

Volumen 20

Marzo, 2014 CONTENIDO

Nmero 3

TRABAJOS ORIGINALES 205 Agrotransformacin y evaluacin de la resistencia a Phytophthora infestans en Solanum tuberosum L. variedad Dsire Agro-transformation and evaluation of resistance to Phytophthora infestans in Solanum tuberosum L. variety Dsire Jeanette Orbegozo, Mara Lupe Romn, Cristina Rivera, Jos Carlos Tovar, Willmer Prez, Soledad Gamboa, Greg Forbes, Jan Kreuze y Marc Ghislain

211 Identificacin de genes relacionados a sequa en papas nativas empleando RNA-Seq Identification of genes related to drought in native potatoes using RNA-Seq Yerisf Torres, Roberto Lozano, Carlos Merino y Gisella Orjeda

215 Diversidad gentica de papas nativas (Solanum spp.) conservadas en cultivares nativos del Per Genetic diversity of native potatoes (Solanum spp.) conserved in landraces from Peru Julin Soto, Tulio Medina, Yeny Aquino, Rolando Estrada

223 Efecto de Maytenus macrocarpa Chuchuhuasi en el sistema reproductor masculino del ratn (Mus musculus) Effect of Maytenus macrocarpa Chuchuhuasi in the male system reproductive of mouse (Mus musculus) Lyonal G. Acosta, Jonathan Vsquez, Vctor Nez, Jos Pino1, Betty Shiga

227 Efecto ahorrativo de la protena usando niveles altos de energa y obtencin de la relacin optima energa digestible/protena digestible en dietas para el crecimiento de Oreochromis niloticus (L) Protein-sparing effect with high energy levels and obtaining the optimum digestible energy/digestible protein ratio in growth diets to Oreochromis niloticus (L.) Felix Walter Gutierrez, Mximo Quispe, Luz Valenzuela

233 Desarrollo reproductivo de Krapfia weberbaueri (Ranunculaceae) en condiciones controladas de luz y temperatura Reproductive development of Krapfia weberbaueri (Ranunculaceae) under controlled conditions of light and temperature Beatriz Roca, Mery Suni, Asuncin Cano

NOTA CIENTFICA 241 Parmetros reproductivos de Hypsiboas punctatus (Schneider 1799) (Anura: Hylidae) en el extremo sur de su rea de distribucin Reproductive parameters of Hypsiboas punctatus (Schneider 1799) (Anura: Hylidae) in the south limit of its distribution area Carolina E. Antoniazzi, Romina Ghirardi, Javier A. Lpez, Andrea P. Armando

245 Caracterizacin citogentica de Caesalpinia spinosa de los distritos de Tarma y Palca (Junn) Cytogenetic characterization of Caesalpinia spinosa from Tarma and Palca (Junn) Alberto Lpez, Mara Siles-Vallejos, Diego Orihuela, Jos Linares, Shary Ros, Yvette Villafani, Misael Guevara, Olga Bracamonte

249 Depositorios del material tipo de la especie Coccidophilus lozadai Gonzalez, 2012 (Insecta: Coleoptera: Coccinellidae) Depositories of the type material of the species Coccidophilus lozadai Gonzalez, 2012 (Insecta: Coleoptera: Coccinellidae) Pedro W. Lozada y Juana Aliaga-Camarena

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Agrotransformacin y resistencia a PHYTOpHTHORA INFESTANS en SOLANUM TUBEROSUM

ISSN-L 1561-0837

TRABAJOS ORIGINALES Agrotransformacin y evaluacin de la resistencia a Phytophthora infestans en Solanum tuberosum L. variedad Dsire
Agro-transformation and evaluation of resistance to Phytophthora infestans in Solanum tuberosum L. variety Dsire
Jeanette Orbegozo, Mara Lupe Romn, Cristina Rivera, Jos Carlos Tovar, Willmer Prez, Soledad Gamboa, Greg Forbes, Jan Kreuze y Marc Ghislain
Laboratorio de Biotecnologa Aplicada, Centro Internacional de la Papa (CIP), Apartado 1558, Lima 12, Per. E-mail Jeanette Orbegozo: jorbegozoramirez@gmail.com E-mail Mara Lupe Romn: m.roman@cgiar.org E-mail Cristina Rivera: c.rivera@cgiar.org E-mail Jos Carlos Tovar: josectovar@gmail.com E-mail Willmer Prez: w.perez@cgiar.org E-mail Soledad Gamboa: s.gamboa@cgiar.org E-mail Greg Forbes: g.forbes@cgiar.org E-mail Jan Kreuze: j.kreuze@cgiar.org E-mail Marc Ghislain: m.ghislain@cgiar.org

Resumen
El Oomiceto Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, agente causal de la enfermedad denominada tizn tardo, es el principal responsable del dficit en rendimiento y produccin en el cultivo de papa a nivel mundial; una de las alternativas a considerar en la lucha contra este patgeno es la integracin de secuencias completas de genes R en el genoma de la papa a travs de Agrotransformacin. El gen Rpi-blb2 (gen R) de la especie silvestre Solanum bulbocastanum Dunal, presenta una amplia resistencia a los aislamientos de P. infestans, hacindolo un importante candidato en los estudios de mejoramiento gentico en plantas. En el presente trabajo se describe la introduccin del gen Rpi-blb2 por Agrobacterium tumefaciens en el genoma de la papa variedad Dsire, la caracterizacin molecular de 29 eventos transformados e infeccin de plantas completas con el aislamiento POX067 de P. infestans obtenido en el Per. Los eventos Dsire [Rpi-blb2] 4 y Dsire [Rpi-blb2] 30, presentaron una resistencia considerable frente a la infeccin de P. infestans, comprobando de esta manera la transferencia del gen Rpi-blb2 de una especie silvestre a una cultivada mediante transformacin gentica. Palabras clave: papa; Phytophthora infestans; Agrobacterium tumefaciens; gen Rpi-blb2.

Abstract
The Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, the causal agent of the disease known as late blight, is primarily responsible for the decreased in production performance and potato crops worldwide. The integration of the complete R genes sequences in the potato genome using Agro-transformation appears an alternative to be considered in the fight against this pathogen. The Rpi-blb2 gene (R gene) from the wild species Solanum bulbocastanum Dunal shows a broad resistance to isolates of P. infestans, making it an important candidate for plant breeding studies. This paper reports the integration of the Rpi-blb2 gene into potato var. Dsire genome by Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation system, the molecular characterization of 29 events transformed and whole plant infection with isolate POX67 of P. infestans from Peru. Dsire events [Rpi-blb2] 4 and Dsire [Rpi-blb2] 30, showed a substantial resistance to P. infestans infection confirming complete transfer of the Rpi-blb2 gene from a wild species to a cultivated species by genetic transformation. Keywords: potato; Phytophthora infestans; Agrobacterium tumefaciens; Rpi-blb2 gene.

Citacin: Orbegozo J., M.L. Romn, C. Rivera, J.C. Tovar, W. Prez, S. Gamboa, G. Forbes, J. Kreuze & M. Ghislain. 2013. Agrotransformacin y evaluacin de la resistencia a Phytophthora infestans en Solanum tuberosum L. variedad Dsire. Rev. peru. biol. 20(3): 205 - 210 (Marzo 2014)

Presentado: Aceptado: Publicado online:

18/12/2013 15/01/2014 14/03/2014

Introduccin Desde el inicio del uso de la bacteria Agrobacterium tumefaciens en los aos 80, se revolucion la obtencin de plantas resistentes a diversos patgenos de una manera rpida y sencilla, siendo considerado hasta la fecha como un proceso importante en la biotecnologa vegetal (Petti et al. 2009). Asimismo, la bsqueda de nuevas fuentes de resistencia ha impulsado el uso de genes de la misma especie o de una familia cercana a la planta que se desee modificar (Storck et al. 2012). Un ejemplo de ello son los genes R (genes de resistencia) de la familia de genes NB-LRR (Nucleotide binding and leucine-rich repeat), provenientes de la especie silvestre Solanum bulbocastanum (Collinge et al. 2008, Jacobs et al. 2010; Pel et al. 2009). Los genes R de S. bulbocastanum ms

Los autores. Publicado por la Revista Peruana de Biologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Este es un artculo de acceso abierto, distribuido bajo los trminos de la Licencia de Atribucin Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 de Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed. es_ES), que permite el uso no comercial, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citadas. Para uso comercial, por favor pngase en contacto con editor.revperubiol@gmail.com.

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representativos son Rpi-blb1, Rpi-blb2 y Rpi-blb3, y se encuentran localizados en los cromosomas 8, 6 y 4 respectivamente (Naess et al. 2000, Song et al. 2003). El inters que se tiene en estos genes radica en la resistencia que confieren ante el tizn tardo, enfermedad ocasionada por el Oomiceto Phytophthora infestans y descrita como la ms devastadora en el cultivo de la papa (Garelik 2002, Fry 2008). La lucha contra P. infestans es continua debido a su elevado potencial evolutivo y debido a que en su genoma posee regiones altamente repetitivas, las cuales presentan caractersticas muy dinmicas que les permite secretar protenas efectoras (AVR) facilitando su colonizacin y patognesis en la planta hospedera (Haas 2009). En consecuencia, la obtencin de plantas con resistencia a P. infestans es apremiante. Es por este motivo, que el estudio de los genes R a tenido gran atencin, como es el caso del gen Rpi-blb2, el cual presenta un amplio espectro de resistencia a P. infestans (van der Vossen et al. 2005). Se ha demostrado que este gen evolucion ms recientemente que el gen RB / Rpi-blb1 y codifica una protena de 1,267 aminocidos, cuya secuencia gnica presenta 82% de similitud con el gen Mi-1 de tomate, el cual tambin confiere resistencia a nematodos, fidos y a la mosca blanca (Nombela et al. 2003, Lokossou et al. 2010). En el 2011, el grupo BASF (Alemania) obtuvo el cultivo de papa Fortuna, a partir de la introduccin de genes Rpi-blb2, as como otros genes no reportados de S. bulbocastanum y otras

especies silvestres. Sin embargo, de estas investigaciones slo se conocen notificaciones de avances, y en la actualidad el grupo ha retirado su solicitud de liberacin del cultivo en la Unin Europea por temas de mercado (Gillund et al. 2013). Debido a esta situacin poco se conoce acerca de la resistencia que puede conferir este gen en cultivos de inters, es por ello que el presente trabajo provee de informacin actual en la generacin de plantas transgnicas de S. tuberosum var. Dsire con el gen Rpi-blb2, as como la evaluacin de la resistencia frente la infeccin con el aislado POX067 de P. infestans. Materiales y mtodos Material vegetal.- Las plntulas de papa var. Dsire fueron obtenidas del banco de germoplasma del Centro Internacional de la Papa (CIP) (CIP800048). Se usaron explantes tipo hojapeciolo y entrenudos con cuatro semanas de su propagacin invitro. El aislamiento POX067 (Oxapampa, Pasco), se obtuvo de S. tuberosum var. Amarilis, perteneciente al tipo de apareamiento A1 y linaje clonal EC-1 (Prez et al. 2001). Diseo del plsmido pCIP95.- La secuencia completa del gen Rpi-blb2 fue obtenida del GenBank (nmero de accesin DQ122125.1), y sintetizado por la empresa Entelechon GmbH (Alemania). Posteriormente este gen fue clonado en el plsmido pCAMBIA1300 obtenindose el plsmido pCIP95 (Fig.1). Por transformacin de shock trmico se introdujo el plsmido en la

hpt-R hpt-F

Blb2-F Blb2-R

nptII

Figura 1. Plsmido pCIP95. RB, borde derecho; gen Rpi-blb2; P35S, promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S; gen hpt, higromicina fosfotransferasa; t35S, terminador del virus del mosaico de la coliflor 35S; LB, borde izquierdo; gene nptII, neomicina fosfotransferasa II; pBR322, ori pBR322 origen de replicacin; pBR322 bom, pBR322 bases de mobilidad; pVS1 rep, pVS1 funcin de replicacion; pVS1 Sta, funcin de estabilidad. Posiciones de sitios de amplificacin de los cebadores, indicados por flechas en negro. Figure 1. Plasmid pCIP95. RB, right border; Rpi-blb2 gene; P35S, promoter of the cauliflower mosaic virus 35S; hpt gene, hygromycin phosphotransferase; t35S, terminator of the cauliflower mosaic virus 35S; LB, left border; nptII gene, neomycin phosphotransferase II; pBR322 ori, pBR322 origin of replication; bom pBR322, pBR322 bases mobility; pVS1 rep, pVS1 replication function; pVS1 Sta, stability function. Positions of sites for amplification primers, indicated by black arrows.

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cepa DH5 de E. coli y por electroporacin en la cepa EHA105 de A. tumefaciens (Hood et al. 1993, Sambrok & Russell 2001). Evaluacin de la sensibilidad de los explantes de S. tuberosum var. Dsire al agente selector higromicina.- Por cada tipo de explante se us 30 unidades sin transformar, las cuales fueron colocadas en un medio de regeneracin semislido (4.60 g/L de sales Murashigue & Skoog, 2% de glucosa, 0.02 mg/L de cido giberlico, 0.02 mg/L de cido naftalen actico, 2 mg/L de ribsido de zeatina, pH 5.6 y 0.23% de gelride) complementado con una gradiente de concentracin del antibitico higromicina: 1, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 mg/L. El control negativo fue la var. Dsire (no transformada) colocada en el medio de propagacin sin antibitico. El cambio de placas se realiz cada 15 das. Transformacin de papa.- La transformacin fue va organognesis directa, siguiendo el protocolo establecido por Medina et al. 2003, con modificaciones para la var. Dsire. Las plantas fueron propagadas in-vitro en magentas en un medio lquido de propagacin (4.3 g/L de sales Murashige & Skoog, 0.4 mg/L de tiamina, 2 mg/L de glicina, 0.5 mg/L de cido nicotnico, 0.5 mg/L de piridoxina, 0.1 mg/L de cido giberlico, 2% de sacarosa y pH 5.6). La bacteria A. tumefaciens conteniendo el plsmido pCIP95 fue sembrada en el medio semislido Luria-Bertani (LB) (1% de bacto-triptona, 0.5% de extracto de levadura, 1% NaCl, pH 7.5 y 2.5 g/L de agar) con 100 mg/L de kanamicina, a 28 C por 48 horas. Los explantes fueron cortados de forma transversal con una cuchilla estril que previamente fue puesta en contacto con una colonia de A. tumefaciens. Los explantes tratados fueron transferidos a un medio que contena: 4.60 g/L de sales Murashige & Skoog, 2% de sacarosa, 30 mg/L de acetosiringona, pH 5.6 y 0.23% de gelride, sin antibitico de seleccin, a 18 22 C por 24 horas en oscuridad. Posteriormente, stos fueron colocados en el medio de regeneracin semislido con el antibitico higromicina y 200 mg/L de carbenicilina. Cada 15 das el material vegetal fue transferido a placas conteniendo un medio de regeneracin nuevo. Una vez obtenidos los regenerantes fueron individualizados para su posterior evaluacin. Los clculos de las eficiencias de regeneracin y transformacin fueron obtenidos segn Garca et al. (2008) y Luo et al. (2006), respectivamente. Caracterizacin molecular por PCR.- El proceso de extraccin de DNA se realiz siguiendo lo descrito por Doyle y Doyle (1990). Para la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se usaron los siguientes sets de cebadores: gen Rpi-blb2: Blb2-F: 5'- AATACGCAAACCGCCTC-3' y Blb2-R: 5'-AGCTTCAGATCCTTGGCC-3' (Vector NT 9.1.0), para el gen hpt: hpt-F: 5'-TCCATCACAGTTTGCCAGTGATACA-3' y hpt-R: 5'-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGA-3' (Nishizawa et al. 1999). El volumen final de la reaccin de PCR fue de 15L, conteniendo 10ng de DNA, 1X PCR buffer (Promega), 0.4 M de cada cebador, 0.5 M dNTPs y 1 U de la enzima Taq DNA polimerasa (Promega). El programa de PCR usado fue: 95 C por 5 min, la temperatura de hibridacin para ambos cebadores fue de 56 C con 34 ciclos de 95 C por 1 min, 56 C por 45 s y 72 C por 1 min, y una elongacin final de 72 C por 5 min. Una vez terminada la amplificacin los productos de PCR se mezclaron con solucin de carga (0.25% azul de bromofenol, 40% sacarosa) y separados en geles de agarosa al
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1% en amortiguador TBE 1X (20 mM Tris-borato y 0.5 mM EDTA, pH 8.0). Los tamaos del producto de PCR fueron comparados con el peso molecular del marcador Lamdda DNA previamente digerido con PstI. El gel fue teido con bromuro de etidio para la visualizacin de los fragmentos de DNA a travs de la irradiacin del gel con luz UV (Sambrok & Russell 2001). Imgenes del gel donde se observan los fragmentos de DNA obtenidos por PCR fueron capturadas con el equipo EpiChemi3 Darkroom para su posterior anlisis. Ensayo de infeccin con P. infestans.- Se usaron 2 plantas por evento de transformacin de la segunda propagacin vegetativa, de un mes y medio de siembra. Los ensayos de infeccin se realizaron en los cubculos de bioseguridad del CIP bajo condiciones controladas de temperatura 16 18 C, 12 h /12 h de exposicin de luz/oscuridad y 60 75% de humedad relativa. La infeccin se realiz por aspersin de la planta completa con una suspensin de 3000 esporangios/mL del aislamiento POX067 de P. infestans. Una vez inoculadas las plantas, estas fueron colocadas en cmaras con humedad relativa alta (> 90%) para promover y aumentar el desarrollo del patgeno. Las plantas de S. tuberosum var. Dsire (susceptible) y el clon CIP 387164.4 (resistente) fueron usadas como control negativo y positivo, respectivamente. Las evaluaciones fueron realizadas por el Laboratorio de Patologa del CIP al quinto da post infeccin (dpi). El dao foliar observado en cada uno de los clones se report en porcentaje y los valores promedios fueron analizados usando la siguiente escala: Altamente resistente= 10%, resistente= 11 20%, medianamente resistente = 21 50%, medianamente susceptible =50 65%, susceptible =>65 80%, altamente susceptible =>80%. Resultados y Discusin Determinacin de la dosis letal de higromicina y transformacin gentica.- A travs de los ensayos de sensibilidad al antibitico higromicina se determin que la dosis letal para los explantes hoja-peciolo y entrenudos no transformados fue de 5 mg/L y 10 mg/L, respectivamente. Las soluciones del antibitico en las concentraciones descritas arriba fueron usadas de manera directa sobre los explantes, sin necesidad de adicionar un paso previo de precultivo, el cual incrementa la aparicin de eventos considerados escapes (Chaudhry y Rashid 2010). Durante los ensayos de transformacin se obtuvieron 29 regenerantes a partir de 898 explantes transformados (364 entrenudos y 534 hoja-peciolo), reportndose una eficiencia de regeneracin de 1.5% para hoja-peciolo y 5.7% para entrenudos. As tambin, se registro una eficiencia de transformacin de 1.5% en hojapeciolo y 5% para entrenudos. La caracterizacin molecular de los 29 regenerantes obtenidos, identific 26 eventos positivos conteniendo el gen de inters. De este anlisis se concluye que los explantes tipo entrenudos presentaron una mejor respuesta de eficiencia de transformacin (18 eventos positivos) que los explantes hoja-peciolo (8 eventos positivos). Esta observacin confirma lo descrito por Beaujean et al. (1998), quienes al trabajar con las variedades Dsire, Bintje y Kaptah Vandel, identificaron que los explantes tipo entrenudos presentan una mejor respuesta a las condiciones in vitro debido a que son menos sensibles al dao durante los pasos de manipulacin de transformacin y tienen un alto poder regenerativo a diferencia de las hojas (Sarker et al. 2009, Soto et al. 2007). En relacin al uso de higromicina durante el proceso

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Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa de los amplificados por PCR. Gen Rpi-blb2, 520 pb (A), gen hpt, 500 pb (B). B, agua libre de nucleasas; NT, control negativo (DNA genmico de una planta no transformada); C+, control positivo (DNA de pCIP95); M, marcador molecular del -DNA digerido con PstI; 1-5 DNA genmico de plantas regeneradas. Figure 2. Agarose gel electrophoresis of PCR products. Rpi-blb2 gene, 520 bp (A), hpt gene, 500 bp (B). B, nuclease-free water; NT, negative control (DNA genomic from an untransformed plant); C +, positive control (DNA of pCIP95); M, molecular marker from -DNA digested with PstI; 1-5, DNA genomic from regenerants.

de obtencin de transformantes, se concluye que la eficiencia en ambos tipos de explantes fueron bajas en el presente trabajo esto se determin al comparar los resultados obtenidos con ensayos reportados previamente donde se describe el uso del mismo antibiotico (M'Hamdi et al. 2003, Kashani et al. 2012). Estas diferencias pueden deberse a mltiples factores asociados a las condiciones de transformacin o al tipo de explante usado (Lagunes 2009). No obstante la principal causa puede deberse a que los ensayos de regeneracin y transformacin son genotipodependiente del tipo de cultivo que se use en los experimentos a realizar (Cingel et al. 2010). Anlisis de eventos transformados por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).- De los 29 eventos obtenidos en el primer experimento de transformacin, 26 (90%) eventos fueron positivos por PCR para las amplificaciones de los genes Rpi-blb2 y hpt (Fig. 2A y 2B). Los eventos restantes fueron considerados como escapes, esto se puede deber a una proliferacin de algunas clulas no transformadas presentando una resistencia o tolerancia natural ante el agente selector (Lpez y Chaparro 2007). As tambin es posible que la superficie de estos explantes no haya tenido un contacto perenne con el medio de cultivo haciendo favorable su desarrollo (Monserrat et al. 2001). Respuesta de resistencia a la infeccin con P. infestans.Del total de los 26 eventos transformados, solo 13 presentaron aclimatacin total y produjeron tubrculos en invernadero. Los eventos Dsire [Rpi-blb2]: 4 y Dsire [blb2] 30 registraron un 42.5% y 37.5% de severidad, respectivamente (Fig. 3). La respuesta de hipersensibilidad (HR) inducida por la infeccin en estos dos eventos no estuvo correlacionada con una completa resistencia al patgeno, otorgando slo una resistencia moderada. Esto pudo deberse a que el aislamiento POX067 presenta una gran variedad de genes Avr (genes de avirulencia de P.infestans) incluyendo a los Avr8 y Avr9 identificados previamente en infecciones en S.demissum (Villamon et al., 2005). Es probable que estos genes Avr incrementen la agresin del aislado

POX067durante la infeccin a la var. Dsire. Por lo general, la respuesta HR es asociada con otro tipo de respuestas que cooperan para restringir el desarrollo del patgeno (Chen & Halterman, 2011). Es por ello que la muerte celular y la resistencia pueden actuar de manera independiente, indicando que mltiples respuestas, as como la presencia de ms de un gen R por parte de los hospederos, seran necesarias para lograr obtener resistencia o inmunidad. La deteccin de los eventos Dsire [Rpi-blb2] 4 y Dsire [Rpi-blb2] 30, muestra el xito logrado en el presente trabajo debido a que las infecciones se realizaron en una poblacin pequea (13 plantas transgnicas) y con el aislamiento POX067 el cual es considerado una raza compleja y agresiva. Agradecimientos El presente trabajo fue realizado gracias al financiamiento de la Agencia de los Estados Unidos para el Desarrollo Internacional (USAID). Literatura citada
Beaujean A., R.S Sangwan, A. Lecardonnel & B.S. Sangwan-Norreel. 1998. Agrobacterium-mediated transformation of three economically important potato cultivars using sliced internodal explants: an efficient protocol of transformation. Journal of Experimental Botany 49 (326): 15891595. doi: 10.1093/jxb/49.326.1589. Chaudhry Z., & H. Rashid. 2010. An improved Agrobacterium mediated transformation in tomato using hygromycin as a selective agent. African Journal of Biotechnology 9 (13): 1882-1891. doi: http:// dx.doi.org/10.4314%2Fajb.v9i13. Chen Y. & D.A Halterman. 2011. Phenotypic characterization of potato late blight resistance mediated by the broad-spectrum resistance gene RB. Phytopathology 101(2):263-70. doi: 10.1094/PHYTO-04-10-0119. Cingel A., B. Vinterhalter, D. Vinterhalter, et al. 2010. Agrobacterium-mediated transformation of two Serbian potato cultivars (Solanum tuberosum L. cv. Dragaevka and cv. Jelica). African Journal of Biotechnology 9(30):4644-4650. doi: 10.5897/AJB09.1241. Collinge D.B., O.S Lund & H.T Christensen. 2008. What are the prospects for genetically engineered, disease resistant plants?. Eur J Plant Pathol 121:217231. Doi: 10.1007/s10658-007-9229-2.

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Agrotransformacin y resistencia a PHYTOpHTHORA INFESTANS en SOLANUM TUBEROSUM

Figura 3. Infeccin de plantas completas de la var. Dsire con el aislado POX067 de P. Infestans. Dsire [Rpi-blb2] 4 (A), Dsire [Rpi-blb2] 30(B), S. tuberosum var. Dsire (C), y el clon CIP 387164.4 (D). El desarrollo de los sntomas fue visualizado 5 dpi. Figure 3. Infection of complete plant of var. Dsire with isolated POX067 from P. infestans. Dsire [Rpi-blb2] 30 (A), Dsire [Rpi-blb2] 4 (B), S. tuberosum var. Dsire (C) and clon CIP 387164.4 (D). Disease symptoms were visuals 5 dpi.

Doyle J.J & J.L. Doyle. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-15. DOI: 10.1313/1-92559-287-7:141. Fry W., 2008. Phytophthora infestans: the plant (and R gene) destroyer. Mol Plant Pathol 9(3):385-402. doi: 10.1111/j.13643703.2007.00465.x. Garca R., D. Somonte, Z. Zalda, et al. 2008. Efficient regeneration and Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of recalcitrant sweet potato (Ipomoea batatas L.) cultivars. AsPac J. Mol. Biol. Biotechnol 16 (2): 25-33. doi: 10.1313/1-259-627-7:111. Garelik G. 2002. Agriculture. Taking the bite out of potato blight. Science 298(5599):1702-1704. doi: 10.1126/science.298.5599.1702 Gillund F., A. Hilbeck, O.G Wikmark, L. Nordgard & Bohn T. 2013. Genetically Modified Potato with Increased Resistance to P. infestans - Selecting Test Species for Environmental Impact Assessment on Non-Target Organisms. Biosafety Report 2013/01. Available online: http://genok.no/wp-content/uploads/2013/03/Biosafety_Report_2013_01.pdf. Accessed 23.01.2013 Haas B.J, S. Kamoun, M.C. Zody, R H. Y. Jiang, et al. 2009. Genome Sequence and Analysis of The Irish Potato Famine Pathogen Phytophthora Infestans. Nature 461(7262): 393-398. doi:10.1038/nature08358 Hood E. E., S. B. Gelvin, L. S. Melchers, & A. Hoekema. 1993. New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Res 2:208-218. DOI:10.1007/BF01977351. Jacobs M.M., B. Vosman, V.G Vleeshowers, R.G Viser, B, et al. 2010. A novel approach to locate Phytophthora infestans resistance genes on the potato genetic map. Theor Appl Genet. 120(4):785-96. doi: 10.1007/s00122-009-1199-7. Kashani K., M.J Javaran, M. Mohebodini, A. Moieni; M. Sheikhi & D. Abad 2012. Regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of three potato cultivars (Solanum tuberosum cv. Dsire Agria and Marfona) by human proinsulin gene. AJCS 6(7):1212-1220. ISSN 1835-2693. Lagunes F.E. 2009. Transformacin gentica de ajo (Allium sativum L.) mediante Agrobacterium tumefaciens. Transformacin gentica de ajo (Allium sativum L.) mediante Agrobacterium tumefaciens. Tesis, Magister en Recursos Genticos y Productividad, mencin en Ciencias. Colegio de Postgraduados Campus Montecillo, Texcoco, Edo. de Mxico. p.95. http://www.cm.colpos.mx/2010/images/tesis_p/ fisiologiaV/resumen/resumen_transformaci%F3n.pdf

Lokossou A.A, H. Rietman, M. Wang, P. Krenek, et al. 2010. Diversity, distribution, and evolution of Solanum bulbocastanum late blight resistance genes. Mol Plant Microbe Interact. 23(9):1206-16. doi: 10.1094/MPMI-23-9-1206. Lpez A. & A. Chaparro. 2007. A system for transformation potato plants (Solanum tuberosum sp. andigena var. Pastusa suprema) mediated through Agrobacterium tumefaciens. Agronoma Colombiana 25(1):16-25. ISSN 0120-9965. Luo H.R., M. Santa Maria, J. Benavides, D.P Zhang, Y.Z Zhang & M. Ghislain. 2006. Rapid genetic transformation of sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam) via organogenesis. African Journal of Biotechnology. 5(20):1851-1857. ISSN 16845315. MHamdi M., C. Rouvire, J. Rojas-Beltran, P. Du Jardin. 2003. Optimisation de la transformation gntique de la ponme de terre par Agrobacterium tumefaciens. Utilisation de la rsistance lhygromycine comme marqueur slectif. Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 7 (34):183188. ISSN 1370-6233. Medina-Bolivar F., R. Wright, V. Funk, et al. 2003. A non-toxic lectin for antigen delivery of plant-based mucosal vaccines. Vaccine. 21(910):997-1005. doi.org/10.1016/S0264-410X(02)00551. Monserrat E., V. Marfa, E. Mel & J. Messenguer. 2001. Study of different antibiotic combinations for use in the elimination of Agrobacterium with kanamycin selection in cRNAation. Plant Cell Tissue and Organ Culture 65: 211-220. DOI:10.1023/A:1010630726444. Naess S., J. Bradeen, S. Wielgus, et al. 2000. Resistance to late blight in Solanum bulbocastanum is mapped to chromosome 8. Theor Appl Genet.10: 697704. DOI: 10.1007/s001220051533. Nishizawa Y., A. Kawakami, T. Hibi, D. He, N. Shibuya & E. Minami. 1999. Regulation of the chitinase gene expression in suspensioncultured rice cells by N-acetylchitooligosaccharides: differences in the signal transduction pathways leading to the activation of elicitor-responsive genes. Plant Mol Biol. 39(5):907-914. DOI: 10.1023/A:1006161802334. Nombela G., V.M Williamson, & M. Muniz. 2003. The root-knot nematode resistance gene Mi-1.2 of tomato is responsible for resistance against the whitefly Bemisia tabaci. Mol. Plant Microbe.16(7):645-9. doi. org/10.1094/MPMI.2003.16.7.645. Pel M.A., S.J Foster, T.H Park, H. Rietman, et al. 2009. Mapping and cloning of late blight resistance genes from Solanum venturii using an interspecific candidate gene approach. Mol Plant Microbe Interact. 22(5):601-15. doi: 10.1094/MPMI-22-5-0601.

Rev. peru. biol. 20(3): 205 - 210 (March 2014)

209

Orbegozo et al.
Prez W., J. Gamboa, Y. Falcon, M. Coca, et al. 2001. Genetic structure of Peruvian populations of Phytophthora infestans. Phytopathology.91:956-965. doi: 10.1094/PHYTO.2001.91.10.956. Petti C., T. Wendt, C. Meade & E. Mullins. 2009. Evidence of genotype dependency within Agrobacterium tumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic. Phytophthora infestans-tolerant potato. J Biosci Bioeng.107(3):301306. doi.org/10.1016/j.jbiosc.2008.11.012 Sambrook J. & D. Russell. 2001. Molecular Cloning: a Laboratory Manual 3er ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Sarker S.R., M. Hossain & F. Shirin. 2009. Precise Incubation Period Increases the Agrobacterium Mediated Transformation Efficiency in Potato (Solanum tuberosum L.) cvs. Cardinal and Atlas. Plant Tissue Cult. & Biotech. 19(2): 227-235. DOI. 10.3329/ptcb.v19i2.5440. Song J., J.M Bradeen, S.K Naess, et al. 2003. Gene RB cloned from Solanum bulbocastanum confers broad spectrum resistance to potato late blight. Proc Natl Acad Sci U S A. 100(16):9128-9133. doi: 10.1073/ pnas.1533501100. Soto N., G.A Enrquez, A. Ferreira, et al. 2007. Efficient transformation of potato stems segments from cultivar Dsire using phosphinothricin as selection marker. Biotecnologa Aplicada. 24:139-144. ISSN: 0864-4551. Storck T., T. Bhme & H. Schultheiss. 2012. Fortuna et al. Status and perspectives of GM approaches to fight late blight. PPO-Special.15: 45 48. DOI: 09.11/j.6531-413.2012.02927. Van Der Vossen E.A., J. Gros, A. Sikkema, M. Muskens, et al. 2005. The Rpiblb2 gene from Solanum bulbocastanum is an Mi-1 gene homolog conferring broad-spectrum late blight resistance in potato. Plant J. 44(2):208-222. DOI: 10.1111/j.1365-313X.2005.02527.x Villamon F.G., D.M. Spooner, M. Orrillo, E. Mihovilovich, W. Perez, & M. Bonierbale. 2005. Late blight resistance linkages in a novel cross of the wild potato species Solanum paucissectum (series Piurana). Theor. Appl. Genet. 111:1201-1214. DOI 10.1007/s00122005-0053-9

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Rev. peru. biol. 20(3): 211 - 214 (Marzo 2014) FACULTAD DE C IENCIAS BIOLGICAS UNMSM

Identificacin de genes relacionados a sequa en papas nativas empleando RNA-Seq

ISSN-L 1561-0837

TRABAJOS ORIGINALES Identificacin de genes relacionados a sequa en papas nativas empleando RNA-Seq
Identification of genes related to drought in native potatoes using RNA-Seq

Yerisf Torres*, Roberto Lozano, Carlos Merino y Gisella Orjeda

Unidad de genmica, Laboratorios de Investigacin y Desarrollo (LID), Universidad Peruana Cayetano Heredia. Av. Honorio Delgado 430, Urb. Ingeniera, S.M.P. Lima - Per. Email Yerisf Torres: yerisf.torres.a@upch.pe; Email Roberto Lozano: roberto.lozano@upch.pe Email Carlos Merino: carlos.merino.m@upch.pe Email Gisella Orjeda: gisella.orjeda@upch.pe *Autor para Correspondencia

Resumen
El reciente desarrollo del RNA-Seq, un mtodo de secuenciamiento masivo en paralelo para el anlisis de transcriptomas permite conocer el perfil de expresin de las plantas en respuesta a estrs de tipo abitico y bitico. En este estudio, se secuenci el mRNA proveniente de hojas y races de dos variedades de papas nativas expuestas a diferentes niveles de sequa. Lecturas o reads de 50 pares de bases provenientes de mRNA se mapearon al genoma de papa: 75 82% mapearon a posiciones nicas, 6 14% mapearon a mltiples posiciones y 9 12% no mapearon a posicin alguna del genoma. Comparando los perfiles de expresin, se encontraron entre 887 1925 genes inducidos/reprimidos por sequa en la variedad sensible y 998 1995 en la tolerante. Este estudio gener informacin de gran valor que podr ser utilizada en futuros estudios para comprender mejor los mecanismos moleculares de resistencia a sequa en papa y especies cercanas. Palabras clave: RNA-Seq; transcriptoma; sequa; papa; mRNA.

Abstract
The recent advent RNA sequencing technology (RNA-Seq), a massively parallel sequencing method for transcriptome analysis, provides an opportunity to understand the expression profile of plants in response to biotic and abiotic stress. In this study, the mRNA was sequencing from leaves and roots of two native potato varieties at different levels of drought. Fifty-base-pair reads from whole mRNAs were mapped to the potato genomic sequence: 75 82% mapped uniquely to the genome, 6 14% mapped to several locations in the genome and 9 12% had no match in the genome. Comparing expression profiles, 887 to 1925 genes were found to be induced/repressed by drought in the sensible variety and 998 to 1995 in the tolerant. This research provides valuable information for future studies and deeper understanding of the molecular mechanism of drought resistance in potato and related species. Keywords: RNA-Seq; transcriptome; drought; potato; mRNA.

Citacin: Torres Y., R. Lozano, C. Merino & G. Orjeda. 2014. Identificacin de genes relacionados a sequa en papas nativas empleando RNA-Seq. Rev. peru. biol. 20(3): 211 - 214 (Marzo 2014)

Introduccin La sequa es el estrs medio ambiental ms importante en la agricultura, por lo que se vienen realizado muchos esfuerzos para mejorar la productividad de los cultivos bajo condiciones limitantes de agua. La papa, el tercer cultivo alimentario ms importante del mundo (FAOSTAT 2008) es muy sensible a la sequa, ya que necesita un riego frecuente. A diferencia de Solanum tuberosum subs. tuberosum, las especies nativas de los andes, cultivadas a altitudes de 3500 m, estn adaptadas a diversas condiciones climticas adversas (Vasquez-Robinet et al., 2008). Esto hace a estas variedades de papa los candidatos ideales para estudiar la expresin de genes responsables de la tolerancia a la sequa. Este trabajo pretende identificar genes relacionados a sequa en papa, empleando la tecnologa de secuenciamiento de RNA (RNA-Seq), una herramienta revolucionaria de la transcriptmica (Mortazavi et al. 2008) que permite secuenciar genes transcritos y cuantificarlos de manera precisa.

Presentado: Aceptado: Publicado online:

05/11/2013 20/01/2014 14/03/2014

Los autores. Publicado por la Revista Peruana de Biologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Este es un artculo de acceso abierto, distribuido bajo los trminos de la Licencia de Atribucin Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 de Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed. es_ES), que permite el uso no comercial, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citadas. Para uso comercial, por favor pngase en contacto con editor.revperubiol@gmail.com.

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Torres et al.

Materiales y mtodos Material vegetal.- Dos variedades de S. tuberosum andigena, Negrita 703671 (tolerante a sequa) y Wila-HuakaLajra 703248 (susceptible a sequa) fueron propagadas in-vitro, enraizadas y transferidas a un sistema aeropnico de cultivo en la Estacin Experimental de INIA- Huancayo. Diseo del experimento.- Las plantas recibieron una irrigacin normal durante aproximadamente 3 meses, tiempo despus del cual comienza la tuberizacin, en este momento se inici la induccin del estrs por sequa dejando de regar a las plantas. Se tomaron muestras de hojas y races de ambas variedades considerando cuatro tiempos de muestreo. Para determinar los tiempos de muestreo se realizaron mediciones de la tasa fotosintticas de la variedad tolerante (703671) en condiciones normales y de sequa, empleando el equipo CI-340 Handheld Photosynthesis System (CID Bio-Science, Inc. USA) que es un analizador infrarrojo de CO2/H2O que mide la cantidad de CO2 asimilada por un rea de hoja conocida en un tiempo dado. El Tiempo Cero correspondi al control del experimento, antes del inicio de la sequa. Los tiempos T1, T2 y T3 correspondieron a una disminucin de la tasa fotosinttica en la planta tolerante de 25%, 50 60% y una recuperacin hasta del 80% del valor control respectivamente (Vsquez- Robinet et al. 2008). Los tiempos T1, T2 representaron la respuesta temprana y tarda de las plantas frente a la sequa, mientras que el tiempo T3 represento la recuperacin de las plantas luego de reiniciado el riego. Anlisis de expresin.- El RNA fue aislado de aproximadamente 1 2 g de tejido de hojas y races usando el mtodo fenol-cloroformo (Buell Lab - Michigan State University, comunicacin personal 2010), y purificado usando el Kit Ambion DNA-free (Cat. No. 1906). El RNA extrado fue secuenciado empleando un secuenciador Illumina Hi-SeqTM 2000. Brevemente consiste en que la poblacin de RNA extrado fue convertido a una librera de fragmentos de DNA, cada molcula luego fue amplificada, cuantificada y secuenciada, con lecturas de 50 pares de bases (bp).
Tabla 1. Descripcin de las 16 libreras secuenciadas. T: tolarante, S: susceptible, L: hojas, R: races. Nivel de sequa Variedad 703671 Control 703248 703671 Respuesta temprana 703248 703671 Respuesta tarda 703248 703671 Recuperacin 703248 Tejido Hoja Raz Hoja Raz Hoja Raz Hoja Raz Hoja Raz Hoja Raz Hoja Raz Hoja Raz Librera TLC TRC SLC SRC TL1 TR1 SL1 SR1 TL2 TR2 SL2 SR2 TL3 TR3 SL3 SR3

Este procedimiento fue realizado en la Universidad de Michigan (Buell Lab, Michigan State University). Se generaron en total 16 libreras correspondientes a mRNA de hojas y races de las dos variedades en estudio en los cuatro tiempos de muestreo (Tabla 1). Para el anlisis bioinformtico se realiz primero un control de calidad de las lecturas empleando el programa FastQC versin 0.10.0, y dos herramientas de FastX, FASTQ Clipper, que eliminan secuencias de adaptadores o linkers y FASTQ Trimmed, que permite eliminar bases de mala calidad presentes en las lecturas, acortando el tamao de stas. Las lecturas fueron alineadas al genoma de referencia de papa (PGSC. 2011), empleando los programas Bowtie 2.0.0 (Langmead et al. 2009) y TopHat (Trapnell et al. 2009). Posteriormente se ensamblaron y cuantificaron las lecturas empleando el programa Cufflinks 1.3.0 (Trapnell et al., 2010), y se emple la herramienta Cuffdiff para identificar los genes con cambios ms significativos en el nivel de expresin durante el experimento. Resultados y discusin Control de calidad.- Con el programa FastQ se determin el Phred Score para los reads de las 32 libreras. Los valores Phred varan entre 4 y 60, y asignaron un valor de calidad a cada base de una secuencia, siendo ms alta la calidad al ms alto valor. Se consider como umbral un valor Phred > 28 (considerando que un valor de Phred = 30 indica que la probabilidad de tener una base incorrecta es de 1 en 1000). En 5 libreras las 50 bases de los reads tienes un valor Phred por encima del umbral, 6 libreras presentaron las 3 primeras bases con un valor Phred debajo del umbral y 5 libreras presentaron las 4 primeras bases con un valor Phred debajo del umbral. En estos dos ltimos casos se emple la herramienta FastX-Trimmer para cortar las primeras 3 4 bases de todos los reads de estas libreras y optimizar la calidad de los mismos. Mapeo de las lecturas.- Una vez realizado el control de calidad, se emple el programa TopHat para mapear todas las secuencias obtenidas al genoma de referencia de papa que corresponde a S. tuberosum Group Phureja DM1-3 516R44 (PGSC 2011). En base al alineamiento, las secuencias fueron clasificadas en tres clases: reads nicos que son aquellos que mapean con una nica posicin en el genoma, reads que mapean con ms de una posicin en el genoma de referencia y los reads que no mapean con regin genmica alguna. Empleando el script Perl mapping stadisticas se calcul el nmero y porcentaje de estos reads (Tabla 2). Del total de reads evaluados por cada librera, el 75 83% de reads fueron nicos, mientras que el 6 14% mapearon a mltiples localizaciones en el genoma y 8 11% no mapearon con el genoma. Estos valores indican un desempeo/ rendimiento similar de construccin y secuenciamiento entre las libreras. Adicionalmente, como un control de calidad se secuenci una librera construida a partir de hojas del individuo de referencia DM1-3 516R44, encontrndose valores semejantes. Expresin diferencial de genes.- El siguiente paso en el anlisis de RNA-Seq fue la reconstruccin del transcriptoma y su cuantificacin El nivel de expresin de todos los transcriptos que mapearon en el genoma fue cuantificado como fragmentos por kilobase de exn por milln de reads (FPKM).
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Identificacin de genes relacionados a sequa en papas nativas empleando RNA-Seq

Tabla 2. Resumen estadstico del nmero de reads secuenciados y mapados con TopHat al genoma de referencia. DM hojas: corresponde a una librera construida a partir del RNA de hojas de DM, a quien corresponde el genoma de referencia. Librera TLC TL1 TL2 TL3 TRC TR1 TR2 TR3 SLC SL1 SL2 SL3 SRC SR1 SR2 SR3 DM Hojas Total reads 26304956 17079619 22260826 25424875 30840996 19780525 23292392 14717082 27976839 28223430 23408804 20067948 27993309 27415791 24620110 16975442 15983851 nico 21291611 14158415 18156792 20546901 25101293 16431906 19398147 12249428 21798560 21187144 18275867 15983176 22590737 22386601 20164169 13975326 12481572 % 80,94 82,9 81,56 80,81 81,39 83,07 83,28 83,23 77,92 75,07 78,07 79,65 80,7 81,66 81,9 82,33 78,09 Mltiple 2758808 1535509 2257435 2214432 2153567 1478617 1475718 1047903 3250580 4139513 2455980 2002679 2129629 1945125 1711811 1162503 1513613 % 10,49 8,99 10,14 8,71 6,98 7,48 6,34 7,12 11,62 14,67 10,49 9,98 7,61 7,09 6,95 6,85 9,47 Unmapped 2254537 1385695 1846599 2663542 3586136 1870002 2418527 1419751 2927699 2896773 2676957 2082093 3272943 3084065 2744130 1837613 1988666 % 8,57 8,11 8,3 10,48 11,63 9,45 10,38 9,65 10,46 10,26 11,44 10,38 11,69 11,25 11,15 10,83 12,44

La comparacin de niveles de expresin entre diferentes muestras es parte clave del secuenciamiento de transcriptoma. Empleando el programa Cuffdiff se compararon los perfiles de expresin de las variedades susceptible (703248) y tolerante (703671) durante la exposicin a sequa (respuesta temprana, tarda y recuperacin) y adems entre ambos individuos. En la Figura 1 se muestra la comparacin del nmero total de transcriptos diferencialmente expresados en hojas y races de 703248 y 703671 bajo los tratamientos de sequa; el nmero de genes diferencialmente expresados entre los tratamientos vara entre 887 1995 y se encontr un aumento de este nmero conforme avanza el experimento. Respecto a la induccin y represin gnica, en hojas de 703248 durante la respuesta temprana se encontr que 364 genes

fueron inducidos significativamente, mientras que en la sequa tarda y en la recuperacin 893 y 989 genes respectivamente; esta tendencia creciente en la induccin de genes se mantiene en hojas y races de ambas variedades conforme la sequa avanza. Por otra parte, el nmero de genes reprimidos vari entre 359 en races de 703671 durante la respuesta temprana y 1085 en hojas de 703671 tambin en la respuesta temprana (Fig. 2). Comparando el perfil de expresin de ambas variedades, se encontr que en la variedad 703671 un mayor nmero de genes mostraron cambios significativos en respuesta a la sequa. En la respuesta temprana, 149 genes inducidos y 276 reprimidos fueron comunes a hojas de las dos variedades bajo estudio. Se

1600 1400 1200 989 788 1086 956 730 382 639 1002 1386

Nmero total de genes

2500 2000 1500 1000 500 0 887 1506 998 1623 1450 1995 1925 1853 1729

1000

893

Nmero de genes

800 600 400 200 0 -200 -400 -600 - 523 364 421

1731 1654

918

- 359 - 536 - 730 - 740 - 1085 - 662 - 897 - 924 - 839 - 729 - 609

Respuesta temprana

Respuesta tarda

Recuperacin

-800 -1000 -1200 -1400

Tratamientos de sequa
703248-Hojas 703671-Hojas 703248-Races 703671-Races

Reprimidos

Inducidos

Figura 1. Nmero total de genes diferencialmente expresados en hojas y races de S. tuberosum andigena, variedad Negrita 703671 (tolerante a sequa) y Wila-HuakaLajra 703248 (susceptible a sequa) durante el estrs por sequa.
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Figura 2. Distribucin del nmero de genes inducidos y reprimidos en S. tuberosum andigena, variedad Negrita 703671 (tolerante a sequa) y Wila-HuakaLajra 703248 (susceptible a sequa) durante el estrs por sequa.

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Torres et al.
HOJAS Respuesta temprana 703248 215 149 272 703671 RACES Respuesta temprana 703248 212 170 469 703671
HOJAS Respuesta temprana 703248 247 Respuesta tarda 703248 432 298 356 276 809 703671 RACES Respuesta temprana 703248 435 Respuesta tarda 703671 703248 656 267 562 703671 101 983 703671

Respuesta tarda 703248 455 438 347

Respuesta tarda 703671 703248 383 347 555 703671

Recuperacin 703248 412 577 379

Recuperacin 703671 703248 294 792 594 703671

Recuperacin 703248 393 347 550

Recuperacin 703671 703248 494 345 263 703671

Figura 3. Nmero de genes inducidos por sequa (respuesta temprana y tarda) y en la recuperacin. Se muestra el nmero de genes compartidos por S. tuberosum andigena, variedad Negrita 703671 (tolerante a sequa) y Wila-HuakaLajra 703248 (susceptible a sequa) y aquellos de expresin nica.

Figura 4. Nmero de genes reprimidos por sequa (respuesta temprana y tarda) y en la recuperacin. Se muestra el nmero de genes compartidos por S. tuberosum andigena, variedad Negrita 703671 (tolerante a sequa) y Wila-HuakaLajra 703248 (susceptible a sequa) y aquellos de expresin nica.

encontr un mayor nmero de genes especficos y diferencialmente expresados en hojas de la variedad 703671 (272 inducidos y 809 reprimidos), mientras que se encontraron solo 562 genes (215 inducidos y 247 reprimidos) especficos de hojas de la variedad 703248 (Figs. 3 y 4). Un patrn similar se encontr en races, 170 genes inducidos y 101 reprimidos fueron comunes en las dos variedades, encontrndose un mayor nmero de genes especficos y diferencialmente expresados en la variedad 703671 (469 inducidos y 983 reprimidos), mientras que se encontraron solo 646 genes (211 inducidos y 435 reprimidos) especficos de la variedad 703248 (Figs. 3 y 4). Estos genes especficos de la variedad tolerante representan candidatos que debern ser estudiados a mayor profundidad para conocer el rol que estos cumplen en la resistencia a sequa. Es importante resaltar que, durante la respuesta temprana de ambas variedades se encontr un mayor nmero de genes nicos y especficos con expresin diferencial en comparacin al de los genes comunes, mientras que en la etapa de recuperacin es mayor el nmero de genes comunes con expresin diferencial. Lo cual podra indicar que los mecanismos de respuesta temprana a sequa son especficos de cada variedad, pudiendo ser esta la etapa clave para encontrar genes responsables de la resistencia a sequa. En este trabajo, el empleo del RNA-Seq permiti generar 400 millones de reads, que analizados y procesados con herramientas bioinformticas permitieron identificar y cuantificar un gran nmero de genes de papa relacionados a sequa y que podran permitir comprender mejor los mecanismos de resistencia en papa y otras especies relacionadas.

Informacin adicional Contribucin de autores.- Gisella Orjeda y Yerisf Torres: concepcin y diseo de experimento. Yerisf Torres, Roberto Lozano: realizacin del experimento. Yerisf Torres, Roberto Lozano y Carlos Merino: anlisis de datos. Yerisf Torres, Roberto Lozano y Carlos Merino: redaccin del artculo. Conflicto de inters.- Los autores han declarado no incurrir en conflicto de intereses. Financiamiento.- Los autores agradecen el financiamiento FINCyT (099-FINCyT-EQUIP-2009)/(076-FINCyTPIN-2008). Literatura citada
FAOSTAT 2008. Potato world: Production and consumption. International Year of the Potato. <http://www.potato2008.org/en/world/>. Acceso: 08/10/2008. Langmead B., C. Trapnell, M. Pop & S. Salzberg. 2009. Ultrafast and memoryefficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol.10:R25. Mortazavi A., B. Williams, K. McCue, L. Schaeffer & B. Wold 2008. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods, Vol. 5, Isuue7, pp. 621-628. PGSC (The Potato Genome Sequencing Consortium). 2011. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature 475, 189195. Trapnell C., L. Pachter & SL. Salzberg. 2009. TopHat: discovering splice junctions with RNA-seq. Bioinformatics.;25:11051111. Trapnell C., A. Roberts, L. Goff, et al. 2012. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature Protocols, Vol. 7, Issue 3, pag 562578 Vasquez-Robinet C., Sh. Mane, A. Ulanov, et al. 2008. Physiological and molecular adaptations to drought in Andean potato genotypes. Journal of Experimental Botany, Vol. 59, No. 8, pp. 21092123.

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Rev. peru. biol. 20(3): 215 - 222 (Marzo 2014) FACULTAD DE C IENCIAS BIOLGICAS UNMSM

Diversidad gentica de papas nativas en cultivares nativos del Per

ISSN-L 1561-0837

TRABAJOS ORIGINALES Diversidad gentica de papas nativas (Solanum spp.) conservadas en cultivares nativos del Per
Genetic diversity of native potatoes (Solanum spp.) conserved in landraces from Peru

Julin Soto3, Tulio Medina2, Yeny Aquino2, Rolando Estrada1*

1 Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Ciudad Universitaria de San Marcos Av. Venezuela s/n. Apartado 110058, Lima 11 Per. 2 Instituto Nacional de Investigacin Agraria-INIA, Av. La Molina # 1981. Apartado Postal 2791, La Molina, Lima - Per 3 Centro Internacional de la Papa, CIP-Lima. Av. La Molina 1895 La Molina Apartado 1558, Lima 12, Per *Autor para correspondencia Email Rolando Estrada: restradaj@gmail.com Email Julin Soto: julian4881@yahoo.es

Resumen
El presente trabajo analiza el grado de diversidad gentica utilizando 18 marcadores microsatlites, de una muestra aleatoria de 79 variedades nominales de papa nativa (Solanum spp.) procedentes de cinco regiones polticas del Per (Ayacucho, Cajamarca, Cusco, Huancavelica y Puno), cultivadas en chacras de agricultores que colaboraron con el proyecto Conservacin in situ de los cultivos nativos y sus parientes silvestres. De los 18 marcadores, 17 amplificaron un solo locus polimrfico, siendo el promedio de alelos por locus de 8.79. Se obtuvo una similitud media de 0.62 y rangos de agrupamiento que vararon desde 0.41 a 0.98. Para los 19 loci registrados se obtuvo un total de 166 alelos. La regin de Cuzco present el mayor nmero de alelos (130 alelos). De los 166 alelos caracterizados, 72 alelos (43.37%) fueron comunes o compartidos con las 5 regiones de colecta. La regin de Puno presento el mayor numero de alelos exclusivos (8 alelos). Las 42 variedades nominales de S. tuberosum subsp. andigena tuvieron una diversidad promedio de 0.74 y las 18 variedades nominales de S. x chaucha una diversidad promedio de 0.70. Los valores de polimorfismo (PIC = 0.55 0.85) y los ndices de diversidad gentica obtenidos indicaran que los microsatlites evaluados logran identificar altos niveles de diversidad gentica, pero a la vez no son suficientes para discriminar grupos diferenciados por procedencia o especies. Nuestros anlisis indican que existe un alto grado de diversidad gentica y corroboran los resultados obtenidos de los inventarios y caracterizaciones morfolgicas realizadas in situ; tambin podemos concluir que existira un pool de genes comn que se encontraran ampliamente distribuidos entre las regiones estudiadas. Palabras claves: Conservacin in situ; Diversidad gentica; papa nativa; microsatlites; SSR.

Citacin: Soto J., T. Medina, Y. Aquino, R. Estrada. 2014. Diversidad gentica de papas nativas (Solanum spp.) conservadas en cultivares nativos del Per. Rev. peru. biol. 20(3): 215 - 222 (Marzo 2014)

Abstract
This paper analyzes the genetic diversity of 79 accessions of native potato varieties (Solanum spp.) using 18 microsatellite markers. A random sample from Ayacucho, Cajamarca, Cusco, Huancavelica and Puno from "chacras" of farmers who collaborated with the "In situ conservation of native crops and wild relatives" were used. 17 markers amplified one single polymorphic locus, the mean number of alleles per locus was 8.79. The mean similarity was 0.62 and clustering indexes varied between 0.41 and 0.98. 19 loci showed a total of 166 alleles. Cuzco had the highest number of alleles (130 alleles). Of the 166 characterized alleles, 72 alleles (43.37%) were common or shared with 5 sampling sites. Puno had the highest number of exclusive alleles (8 alleles). The 42 varieties of S. tuberosum subsp. andigena showed a mean diversity of 0.74 and 18 varieties of S. x chaucha an average diversity of 0.70. Polymorphism (PIC = 0.55 to 0.85) and genetic diversity indices show that microsatellites evaluated can identify high levels of genetic diversity, but also are not sufficient to discriminate differentiated by origin or species groups. Our analyzes indicate a high genetic diversity and are consistent with inventories and morphological characterizations performed in situ, we can also conclude that there would be a common pool of genes would be found widely distributed among the regions studied. Keywords: In situ conservation; genetic diversity; native potato; microsatellites; SSR.

Presentado: Aceptado: Publicado online:

23/07/2012 14/11/2012 14/03/2014

Los autores. Publicado por la Revista Peruana de Biologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Este es un artculo de acceso abierto, distribuido bajo los trminos de la Licencia de Atribucin Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 de Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed. es_ES), que permite el uso no comercial, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citadas. Para uso comercial, por favor pngase en contacto con editor.revperubiol@gmail.com.

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Introduccin El gnero Solanum tiene ms de 300 especies que forman tubrculos, entre especies cultivadas y silvestres; sin embargo el gnero, considerado altamente polimrfico y muy complejo (Linnaeus 1753 en Ochoa 1990) incluye alrededor de 2400 especies alrededor del mundo (Ochoa 1999). En los Andes, el gnero est representado por ocho especies cultivadas y alrededor de 200 silvestres. La rica diversidad de las especies cultivadas est incluida en una serie poliploide (2n = 24, 36, 48 y 60), que incluye unas 4000 variedades comestibles, con alto potencial gentico para el rendimiento y amplia adaptabilidad a diferentes climas, lo que le ha permitido convertirlo en uno de los cultivos de mayor importancia para la alimentacin mundial (Estrada 2000, Hawkes 1962). A pesar del gran polimorfismo que existe entre las ocho especies cultivadas de papa (Fig. 1), estas tienen como caractersticas comunes el producir numerosos tubrculos, de gran tamao y agradables al paladar (Matsubayashi 1991), lo que las distingue de las especies silvestres, que poseen gran diversidad de caracteres y que pueden ser incorporarlos en las especies cultivadas mediante cruzamientos o manipulaciones genticas. La alta variabilidad de caracteres de las especies silvestres incluye tolerancias y resistencias a estrs bitico y abitico, que han permitido mejorar las variedades comerciales desde el punto de vista nutricional, agronmico, industrial y farmacutico. Es por ello que cada vez se incrementa ms el inters por conocer las caractersticas morfolgicas, bioqumicas y moleculares de las especies silvestres y cultivadas para prevenir la erosin gentica de las mismas. En el Per existe una gran diversidad cultural ligada a la conservacin de la biodiversidad, en este contexto el proyecto Conservacin in situ de los cultivos nativos y sus parientes silvestres (Proyeto in situ, llevado a cabo entre los aos 2001

- 2006 en el Instituto Nacional de Innovacin Agraria, INIA), estuvo orientado a reforzar la conservacin de los cultivos nativos en las chacras, identificar los factores que lo hacen posible y elevar el nivel de conciencia sobre su valor biolgico, cultural y nutricional en el mbito local y nacional, contando con la participacin de las comunidades campesinas del pas (INIA 2005 a-e). Los resultados del proyecto permitieron sustentar el alto grado de diversidad que presentan estos cultivos y fueron la base cientfica ms importante para justificar la necesidad de proteccin que debe ejercer el Estado en los aspectos culturales y biolgicos sobre los cultivares de papa nativa. Dentro de este contexto, se consider necesario afianzar los resultados obtenidos en la caracterizacin morfolgica de las papas nativas con el uso de marcadores moleculares. Para el caso de la papa, los microsatlites vienen siendo usados hace ms de 18 aos para la genotipificacin de este cultivo. Provan (1996), fue uno de los primeros en estudiar el potencial de los microsatlites para el anlisis de la diversidad gentica de cultivares de papa. Por otro lado, Milbourne et al. (1997) compararon la eficiencia de tres marcadores basados en PCR para diferenciar variedades de papa tetraploide llegando a la conclusin que los microsatlites presentaban mayor polimorfismo y mayores ventajas que los AFLP y RAPD. En el Per, Ghislain et al. (2001) en el Centro Internacional de la Papa (CIP), lograron seleccionar 18 iniciadores para secuencias microsatlites de papa, con un alto grado informativo y son este grupo de iniciadores los que fueron utilizados en el presente trabajo. Materiales y mtodos Material Vegetal y Extraccin de ADN.- Se colectaron al azar tubrculos de 79 variedades nominales de papa nativa (Solanum spp.) perteneciente a agricultores colaboradores del Proyecto in situ y procedentes de cinco regiones politicas: ocho variedades del distrito de Luricocha y 17 del distrito de Vinchos en la Regin Ayacucho, 14 variedades del distrito de Ocongate

Figura 1: Diagrama de evolucin de las especies de papa cultivada, sus relaciones genticas y sus posibles ancestros silvestres segn Hawkes (1994). Especies silvestres S. acaule (4X) S. sparsipilum (2X) S. leptophytes (2X) S. megistracolobum (2X)

S. Tuberosum subsp. andigena (4X)

S. stenotomum subsp. stenotomum (2X)

S. ajanhuiri (2X)

Especies cultivadas

S. Tuberosum subsp. tuberosum (4X) S. x curtilobum (5X)

S. x chaucha (3X)

S. stenotomum subsp. goniocalyx (2X)

S. phureja (2X)

S. x juzepczukii (3X)

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en la Regin Cusco, 15 variedades del distrito de Pomata en la Regin Puno, 13 variedades del distrito de Huasmn en la Regin Cajamarca y 12 variedades del distrito de Yauli en la Regin Huancavelica. De las 79 variedades, se identificaron 6 especies de papa cultivada: S. tuberosum subsp. andigena (42 variedades), S. stenotonum subsp. stenotonum (5 variedades) y S. stenotonum subsp. goniacalyx (4 variedades), S. phureja (2 variedades), S. ajanhuri (1 variedad), S. x chaucha (19 variedades) y S. x curtilobum (6 variedades). El ADN fue aislado a partir de hojas jvenes y frescas mediante el mtodo CTAB modificado de Doyle y Doyle (1990). Amplificacin de microsatlites.- Se utilizaron 18 iniciadores microsatlites identificados como altamente informativos por Ghislain et al. (2004) y desarrollados por Milbourne et al. (1998). Las condiciones de amplificacin se llevaron a cabo segn protocolos del CIP (CIP 1997, Ghislain et al. 2001) adaptados de Provan et al. (1996). La mezcla de reaccin const de: 20 ng de ADN, 0.5 M de cada iniciador, 2.5 mM de MgCl2, 0.2 mM de dNTPs, 1X de Taq buffer y 0.5 U de Taq polimerasa en un volumen total de 20 L. El programa de amplificacin se desarroll de la siguiente manera: 3 min. a 94 C, dos minutos a la temperatura de alineamiento, 1.5 minutos a 72 C, 30 ciclos de 1 minuto a 94 C, dos minutos a la temperatura de alineamiento, 1.5 minutos a 72 C y una elongacin final de 5 minutos a 72 C, utilizando un termociclador modelo PTC100 (MJ Reasearch Inc.). La temperatura de alineamiento fue usada segn los datos reportados por Ghislain et al. (2001, 2004). Los productos de amplificacin fueron separados en geles denaturantes de poliacrilamida (acrilamida 6%, bisacrilamida 0.3%, Urea 7M y TBE 1X) mediante electroforesis vertical en un sistema de secuenciamiento modelo S2-Gibco aplicndole un voltaje de 1600 V (40W). Se utiliz como marcador de peso la reaccin de secuenciamiento del plsmido pUC-18 (Kit de secuenciamiento -Promega) y la deteccin de los fragmentos se realiz mediante tincin con nitrato de plata (Promega Corporation 1996). Anlisis de datos.- El patrn de bandas obtenido para cada iniciador fue registrado en una matriz binaria donde a las bandas presentes se les asign el valor 1 y las ausentes el valor 0. Se calcul el ndice de similaridad DICE (Dice 1945, Nei y Lei 1979) y se realiz un anlisis de agrupamiento UPGMA mediante el programa NTSYSpc ver 2.0 (Rohlf 1993), adems se realiz un anlisis bootstrap con ayuda del programa WinBoot (Yap 1992). Las variedades analizadas se agruparon segn su procedencia, para determinar la cantidad de alelos que presentaban del total registrado, se analiz la presencia de los alelos compartidos entre las cinco regiones polticas de colecta y se determin el rango de alelos comunes y exclusivos en cada regin. Por ltimo, se determin el ndice de diversidad gentica (Nei 1973) para las especie S. tuberosum subsp. andigena (4x) y S. x chaucha (3x), por ser las que poseen mayor nmero de variedades en la muestra analizada. Teniendo en cuenta que su valor vara entre 0 a 1, siendo los valores cercanos a 1 los de mxima diversidad.

h = probabilidad que 2 alelos tomados al azar de la poblacin sean diferentes (Nei 1973) Resultados Nmero de alelos amplificados por locus e individuos no definidos.- De los 18 iniciadores microsatlites utilizados, 17 amplificaron un solo locus polimrfico mientras que el iniciador STM0019 amplific 2 loci. El rango de alelos encontrados por locus, fue desde 5 (STM1049 y STM1053) a 16 alelos (STM0019a), siendo el promedio de alelos por locus de 8.79. Adems los valores superiores a 0.5 encontrados (0.55 0.85) en el Contenido de Informacin Polimrfica (PIC) indican que los microsatlites evaluados son muy informativos detectando variaciones genticas en el cultivo de papa (Tabla 1). De las 79 variedades nominales analizadas, 16 no concordaron con el nmero de alelos esperados para un marcador segn la especie y ploidia asignada, siendo el iniciador STM2013 el que present con mayor frecuencia este fenmeno (13 variedades nominales). Adems, se identificaron 5 variedades nominales (4 accesiones diploides S. stenotomum subsp stenotomum y 1 accesin triploide S. x chaucha) que no concordaron con la especie asignada, debido a que el nmero de alelos para la mayora de iniciadores exceda a lo esperado para cada especie. Anlisis de agrupamiento.- Se obtuvo una similitud media de 0.62 y amplios rangos de agrupamiento que varan desde 0.41 a 0.98. El agrupamiento fue reforzado por medio del anlisis de bootstrap para ver la consistencia de los grupos formados. Aunque se usaron 18 marcadores microsatlites repartidos por todo el genoma de la papa y se analizaron 19 locus muy polimrficos, las variedades nominales no lograron diferenciarse en grupos homogneos. Sin embargo, en un rango de similitud de 0.51 a 0.72, se logr determinar 18 pequeos grupos en los cuales la mayora guardan alguna relacin de nombre, lugar y/o especie (Fig. 2). De estos 18 grupos, 7 grupos (I, IV, VIII, IX, X, XIII y XVIII) presentaron una consistencia de media a alta (46.1 a 83.8%) segn el anlisis bootstrap. Los grupos restantes presentaron una consistencia media a baja (39.6 a 10.4%). Con respecto a la procedencia del material colectado y a su identidad taxonmica, se observaron 5 grupos formados con accesiones pertenecientes a la misma regin poltica y con cierta relacin de especie (VII, VIII, X, XII y XVII). Se encontraron 4 variedades, posiblemente duplicadas: a) 2 accesiones de S. x curtilobum procedente de Cusco y b) 2 accesiones de S. x chaucha, una procedente de Ayacucho y la otra de Cusco. Riqueza allica.- Para los 19 loci registrados se obtuvo un total de 166 alelos. La regin de Cusco present el mayor nmero de alelos (130 alelos), seguido de Puno con 120, Ayacucho con 115, Huancavelica con 111 y Cajamarca con 105 alelos. Cabe resaltar que se analiz un mayor nmero de muestras de Ayacucho, sin embargo no se encontr un mayor nmero de alelos en esa regin; y ms an, solo 4 de los 19 locus analizados presentaron un mayor nmero de alelos en Ayacucho (Tabla 2) Alelos comunes y exclusivos.- De los 166 alelos caracterizados, 72 alelos (43.37%) fueron comunes o compartidos con las 5 regiones de colecta. Se registraron alelos exclusivos (aquellos que solo se encontraron en una de las 5 regiones) en todas las zonas

h=1
xi = frecuencia del alelo i

i=1

xi2

q = N de alelos observados en el locus

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Tabla 1. 19 locus registrados por 18 iniciadores microsatlites, nmero de alelos, rangos del tamao de alelos e ndice Polimrfico (PIC) registrados para 79 variedades nominales de papa nativa (Solanum spp). Iniciador (SCRI) STM1049 Secuencia de iniciadores forward Reverse (5- 3) CTACCAGTTTGTTGATTGTGGTG AGGGACTTTAATTTGTTGGACG STM2022 (CAA)3(CAA)3 GCGTCAGCGATTTCAGTACTA TTCAGTCAACTCCTGTTGCG STM1053 (TA)4 (ATC)5 TCTCCCCATCTTAATGTTTC CAACACAGCATSCAGATCATC STM3023 (GA)9,(GA)8,(GA) AAGCTGTTACTTGATTGCTGCA GTTCTGGCATTTCCATCTAGAGA STM1031 (AT)13 TGTGTTTGTTTTTCTGTAT AATTCTATCCTCATCTCTA STPcAo58 (TA)13 (AT)7(GT)10(AT)4 STM0019a (GT)5(GC)4(GT)4 (AT)7(GT)10(AT)4 STM0019b (GT)5(GC)4(GT)4 STM0031 (AC)5(AC)3 (GCAC)(AC)2 (GCAC)2 (AT)14 GT (AT)4 (GT)6 TTGATGAAAGGAATGCAGCTTGTG ACGTTAAAGAAGTGAGAGTACGAC AATAGGTGTACTGACTCTCAATG TTGAAGTAAAAGTCCTAGTATGTG AATAGGTGTACTGACTCTCAATG TTGAAGTAAAAGTCCTAGTATGTG CATACGCACGCACGTACAC TTCAACCTATCATTTTGTGAGTCG CAATTTCGTTTTTTCATGTGACAC ATGGCGTAATTTGATTTAATACGTAA STM2013 (TCTA)6 TTCGGAATTACCCTCTGCC AAAAAAAGAACGCGCACG STM1104 (TCT)5 TGATTCTCTTGCCTACTGTAATCG CAAAGTGGTGTGAAGCTGTGA STM1016 (TCT)9 TTCTGATTTCATGCATGTTTCC ATGCTTGCCATGTGATGTGT STGBSS (TCT)9 AATCGGTGATAAATGTGAATGC ATGCTTGCCATGTGATGTGT STWAX-2 (ACTC)5 CCCATAATACTGTCGATGAGCA GAATGTAGGGAAACATGCATGA STM3012 (CT)4, (CT)8 CAACTCAAACCAGAAGGCAAA GAGAAATGGGCACAAAAAACA STM1106 (ATT)13 TCCAGCTGATTGGTTAGGTTG ATGCGAATCTACTCGTCATGG STM0037 (TC)5 (AC)6 AA (AC)7 (AT)4 AATTTAACTTAGAAGATTAGTCTC ATTTGGTTGGGTATGATA STM0030 Compuesto (GT/GC)(GT)8 AGAGATCGATGTAAAACACGT GTGGCATTTTGATGGATT 53 XII 10 130 - 167 0.8434 53 XI 8 76 - 95 0.7164 55 X 9 132 - 166 0.8276 57 IX 7 150 - 212 0.5852 53 VIII 7 243 - 218 0.7713 53 VIII 11 125 - 142 0.8393 53 VIII 14 236 - 261 0.8405 57 VIII 12 163 - 180 0.8475 55 VII 11 146 - 171 0.8291 Td. 60-50 VII 6 212 - 229 0.7683 57 VII 10 148 - 199 0.7091 47 n.d. 6 93 - 106 0.6903 47 VI 16 157 - 214 0.8124 57 V 9 233 - 255 0.7873 55 V 7 262 - 298 0.5469 50 IV 7 167 - 202 0.6849 55 III 5 169 - 179 0.6835 53 II 6 184 - 257 0.6713 T de Nmero Rando de alineamiento Cromosoma de Alelos Alelos (C) 57 I 5

Motivo Repetitivo (ATA)6

PIC

185 - 204 0.5874

STM1052

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Figura 2: Dendograma obtenido por el mtodo de agrupamiento UPGMA a partir de una matriz de similitud (DICE) con 79 variedades de papa nativa (Solanum spp.) utilizando 18 iniciadores microsatlites. Los nmeros romanos indican los 18 grupos mejor formados y los nmeros entre cada brazo indican el grado de consenso segn el anlisis bootstrap. Abreviaturas: adg = S. tuberosum subsp. andigena, cur = S. x curtilobum, cha = S. x chaucha, gon = S. stenotomum subsp. goniacalyx, stm = S. stenotomum subsp. stenotomum, phu = S. phureja, aja = S. ajanhuri, AYA = Ayacucho, CUZ = Cuzco, CAJ = Cajamarca, PUN = Puno y HUA = Huancavelica.

de colecta y para 15 de los 18 iniciadores, siendo los iniciadores STWAX-2, STM1049 y STM1106 los que no presentaron alelos exclusivos (Tabla 3). La regin de Puno presento el mayor numero de alelos exclusivos (8 alelos). ndice de Diversidad gentica. - Para el caso de las 42 variedades nominales de S. tuberosum subsp. andigena, el valor promedio de diversidad fue de 0.74 y para las 18 variedades nominales de S. x chaucha, el valor promedio de diversidad fue de 0.70, siendo S. tuberosum subsp. andigena ligeramente ms diversa que S. x chaucha.
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Discusin Iniciadores multilocus En papas tetraploides, Milbourne el al. (1998) describieron la existencia de iniciadores que amplifican varios loci en simultaneo (multilocus); como es el caso del iniciador STM0019 que presenta dos regiones bien diferenciadas anteriormente reportado (Andrade 2001, Ames 2003, Ghislain et al. 2001). El incremento del nmero alelos esperados en el iniciador STM2013 para 13 accesiones, indicara la posibilidad de ser un marcador multilocus, presentando un locus bien definido y otro con problemas

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Tabla 2. Nmero total de alelos presentes para los 19 locus analizados y nmero total de alelos por zona de colecta. AYA = Ayacucho, CUZ = Cuzco, CAJ = Cajamarca, PUN = Puno y HUA = Huancavelica. Marcador SSR STWAX-2 STM3012 STM1104 STM1031 STM0031 STGBSS STM1052 STPcAo58 STM2022 STM1049 STM1016 STM0030 STM3023 STM1106 STM1053 STM0037 STM0019a STM0019b STM2013 Total Promedio Total 7 7 12 7 10 11 6 9 6 5 14 10 7 9 5 8 16 6 11 166 8.74 N alelos AYA 6 5 8 5 6 6 4 9 3 3 8 8 4 8 3 8 9 5 7 115 6.05 CUZ 7 5 8 6 7 8 5 7 4 5 11 7 7 9 4 6 10 6 8 130 6.84 PUN 6 3 9 3 5 9 6 7 5 5 10 7 3 6 4 7 10 5 10 120 6.32 CAJ 5 4 8 2 7 7 5 4 5 4 8 8 4 6 3 6 6 5 8 105 5.53 HUA 6 3 9 2 6 7 5 5 6 4 9 7 6 7 3 5 9 4 8 111 5.84 Tabla 3. Nmero de alelos comunes entre las zonas de colecta y nmero de alelos exclusivos para cada zona de colecta. AYA = Ayacucho, CUZ = Cuzco, CAJ = Cajamarca, PUN = Puno y HUA = Huancavelica. Marcador Alelos SSR comunes AYA STWAX-2 STM3012 STM1104 STM1031 STM0031 STGBSS STM1052 STPcAo58 STM2022 STM1049 STM1016 STM0030 STM3023 STM1106 STM1053 STM0037 STM0019a STM0019b STM2013 Total 4 3 5 1 3 6 4 4 2 3 6 4 3 4 3 4 3 3 7 72 0 2 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 6 N alelos exclusivos CUZ 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 6 PUN 0 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 2 0 2 8 CAJ 0 0 1 0 2 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 6 HUA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2

de especificidad en la regin amplificada, por lo que presentara bandas sobrepuestas y una gran cantidad de alelos nulos, esto tambin fue sugerido por Ghislain (1999) y Andrade (2001). Individuos no definidos La probable explicacin para que 5 variedades nominales no concuerden con el nmero de alelos esperado sera una mala clasificacin taxonmica in situ y por lo tanto no concuerdan con la especie asignada. Aunque tambin deberamos tomar en cuenta que los campesinos no siembran los cultivos de papa separndolos por especie y no tienen cuidado de la hibridacin natural que puede sufrir este cultivo (Sevilla 2004, Brush et al. 1981, Jackson et al. 1978) lo que estara ayudando a cometer errores involuntarios en la caracterizacin. Esta caracterstica natural de la papa de formar hbridos espontneos interespecficos podra hacer que fenotpicamente un hbrido sea reconocido como alguna especie determinada debido a que expresa caracterstica de uno de sus progenitores pero que genotpicamente comparte regiones genmicas de sus dos especies parentales. Anlisis de agrupamiento La baja similitud media obtenida (0.62) y los amplios rangos de agrupamiento nos indican una alta variacin gentica entre las accesiones evaluadas. Si bien existen ciertas relaciones entre zonas de procedencia y/o especie, la consistencia de estos grupos no es fuerte, por lo que no se puede afirmar grandes relaciones genticas entre las variedades nominales agrupadas.

Estos resultados sugieren que los 18 iniciadores microsatlites no fueron suficientes para lograr una completa diferenciacin en grupos homogneos por especies, zona de procedencia ni por ploida. Este fenmeno ya fue observado por Raker y Spooner en el 2002, donde encontraron que muchas accesiones de S. tuberosum subsp. andigena (tetraploides) se mantenan agrupadas junto con sus ancestros diploides sin formar grupos definidos. Adems debemos tener en cuenta el alto porcentaje de hibridacin natural presente en las especies de papa nativa y que posiblemente los marcadores moleculares evaluados no se encuentren ligados a regiones genticas que puedan diferenciar estas especies. La presencia de variedades duplicadas indicara la existencia de un pequeo grado de sobreestimacin de la diversidad gentica, especficamente en el caso de las 2 variedades que provienen de la misma regin. Por otro lado, las 2 variedades duplicadas que provienen de lugares diferentes podran explicarse por los mecanismo de intercambio de semillas que se efectan entre los agricultores (trueques, ferias regionales y nacionales) referenciado en los informes del Proyecto in situ (INIA 2005a-e). Riqueza allica La respuesta ms probable para que las cinco regiones presenten valores similares de polimorfismo, adems de presentar cantidades similares de alelos totales, de alelos exclusivos y de no formar grupos homogneos, probablemente se deba a la seleccin realizada por los agricultores (realizado desde los
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primeros pobladores andinos) que tienden a conservar diversos cultivares de papa; pero que entre todas ellas comparten las mismas caractersticas de utilidad comercial y de consumo (sabor, tamao, productividad, etc.) que hace que prevalezca un pool de genes especfico, adems no todos los agricultores mantienen las mismas variedades, pero s todas ellas se encuentran dentro de un solo pool de genes utilitarios. En el caso de Ayacucho, el tener un mayor nmero de muestras no signific encontrar un mayor nmero de alelos. Por lo que se puede afirmar que conservar el mayor nmero de variedades en una regin no necesariamente significar conservar la mayor cantidad de variacin gentica, ya que la diversidad gentica dentro de una especie no se distribuye homogneamente a travs de los ambientes donde se desarrolla (Hodgkin 1995). Por otro lado, casi la mitad de alelos caracterizados son comunes para las 5 regiones de colecta, lo que indicara que estos alelos son fijos para las especies de papa nativa y se encuentran ampliamente distribuidas en la zona andina del Per. Diversidad gentica de las especies evaluadas Los valores de diversidad gentica encontrados para las especies analizadas (S. tuberosum subsp. andigena y S. x chaucha) son altos y reafirman el alto grado de diversidad gentica mantenido en la poblacin muestreada. En promedio el valor de diversidad gentica es ms alto en S. tuberosum subsp. andigena (0.74) en comparacin con el valor obtenido para S. x chaucha (0.70), probablemente esto se deba a un menor nmero de muestras analizadas por parte de la especie triploide, pero tampoco podemos descartar la naturaleza gentica de la misma especie y sus diferencias de ploida como responsables del grado de diversidad. Los resultados nos indican que los microsatlites evaluados para papa nativa logran identificar altos niveles de diversidad gentica dado por los valores de polimorfismo (PIC = 0.55 0.85) y los ndices de diversidad gentica obtenidos, pero a la vez no son suficientes para discriminar grupos diferenciados por procedencia y/o especies. Asimismo, el anlisis de agrupamiento, la riqueza allica y los valores de diversidad gentica obtenidos indican que existe un alto grado de diversidad gentica y corrobora los resultados obtenidos de los inventarios y caracterizaciones morfolgicas realizadas en las chacras de los agricultores; tambin podemos concluir que debido a los niveles similares de riqueza allica, de alelos exclusivos y el gran porcentaje de alelos compartidos para las cinco regiones de colecta, existira un pool de genes comn y fijo para las especies de papa nativa y que se encontraran ampliamente distribuidos entre las chacras de los campesinos. Agradecimientos El presente trabajo ha sido realizado en el Instituto Nacional de Investigacin Agraria INIA de la Direccin de Investigacin Agraria DIA en la Sub direccin de Recursos Genticos y Biotecnologa SUDIRGEB, en el Centro Experimental La Molina - Lima, dentro del marco del Proyecto Conservacin in situ de los cultivos nativos y sus parientes silvestres, con el apoyo financiero del Fondo Mundial para el Medio Ambiente FMAM, la Cooperacin Italiana y el Gobierno Peruano. Los autores agradecen la colaboracin del Centro Internacional de la Papa por permitirnos usar los programas informticos necesarios para este trabajo.
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Literatura citada
Ames M. 2003. Validacin de la seleccin de la coleccin ncleo de Solanum tuberosum subsp. andigena mediante el uso de marcadores microsatlites. Tesis para optar el Titulo Profesional de BilogoUniversidad Nacional Federico Villareal, Lima, Per. pp. 48-63. Andrade D. 2001. Seleccin de la coleccin ncleo para Solanum phureja mediante el uso de marcadores microsatlites. Tesis para optar el Titulo Profesional de Bilogo-Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima, Per. pp. 51-71 Brush S. B., Carney, H. J. & Huamn, Z. 1981. Dynamics of Andean potato agriculture. Econ. Bot. 35:70-88. En: Estrada N. 2000. La biodiversidad en el mejoramiento gentico de la papa. Pp:41-42 CIP (Centro Internacional de la Papa). 1997. Protocolos de laboratorio de biologa molecular-Tipicacin gentica. En: Ghislain, M., Zhang, D. & Herrera, M. R (edit). Departamento de Recursos Genticos. Manual de Capacitacin CIP. Lima, Per. pp. 30. Dice L.R. 1945. Measures of the amount of ecologic association between species. Ecology, 26: 297-302. http://dx.doi. org/10.2307/1932409 Doyle J. J. & J. L. Doyle. 1990. Isolation of DNA from small amounts of plant tissues. BRL Focus 12: 13-15, modified at the Forest Biotechnology Lab at NCSU. Estrada R. 2000. La biodiversidad en el mejoramiento gentico de la papa. PROINPA/CIA/CIP. Bolivia. pp. 21-88. Ghislain M., D. Zhang, D. Fajardo, Z. Huaman & R. Hijmans. 1999. Marker-assisted sampling of the cultivated Andean potato Solanum phureja collection using RAPD markers. Genetic Resources and Crop evolution, 46 (6): 547-555. DOI 10.1023/A:1008724007888 Ghislain M., D.M. Spooner, F. Rodrguez, F. Villamn, J. Nuez, C. Vsquez, R. Waugh & M. Bonierbale. 2004. Selection of highly informative and user-friendly microsatellites (SSRs) for genotyping of cultivated potato. Theor Appl Genet (2004) 108:881890. DOI 10.1007/s00122-003-1494-7 Ghislain M., F. Rodrguez, F. Villamn, J. Nez J., R. Waugh & M. Bonierbale1. 2001. Establishment of microsatellite assays for potato genetic identification In: Scientist and farmer: partners in research for the 21th century. Technical Progress Report (1999-2000). International Potato Center, Lima, Per. pp. 167-174. Hawkes J.G. 1962. The origin f Solanum jusepczukii Buk and Solanum curtilobum Juz. et Buk. Z. Pflanzenzucht 47: 1-14. Hawkes J.G. 1994. Origins of cultivated potatoes and species relationships. In: Potato Genetics. Centre for Agriculture and BiosciencesCAB Internacional University Press UK Cambridge. Pp. 3-42. Hodgkin T. 1995. Some current issues in the conservation and use of plant Genetic Resources. In: Molecular Genetic techniques for plant genetic resources. Report of IPGRI workshop 9-11. Ayad W G, Hodgkin T, Jaradat A & Rao V R (Eds). October 1995. Rome, Italy. pp.3-22 Instituto Nacional de Investigacin Agraria-INIA. 2005a. Informe Final de cierre del Proyecto Conservacin in situ de cultivos nativos y sus parientes silvestres 2005. SUDIRRGG-Estacin Experimental Andenes. Cusco, Per Instituto Nacional de Investigacin Agraria-INIA. 2005b. Informe Final de cierre del Proyecto Conservacin in situ de cultivos nativos y sus parientes silvestres 2005. SUDIRRGG-Estacin Experimental Canaan. Ayacucho, Per Instituto Nacional de Investigacin Agraria-INIA. 2005c. Informe Final de cierre del Proyecto Conservacin in situ de cultivos nativos y sus parientes silvestres 2005. SUDIRRGG-Estacin Experimental Ilpa. Puno, Per Instituto Nacional de Investigacin Agraria-INIA. 2005d. Informe Final de cierre del Proyecto Conservacin in situ de cultivos nativos y sus parientes silvestres 2005. SUDIRRGG-Estacin Experimental Baos del Inca. Cajamarca, Per Instituto Nacional de Investigacin Agraria-INIA. 2005e. Informe Final de cierre del Proyecto Conservacin in situ de cultivos nativos y sus parientes silvestres 2005. SUDIRRGG-Estacin Experimental Santa Ana. Huancayo, Per. Jackson M. T., P. R. Rowe & J.G. Hawkes. 1978. Crossability relationships of Andean potato varieties of three ploidy levels. Euphytica 27:541-551. En: Estrada N. 2000. La biodiversidad en el mejoramiento gentico de la papa. pp:41-42

221

Soto et al.
Matsubayashi M. 1991. Phylogenetic relationships in the potato and its related species. In: Chromosome engineering in Plants: genetics, breeding and evolution. Part B: Development in plant genetics and breeding. Edited by T. Tsuchiya and P. K. Gupta. Elsevier science Publisher B. V.; Amsterdan Printed in the Netherlands. Pp. 93-118. Milbourne D., R. Meyer, A.J. Cllins, L.D. Ramsay-Gebhardt & R. Waugh. 1998. Isolation, characterization and mapping of simple sequence repeat loci in potato. Mol. Gen. Genet (1998) 259: 233-245. DOI 10.1007/s004380050809 Milbourne D., R. Meyer, J.E. Bradshaw, E. Baird, N. Bonar, J. Provan, W. Powell & R. Waugh. 1997. Comparison of PCR-based marker system for the analysis of genetic relationships in cultivated potato. Molecular Breeding 3:127-136. DOI 10.1023/A:1009633005390 Nei M. & Lei W.H. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5269-5273 Nei M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA: 3321-3323 Ochoa C M. 1999. Las Papas de Sudamrica: Per. CIP. 1999. Kansas (USA). Allen Press. 1036 p Ochoa Carlos M. 1990. The potatoes of South America: Bolivia. Cambridge University Press.512 pp Promega Corporation. 1996. Silver sequence DNA sequencing system. Manual tcnico, EEUU. pp. 19 Provan J., A. Kumar, L. Shepherd, W. Powell & R. Waugh. 1996. Analysis of intra-specific somatic hybrids of potato (Solanum tuberosum) using simple sequence repeats. Plant Cell Reports 16:196-199. DOI 10.1007/BF01890866 Provan J., W. Powell & R. Waught. 1996. Microsatellite analysis of relationships within cultivated potato (Solanum tuberosum). Theorical and Applied Genetics. Springer-Verlag. 92:1078-1084. DOI10.1007/ BF00224052 Raker C M & Spooner D. 2002. Chilean tetraploid cultivated potato, Solanum tuberosum, is distinct from the Andean populations: Microsatellite data. Crop Sci. 42:1451-1458. doi:10.2135/cropsci2002.1451 Rohlf F. 1993. NTSYS pc. Numerical taxonomy and multivariate analysis system. Exeter Softyware. New York. E.E.U.U. Sevilla R & Holle M. 2004. Recursos Genticos Vegetales. Ed. Torre Azul. Lima, Per. Yap I.V. 1992. Winboot UPGMA bootstrapping for binary data. PHYLIP Copyright 1986-1991 by the University of Washington and Joseph Felsentein.

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del Chuchuhuasi MAYTENUS MACROCARpA en el sistema reproductor masculino del ratn

ISSN-L 1561-0837

TRABAJOS ORIGINALES Efecto de Maytenus macrocarpa Chuchuhuasi en el sistema reproductor masculino del ratn (Mus musculus)
Effect of Maytenus macrocarpa Chuchuhuasi in the male system reproductive of mouse (Mus musculus)
Lyonal G. Acosta1,2*, Jonathan Vsquez1, Vctor Nez1, Jos Pino1, Betty Shiga1

1 Laboratorio de Reproduccin y Biologa del Desarrollo, Instituto de Investigacin de Ciencias Biolgicas Antonio Raimondi, Facultad de Ciencias Biolgicas Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM). Lima Per 2 BIOGENETIC LAB SAC. Chiclayo Per. Autor para correspondencia: Bilogo Genetista. Lyonal Germn Acosta Campos. BIOGENETIC LAB SAC. Chiclayo Per. Laboratorio de Reproduccin y Biologa del Desarrollo, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Per. Casilla 11-058, Lima 11, Per. Tel.: +51 6 197000 1529; fax: +51 6 197000 1509. Email Lyonal Acosta: acostaclg@gmail.com

Resumen
Maytenus macrocarpa (Chuchuhuasi) es un rbol nativo de la regin Amaznica del Per utilizado como planta medicinal para el tratamiento de muchas enfermedades, sin embargo su efecto sobre el sistema reproductor masculino an no ha sido elucidado. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del extracto acuoso de M. macrocarpa en dosis diarias durante 7 das sobre los parmetros reproductivos de ratones machos. Se utiliz machos maduros de la cepa C57BL divididos en 2 grupos (n=10), Grupo Control (C): NaCl 0.9% y Grupo Tratamiento (T): Extracto acuoso de Chuchuhuasi, ambos suministrado diariamente va sonda esofgica y al octavo da fueron eutanizados. Se registraron el peso corporal y de los rganos reproductivos: testculo, epiddimo y conducto deferente, se evaluaron la concentracin, movilidad y morfologa espermtica. En nuestros datos observamos diferencias significativas (Prueba t- Student P=0.05) en el peso de la cabeza y cuerpo del epiddimo (C: 19.251.1 vs T: 21.262.0), el peso del conducto deferente (C: 10.620.7 vs T: 11.750.5), movilidad espermtica progresiva (C: 42.165.2 vs T: 25.828.4) e Inmviles (C: 36.054.9 vs T: 48.517.2). No se observaron diferencias en el recuento espermtico entre ambos grupos. La morfologa espermtica normal disminuy con la ingesta de M. macrocarpa (Prueba t-Student p<0.05) (C: 39.721.3 vs T: 30.784.9). Concluimos que el extracto acuoso de M. macrocarpa presenta un efecto negativo en el sistema reproductivo masculino de ratones. Palabras claves: Maytenus macrocarpa, Chuchuhuasi, ratn, calidad espermtica, infertilidad.

Abstract
Citacin: Acosta L.G., J. Vsquez, V. Nez., J. Pino, B. Shiga. 2014. Efecto de Maytenus macrocarpa Chuchuhuasi en el sistema reproductor masculino del ratn (Mus musculus). Rev. peru. biol. 20(3): 223 - 226 (Marzo 2014)

Maytenus macrocarpa (chuchuhuasi) is native tree of the Peruvian Amazon used as traditional medicine for the treatment of many diseases, but its effect on the male reproductive system has not yet been elucidated. The aim of this study is evaluate the effect of aqueous extract of M. macrocarpa in daily doses for 7 days on reproductive parameters of male mice. We used C57BL mature male mice divided into 2 groups (n= 10), Control Group (C): 0.9% NaCl and Treatment group (T): Aqueous extract of Chuchuhuasi, both supplied daily via oral gavages. At the eight day of treatment the mice were euthanized. The weight of the body and reproductive organs: testis, epididymis and vas deferens, were registered. Concentration, motility and sperm morphology were evaluated. The results showed significantly differences (t- Student test P<0.05) in the weight of the head and body epididymis (C: 19.251.1 vs T: 21.262.0), vas deferens (C: 10.610.7 vs T: 11.750.5), progressive sperm motility (C: 42.165.2 vs T: 25.828.4) and immobile sperm (C: 36.054.9 vs T: 48.517.2). No difference in sperm count was observed. The sperm normal morphology diminished with ingest of M. macrocarpa (tStudent test p <0.05) (C: 39.721.3 vs T: 30.784.9). We conclude that the aqueous extract of chuchuhuasi, has a negative effect on the male reproductive system of mice. Keywords: Maytenus macrocarpa, Chuchuhuasi, mouse, sperm quality, infertility.

Presentado: Aceptado: Publicado online:

04/10/2013 13/12/2013 14/03/2014

Introduccin Las plantas y sus derivados han sido usados como alimentos y fuente importante de principios activos para el tratamiento de distintas enfermedades. El potencial teraputico de la mayora de estas plantas esta basado en sus propiedades anticancergenas, antidiabticas, hepatoprotectivas, cardioprotectivas, antipasmdicas, analgsicas y varias otras propiedades farmacolgicas (D'Cruz et al. 2010).

Los autores. Publicado por la Revista Peruana de Biologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Este es un artculo de acceso abierto, distribuido bajo los trminos de la Licencia de Atribucin Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 de Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed. es_ES), que permite el uso no comercial, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citadas. Para uso comercial, por favor pngase en contacto con editor.revperubiol@gmail.com.

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Sin embargo, algunas plantas pueden afectar negativamente distintas funciones fisiolgicas normales, entre ellas la funcin reproductiva masculina, cuyos efectos adversos han sido atribuidos principalmente a propiedades antiespermatognicas y antiesteroidognicas de uno o ms compuestos activos (Lohiya et al. 2002, Ashok & Meenakshi 2004, Gupta et al. 2004). En el Per, aproximadamente 1400 especies de plantas son utilizadas con fines medicinales, cuyo uso popular se conoce desde pocas prehispnicas. Los extractos de las plantas de la familia Celastrceas han sido utilizados por siglos como insecticidas y para el tratamiento de complicaciones estomacales, fiebre, reumatismo y cncer (Meja & Reng 1995). El gnero Maytenus es el ms abundante e importante de la familia Celastrceas (Santos et al. 2007). Se ha demostrado la actividad biolgica de varias especies de Maytenus: M. ilicifolia como anticonceptivo, antiinflamatorio y antioxidante (Jorge et al. 2004, Vellosa et al. 2006); M. krukovii presenta actividad antioxidante, antimutagnica y antimicrobiana (Bruni et al. 2006); M. aquifolium, propiedades analgsicas (Gonzalez et al. 2001); M. senegalensis posee actividad antibacteriana, antiviral, antitumoral (Gessler et al. 1995, Otake et al. 1995, Matu & Van Staden 2003) y M. macrocarpa acta como citotxico de clulas cancergenas (Chavez et al. 2010) y antimicrobiano (Kloucek et al. 2007). El gnero Maytenus contiene compuestos activos como los maitansinoides que ejercen actividad insecticida (Madrigal et al. 1985), triterpenoquinonas y dmeros triterpnicos con actividad antimicrobiana (Gonzlez et al. 1996a) y nortriterpeno metilnquinonas con funciones antimicrobianas (Gonzlez et al. 1996b). Existe poca informacin de los efectos de las plantas de Maytenus sobre el sistema reproductor de mamferos. Montanari et al. (1998) proporcionaron dosis diarias de 800 mg/kg peso corporal (pc) de M. ilicifolia a ratones machos por 20 das y no encontraron efecto alguno sobre la espermatognesis, sin embargo Montanari y Bevilacqua (2002) en dosis diarias de 1000 mg/kg pc concluyeron que interfiere con la implantacin embrionaria en ratones. Maytenus macrocarpa (Chuchuhuasi) es una planta nativa de la regin Amaznica del Per, y es usado como planta medicinal desde la poca del antiguo Per. Previos estudios han reportado el aislamiento de triterpenos dammarane y triterpenos friedelane a partir de la corteza del tallo (Chavez et al. 1997, Chvez et al. 1998), polisteres sesquiterpnicos de las hojas (Chavez et al. 1999) y nortriterpenos macrocarpines A-D de las races de M. macrocarpa (Chavez et al. 2000). Su corteza es utilizada generalmente como aguardiente para el tratamiento de reumatismo, influenza, enfermedades gastrointestinales y como agente antitumoral (Dhingra et al. 2000), sin embargo su efecto sobre el sistema reproductor masculino an no ha sido elucidado. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la ingesta de extracto acuoso de M. macrocarpa (1000 mg/kg pc) durante 7 das sobre los parmetros reproductivos de ratones machos. Material y mtodos Animales y condiciones ticas.- Los experimentos se llevaron a cabo con ratones (Mus musculus) machos (n= 20) de 8 a 10 semanas de edad de la cepa C57BL. Los animales fueron

adquiridos en el Bioterio de la UniversidadPeruanaCayetano Heredia (UPCH), Lima, Per y aclimatados durante una semana previa a los ensayos en el Bioterio de la Facultad de CienciasBiolgicasde la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM), Lima, Per, siguiendo lo indicado en la Gua de manejo y cuidado de animales de laboratorio: ratn del Instituto Nacional de Salud (Fuentes 2008). Los animales fueron mantenidos bajo condiciones estndar de bioterio con clima controlado (235 C, 905% humedad) fotoperiodo de 14 h luz: 10 h oscuridad, alimentados con dieta balanceada para animales (Bedoce) y agua ad libitum un total de 15 das mientras dur la aclimatacin y los ensayos. Los animales fueron eutanizados por dislocacin cervical siguiendolos lineamientos del Consejo Nacional de Investigacin para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NRC, 1996). Extracto acuoso.- Maytenus macrocarpa fue obtenido de PromoAgro Export CC (Lima, Per; voucher botnico Co-V060-013). El extracto acuoso fue preparado del material seco y pulverizado de la corteza. Cien gramos de M. macrocarpa fue hervido por 30 minutos en un litro de agua y se dejo enfriar durante toda la noche a temperatura ambiente. Al siguiente da el sobrenadante fue filtrado dos veces usando papel filtro estril Whatman (40 m y 20 m, respectivamente). El extracto resultante fue alicuotado en microtubos de 1.5 mL y almacenados a 4 C hasta su uso. Diseo experimental.- Los ratones fueron divididos en dos grupos; el grupo Tratamiento (T) (n= 10), se le administr el extracto acuoso de M. macrocarpa (1000 mg/kg pc) y al grupo control (C) (n= 10) solucin salina NaCl 0.9%. Al inicio del tratamiento se registro su peso corporal. El extracto acuoso de M. macrocarpa y la solucin salina fueron administrados usando una sonda esofgica N18 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). Al octavo da despus del tratamiento se registr el peso corporal final y los animales fueron eutanizados por dislocacin cervical. Se pesaron: testculos, epiddimos y conductos deferentes. Se obtuvieron espermatozoides de la cola del epiddimo para registrar la movilidad, concentracin y morfologa espermtica. Obtencin de epiddimos y espermatozoides.- Cada uno de los epiddimos obtenidos fueron lavados con buffer fosfato salino (PBS pH 7.4) a 37 C, se realizaron varios cortes en la cola del epiddimo y luego los espermatozoides se liberaron permaneciendo durante 10 minutos en 0.5 mL de medio de cultivo Flushing (MediCult, Copenhagen, Dinamarca), el contenido espermtico se recuper en su totalidad en tubos de polipropileno de 1.5 mL (Axygen Scientific). Evaluacin de la movilidad espermtica.- Muestra espermtica fue colocada sobre una lmina portaobjetos a 37 C y observada a 400X en un microscopio ptico de contraste de fases (Carl Zeiss Jena). Este procedimiento fue repetido dos veces, los resultados presentados son el promedio de ambas evaluaciones, contabilizndose al menos 100 espermatozoides. Se consider que un espermatozoide presentaba Movilidad Progresiva (MP), cuando presentaba desplazamiento, Movilidad No Progresiva (MNP) a aquellos que no se desplazaban y slo tenan un movimiento in situ e Inmviles (IM) los que no presentaban ningn tipo de movimiento (WHO, 2010).

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Efecto del Chuchuhuasi MAYTENUS MACROCARpA en el sistema reproductor masculino del ratn
Tabla 1. Efecto del extracto acuoso del Chuchuhuasi Maytenus macrocarpa sobre el peso corporal, peso de testculo, epiddimo y conducto deferente entre el grupo Control (C) y Tratamiento (T). Los valores son expresados como media DS. C=Control peso corporal, T=Tratamiento peso corporal. Control (NaCl 0.9%) Ratones analizados (n) Peso corporal inicial (g) Peso corporal final (g) Peso testculo (mg) Peso de cabeza + cuerpo del epiddimo (mg) Peso de la cola del epiddimo (mg) Peso del conducto deferente (mg) 10 21.400.5 23.351.2 72.995.5 19.251.1 143.12.2 10.620.7 Chuchuhuasi (1000mg/kg pc) 10 27.301.6 26.621.9 78.028.2 21.262.0 143.31.7 11.750.5 C=0.020 T=0.248 0.118 0.034 0.980 0.003 P

Medicin de la concentracin espermtica.- La concentracin espermtica se midi usando una dilucin 1:20, 10 L de la muestra se diluy con 190 L solucin de fijacin (WHO, 2010) posteriormente se coloc 10 L de la dilucin en la cmara de Neubauer, y se contaron los espermatozoides dentro de los campos definidos en la cmara, mediante el uso de un microscopio ptico de contraste de fases 400X, la cantidad de espermatozoides observados se multiplic por el factor correspondiente (106). La concentracin de espermatozoides fue expresada en millones/mL. Evaluacin de la morfologa espermtica.- Los espermatozoides fueron expandidos mediante un frotis sobre lminas portaobjetos, se dej secar a temperatura ambiente, se fijaron con paraformaldehdo por 20 minutos y se colorearon con Eosina-Y al 5%. Se analizaron 250 espermatozoides por espcimen bajo un microscopio ptico (Carl Zeiss Jena, Amplival) de campo claro con objetivo de inmersin (1000X). Se consider como anormal, aquel espermatozoide que presentaba alteraciones morfolgicas en cabeza, pieza intermedia, cola o en presencia de ms de una alteracin. Espermatozoides con gota citoplasmtica fueron considerados inmaduros. Anlisis estadsticos.- Los anlisis estadsticos fueron realizados con el programa SPSS v21 para Windows. Los datos cumplieron las premisas de normalidad y homogeneidad de varianza (Prueba de Levene) por lo cual todos los resultados se analizaron mediante la prueba de T-student. El nivel de significancia establecido fue P< 0.05. Resultados Peso corporal y rganos reproductivos.- En el grupo control se observ diferencias significativas en el peso corporal inicial y final (P= 0.020). As mismo se observ diferencias significativas

entre el grupo control y tratamiento en el peso de la cabeza y el cuerpo del epiddimo (P= 0.034) y el peso del conducto deferente (P= 0.003). Los resultados se resumen en la Tabla 1. Movilidad y concentracin espermtica.- No se observ diferencias significativas en la concentracin espermtica entre ambos grupos (Tabla 2). Respecto a la movilidad espermtica se observa diferencias significativas (P<0.05) en la Movilidad Progresiva (C: 42.165.2 vs T: 25.828.4) e Inmviles (C: 36.054.9 vs T: 48.517.2). No se encontr diferencias significativas en la Movilidad No Progresiva (C: 25.384.0 vs T: 29.165.5) (Figura 1).
60 50 40 (%) 30 20 10 0

MP

MNP

IM

Movilidad espermtica
Control NaCl 0.9% Maytenus macrocarpa 1000 mg/kg pc

Figura 1. Efecto del extracto acuoso del Chuchuhuasi Maytenus macrocarpa sobre la movilidad espermtica. MP: Movilidad progresiva; MNP: Movilidad no progresiva; IM: Inmovilidad; pc: peso corporal. Los valores son expresados como media SD. *P<0.05 en comparacin con el grupo control.

Tabla 2. Efecto del extracto acuoso del Chuchuhuasi Maytenus macrocarpa sobre la concentracin y morfologa espermtica. PI: Pieza intermedia, pc: peso corporal. Los valores son expresados como media SD. *P<0.05 en comparacin con el grupo control. Control NaCl 0.9% N ratones analizados Concentracin espermtica (x10 /mL)
6

Chuchuhuasi 1000 mg/kg pc 10 15,042.2 30,784,9* 26,743,7 49,8810,9 30,705,9 23,419,2

10 14,403.3 39,721,3 23,915,9 50,596,5 31.739,1 18,518,6

Normales Anormalidad de la cabeza Anormalidad de la PI Anormalidad de la cola Gota citoplasmtica

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Acosta et al.

Morfologa.- Las evaluaciones morfolgicas mostraron diferencias significativas (prueba t-student, P<0.05) en el porcentaje de espermatozoides normales entre el grupo T y el grupo C (Tabla 2). Al evaluar la distribucin de anormalidades (cantidad neta de ocurrencias por cada anormalidad observada) no se observ diferencias significativas entre ambos grupos (Tabla 2). Discusin El presente estudio se realiz para evaluar si el extracto acuoso de M. macrocarpa (1000 mg/kg pc) produce toxicidad sobre el sistema reproductor masculino. No se observ diferencias significativas en el peso corporal de los ratones suministrados con M. macrocarpa Chuchuhuasi (Tabla 1) sugiriendo que el extracto acuoso no causara toxicidad sistmica en el individuo a la concentracin suministrada. M. macrocarpa Chuchuhuasi presenta fitoelementos como triterpenos cuya actividad antiinflamatoria (Safavhi y Sailer 1997, Nikiema et al., 2001, Costa et al. 2003) se ha asociado con la inhibicin de la ciclooxigenasa 2 (COX-2) (Medeiros et al. 2007), molcula relacionada a la sntesis de prostaglandina, molculas importantes en la movilidad de los espermatozoides (Balaji et al. 2007a, b). Adems, contiene alcaloides que inhiben la produccin de protena quinasa C (PKC) (Bradshaw et al. 1993) asociada tambin a la movilidad espermtica (White et al. 2007), alguno de estos compuestos podra estar disminuyendo la movilidad espermtica reportada en esta investigacin. Los resultados con respecto a la morfologa espermtica, sugieren que M. macrocarpa Chuchuhuasi afectara a la espermatognesis en el estadio de espermtide tarda, al final de la espermiognesis, posiblemente alterando la condensacin de la cromatina, ocasionando un aumento de la morfologa anormal reportado en este estudio. Basados en los resultados del presente estudio concluimos que el extracto acuoso de M. macrocarpa Chuchuhuasi en dosis de 1000 mg/kg pc, presenta un efecto negativo en el sistema reproductivo masculino de ratones. Literatura citada
Ashok P. & B.Meenakshi. 2004. Contraceptive effect of Curcuma longa (L.) in male albino rat. Asian J. Androl. 6:7174. Balaji T., M. Ramanathan & V.P.Menon. 2007a. Localization of cyclooxygenase-2 in mice vas deferens and its effects on fertility upon suppression using nimesulide a preferential cyclooxygenase-2inhibitor. Toxicology. 234:135144. Balaji T., M. Ramanathan, V.P. Menon. 2007b. Localization of cyclooxygenase-2 in mice testis and assessment of its possible through suppressing its expression usingnimesulidea preferential cyclooxygenase-2 inhibitor.Prostaglandins Leukot.Essent. Fatty Acids. 76:341348. Bradshaw D., C.H. Hill, J.S. Nixon, et al. 1993. Therapeutic potential of protein kinase C inhibitors. Agents and Actions. 38:135-147. Bruni R., D. Rossi, M. Muzzoli, et al. 2006. Antimutagenic, antioxidant and antimicrobial properties of Maytenus krukovii bark. Fitoterapia. 77:538-545. Chavez H, A.E. Estevez-Braun, A.G. Ravelo, et al. 1997. First examples of dammarane triterpenes isolated from Celastraceae. Tetrahedron. 53:6465-6472. Chavez H., A.E. Estevez-Braun, A.G. Ravelo, et al. 1998. Friedelane triterpenoids from Maytenus macrocarpa. J. Nat. Prod. 61:82-85. Chavez H., N. Callo, A.E. Estevez-Braun, et al. 1999. Sesquiterpene polyolesters from the leaves of Maytenus macrocarpa. J. Nat. Prod. 62:1576-1577. Chavez H., G. Rodriguez, A.E. Estevez-Braun, et al. 2000. Macrocarpins AD, new cytotoxic nor-triterpenes from Maytenus macrocarpa. Bioorg Med Chem Lett. 10:759762.

Costa V.B., C.S. Coube, B.G. Marinho, et al. 2003. Antiinammatory and analgesic activity of Bouche auminensis. Fitoterapia. 74:364371. D'Cruz S.C., S. Vaithinathan, R. Jubendradass, et al. 2010. Effects of plants and plant products on the testis. Asian J. Androl. 12:468-479. Dhingra V., K.V. Rao & M. Narasu. 2000. Current status of artemisinin and its derivatives as antimalarial drugs. Life Sciences. 66:279-300. Fuentes F.M., R.A. Mendoza, A.L. Rosales & R.A. Cisneros. 2008. Gua de manejo y cuidado de animales de laboratorio: ratn. Instituto Nacional de Salud (Per). Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud. Lima. Pp 52. Gessler M.C., M. Tanner, J. Choll, et al. 1995. Tanzanian medicinal-plants used traditionally for the treatment of malaria - in vivo antimalarial and in vitro cytotoxic activities. Phytother. Res. 9:504-508. Gonzlez A.G., N. Alvarenga, A. Ravelo, et al. 1996a. Scutione, a new bioactive norquinone- methide triterpene from Maytenus scutioides (Celastraceae). Biorg. Med. Chem. 4:815-820. Gonzlez A.G., N. Alvarenga, A. Ravelo, et al. 1996b. Antibiotic phenol nortriterpenes from Maytenus canariensis. Phytochemistry. 43:129-132. Gonzalez F.G., T.Y. Portela, E.J. Stipp, et al. 2001. Antiulcerogenic and analgesic effects of Maytenus aquifolium, Sorocea bomplandii and Zolernia ilicifolia. J. Ethnopharmacol. 77:41-47. Gupta R.S., J.B. Kachhawa & R. Chaudhary. 2004. Antifertility effects of methanolic pod extract of Albizzialebbeck (L.) Benth in male rats. Asian J. Androl. 6:155-9. Gupta R.S. & R. Sharma. 2006. A review on medicinal plants exhibiting antifertility activity in males. Nat. Prod. Radiance. 5:389410. Jorge R.M., J.P. Leite, A.B. Oliveira, et al. 2004. Evaluation of anticonceptive, anti-inammatory and anti ulcerogenic activities of Maytenus ilicifolia. J. Ethnopharmacol. 94:93-100. Kloucek P., B. Svobodova, Z. Polesny, et al. 2007. Antimicrobial activity of some medicinal barks used in Peruvian Amazon. J. Ethnopharmacol. 111:427-429. Lohiya N.K., B. Manivannan, P.K. Mishra, et al. 2002. Chloroform extract of Carica papaya seeds induces long-term reversible azoospermia in langur monkey. Asian J. Androl. 4:17-26. Madrigal R.V., B.W. Zilkowski, Jr C.R. Smith. 1985. Structure-activity relationships among maytansinoids in their effect on the European corn borer, Ostrinia nubilalis (Hubner). J. Chem. Ecol. 11:501-506. Matu E.N. & J. Van Staden. 2003. Antibacterial and anti-inammatory activities of some plants used for medicinal purposes in Kenya. J. Ethnopharmacol. 87:35-41. Medeiros R., M.F. Otuki, M.C. Avellar & J.B. Calixto. 2007. Mechanisms underlying the inhibitory actions of the pentacyclictriterpene alpha-amyrin in the mouse skin inflammation induced by phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Eur J Pharmacol. 559:227235. Mejia K. & E. Reng. 1995. Usos Medicinales de Plantas de uso popular en la Amazona Peruana. AECI y IIAP. Lima, Per. Montanari T., J. De Carvalho & H. Dolder. 1998. Effect of Maytenus ilicifolia Mart. ex. Reiss on spermatogenesis. Contraception. 57:335-339. Montanari T. & E. Bevilacqua. 2002. Effect of Maytenus ilicifolia Mart on pregnant mice. Contraception. 65:171175. Nikiema J.B., R. Vanhaelen-Fastre, M. Vanhaelen, et al. 2001. Effects of antiinammatory triterpenos isolated from Leptadeniahastata latex on keratinocyte proliferation. Phytoteraphy Research. 15:131134. Otake T., H. Mori, M. Morimoto, et al. 1995. Screening of Indonesian plant extracts for anti-human immunodeciency virus type 1 (HIV-1) activity. Phytother. Res. 9:6-10. Safavhi H., E.R. Sailer. 1997. Antiinammatory actions of penta cyclic triterpenes. Planta Medica. 63:487493. Santos V.L., V.B. Costa, M.F. Agra, et al. 2007. Pharmacological studies of ethanolic extracts of Maytenus rigida Mart (Celastraceae) in animal models. Rev. Bras. Farmacogn. 17:336-342. Vellosa J.C.R., N.M. Khalil, V.A.F. Formenton, et al. 2006. Antioxidant activity of Maytenus ilicifolia root bark. Fitoterapia.77:243-244. White D., E. de LaMirande & C. Gagnon. 2007. Protein kinase C is an important signaling mediator associated with motility of intact sea urchin spermatozoa. J. Exp. Biol. 210:4053-4064. World Health Organization (WHO). Standard procedures. 2010. In: T.G. Cooper, Eds. Laboratory manual for the Examination and processing of human semen, 5th edn. Switzerland.

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Rev. peru. biol. 20(3): 223 - 226 (Marzo 2014)

Rev. peru. biol. 20(3): 227 - 232 (Marzo 2014) FACULTAD DE C IENCIAS BIOLGICAS UNMSM

EFECTO AHORRATIVO DE LA pROTENA CON NIVELES ALTOS DE ENERGA EN DIETAS pARA OREOCHROMIS NILOTICUS
ISSN-L 1561-0837

TRABAJOS ORIGINALES Efecto ahorrativo de la protena usando niveles altos de energa y obtencin de la relacin optima energa digestible/protena digestible en dietas para el crecimiento de Oreochromis niloticus (L)
Protein-sparing effect with high energy levels and obtaining the optimum digestible energy/ digestible protein ratio in growth diets to Oreochromis niloticus (L.)
Felix Walter Gutierrez1, 2, Mximo Quispe1, Luz Valenzuela1

1 Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. 2 Direccin para correspondencia: 10642 Mallard DR. Garden Grove, CA 92843, USA. Felix Gutierrez. E mail: gutierrez_romero@sbcglobal.net Mximo Quispe Chau. E mail: mquispe@alicorp.com.ec Luz Valenzuela. E mail: luzmvalenzuela@yahoo.com

Resumen
Se evalu el efecto ahorrativo de la protena usando dietas altas en energa. Se utiliz un diseo factorial para medir la interaccin de dos niveles de protena (30% y 35%) y dos niveles de energa digestible (3.3 y 3.7 kcal/g de alimento) sobre la ganancia (GP), conversin alimenticia (CA), protena retenida (PR), energa retenida (ER) y la relacin de eficiencia proteica (REP) en la tilapia del Nilo todos machos (Oreochromis niloticus). En la composicin de las dietas se emplearon harina de anchoveta y harina de torta de soya como fuentes de protena y maz amarillo duro y subproducto de trigo como fuentes de energa. El aceite de pescado fue aadido para ajustar los niveles de energa requeridos en las dietas experimentales. Se encontraron interacciones altamente significativas (P<0.01) entre la protena y la energa digestible. Cuando se utilizaron las dietas con 30% de protena, el incremento del nivel de energa digestible afect significativamente la GP, CA, PR, ER y la REP, donde el nivel de 3.3 kcal/g tuvo el mejor comportamiento. Con 35% de protena, el nivel de energa digestible no influy significativamente sobre la GP, CA, PR, ER y la REP, sin embargo el nivel de 3.0 kcal/g tuvo el mayor rendimiento. Cuando se compararon las dos dietas no se observaron diferencias estadsticamente significativas. Considerando el costo de la protena dietara se concluy que la mejor respuesta fue obtenida con la dieta de 30% de protena y 3.7 kcal/g de energa digestible y una relacin optima energa digestible/protena digestible de 13.75 kcal/g de protena. Palabras clave: protena; energa digestible; requerimientos nutricionales; Oreochromis

Citacin: Gutierrez F.W., M. Quispe, L. Valenzuela. 2014. Efecto ahorrativo de la protena con niveles altos de energa y obtencin de la relacin optima energa digestible/protena digestible en dietas para el crecimiento de Oreochromis niloticus (L.). Rev. peru. biol. 20(3): 227 - 232 (Marzo 2014)

Abstract
The sparing effect of the dietary protein using diets with high energy levels was evaluated. A factorial design was used to examine the interaction of two levels of protein (30 and 35%) and two levels of digestible energy (3.3 and 3.7 kcal/g) on the weight gain (WG), food conversion FC), retained protein (PR), retained energy (ER) and protein efficiency ratio (PER) in sex reversal Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Diets contained anchovy and soybean meal as protein sources and yellow corn and wheat bran as energy sources. The fish oil was used to adjust the energy levels. There were highly significant interactions (P<0.01) between the experimental diets. In diets with 30% proteins, the increase of digestible energy significantly enhances WG, FC, PR, ER and PER, where the level of 3.7 kcal/g had the best performance. With 35% protein, the increase of digestible energy had not significant influence on the GP, CA, PR, ER and PER, however the growth of sex reversal Nile Tilapia was improved with the level of 3.3 kcal/g. When were compared both diets, were not find significant differences. Considering the protein cost, it can be concluded that best response was obtained with a diet containing 30 % of protein and 3.7 kcal/g of digestible energy and optimum digestible energy/ digestible protein ratio of 13.75 kcal/g protein. Keywords: protein; digestible energy; nutritional requirements; Oreochromis.

Presentado: Aceptado: Publicado online:

21/06/2013 23/09/2013 14/03/2014

Los autores. Publicado por la Revista Peruana de Biologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Este es un artculo de acceso abierto, distribuido bajo los trminos de la Licencia de Atribucin Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 de Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed. es_ES), que permite el uso no comercial, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citadas. Para uso comercial, por favor pngase en contacto con editor.revperubiol@gmail.com.

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Gutierrez et al.

Introduccin En general los requerimientos de protena para el crecimiento de tilapia del Nilo han sido establecidos en un rango de 30% y 40%, dependiendo del tamao de la especie, relacin protenaenerga y otras variables experimentales (Siddiki et al. 1988, Stickney 1997, Hafedh 1999). La protena es uno de los ms importantes nutrientes para el crecimiento de los peces, y a su vez es el componente ms costoso de la dieta. Por dicha razn el nivel ptimo de protena en las dietas para peces ha sido muy bien estudiado. Tambin el nivel de energa en las dietas es crtico para el crecimiento de los peces debido a que niveles altos de energa en las dietas reduce el consumo de alimento y puede resultar en un crecimiento pobre debido a la falta de los nutrientes necesarios. Por otro lado, niveles bajos de energa pueden causar que la protena sea usada para satisfacer los requerimientos de energa, importantes para el metabolismo basal de los peces, en lugar de ser utilizada para el crecimiento. Por lo tanto, el nivel de energa y protena en la dieta debe estar en balance para optimizar la produccin pisccola. Se conoce del uso de dietas bajas en protenas y altas en energa para mejorar la produccin de peces (Helland & Grisdale-Helland 1998, Company et al. 1999; Harpaz et al. 1999, McGoogan & Gatlin 1999), tambin, Watanabe et al. (1987) afirmaron que otro beneficio de dietas bajas en protena y altas en energa es la disminucin de los desechos nitrogenados que provienen del metabolismo de los peces. Sin embargo, otros investigadores han reportado efectos no deseables sobre el rendimiento de los peces cuando usaron dietas con altos niveles de energa (Davis & Arnold 1997, Jover et al. 1999). Estos resultados, probablemente se debieron a la disponibilidad de la energa o porque los requerimientos para los peces son variables, dependiendo de la especie de pez (NRC 1993), contenido de protena o calidad del alimento (Hillestad & Johnsen 1994, Jover et al. 1999, Vergara et al. 1999), frecuencia alimenticia (Xie et al. 1997) y tamao del pez (Mangalik 1986). No existen muchos estudios acerca de los requerimientos de energa dietara en tilapia. Yong et al. (1989) recomienda niveles de energa de 4.0 kcal/g y entre 28 30% de protena para juveniles de tilapia. Wang et al. (1985), encontraron un crecimiento mximo en juveniles de tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) alimentadas con una dieta de 25% de protena y una relacin energa/protena de 14 a 15 kcal/g. Santiago y Laron (1991) estudiaron el efecto de cuatro niveles de protena y cuatro niveles de energa digestible sobre el rendimiento de la tilapia roja. Encontraron que el mayor rendimiento se obtuvo con 40% de protena y una relacin optima de 111 mg de protena/kcal. Cualquiera que sea el mtodo usado para hallar el requerimiento ptimo de energa tilapia del nilo se concluye que utiliza mejor la energa y la protena provenientes de insumos de origen animal (Hanley 1991). El propsito del presente estudio fue analizar el efecto ahorrativo de la protena dietara, usando dietas con altos niveles de energa y obtener la relacin optima energa/protena que exprese el mayor efecto sobre el rendimiento productivo de tilapia del nilo todos machos O. niloticus. Materiales y mtodos El experimento se ejecut en el Laboratorio Hmedo de

Huachipa bajo el Conveniio IMARPE-Facultad de Ciencias Biolgicas-Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Se utilizaron doce acuarios de vidrio de 50 litros de capacidad. La densidad de carga fue de cinco peces por acuario, con pesos promedios de 25.331.29 g. Siete das antes del inicio del experimento los peces fueron acostumbrados al alimento seco y peletizado a travs de la ingestion de una dieta alta en protena y fortificada con vitaminas y minerales. Los peces se trataron con verde de malaquita y oxitetraciclina a fin de evitar la presencia del hongo Ichthyopthirius y bacterias patgenas. Asimismo, despus de cada muestreo se emple una solucin de violeta de genciana o azul de metileno diluido en el agua para evitar ataques bacterianos y fngicos. Los acuarios se alimentaron con agua de la napa fretica almacenada en un tanque elevado de veinte metros cbicos de capacidad. La dureza del agua fue mantenida a una concentracin de 21.900.21 mg/L, considerada como ptima para la tilapia del Nilo. Los acuarios se equiparon con aireadores y termostatos por lo que factores como la temperatura, el oxgeno disuelto y el pH fueron muy estables. La temperatura promedio fue de 27.500.21 C, el oxgeno disuelto de 6.830.10 mg/L y el pH de 8.420.04. La limpieza diaria de los desechos orgnicos del fondo de los acuarios y el recambio diario del agua ayudaron a mantener las condiciones ambientales adecuadas para la realizacin del experimento. Las dietas fueron formuladas por programacin lineal (Programa LP88) para representar dos niveles de protena (30% y 35%) y dos niveles de energa digestible (3.0 kcal/g y 3.3 kcal/g) por cada nivel de protena. En la preparacin de las dietas experimentales se utilizaron los insumos alimenticios harina de anchoveta, harina de torta de soya, maz amarillo duro, subproducto de trigo, aceite hidrogenado de pescado y los aditivos premezcla de vitaminas y minerales, BHT, cido propinico y bentonita como ligante. La energa digestible de las dietas fue calculada a partir de los valores calricos de 3.5 kcal/g, 8.1 kcal/g y 2.5 kcal/g para protena, lpidos y carbohidratos respectivamente (Wilson 1977). Los clculos de las concentraciones de lisina, metionina, metionina+cistina, calcio y fsforo disponible se hicieron de acuerdo a la NRC (2011), tomando en cuenta los requerimientos para esta especie (Stickney 1997). El anlisis qumico proximal (AOAC 1990) se realiz para determinar los contenidos de humedad, protena, lpidos, fibra, ceniza y extracto libre de nitrgeno (ELN) en los insumos alimenticios, en las dietas experimentales. Los insumos y la composicin porcentual de las dietas experimentales se observan en la Tabla 1. El contenido de nutrientes se muestran en la Tabla 2 y el anlisis proximal de las dietas experimentales se observan en la Tabla 3. La composicin qumica de la carcasa (protena, lpidos, cenizas y humedad) expresadas en base hmeda se determin al inicio y al final del experimento sobre la base de una muestra total de 6 peces por tratamiento (AOAC 1990). Los datos sirvieron para calcular la energa retenida y la protena retenida. El comportamiento productivo de la tilapia del Nilo se evalu a travs de la ganancia de peso (Hopkins 1992), conversin alimenticia, protena retenida, energa retenida (Reinitz & Hitzel 1980) y la razn de eficiencia proteica (Hepher 1993). El alimento fue ofrecido ad-libitum, dos veces al da (08:00 y 16:00 horas). La duracin del experimento fue de 45 das. Se emple un diseo factorial de 2 x 2, con cuatro
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Tabla 1. Insumos y composicin porcentual de las cuatro dietas experimentales utilizadas para evaluar el crecimiento de tilapia del Nilo todos machos (Oreochromis niloticus). Dietas experimentales Insumos Harina de Pescado Harina de soya Harina de maz Subproducto de trigo Aceite compuesto Vitaminas/minerales1 Bentonita BHT 1 25.00 23.00 44.00 2.99 1.00 1.00 3.00 0.01 2 27.00 21.00 40.00 0.99 7.00 1.00 3.00 0.01 3 25.00 36.90 30.00 4.00 ----1.00 3.00 0.01 4 25.00 37.90 27.00 1.18 5.00 1.00 3.00 0.01

1 Vitaminas (en UI o mg/kg de dietas): A, 5500 UI; D3, 1000 UI; E, 50 UI; K, 10; Colina, 550; Niacina, 100; Riboflavina, 20; Tiamina, 20; D-Pantetonato de Calciio, 50; Biotina, 0.10; Folacina, 5; B12, 20; Acido Ascrbico, 200; Inositol,100. Minerales ( en % o mg/kg de dieta): Manganeso, 115; Yodo, 2.80; Cobre, 4.30; Zinc, 88; Fierro,44; Cobalto, 0.05; Calcio, 90 %, Fsforo Disponible, 0.45%.

Tabla 2. Contenido de nutrientes en porcentajes de las cuatro dietas experimentales utilizadas para evaluar el crecimiento de tilapia del Nilo todos machos (Oreochromis niloticus). Dietas experimentales Nutrientes Lisina1 Metionina1 Metionina + Cistina1 Calcio1 Fsforo Disponible1 Energa Bruta (kcal/g)1 Energa Digestible (kcal/g)1 Protena Cruda (%)1 Protena Digestible (%)1 Relacin ED/PD(kcal/g protena)1
1

1 2.04 0.71 1.11 0.95 0.25 4.01 3.32 30.65 26.76 12.41

2 1.98 0.73 1.12 1.02 0.30 4.29 3.68 30.44 26.77 13.75

3 2.41 0.79 1.27 0.96 0.24 4.00 3.34 35.72 31.25 10.69

4 2.42 0.77 1.24 0.97 0.29 4.24 3.66 35.49 31.22 11.72

Los nutrientes y la energa fueron calculados a partir de los valores publicados por el Consejo Nacional de Investigacin-USA (NRC 2011).

Tabla 3. Anlisis Proximal (%) de las cuatro dietas experimentales utilizadas para evaluar el crecimiento de la tilapia del Nilo todos machos (Oreochromis nmiloticus). Dietas experimentales Parmetros Humedad Protena Lpidos Fibra Caniza ELN 1
1

1 14.89 30.65 4.21 3.24 5.75 41.26

2 14.48 30.44 9.76 2.82 5.76 36.74

3 14.37 35.72 3.69 4.03 6.34 35.85

4 10.82 35.49 7.71 3.75 6.38 35.85

Extracto Libre de Nitrgeno

tratamientos y tres repeticiones por tratamiento. Los valores obtenidos fueron sometidos al anlisis de variancia y las diferencias entre promedios se determinaron con la prueba de Tuckey, empleando el paquete estadstico Statigraphics version 5.1. Resultados y discusion Se encontraron interacciones altamente significativas (P<0.01) entre los niveles de energa y protena dietarias. En las dietas con 30% de protena (PC), el nivel de energa influy significativamente (P<0.01) sobre la ganancia de peso. A medida que la energa dietara se increment, la ganancia de peso tambin se increment, siendo ms alta con la dieta de 30% de protena y 3.7 kcal/g de energa digestible (ED). No ocurri lo mismo en las dietas con 35% de protena, en las cuales las ganancias de peso fueron estadsticamente iguales, independiente
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de los niveles de energa dietarios, sin embargo la mayor ganancia de peso se obtuvo con la dieta de 35% de PC y 3.3 kcal/g de ED. Al comparar ambas dietas result que, estadsticamente las ganancias de peso fueron iguales, razn por la cual se establece que la dieta con 30% de protena y 3.7 kcal/g de energa digestible y una relacin optima energa digestible/protena digestible (ED/P) de 13.75 kcal/g de protena fue las ms eficiente en trminos de ganancia de peso y ahorro de protena (Tabla 4). Fisiolgicamente, los lpidos y las protenas constituyen un componente importante de la estructura de un pez. Si bien, la necesidad de energa calorfica puede evitar su incorporacin a los tejidos y obligar a su catabolismo como fuentes energticas. As pues, la utilizacin de la energa y los nutrientes de cada dieta depender del nivel de su ingesta y composicin. Al igual que otros animales, los peces comen hasta cubrir sus necesidades

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Tabla 4. Ganancia de peso, conversin alimenticia, protena retenida, energa retenida y relacin de eficiencia proteica de alevinos de tilapia del Nilo todos machos (Oreochromis niloticus) alimentados durante 45 das con cuatro dietas experimentales que representaron dos niveles de protena (30 y 35%) y dos niveles de energa digestible (3.3 y 3.7 kcal/g) por cada nivel de protena. 30% Parmetros PF
1

35% 3.7 3.3

b

3.3 38.441.17
a

3.7
b

48.570.06 1.830.22

49.090.49 1.850.03

48.041.23b 90.471.38b 2.000.28b 28.070.68b 19.880.79b 1.400.11c

GP 2 CA ER
5 3

51.022.04a 3.30.72
a

97.731.91b
b

103.010.79b
b

PR 4 REP 6
a, b, c: 1 2 3 4 5 6

22.274.62a 14.982.99
a

34.601.96b 20.833.62
b

25.541.11b 18.191.58
b

1.040.24a

1.770.23b

1.540.05c

Letras diferentes dentro filas indican diferencias significativas ( p<0.01) por la prueba de Tuckey

Peso Final (g) Ganancia de peso (%): (Peso Final-Peso Inicial/Peso Inicial)X100 Conversin Alimenticia: Ingesta de alimento (g)/ganancia de peso (g) Protena Retenida: Protena corporal finalprotena corporal inicial/ingesta de protena X 100 Energa Retenida: energa corporal final-energa corporal inicial/ingesta de energa X 100 Relacin de Eficiciencia Proteica: Ganancia de peso (g)/protena ingerida (g)

energticas (Cho 1987). Contando con que el alimento tiene un balance adecuado de nutrientes, los peces pueden dentro de ciertos lmites, compensar un bajo contenido energtico de la dieta consumiendo una mayor cantidad de la misma. Este tipo de compensacin ocurrir dentro de los lmites de la capacidad fsica del tracto digestivo, aunque los peces alimentados con una dieta hiperenergtica requerirn menos alimento por unidad de ganancia de peso. Sin embargo, al mximo fsico de ingesta, los peces alimentados con una dieta rica en energa pueden ingerir ms nutrientes y, naturalmente, sostener un mayor crecimiento (Cho et al. 1985). El establecimiento de un ptimo balance de los componentes energticos es importante debido a que un exceso deficiencia de la energa no proteica (carbohidratos y lpidos) puede resultar en una tasa de crecimiento baja. Si la dieta es deficiente en energa no proteica, la protena ser usada para propsitos energticos (metabolismo basal y actividad voluntaria) y no para sntesis de tejido. Similarmente, si la dieta tiene un exceso de energa no proteica, el apetito o demanda puede ser satisfecha antes que una suficiente cantidad de protena (y posiblemente otros nutrientes) sea ingerida para satisfacer la demanda para una mxima tasa de sntesis proteica y crecimiento (Cho & Cowey 1991). En el presente estudio la dieta alta en energa considerada la ms eficiente (30% de PC y 3.7. kcal/g de ED y una relacin ptima ED/PD de 13.75 kcal/g de protena) ha permitido que los peces usen la alta energa dietara para cubrir sus requerimientos energticos, mejorando de esta manera la eficiencia de utilizacin de la protena dietara para sintetizar mayor masa muscular, que se traduce en una excelente ganancia de peso. De acuerdo con la NRC (1993), 10.7 kcal/g de protena es una apropiada relacin ED/P cuando la dieta contiene 28% de protena y 3.0 kcal/g de protena respectivamente. En este estudio la relacin ED/PD fue de 13.75 kcal/g de protena y fue formulada bajo las recomendaciones de la NRC (2011), sin embargo Wang et al. (1985) demostraron que la relacin ptima ED/P para crecimiento de tilapia de 6 g fluctu entre 14 a 15 kcal/g de protena. Santiago et al. (1982) obtuvieron excelentes resultados alimentando la tilapia del nilo con una dieta de 35% de protena. Viola et al. (1994) demostraron que alevinos de tilapia hbrida crecieron muy bien con una dieta de 35% de protena. Santiago y Laron

(1991) reportaron para la tilapia roja que el mejor crecimiento fue obtenido con una dieta de 40% de protena y una relacin protena/energa de 111 mg de protena/kcal igual a 9.00 kcal/g de protena. La conversin alimenticia (CA) fue significativamente afectada (P<0.01) por los niveles de energa en las dietas con 30% de protena. La mejor conversin alimenticia (1.83) fue obtenida con el nivel de 3.7 kcal/ de energa digestible (Tabla 4). En las dietas con 35% de protena los niveles de energa no afectaron significativamente la CA . Sin embargo la dieta con 3.3 kcal/g de energa digestible mostr una mejor CA (1.85). Cuando se compararon ambas dietas, los valores de CA fueron estadsticamente iguales, por lo que la dieta con 30% de protena, 3.7 kcal/g de energa digestible y una relacin ptima ED/PD de 13.75 kcal/g de protena fue la ms eficiente en trminos de ahorro de protena. Los valores de conversin alimenticia fueron consistentes con los encontrados en otros estudios (Andrews & Stickney 1972, Webster et al. 1992a, 1992b). La protena retenida (PR) fue significativamente influenciada (P<0.05) por los niveles de energa en las dietas con 30% de protena (Tabla 4). La PR fue ms eficiente con el nivel de 3.7 kcal/g (34.60%). Por otro lado con las dietas de 35% de protena, la energa dietara no afect la PR, siendo estadsticamente igual para ambos niveles de energa (25.54 y 28.07%). En funcin de la PR la dieta con 30% de protena y 3.7 kcal/g, fue considerada como la mejor en trminos de ahorro de protena. En promedio, para la mayora de telesteos la eficiencia de retencin de la protena neta es de alrededor de 40% (Kaushik 1995), similar a lo obtenido en este estudio con la dieta sealada como la mejor. Asimismo, este resultado estara indicando una apropiada relacin ED/PD, que ofrece ventajas como incremento de la economa proteica, mejor retencin de nitrgeno y reduccin de la excrecin de desechos niotrogenados al ambiente (Kaushik & Mdale 1994). Cuando se evalu la energa retenida (ER), el nivel de energa dietara influy significativamente (P<0.01), solamente para el nivel de 30% de protena dietara (Cuadro 4). La dieta con 3.7 kcal/g fue la ms eficiente en trminos de ER (20.83 %). Por otro lado, para las dietas con 35% de protena la ER fue
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estadsticamente igual para ambos niveles energticos (18.19 y 19.88% respectivamente). Estos resultados permiten establecer que la dieta con 30% de protena y 3.7 kcal/g fue la de mejor performance en trminos de ER y ahorro proteico. Lo encontrado, se explica porque los peces tropicales no solo tienen mejor capacidad para la retencin de energa proteica, sino tambin son hbiles para la mejor utilizacin de la energa no proteica, ahorrando la protena para propsito de sntesis de tejidos (Lucket & Moreau 1989). La alta energa dietara de la dieta y la adecuada relacin ED/PD (13.75 kcal/g de protena), posibilit una mayor incorporacin de insumos energticos (maz amarillo duro, sub producto de trigo y aceite de pescado) como fuentes de energa, ahorrando la protena para el crecimiento (Kaushik & Cowey 1991, Kaushik & Mdale 1994, Mdale et al. 1995). En las dietas con 30% de protena la relacin de eficiencia proteica (REP) fue afectada significativamente por los niveles de energa, alcanzando el valor ms alto con el nivel de 3.7 kcal/g (Tabla 4). En las dietas con 35% de protena, los niveles de energa dietara no influenciaron significativamente la REP, siendo los valores estadsticamente iguales (Tabla 4). Los valores de la REP obtenidos en este estudio son similares a los valores reportados por Webster et al. (1992b). La literatura indica que el mximo crecimiento de tilapia hbrida se obtuvo con una dieta de 24% de protena y una REP de 2.99 (Shiau & Huang 1989, 1990). Asimismo con dietas de 20% de protena en tilapia roja se obtuvo una REP de 2.41, logrndose una mejor eficiencia de utilizacin de la protena, al compararse con dietas de mayor nivel de protena (Clark et al. 1990). Datos similares han sido obtenidos en otros estudios con la carpa cabezona Aristichthys nobilis (Santiago & Reyes 1991) y en otras especies de tilapia (Teshima et al. 1978, Mazid et al. 1979, Jauncey 1982, Teshima et al. 1985, Siddiki et al. 1988). No obstante El-Sayed y Teshima (1992) encontrron para la tilapia del Nilo el mejor valor de la REP con una dieta de 45% de protena y 3.0 kcal de energa bruta/g. En los estudios sobre tilapia, la literatura muestra un amplio rango de variacin en relacin a la concentracin de protena dietara, fluctuando entre 20 y 45%. Los resultados encontrados en el presente estudio indican que el incremento del nivel de energa digestible independiente del nivel de protena dietara usado, mejor significativamente la ganancia de peso, conversin alimenticia, protena retenida, energa retenida y la eficiencia proteica; por lo que se puede concluir, considerando las condiciones del experimento y el costo de la protena, que la mejor respuesta animal se puede obtener con la dieta de 30% de protena, 3.7 kcal/g de energa digestible y la relacin ptima energa digestible/protena digestible de 13.75 kcal/g de protena. Literatura citada
Andrews J.W. & R.R. Stickney. 1972. Interaction of feeding rates and environmental temperature on growth, food conversion and body composition of channel catfish. Transactions of the American Fisheries Society 101:94-98. AOAC (Association of Official Analytical Chemist). 1990. Official methods of analysis. 15th edition. Association of Official Analytical Chemists, Arlington, Virginia, USA. 957 pp. Cho C.Y. 1987. La energa en la nutricin de los peces. p. 197-243. En: Nutricin en Acuicultura. Vol II. J. Espinosa de los Monteros y U. Labarta Editores. FEUGA-CAYCIT, Madrid, Espaa. 318 pp. Cho C.Y. & C.B. Cowey. 1991. Rainbow Trout Oncorhynchus mykiss . pp 131-144. In Handbook of Nutrient Requirement of Finfish (Wilson, R. P. ed.). CRC Press, Florida.
Rev. peru. biol. 20(3): 227 - 232 (March 2014)

Cho C.Y., C.B. Cowey, T. Watanabe. 1985. Finfish Nutrition in Asia. Methodological Approaches to Research and Development. International Development Research Centre, Ottawa. 154 p. Clark A.E., W.O. Watanabe, B.L. Olla, R.I. Wicklund. 1990. Growth, feed conversion and protein utilization of florida red tilapia fed isocaloric diets with different protein levels in seawater pools. Aquaculture 88:75-85. Company R., J.A. Calduch-Giner, S. Kaushik & J. Prez Sanchez.1999. Growth performance and adiposity in gilthead sea bream (Sparus aurata): risks and benefits of high energy diets. Aquaculture 171 (3-4):279-292. Davis D. A. & C.R. Arnold. 1997. Response of Atlantic croaker fingerling to practical diet formulation with varying protein and energy contents. Journal of the World Aquaculture Society 28 (3):241-248. El-Sayed A.F. & S. Teshima. 1992. Protein and energy requirement of nile tilapia Oreochromis niloticus fry. Aquaculture 103:55-63. Hafedh Y.S. A. 1999. Effects of dietary protein on growth and body composition of Nile tilapia, Oreochromis niloticus L. Aquaculture Research 30:385-393. Hanley F. 1991. Effects of feeding supplementary diets containing varying levels of lipid on growth, food conversion, and body composition of Nile tilapia, Oreochromis niloticus (L.). Aquaculture 93: 323-334. Harpaz S., S. Sklan, I. Karplus, A. Barki & Y. Noy. 1999. Evaluation of juvenile perch Bydianus bydianus (Mitchel) nutritional needs using highand low-protein diets at two feeding levels. Aquaculture Research 30: 603-610. Hellan S.J. & B. Grisdale-Helland. 1998. Growth, feed utilization and body composition of juvenile Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) fed diets differing in the ratio between the macronutrients. Aquaculture 160:49-56. Hepher B. 1993. Nutricin de peces comerciales en estanques. Primera Edicin. Editorial Limusa, Mexico. 406 pp. Hillestad M. & F. Jonhsen. 1994. High-energy/low-protein diets for Atlantic salmon:effects on growth, nutrient retention and slaughter quality. Aquaculture 124:109-116. Hopkins, K.D. 1992. Reporting Fish Growth: A review of the Basis. Journal of the World Aquaculture Society, 23 (3): 173-179. Jauncey K. 1982. The effect of varying dietary protein level on the growth, food conversion, protein utilization and body composition of juvenile tilapias (Sarotherodon mossambicus). Aquaculture 27:43-54. Jover M., A. Garca-Gmez, A. Tomas, F. De la Gandara & L. Prez. 1999. Growth of Mediterranean yellowtail (Seriola dumerilli) fed extruded diets containing different levels of protein and lipid. Aquaculture 179:25-33. Kaushik S.J. 1995. Amino acid requirement, protein and energy utilization in fish. In: Symposium From Feed to food. Utrecht, Netherlands. Victam International. Feed and Food Industries Show. Kaushik S.J. & C.B. Cowey. 1991. Ammoniogenesis and dietary factors affecting nitrogen excretion. In: Cowey C.B, Cho, C. Y., eds. Nutritional Strategies and Aquaculture Waste. Guelph, Canada: Univ. Guelph. P 3-19. Kaushik S.J. & F. Mdale. 1994. Energy requirements, utilization and supply to salmonids. Aquaculture. 124:81-97. Mangalik, A. 1986. Dietary energy requirements of channel catfish. Doctoral dissertation. Auburn University, Auburn, Alabama, USA. Mazid M.A., Y. Tanaka, T. Katayama, M.A. Rhaman, K.L. Sympson, C.O. Chichester. 1979. Growth response of Tilapia zilli fingerling fed isocaloric diets with variable protein levels. Aquaculture 18:115-122. McGoogan B. B. & D. M. Gatlin. 1999. Dietary manipulations affecting growth and nitrogenous waste production of red drum, Sciaenops ocellatus. Effects of dietary protein and energy levels. Aquaculture 178:333-348. Mdale F., C. Brauge, C.F. Valle & S.J. Kaushik. 1995. Effects of dietary protein/energy ratio, ration size, dietary energy source and temperature on nitrogen excretion in rainbow trout. Water Sci. Technol. 31 (10): 185-195. NRC. (National Research Council). 1993. Nutrient requirements of fish. National Academy Press. Washington D.C. USA. NRC (National Research Council), 2011. Nutrient requirements of fish and shrimp. National Academy Press. Washington, D.C. USA. Reinitz G. & F. Hitzel. 1980. Formulation of practical diets for rainbow trout based desire performance and body comparison. Aquaculture, 19: 243-52.

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Gutierrez et al.
Santiago C.B., M. Babes-Aldaba, M.A. Laron. 1982. Dietary crude protein requirement of Tilapia nilotica fry. Phillippines J. Biology, 11:255265. Santiago C.B. & O.S. Reyes. 1991.Optimum dietary protein level for growth of bighead carp Aristichthys nobilis fry in a static water system. Aquaculture 93:155-162. Santiago C.B. & M. A. Laron. 1991. Growth response and carcass composition of red tilapia fry fed diets with varying protein levels and protein to energy ratio. Pages 55-62. In S. S. DeSilva, ed. Proceeding of the Third Asian Fish Nutrition Network Meeting. Special Publication of the Asian Fisheries Society, Manila, Philippines. Shiau S.Y. & S.L. Huang. 1989. Optimal dietary level for hybrid tilapia (Oreochromis niloticus x O. aureus) reared in seawater. Aquaculture 81:119-127. Shiau S.Y. & S.L. Huang. 1990. Influences of varying energy levels with two protein concentration in diets for hybrid tilapia (Oreopchromis niloticus x O. aureus) reared in seawater. Aquaculture 82:110-117. Siddiqui A., M.S. Honlander & A.A. Adam. 1988. Effects of dietary protein levels on growth, feed conversion and protein utilization in fry and young tilapia, Oreochromis niloticus. Aquaculture 70: 63-73. Statigraphics, 1991. Statical Graphics System. Statical Graphics Corporation. MD. USA. Stickney R.R. 1997. Tilapia Nutrition, feeds and feeding. In:Tilapia Aquaculture in the Americas. World Aquaculture Society. (1): 34-54. Teshima S., A. Kanasawa & Y. Ushiyama.1985. Optimum protein levels in casein-gelatin diets for Tilapia niloticus fingerling. Mem. Fac. Fish, Kagoshima Univ.34:45-52. Teshima S., G.M.O Gonzales & A. Kanazawa. 1978. Nutritional requirements of tilapia: utilization for dietary by Tilpai zilli. Mem Fac. Fish, Kagoshima Univ. 27:49-57. Vergara J.M., G. Lopez-Calero, L. Robaina, M.J. Caballero, D. Montero, M.S. Izquierdo, & A. Aksnes. 1999. Growth feed utilization and body lipid content of gilthead seabream (Sparus auratus) fed increasing lipid levels and fish meal of different quality. Aquaculture 179:35-44. Viola S., H. Angeoni, N. Gur & E. Lahav. 1994. Growth performance, protein and energy balances of hybrid tilapia fed two levels of lysine at three levels of protein. Bamidgeh 46:212-222. Wang K. W., T. Takeuchi & T. Watanabe. 1985. Optimum protein and digestible energy levels in diets for Tilapia nilotica. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries 51: 141-146. Watanabe T., T. Takeuchi, S. Satoh, T. Ida and M. Yagichi.1987. Development of low protein-high energy diets for practical carp culture with special reference to reduction of total nitrogen excretion. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries 53 (8):1413-1423. Webster C D., D.H. Yancey & J.H. Tidwell. 1992b. Effects of partially or totally replacing fish meal with soybean meal on growth of blue catfish, Ictalurus furcatus. Aquaculture 103:141-152. Webster C.D., J.H. Tidwell, I.S. Goodgamed, D.H. Yancey & I. Mackey. 1992a. Use of soybean meal and distillers grains with soluble as partial or total replacement of fish meal in diets for channel catfish, Ictalurus punctatus. Aquaculture 106:301-309. Wilson R.P. 1977. Energy relationships in catfish diets. Pp 21-29. In: Nutrition and feeding of channel catfish. R. R. Sticney and R. T. Lovell (Editors). Southern Cooperative Series. Bull. 218. Xie S., Y. Cui, Y. Yang & J. Liu. 1997. Effect of body size on growth and energy budget of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture 157:25-34. Yong W.-Y., T. Takeuchi & T Watanabe.1989. Relationship between digestible energy contents and optimum energy to protein ratio in Oreochromis niloticus diets. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries 55:869-873.

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Rev. peru. biol. 20(3): 233 - 240 (Marzo 2014) FACULTAD DE C IENCIAS BIOLGICAS UNMSM

Desarrollo reproductivo de KRApFIA WEBERBAUERI

ISSN-L 1561-0837

TRABAJOS ORIGINALES Desarrollo reproductivo de Krapfia weberbaueri (Ranunculaceae) en condiciones controladas de luz y temperatura
Reproductive development of Krapfia weberbaueri (Ranunculaceae) under controlled conditions of light and temperature
Beatriz Roca1,2, Mery Suni1,3, Asuncin Cano2,3

1 Laboratorio de Fisiologa Vegetal. Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Direccin Postal 11-0058. Lima 11, Per 2 Laboratorio de Florstica, Departamento de Dicotiledneas, Museo de Historia Natural, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. 3 Instituto de Investigacin de Ciencias Biolgicas Antonio Raimondi (ICBAR), Facultad de Ciencias Biolgicas, UNMSM. Email Beatriz Roca: beatrizrocaramos@yahoo.com Email Mery Suni: msunin@gmail.com Email Asuncin Cano: ashuco@yahoo.com

Resumen
Krapfia weberbaueri Standl. & J. F. Macbr. es una especie endmica del Per, categorizada como vulnerable y distribuida en los departamentos de Ancash, Hunuco, Junn y San Martn. El presente trabajo reporta las observaciones sobre el desarrollo reproductivo de esta especie bajo condiciones controladas de luz y temperatura (12 horas de luz/12 horas de oscuridad y 12 C da y 8 C noche). Plantas completas en estado reproductivo fueron recolectadas en la Cordillera Blanca (Ancash) donde forma parches entre los 4200 y 4800 m de altitud. Los datos morfomtricos de los rganos florales fueron registrados cada dos o tres das con un vernier y se evalu la produccin de nctar a lo largo del desarrollo de la flor. Asimismo se evalu la viabilidad de los granos de polen y la receptividad del estigma. Krapfia weberbaueri tiene flores muy llamativas de 24 a 47 mm de longitud, que desde la antesis hasta el inicio de senescencia se mantienen receptivas aunque en mayor medida en la flor madura, etapa en la cual la dehiscencia de estambres y liberacin de los granos de polen alcanza el 100%. Este periodo suma un total de 13 das. La produccin del nctar se inicia en la flor madura y continua hasta la senescencia total de los ptalos. La viabilidad de los granos de polen vari de 78 a 97% y el xito de produccin de aquenios fue 38 a 62%. Se puede sealar que la polinizacin es favorecida por la posicin final de las anteras sobre los estigmas, produccin del nctar, moderada presencia y desplazamiento de caros y fidos y la posicin pendular de la flor. Palabras clave: Per; Ancash; floracin; ginforo; nctar.

Abstract
Citacin: Roca B., M. Suni, A. Cano. 2014. Desarrollo reproductivo de Krapfia weberbaueri (Ranunculaceae) en condiciones controladas de luz y temperatura. Rev. peru. biol. 20(3): 233 - 240 (Marzo 2014)

Krapfia weberbaueri Standl. & J. F. Macbr. is an endemic species from Peru, categorized as vulnerable, and distributed in the departments of Ancash, Huanuco, Junin and San Martin. This work reports the reproductive development of the species under controlled conditions of light and temperature (12 hours light/12 hours darkness, 12 C during light hrs and 8 C during dark hrs). Entire plants at reproductive stage were collected at Cordillera Blanca (Ancash), where it is found forming patches, at an elevation of 4200 to 4800 m. The species has large and showy flowers, which from anthesis to the onset of senescence remain responsive, however at a greater extent in the mature flower, stage at which the dehiscence of stamens and release of pollen grains reaches 100%. This period lasts a total of 13 days. Nectar production begins when the flower matures and continues until the total senescence of petals. The viability of the pollen grains varied from 78 to 97% and success in achene production was 38-62%. It may be noted that pollination is favored by the final position of anthers over the stigmas, nectar production, moderate presence and movement of mites and aphids, and the pendulous position of the flower. Keywords: Peru; Ancash; flowering; gynophore; nectar.

Presentado: Aceptado: Publicado online:

03/10/2013 18/12/2013 14/03/2014

Los autores. Publicado por la Revista Peruana de Biologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Este es un artculo de acceso abierto, distribuido bajo los trminos de la Licencia de Atribucin Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 de Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed. es_ES), que permite el uso no comercial, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citadas. Para uso comercial, por favor pngase en contacto con editor.revperubiol@gmail.com.

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Introduccin La familia Ranunculaceae est representada por alrededor de 50 gneros y ms de 2000 especies, con amplia distribucin, desde hierbas perennes o anuales, terrestres, acuticas o semiacuticas (Tamura 1993). En el Per, la familia Ranunculaceae est representada por ocho gneros y 50 especies (Brako & Zarucchi 1993; Ulloa et al. 2004), en su mayora hierbas. Uno de los gneros presentes en el Per y endmico de los Andes de Sudamrica es Krapfia DC, que se distribuye encima de los 3500 m de altitud en Colombia, Ecuador, Per y Bolivia (Lourteig 1956). Actualmente se reconoce nueve especies para el gnero (Lourteig 1956, Tamura 1993). Las especies de este gnero presentes en el territorio peruano habitan principalmente laderas rocosas con fuerte pendiente de zonas hmedas. Se caracterizan por presentar flores globosas que no se abren por completo durante su desarrollo, spalos persistentes generalmente rojizos externamente y un ginforo bien desarrollado (Lourteig 1956, Tamura 1993). Krapfia weberbaueri Standl. & J. F. Macb. es una especie perenne, endmica del Per y categorizada como vulnerable segn los criterios de la UICN (Len et al. 2007); se distribuye en los departamentos de Ancash, Hunuco, Junn y San Martin (Macbride 1937). Tiene flores grandes y muy llamativas, por lo que es utilizada como planta ornamental, as como tambin sus flores son usadas en medicina tradicional andina, por la creencia de que ellas propician el desarrollo del lenguaje en los nios que tienen dificultad en el habla; ambos motivos seran los causantes de una fuerte depredacin por el hombre (informacin obtenida en las zonas de estudio). El presente trabajo describe el desarrollo y caractersticas florales de Krapfia weberbaueri, en base a observaciones en laboratorio bajo condiciones controladas de temperatura e iluminacin, lo que permite conocer aspectos bsicos de su biologa y usados en su conservacin.

Material y mtodos Material biolgico.- Se recolectaron plantas completas en estado reproductivo (con yemas florales que presentaban tonalidad rojiza) en el distrito de Chacas, provincia de Asuncin (Ancash) en el flanco oriental de la Cordillera Blanca, en lo que se conoce como Callejn de Conchucos. La primera colecta se realiz en la zona de Huichganga, situado arriba de la laguna Librn a pocos kilmetros del nevado Copa, a 4800 m de altitud (13 de Agosto 2008, tres plantas). La segunda y tercera colecta se realizaron en la misma zona cerca de la laguna Atlante (18 de mayo, cuatro plantas y el 29 de septiembre de 2009, once plantas Figura 1). Un total de 18 plantas con su respectivo sustrato fueron recolectadas y trasladadas en canastas hasta el Laboratorio de Fisiologa Vegetal de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, donde fueron colocadas en dos recipientes de 0.05 m2 y dentro de una cmara climtica (VISION VS-3DS) con fotoperiodo de 12/12 horas de luz/oscuridad y termoperodo de 12/8 C da/noche (similar a las temperaturas registradas in situ al momento de la colecta). Cambios en el desarrollo floral.- Se realizaron observaciones y mediciones cada dos o tres das de todas las (18) flores en estudio, utilizando un vernier digital (0.01 mm). En cada fecha se determinaron: Longitud de la flor (medido desde la base del perianto, sin contar el pednculo, hasta el extremo distal del perianto o del gineceo si esta sobresale). Dimetro de apertura. Momento de la produccin de nctar. Momento de la apertura de antera Momento de la liberacin de granos de polen. La receptividad del estigma (entendida como la capacidad del estigma para sostener la germinacin del polen) fue evaluada en todos los pistilos de cada flor en estadio de antesis, de flor abierta, flor madura y en inicio de senescencia usando perxido de hidrgeno al 3% (mtodo de Osborn et al. 1988). El perxido de hidrgeno era aplicado sobre los estigmas de los pistilos con la ayuda de una pipeta Pasteur, iniciando con los ubicados en la base y terminando con los del pice del gineceo; se evaluaba la intensidad de la reaccin observando la formacin de burbujas. La fertilizacin efectiva se determin por la relacin entre los promedios del nmero de frutos por flor y el nmero de pistilos por flor. La viabilidad de los granos de polen se evalu por la tincin con orcena y carmn actico 1% (D'Ambrogio de Argeso 1970), para esto se colectaron los granos de polen de las flores totalmente abiertas (flor madura) con dehiscencia y liberacin de los granos de polen al cien por ciento, se colect la mayor cantidad posible de granos de polen con la ayuda de un hisopo de algodn y fueron depositados en un vial de vidrio al que se agreg el colorante y se dej por 24 horas en refrigeracin. Se tom una submuestra en una lmina porta objeto que contena una gota de glicerina lquida al 50% y se procedi a la evaluacin. Las lecturas se realizaron en ms de
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Figura 1. Puntos de muestreo de Krapfia weberbaueri. 1) cerca de la Laguna Librn (4800 m de altitud, 0938.36'S, 07738.36'W), 2) cerca de la Laguna Atlante (4700 m de altitud, 091512.19S, 0772624.068W).

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Figura 2. Variabilidad del color de los ptalos de las flores de Krapfia weberbaueri, observadas en lugar de colecta.

50 campos con la ayuda del microscopio ptico con un aumento de 400x, los granos de polen viables se tornan de una coloracin rojiza y los no viables se mantienen de un color amarillo, adicionalmente se tomaron las dimensiones de los dos tipos de polen. La viabilidad de los granos de polen as como los datos morfomtricos florales fueron evaluados en las muestras obtenidas en las dos primeras colectas, mientras que con la tercera colecta se evalu la receptividad del estigma. Para validacin de las diferencias entre las medidas se utiliz el anlisis de varianza de una va (ANOVA), el nivel de significacin se consider 0.05.

Resultados En el periodo de estudio se hicieron viajes en abril, mayo, agosto y septiembre a los hbitats de K. weberbaueri observando siempre plantas en floracin por lo que se podra sealar que florece durante todo el ao, aunque durante los meses de abril y mayo haba mayor nmero de plantas en floracin, tambin se observ que el perianto de las flores maduras presentaban variabilidad de tonalidades, que se mostraban en tonalidades entre verde amarillento a fucsia muy intenso. As mismo, cada planta reproductiva presentaba generalmente una sola flor o yema floral, muy raras veces se observaron plantas con dos flores (Fig. 2). Caractersticas de la flor y desarrollo floral de K. weberbaueri.- Al inicio del estudio las yemas florales tuvieron una

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Inicio de senescencia

Longitud de la flor (mm)

45 40 35 30 25 20 15 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Yem a

Antesis

r ta bie a or Fl a) (F

m Flor ) m (F

ra adu

cia en c s ne Se

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Das despus de iniciada la evaluacin Figura 3. Desarrollo floral de Krapfia weberbaueri. Cada segmento indica la variacin de la longitud de la flor y la duracin en cada estadio.
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Figura 4. Encubrimiento de las anteras sobre el gineceo, desde la etapa de flor en antesis (A), flor abierta (B) y flor madura (C) con dehiscencia de las anteras y liberacin de los granos de polen.

Figura 5. Vista superficial del ginforo (A) y en seccin longitudinal (B) en una flor en maduracin. Glndulas nectarferas se ubican en la base cuneada de la cara interna de cada ptalo, detrs y hacia la base de las escamas de color rojo intenso (Figura 6). Estas producen nctar a partir de la etapa de flor madura hasta inicio de flor senescente. El periodo de produccin del nctar coincide con receptividad de estigma que dura 4 das.

Figura 6. Detalles de escamas en la base cuneada de los ptalos (A -flecha), se observa la produccin del nctar en la etapa de flor madura (B) las glndulas nectarferas, ver flecha (C) y lugar donde se deposita el nctar (D).

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Figura 7. Receptividad del estigma evaluado con H2O2 en las diferentes etapas de desarrollo floral: (A) Flor en antesis (B), flor abierta, (C) flor madura, (D) flor en inicio de senescencia y (E) flor senescente, de Krapfia weberbaueri.
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longitud entre 24 y 32 mm, y que se incrementaron hasta 47 mm al final del estudio. El proceso de desarrollo, desde antesis a inicio de la dispersin de frutos, se complet en 21 das, siendo 13 das el periodo entre la antesis y el inicio de senescencia floral (Fig. 3). Se observ el desplazamiento de las anteras hacia el pice cubriendo la superficie de la mayora de los pistilos, paralelo con la dehiscencia de las anteras y la liberacin de los granos de polen (Fig. 4). En la flor con perianto totalmente abierto, la longitud de la teca fue de 2.9 mm y del filamento 5.9 mm. Las flores presentaron ms de 100 anteras de color amarillo intenso y pistilo verde oscuro, este ltimo en algunos casos presento un color rojo intenso en la parte apical y verde en la parte basal. El ginforo presentaba color rojo intenso y en corte longitudinal de la flor se observ como una zona libre entre la regin estaminal y carpelar (Fig. 5). Receptividad del estigma y liberacin de los granos de polen.- La receptividad del estigma en el estadio de flor en antesis fue coincidi con el momento en que se inici la dehiscencia de las anteras y liberacin de los granos de polen en los estambres ubicados en la base del androceo. En cambio, la receptividad se increment en la flor abierta, siendo mxima en estadio de flor madura (con mayor dimetro de apertura floral) coincidiendo con la total dehiscencia longitudinal de los estambres y la mxima liberacin de los granos de polen. En el periodo de flor madura los filamentos de las anteras se elongaron y cubrieron la mayora de los estigmas del gineceo mientras que en el inicio de la senescencia disminuyo la receptividad del estigma. Adems, se observ que los pistilos que no llegaron a desarrollar aquenios (vulos abortivos) todava reaccionaban al perxido de hidrgeno indicando que presentaban receptividad (Fig. 7 y 8). La dehiscencia y la liberacin de los granos de polen de los estambres ubicados en la base del androceo se inici en la etapa de flor en antesis, cuando sucede tambin la elongacin de los estambres sobre la gran mayora de los estigmas, lo que se incrementa en la flor madura. En la flor madura se produce la dehiscencia y liberacin total de los granos de polen de todos los estambres. En la flor madura pudimos observar abundantes caros y fidos que se desplazaban por el gineceo dispersando grandes cantidades de granos de polen que portan en su cuerpo (Figs. 9 A, B , C y D).

Figura 8. Formacin de los aquenios (A). En (B) detalle de aquellos con desarrollo normal (flecha rojo) y aquenios abortivos (flecha celeste).

La viabilidad de los granos de polen fue la siguiente, en agosto 2008, los granos frtiles tuvieron 37.7 m de dimetro en promedio con 78% de viabilidad y para granos no frtiles 36 m de dimetro. Mientras para mayo 2009, los granos frtiles tuvieron 37.75 m de dimetro con 97% de viabilidad y los no frtiles con 30.3 m de dimetro. Al comparar los dimetros de los granos de polen de 2008 y 2009, no se encontr diferencias significativas para los granos frtiles (ANOVA), pero s para los granos no frtiles del 2009 (con dimetro menor) lo cual podra tener relacin con el mayor

Tabla 1. Variables evaluadas durante el estudio del desarrollo reproductivo de Krapfia weberbaueri Colecta 2008 agosto Nde pistilos/flor N aquenios/flor Fertilizacin efectiva % Nde estambres/flor Long estambre mm Dimetro frtiles m Granos de polen Dimetro no fertiles m Frtiles % (N) No Frtiles % (N) 442 33.33 280 10.80 64.8 300 34.71 8.9 0.19 37.7 0.69 35.95 0.90 78 (2208) 22 (622) 2009 mayo 1015 5.07 769 9.22 75.7 345 16.35 9.6 0.14 37.75 0.57 30.3 0.94 96.7 (4042) 3.3 (136) Sig 0.05%. ** ** ns ns ** ns ** ** **

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Figura 9. Los estambres con dehiscencia (A) y liberacin de los granos de polen (B). Se incluye vista ampliada de presencia de caros (C y D).

porcentaje de los granos frtiles para ese ao lo cual afectara el tamao de los no frtiles. En las muestra recolectada en agosto 2008, el nmero promedio de estambres por flor fue de 300, con longitud promedio de 8.9 mm, y en las muestras de mayo 2009, se tuvo un nmero promedio de 345 estambres por flor, con longitud promedio de 9.6 mm. Una observacin adicional realizada en septiembre 2009, cuando las condiciones climticas mejoraban, determino un promedio de 323 estambres por flor con 8.9 mm longitud en promedio (Tabla 1). Las anteras fueron de color amarillo intenso, bitecadas, basifijas con dehiscencia longitudinal. El gineceo es apocrpico con pistilos de color verde oscuro, arreglados sobre el ginforo. El ovario es unilocular y uniovular que termina en un estigma ssil. Se encontr para agosto 2008 un promedio de 442 pistilos por flor. Con pistilos de longitud y dimetro en promedio (a nivel del ovario) de los siguiente, flor en antesis 1.6 x 0.5 mm, en madura de 2.6 x 1.1 mm y flor en senescencia de 2.7 x 1.5 mm. En mayo de 2009 las flores tenan un promedio de 1015 pistilos, las diferencias entre las dos colectas eran estadsticamente significativas. Fruto es un aquenio de color verde oscuro a guinda que se dispersa apenas senescen los ptalos. En agosto 2008 los aquenios tuvieron en promedio de 2.7 x 1.5 mm de dimetro y el nmero promedio de aquenios por flor y por planta fue 280 (los restantes fueron abortivas), por lo que la fertilizacin
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efectiva fue de 63.3%. En mayo de 2009 el nmero de aquenios por flor y planta fue de 769 aquenios equivalente al 75.8% de fertilizacin efectiva. En general los valores para las variables evaluadas fueron mayores para mayo 2009 excepto para la variable dimetro de grano de polen frtil que no presenta diferencia significativa. Discusin Las diferencias encontradas para la mayora de los caracteres florales entre las dos fechas evaluadas (Tabla 1), mayo 2009 (trmino del periodo de lluvias) y agosto de 2008 (estacin seca sin precipitaciones), podran estar ms relacionados con las diferencias en temperatura y humedad en dichas fechas, que al efecto de la altitud sealado por Cursach y Rita (2012). Tambin, en general las condiciones climticas tendran un mayor efecto sobre el desarrollo floral y el xito reproductivo de K. weberbaueri, ms que las condiciones de fertilidad y de contenido de agua del suelo como ocurre con otras especies (Timmerman-Erskine & Boyd 1999). Cabe resaltar que, aunque los caracteres N de pistilos/flor y N de frutos/flor muestran diferencias significativas entre las fechas, la fertilizacin efectiva no es significativamente diferente, lo cual podra indicar condiciones de estabilidad de su hbitat. Se ha sealado que las especies bajo condiciones extremas como las altoandinas muestran principalmente mecanismos de autopolinizacin aunque tambin invierten buena proporcin

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de su energa en la produccin de nctar y grandes cantidades de polen destinados a la atraccin de los polinizadores lo cual podra disminuir mucho el recurso energtico para la fecundacin de sus vulos (Arroyo 1988). En nuestro estudio encontramos casos de autopolinizacin lo que ocurren cuando se desplaza el androceo sobre el gineceo durante el periodo de maduracin y liberacin de granos de polen. Adems, el hecho de que las flores de K. weberbaueri son de gran tamao, con colores intensos y con buena cantidad de polen y nctar, favorece la presencia de caros y fidos en la planta (Torres et al. 2007) quienes, con su desplazamiento dentro de la flor, donde son frecuentes y de moderada abundancia, cumpliran el rol de polinizadores pese a cualquier otro impacto negativo que podran estar ocasionando a la planta (Powell et al. 2011). Por ltimo, puede observarse que K. weberbaueri puede estar en floracin en cualquier momento del ao y por lo tanto tener una importante produccin de semillas, aspecto trascendente para la especie porque luego de su fructificacin sucede la muerte del individuo, sin embargo es necesario determinar el xito de las semillas y su real aporte a la probabilidad del establecimiento de nuevos individuos. Agradecimientos Expresamos nuestra gratitud al Consejo Superior de Investigacin de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, por el financiamiento parcial del presente estudio a travs del proyecto de investigacin del profesor Asuncin Cano (Estudio N0910001161). As mismo a la Dra. Mnica Arakaki por su apoyo y al Blgo. Jos Roque Gamarra por la elaboracin del mapa de las localidades del estudio.

Literatura citada
Arroyo J. 1988. Atributos florales y fenologa de la floracin en matorrales de sur de Espaa. Lagascalia 15(1): 43-78. Brako L. & J.L. Zarucchi. 1993. Catalogue of the Flowering Plants and Gymnosperms of Peru. Monogr.Syst. Bot. Missouri Bot. Gard. 45: iXl, 11286. Candolle A. de. 1817. Regni Vegetabilis Systema Naturale, Paris. Vol. 1: 130, 228. Cursach, J & J. Rita 2012. Reproductive biology of Ranunculus weyleri (Ranunculaceae), a narrowly endemic plant form the Balearic Islands with disjunct populations. Flora 726-735. DOI http://dx.doi. org/10.1016/j.flora.2012.07.004 DAmbrogio de Argeso A. 1970. Manual de tcnicas en histologa vegetal. 1era Edicin. Buenos Aires. Pp 5-79. Lourteig A. 1956a. Ranunculceas de Sudamrica Tropical. Memoria de la Sociedad de Ciencias Naturales La Salle 16 (43): 19-88. Lourteig A. 1956b. Ranunculceas de Sudamrica Tropical. Memoria de la Sociedad de Ciencias Naturales La Salle 16 (44): 125-228. Macbride J.F. 1937.Ranunculaceae in Flora of Peru. Field Museum of Natural History; Botanical Series 13: 639661. Osborn, M., P. Kevan & M. Lane. 1988. Pollination biology of Opuntia polyacantha and Opuntia plaeacantha (Cactaceae) in southern Colorado. Plant Syst. Evol. 159: 85-94. DOI 10.1007/BF00937427 Tamura M. 1993. Ranunculaceae. En: Kubitzki K., J.G. Rohwer, & V. Bittrich (Eds.). The Families and Genera of Vascular Plants. II. Flowering Plants - Dicotyledons.Springer-Verlag: Berln. Vol. 2: 563-583. Timmerman-Erskine M. & R. Boyd 1999. Reproductive biology of endangeres plant Clematis socialis (Ranunculaceae). Journal of the Torrey Botanical Society 126 (2), pp. 107-116. Torres D.C., L.A. Cavieres, C.M. Ramirez, & M.T.K. Arroyo, 2007. Consecuencias de las variaciones microclimaticas sobre la visita de insectos polinizadores en dos especies de Chaetanthera (Asteraceae) en los Andes de Chile central. Revista Chilena de Historia Natural 80: 455-468. Ulloa C., J. Zarucchi & B. Len. 2004. Diez aos de adiciones a la flora del Per: Arnaldoa, Ed. Especial 7: 242.

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Parmetros reproductivos de HYpSIBOAS pUNCTATUS en el extremo sur de su rea de distribucin

ISSN-L 1561-0837

NOTA CIENTFICA Parmetros reproductivos de Hypsiboas punctatus (Schneider 1799) (Anura: Hylidae) en el extremo sur de su rea de distribucin
Reproductive parameters of Hypsiboas punctatus (Schneider 1799) (Anura: Hylidae) in the south limit of its distribution area
Carolina E. Antoniazzi1, Romina Ghirardi1,2, Javier A. Lpez1,3, Andrea P. Armando1,3

1 Instituto Nacional de Limnologa (CONICET-UNL). Ciudad Universitaria, Paraje el Pozo S/N, (3000) Santa Fe, Argentina. 2 Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Catlica de Santa Fe (UCSF). Echage 7151, (S3004JBS) Santa Fe, Argentina. 3 Departamento de Ciencias Naturales, Facultad de Humanidades y Ciencias, Universidad Nacional del Litoral (UNL). Paraje el Pozo S7N, (3000) Santa Fe, Argentina. Correo electrnico de los autores: Email Carolina Antoniazzi: caroantoniazzi@gmail.com Email Romina Ghirardi: romighirardi@yahoo.com.ar Email Javier Lpez: jalopez@inali.unl.edu.ar Email Andrea Armando: andre_armando@hotmail.com. *Corresponding author: Carolina E. Antoniazzi. caroantoniazzi@gmail.com. Instituto Nacional de Limnologa (CONICET-UNL). Ciudad Universitaria, Paraje el Pozo, (3000) Santa Fe, Argentina.

Resumen
Hypsiboas punctatus (Schneider 1799) posee una amplia distribucin en Sudamrica, a lo largo de un gradiente ambiental y latitudinal (tropical/templado), por lo que las condiciones que enfrentan sus poblaciones difieren significativamente. Hasta el momento, solamente se conocen los parmetros reproductivos de esta especie en regiones tropicales, por lo que en el presente trabajo se estudi una poblacin de una regin templada para evaluar si existen diferencias. Los individuos estudiados resultaron ser de menor tamao que los de poblaciones tropicales. El tamao y peso de los machos no se correlacionaron con el volumen testicular. En cambio, el tamao y el peso de las hembras se correlacionaron positivamente con su fertilidad. No se encontraron cuerpos grasos desarrollados en las hembras pero s en los machos. Los resultados obtenidos sugieren que existe una variabilidad en los parmetros reproductivos de H. punctatus que puede estar relacionada tanto a un fenmeno de plasticidad fenotpica como de diferenciacin gentica entre poblaciones distantes. Esto sera una de las claves que permitira a esta especie prosperar en diferentes ecosistemas con distintas caractersticas y presiones ambientales. Palabras clave: Hypsiboas punctatus, parmetros reproductivos; variabilidad de caracteres de historia de vida.

Abstract
Hypsiboas punctatus (Schneider 1799) has a wide distribution in South America, throughout a latitudinal and environmental gradient (tropical/temperate), thus, supporting significantly different pressures among populations. Until now, only tropical populations reproductive parameters have been recorded. Then, our goal was to study reproductive parameters on a population inhabiting a temperate climate region to evaluate differences with those inhabiting tropical regions. Studied frogs were smaller than those from tropical regions. There was no correlation between weight and size of males and their testicles volume. Conversely, females weight and size was positively correlated to their fertility. Fat bodies were developed in males but absent in females. When compared with other studies, our results showed the variability in reproductive parameters of H. punctatus between tropical and temperate regions. This variability could be the result of phenotypic plasticity and/or genetic differentiation between distant populations. This variability may be one of the keys that allow H. punctatus to thrive in diverse ecosystems with different characteristics and environmental pressures. Keywords: Hypsiboas punctatus; reproductive parameters; life history traits variability.

Citacin: Antoniazzi C.E., R. Ghirardi, J.A. Lpez, A.P. Armando. 2014. Parmetros reproductivos de Hypsiboas punctatus (Schneider 1799) (Anura: Hylidae) en el extremo sur de su rea de distribucin. Rev. peru. biol. nmero especial 20(3): 241 - 244 (Marzo 2014)

Introduccin Hypsiboas punctatus (Schneider 1799) (Fig. 1) se distribuye desde el ocano Atlntico hasta la cordillera de los Andes y desde las cuencas de los ros Orinoco y Amazonas, hasta latitudes templadas a travs del valle aluvial del ro Paran en Argentina (La Marca et al. 2010). Es un depredador generalista que se alimenta principalmente de dpteros (Lpez et al. 2002, Lpez 2009) y, en la llanura de inundacin del ro Paran concentra su actividad entre diciembre y abril, durante la temporada de lluvias y de mayores temperaturas (Lpez et al. 2011).
Presentado: Aceptado: Publicado online: 10/08/2013 23/11/2013 14/03/2014

El modo de reproduccin y variables reproductivas de una especie resulta de una interaccin entre condicionantes de su entorno (clima y otros parmetros ambientales, relacin con otras especies, etc.) y la herencia de su historia evolutiva (Crump 1982,

Los autores. Publicado por la Revista Peruana de Biologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Este es un artculo de acceso abierto, distribuido bajo los trminos de la Licencia de Atribucin Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 de Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed. es_ES), que permite el uso no comercial, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citadas. Para uso comercial, por favor pngase en contacto con editor.revperubiol@gmail.com.

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Antoniazzi et al.

transcurso de no ms de una hora posterior a la eutanasia. En el laboratorio fueron pasados a alcohol 70% para su conservacin definitiva (McDiarmid 1994, Angulo et al. 2006). Los ejemplares se encuentran depositados en la coleccin de referencia del Laboratorio de Herpetologa del Instituto Nacional de Limnologa (Acrnimo: HP1 a HP47). Dentro de las primeras 48 horas de captura, en el laboratorio, en todos los especmenes se midi la longitud hocico-cloaca (LHC) con un calibre digital (0.01 mm de precisin) y se registr el peso (P) con una balanza de precisin (0.00001g). En las hembras se pesaron las gnadas (PO) y se determin el complemento ovrico (CO: nmero de vulos maduros) utilizando un microscopio estereoscpico. El criterio utilizado para definir vulos maduros fue el grado de pigmentacin de los mismos (Martori et al. 2005), los vulos inmaduros se observan como una masa blanca indiferenciada, mientras que los maduros son de color negro. Se midi el dimetro de los vulos maduros (DO), se estim el factor de tamao ovrico (FTO= CO*DO/LHC; Duellman & Crump 1974) y se calcul el esfuerzo reproductivo (ER= PO/(P-PO)*100; Prado & Haddad 2005). En los machos se midi el largo (L) y ancho (A) de los testculos para estimar su volumen (VT) utilizando la frmula del esferoide (VT= 4/3**L/2*(A/2)2; Martori et al. 2005). En ambos casos las medidas se tomaron bajo lupa con un calibre digital (0.01 mm de precisin). La energa almacenada en los cuerpos grasos, es utilizada durante el periodo reproductivo para el crecimiento de testculos y ovarios (Tsiora & Kyriakopoulou-Sklavounou 2002, Martori et al. 2005). Por esta razn, cuando estuvieron presentes, se

Figura 1. Individuo adulto de Hypsiboas punctatus. Figure 1. Adult of Hypsiboas punctatus.

Morrison & Hero 2003). Por lo que los estudios sobre la historia natural de los anfibios deben considerar al organismo en relacin al ambiente donde desarrolla sus actividades (Crump 1982). Crump (1974) describi los parmetros reproductivos de poblaciones de H. punctatus que habitan en una regin tropical, al margen de un tributario del ro Amazonas, al este de Ecuador. El lmite sur de la amplia distribucin de esta especie (11.306.927 km2) se encuentra sobre la planicie de inundacin del ro Paran en Argentina (Fig. 2), donde el clima es templado y de lluvias estacionales (Panigatti et al. 1981); estas condiciones son diferentes a las que afrontan las poblaciones de la regin tropical. Por este motivo, el presente trabajo tiene como objetivo estudiar los parmetros reproductivos de una poblacin de H. punctatus que habita una regin templada, en el lmite sur de su rea de distribucin, y discute las diferencias respecto a los valores registrados para las poblaciones de climas tropicales. Material y mtodos Durante el 4 y 5 de abril de 2004 se colectaron 47 especmenes de H. punctatus (6 machos y 41 hembras) en una laguna semipermanente de la llanura aluvial del ro Paran Medio, en la isla Sirgadero (313855S, 604047W) (Provincia de Santa Fe, Argentina). La regin presenta un clima subhmedo-hmedo, mesotermal, con una marcada estacin lluviosa en verano. La temperatura media anual es de 18 C (mximas de 44 C y mnimas de 7 C). La precipitacin media anual oscila entre 900 y 1000 mm (Panigatti et al. 1981). Al momento de los muestreos la laguna se encontraba cubierta de macrfitas sobre las que se hallaron los anfibios capturados (principalmente Eichhornia crassipes, Ludwigia peploides), y rodeada por un cortaderal (Cortaderia selloana) y un bosque hidrfilo (Salix humboldtiana, Tessaria integrifolia, Enterolobium contortisiliquum y Erithrina crista-galli como especies arbreas dominantes). Los anfibios se capturaron manualmente, realizando una bsqueda activa de ejemplares durante dos horas a partir del crepsculo. Los especmenes capturados fueron inmediatamente sacrificados mediante la aplicacin de un anestsico de uso humano (benzocana) sobre la piel de la cabeza y vientre, y fijados in situ con una solucin al 10% de formalina amortiguada en el

Figura 2. Distribucin de Hypsiboas punctatus. El tringulo seala la ubicacin de la poblacin de clima templado aqu analizada y crculo la de la poblacin de clima tropical estudiada por Crump (1974). Figure 2. Hypsiboas punctatus distribution. Triangle tag the location of population of temperate climate herein analyzed while circle mark the location of the population of tropical climate studied by Crump (1974).
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Parmetros reproductivos de HYpSIBOAS pUNCTATUS en el extremo sur de su rea de distribucin

Tabla 1. Variables reproductivas de Hypsiboas punctatus en la poblacin de clima templado aqu analizada (n: 41; n: 6) y en la poblacin de clima tropical estudiada por Crump (1974) (n: 20; n: 10); (*): n=15. Entre parntesis se brinda el rango de las variables. Table 1. Reproductive variables of Hypsiboas punctatus population of temperate climate herein analyzed (n: 41; n: 6) and the population of tropical climate studied by Crump (1974) (n: 20; n: 10); (*): n=15. Variables ranges are presented within parenthesis. Variables LHC LHC P P PO CO DO FTO ER VT Antoniazzi et al. 26.14 1.88 mm (22.67 31.13) 25.50 2.06 mm (23.33 29.14) 1.40 0.38 g (0.71 2.24) 1.15 0.54 g (0.72 2.22) 0.09 0.07 g (0.01 0.3) 154.51 73.23 (14 364) 0.87 0.14 mm (0.42 1.40) 7.2 106.33 0.80 0.52 mm3 (0.29 1.72) 324.6 (230 430)
( )

Crump (1974) 37.2 (35 41) 36.4 (33 40)

* 1.2 (1 1.5) 13.09

pesaron los cuerpos grasos (PCG) con una balanza de precisin (0.00001 g). Finalmente, entre los parmetros medidos se realizaron correlaciones lineales de Pearson o Spearman, segn las caractersticas de los datos. Resultados y discusin En el 46.34% de las hembras se contabilizaron ms de 150 vulos maduros, en el 48.78% entre 50 y 150 y slo dos ejemplares (4.88%) tuvieron menos de 50. Ninguna present cuerpos grasos desarrollados. La Tabla 1 resume los valores de las variables reproductivas analizadas en este trabajo y se informan los datos una poblacin estudiada por Crump (1974) en la Amazona Ecuatoriana (Fig. 2). El tamao y el peso de las hembras se correlacionaron positivamente con la fertilidad (utilizando CO, DO y PO como indicadores de la misma) (Tabla 2). En Crump (1974) el LHC vs CO tambin se correlacionaron positivamente (r= 0.367; p<0.001).
Tabla 2. Correlacin entre las variables reproductivas y tamao de hembras () y machos () de Hypsiboas punctatus. LHC: longitud hocico-cloaca; CO: complemento ovrico (nmero de vulos maduros); DO: dimetro de los vulos; PO: peso del ovario; P: peso de los ejemplares; VT: volumen testicular. Se informa el valor de los coeficientes de correlacin rho (Spearman) y r (Pearson) y la significancia (p). Table 2. Correlations of Hypsiboas punctatus female and male body size with their reproductive variables. LHC: snow-vent length; CO: ovarian complement (number of mature eggs); DO: eggs diameter; PO: ovarian weight; P: individuals weight; VT: testicles volume. We inform the correlation coefficients rho (Spearman) and r (Pearson) and the significance value (p). Variables LHC vs. CO LHC vs. DO LHC vs. PO P vs. CO P vs. DO P vs. PO LHC vs. VT P vs. VT 0.6152 0.1429 0.7714 0.027 0.6166 0.5192 rho r 0.4308 0.1393 p 0.0049 0.385 0.0878 0.0001 0.0005 0.0001 0.8028 0.1028

En los machos slo dos ejemplares presentaron cuerpos grasos desarrollados (PCG= 0.05 g cada uno). La Tabla 1 resume los valores de variables reproductivas. El tamao y peso de los machos no se correlacionaron significativamente con el VT (Tabla 1). La relacin encontrada entre el tamao de la hembra y la fertilidad concuerda con los resultados reportados por otros autores (Crump 1974, Perotti 1997, Prado & Haddad 2005). Los parmetros reproductivos de las poblaciones de clima templado de H. punctatus muestran hembras con menor fertilidad e inversin en la produccin de gametos que las poblaciones de clima tropical (ver Tabla 1). Sin embargo, cabe destacar que los ejemplares de Ecuador (Crump 1974) presentan en promedio mayor tamao que los analizados en el presente estudio (ver Tabla 1) y en otras poblaciones cercanas a la aqu estudiada (Lpez et al. 2002: LHC= 19.35 3.06mm y LHC= 20.23 8.81mm y Lpez 2009: LHC= 29.02 2.83mm y LHC= 30.62 2.83mm). Esto permite sugerir que los ejemplares de H. punctatus de latitudes templadas son de menor tamao que los de regiones tropicales. Esta variacin latitudinal del tamao podra estar influyendo en la variacin de los parmetros reproductivos observados. La relacin de tamao-fecundidad entre las poblaciones de H. punctatus observadas es inversa a la sugerida por Morrison y Hero (2003) para los anfibios. Sin embargo, estos autores plantean excepciones que atribuyen a presiones ambientales referidas a la calidad del hbitat y la presin de depredacin sobre la edad de maduracin y el tamao de los animales. Factores ambientales como las precipitaciones y la temperatura, pueden afectar directamente la disponibilidad de alimento e indirectamente el nmero y tamao de los vulos mediante la reduccin de las reservas lipdicas, necesarias para el desarrollo y maduracin de las gametas (Tsiora & Kyriakopoulou-Sklavounou 2002). Asimismo, la extensin del periodo de actividad de los adultos posee influencia sobre la fecundidad, ya que es durante el mismo que se obtiene y almacena la energa para la reproduccin (Morrison & Hero 2003), y las poblaciones de climas templados de H. punctatus poseen un periodo de actividad reducido a cinco meses al ao (Lpez et al. 2011).

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La relacin inversa entre el tamao de los cuerpos grasos y el tamao ovrico ha sido reportada para anfibios tanto de regiones templadas como tropicales (Martori et al. 2005, Prado & Haddad 2005, Quiroga & Sanabria 2012), por lo que el avanzado estado reproductivo de las hembras podra ser la causa de ausencia de reservas lipdicas en los ejemplares aqu estudiados (Tsiora & Kyriakopoulou-Sklavounou 2002). Para los machos se ha sugerido una relacin inversa al de las hembras, con cuerpos grasos crecientes hacia el perodo reproductivo, debido a que en la poca de apareamiento los machos se encuentran vocalizando y dedican poco tiempo a la alimentacin, debiendo poseer sus reservas energticas altas para afrontar esta actividad (Quiroga & Sanabria 2012). Los resultados obtenidos permiten sugerir que H. punctatus posee una variabilidad de sus caracteres de historia de vida a lo largo de su amplia rea de distribucin, que pueden deberse tanto a una plasticidad fenotpica como al resultado de una diferenciacin gentica entre poblaciones muy distantes, que habitan desde regiones tropicales hasta templadas. Esta variabilidad sera una de las claves que permitira a esta especie prosperar en diferentes ecosistemas con distintas caractersticas y presiones ambientales. Agradecimientos Agradecemos a Pablo A. Scarabotti por su colaboracin en las diferentes etapas del trabajo. Este estudio fue realizado con el apoyo de becas del Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET, Argentina) a C. E. Antoniazzi, R. Ghirardi y J. A. Lpez. Contribucin de los autores CEA: idea y diseo, anlisis e interpretacin de los datos, escritura del trabajo, aprobacin final del trabajo para publicacin. RG: idea y diseo, adquisicin de datos, anlisis e interpretacin de los datos, escritura del trabajo, aprobacin final del trabajo para publicacin. JAL: idea y diseo, anlisis e interpretacin de los datos, escritura del trabajo, aprobacin final del trabajo para publicacin. APA: escritura del trabajo, aprobacin final del trabajo para publicacin.

Literatura citada
Angulo A., J.V. Rueda-Almonacid, J.V. Rodrguez-Mahecha, et al. 2006. Tcnicas de inventario y monitoreo para los anfibios de la regin tropical andina. Conservacin Internacional. Serie Manuales de Campo N 2. Panamericana Formas e Impresos S.A., Bogot D.C, Colombia. Crump M.L. 1974. Reproductive strategies in a tropical anuran community. Miscellaneus Publication Mus. Nat. Hist. Univ. Kansas. 61: 1-68. Crump M.L. 1982. Amphibian reproductive ecology on the community level. Herpetological Communities: a symposium of the Society for the study of amphibians and reptiles and the herpetologist's League. En: J. Scott, Jr. ed. Fish and Wildlife Service, Wildl. Res. Rep. 13: 21-36. Duellman W.E. & M.L. Crump. 1974. Speciation in frogs of the Hyla parviceps group in the upper Amazon Basin. Occas. Pap. Mus. Nat. Hist. Univ. Kansas. 23: 1-40. La Marca E., N. Scott, L. Aquino, et al. 2010. Hypsiboas punctatus. In: IUCN 2013. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2013.1. <www.iucnredlist.org>. Acceso 02/08/2013. Lpez J.A. 2009. Ecologa trfica de anuros en ambientes ribereos de la provincia de Santa Fe (Argentina) y su relacin con alteraciones ambientales. Tesis Doctoral. Universidad Nacional de la Plata. 268 pp. Lpez J.A., P.M. Peltzer & R.C. Lajmanovich. 2002. Hyla punctata (NCN) diet. Herpetol. Rev. 33 (2): 125-126. Lpez J.A., P.A. Scarabotti & R. Ghirardi. 2011. Seasonal patterns of abundance and recruitment in an amphibian assemblage from the Paran River floodplain. Interciencia. 36: 538-544. Martori R., L. Aun, A. Birri, et al. 2005. Reproduccin comparada de tres especies de anuros sintpicos de una localidad del sudeste de Crdoba. Cuad. Herpetol. 18 (2): 43.59. McDiarmid R.W. 1994. Preparing amphibians as scientific specimens. Pp. 289-296. In: Heyer W.R., M.A. Donnelly, R.W. McDiarmid, L.C. Hayek y M.S. Foster (Eds.). Measuring and Monitoring Biological Diversity. Standard Methods for Amphibians. Smithsonian Institution Press, Washington DC, USA. Morrison C. & J. Hero .2003. Geographic variation in life history characteristics of amphibians: a review. J. Anim. Ecol. 72: 270-279. DOI: 10.1046/j.1365-2656.2003.00696.x Panigatti J., J. Weber & O. Pillati. 1981. Estado actual y futuro de los problemas de suelo de Santa Fe. INTA Rafaela, Santa Fe. 55 pp. Perotti M.G. 1997. Modos reproductivos y variables reproductivas cuantitativas de un ensamble de anuros del Chaco semirido, Salta, Argentina. Rev. Chil. Hist. Nat. 70: 277-288. Prado C.P.A. & C.F.B. Haddad. 2005. Size-fecundity relationships and reproductive investment in female frogs in the Pantanal, South-Western Brazil. Herpetol. J. 15: 181-189. Quiroga L.B. & E.A. Sanabria. 2012. Variation in reproductive parameters of Rhinella arenarum (Hensel, 1867) (Anura: Bufonidae) between the reproductive and post-reproductive periods. Belg. J. Zool., 142 (1): 68-73. Tsiora A. & P. Kyriakopoulou-Sklavounou. 2002. Female reproductive cycle of the water frog Rana epeirotica in Northwestern Greece. AmphibiaReptilia. 23: 269-280.

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Rev. peru. biol. 20(3): 245 - 248 (Marzo 2014) FACULTAD DE C IENCIAS BIOLGICAS UNMSM

citogentica de la tara CAESALpINIA SpINOSA

ISSN-L 1561-0837

NOTA CIENTFICA Caracterizacin citogentica de Caesalpinia spinosa de los distritos de Tarma y Palca (Junn)
Cytogenetic characterization of Caesalpinia spinosa from Tarma and Palca (Junn)

Alberto Lpez1, Mara Siles-Vallejos1, Diego Orihuela1, Jos Linares1, Shary Ros1, Yvette Villafani1, Misael Guevara2, Olga Bracamonte2
1 Laboratorio de Gentica. Facultad de Ciencias Biolgicas. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Per. 2 Laboratorio de Citogentica, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Apartado 110058, Lima 11, Per. Email Alberto Lpez: alopezs@unmsm.edu.pe Email Mara Siles: mariansi@hotmail.com Email Diego Orihuela: diego.orihuela tacuri@hotmail.com Email Jos Linares: jrlinaresgonzales@gmail.com Email Shary Ros: shary49cam@hotmail.com Email Yvette Villafani: yv.villafanib@yahoo.es Email Misael Guevara: mguevarap@unmsm.edu.pe Email Olga Bracamonte: obracamonteg@hotmail.com

Resumen
Se analizan los cromosomas somticos de Caesalpinia spinosa (Feuille ex Molina) Kuntze Tara, de poblaciones silvestres de las localidades de Huinco y Palca (Junn). La especie es diploide (2n=24). Los cromosomas son de pequeo tamao. Aunque los cariotipos de ambas localidades muestran el mismo nmero cromosmico, se encontraron diferencias en los parmetros morfolgicos de los mismos, siendo la frmula cariotpica para la localidad de Huinco: 6m + 6 sm y para la localidad de Palca: 5m + 7 sm. Palabras clave: cromosoma; submetacntrico; metacntrico; metafase; cariotipo.

Abstract
Somatic chromosomes of Caesalpinia spinosa (Feuille ex Molina) Kuntze, Tara, wild populations of Huinco and Palca (Junn) regions were studied. The specie were diploid (2n=24). Chromosomes were small. The karyotypes showed the same chromosome number, they found differences in morphological parameters of the same, with the karyotype formula for the town of Huinco: 6m + 6 sm and the town of Palca: 5m + 7 sm. Keywords: chromosome; submetacentric; metacentric; metaphase; karyotype.

Citacin: Lpez A., M. Siles-Vallejos, D. Orihuela, J. Linares, S. Ros, Y. Villafani, M. Guevara, O. Bracamonte. 2013. Caracterizacin citogentica de Caesalpinia spinosa de los distritos de Tarma y Palca (Junn). Rev. peru. biol. nmero especial 20(2): 245 - 248 (Marzo 2014)

Introduccin La tara (Caesalpinia spinosa (Feuille ex Molina) Kuntze) es una especie nativa del Per, que presenta sustancias tiles en las industrias farmacutica, alimentaria, cosmtica entre otras. Sin embargo, a pesar de su importancia no se cuenta an con su caracterizacin cromosmica. La citogentica es una herramienta muy til para determinar esterilidad, reduccin de la fertilidad, muerte embrionaria, caracterizacin de especies, variedades y razas, estudios filogenticos, estudios ecotoxicolgicos, entre otros. Asimismo, los anlisis cariotpicos y citogenticos han aportado de manera significativa tanto en la clasificacin taxonmica como en el estudio evolutivo de especies vegetales que se desarrollan a diferentes altitudes (Baeza 2009). El objetivo del presente trabajo fue analizar y comparar caractersticas citogenticas de C. spinosa silvestres de las localidades de Huinco, distrito de Tarma; y Palca, distrito de Palca. Materiales y mtodos La colecta del material biolgico se realiz en poblaciones no cultivadas de C. spinosa de la provincia de Tarma, Regin Junn, en las localidades de Huinco (3140 m de altitud), perteneciente al distrito de Tarma, y Palca (2791 m de altitud), ubicada en el distrito de Palca; colectndose vainas de Caesalpinia spinosa de cinco rboles por localidad y 8 vainas por rbol. Se entregaron ejemplares al Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos para su identificacin y deposito (0152-USM-2011).

Presentado: Aceptado: Publicado online:

01/05/2013 28/09/2013 14/03/2014

Los autores. Publicado por la Revista Peruana de Biologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Este es un artculo de acceso abierto, distribuido bajo los trminos de la Licencia de Atribucin Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 de Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed. es_ES), que permite el uso no comercial, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citadas. Para uso comercial, por favor pngase en contacto con editor.revperubiol@gmail.com.

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Lpez et al.

Figura 1 a y b. Metafases, localidad Palca, 2n= 24 cromosomas.

Para el anlisis citogentico, se escogieron 33 semillas al azar por cada localidad, las que se sometieron a un proceso de escarificacin durante la noche inmediatamente despus de la recoleccin. Luego se hicieron germinar las semillas hasta obtener races de 1 cm de longitud, las cuales se fijaron en etanol-cido actico (3:1), se sumergieron en una solucin de HCl 1N para limpiar el citoplasma, se ablandaron en una solucin Targa (acido actico, cido lctico y agua destilada en proporciones 9:5:6) y, finalmente, se tieron con orcena lacto actica 2% seguido del squash para la obtencin de las placas metafsicas mitticas. Se fotografiaron las mejores placas metafsicas, utilizndose un microscopio con cmara fotogrfica incorporada, a un aumento de 1000X. Se realiz el anlisis de las microfotografas para determinar el nmero y morfologa cromosmica. Para determinar el tamao de los cromosomas se hicieron las mediciones relativas de cada uno de ellos y se considero el promedio para as poder generalizar. Se utilizaron 15 placas metafasicas de cada localidad para el anlisis. La clasificacin de los cromosomas se hizo siguiendo la nomenclatura de Levan (1964).

Resultados El nmero diploide hallado para Caesalpinia spinosa fue de 2n=24 para ambas localidades (Figs 1 y 2). Sin embargo, a pesar de ser diploides, hemos observado algunas clulas poliploides (Fig 3). Los cromosomas son de pequeo tamao (Tablas 1 y 2), con una longitud relativa que vara de 0.46 a 0.87 para Huinco y de 0.52 a 1.16 para la localidad de Palca. Se observaron diferencias en la morfologa de los cromosomas; encontrndose que en la localidad de Huinco el complemento presenta 6 pares metacntricos y 6 pares submetacntricos (6m + 6sm), siendo los pares 1, 3, 4, 8, 10 y 12 metacntricos y los pares 2, 5, 6, 7, 9 y 11 submetacentricos (Tabla 1, Fig 4); en tanto que en la localidad de Palca el complemento tiene 7 pares metacntricos y 5 pares submetacntricos (7m + 5sm), siendo los pares 1, 2, 5, 7, 10, 11, 12 metacntricos y los pares 3, 4, 6, 8 y 9 son submetacntricos (Tabla 2, Fig 5).

Figura 2. Metafase localidad de Huinco, 2n= 24 cromosomas

Figura 3. Placas metafsicas evidenciando poliploida.

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citogentica de la tara CAESALpINIA SpINOSA

Tabla 1. Morfologa cromosmica de la localidad de Huinco. Longitudes relativas de xp = longitud del brazo p; xq = longitud del brazo q; c = centrmero; IPC = ndice de proporcionalidad centromrica. PAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 xp 0.34 0.25 0.29 0.31 0.21 0.22 0.18 0.25 0.18 0.25 0.17 0.18 xq 0.53 0.51 0.44 0.36 0.40 0.37 0.37 0.30 0.36 0.28 0.32 0.28 c 0.87 0.76 0.73 0.67 0.61 0.59 0.55 0.55 0.54 0.53 0.49 0.46 IPC 0.39 0.32 0.39 0.46 0.34 0.37 0.32 0.45 0.33 0.47 0.34 0.39 TIPO m sm m m sm sm sm m sm m sm m Tabla 2. Morfologa cromosmica de la localidad de Palca. Valores relativos, xp = longitud del brazo p; xq = longitud del brazo q; c = centrmero; IPC = ndice de proporcionalidad centromrica. PAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 xp 0.57 0.40 0.29 0.29 0.36 0.29 0.29 0.27 0.27 0.28 0.28 0.24 xq 0.59 0.61 0.58 0.54 0.43 0.51 0.48 0.48 0.47 0.45 0.37 0.28 c 1.16 1.01 0.87 0.83 0.79 0.80 0.77 0.75 0.74 0.73 0.65 0.52 IPC 0.49 0.40 0.33 0.35 0.40 0.36 0.38 0.36 0.36 0.38 0.43 0.46 TIPO m m sm sm m sm m sm sm m m m

Figura 4. Cariotipo localidad de Huinco

Figura5. Cariotipo de la localidad de Palca

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Lpez et al.

Discusin Ha sido reportado que las especies de Caesalpinoideae presentan una gran variacin en el nmero somtico, con 2n=14, 16, 20, 22, 24, 26 y 28 cromosomas; existiendo series poliploides para el caso del gnero Caesalpinia (2n=12 y 2n=24) (Poggio et al. 2008). En nuestro caso, para las localidades de Huinco y Palca, hemos encontrado 2n=24 cromosomas, este nmero de cromosomas coincide con el que presenta la mayora de las especies del gnero las cuales muestran x=12. Silva et al (2012) describen la morfologia cromosmica de cinco especies de Caesalpinia del Brasil, reportando un numero diploide de 24, nuestras observaciones son concordantes con el mismo valor. Las especies de Caesalpinia que han sido estudiadas citogenticamente tienen cromosomas pequeos (Cangiano & Bernardello 2005, Zanin & Cangiano 2001) lo que concuerda con nuestras observaciones. La frmula cariotpica muestra nicamente cromosomas metaccntricos y submetacntricos (m y sm), lo cual es muy comn dentro de la subfamilia Caesalpinioidae (Souza et al, 2004). Gmez et al. (2003) sealan que el anlisis de cariotipos entre poblaciones de plantas de la misma especie, desarrolladas en reas distintas, puede ayudar a entender los aspectos evolutivos, ecolgicos y de adaptacin. En nuestro estudio, el anlisis citogentico de las dos poblaciones estudiadas revela diferencias en el cariotipo; aunque ambas poblaciones presentan 2n=24 cromosomas y en ambos casos los complementos estn compuestos por cromosomas metacntricos y submetacntricos, encontramos diferencias en cuanto al nmero de metacntricos y submetacntricos. As, en la localidad de Huinco la frmula es 6m + 6sm mientras que en Palca la frmula cariotpica es 7m + 5sm evidenciando la presencia de dos citotipos diferentes. Encontramos que hay polimorfismo interpoblacional en los cromosomas 2,3,4,5,7,8 y 11 entre ambas localidades. Nuestras observaciones indican que a pesar de poseer el mismo nivel de ploida, existen diferencias en los parmetros morfolgicos del cariotipo, lo que indica que el cariotipo de C. spinosa no es uniforme entre poblaciones. Al respecto, Tapia-Pastrana et al. (2012) refieren que la posibilidad de encontrar citotipos con formulas

cromosomicas diferentes estara relacionada con la distribucin ecolgica y geogrfica de la planta y que la divergencia en los genomas ocurrira como una consecuencia adaptativa a condiciones ambientales especficas. Esto mismo ha sido observado en otras monocotiledoneas como Alstroemeria hookeri L. asi como en Crotalaria (Fabaceae) (Baeza et al. 2006). Agradecimientos El presente trabajo fue financiado por el Vice rectorado de Investigacin de la UNMSM como parte del Proyecto Multidisciplinario PEM 2009B03. Literatura citada
Baeza C. M., O. Schrader, E. Ruiz. & Negritto M. 2006. Anlisis comparativo del cariotipo en poblaciones de Alstroemeria ligtu subsp ligtu y A. ligtu subs. siimsi (Alstroemeriaceae) de Chile. Darwiniana 44 (2): 313-318. Baeza C., E. Ruiz & M. A. Negritto. 2009. Importancia del cariotipo en la taxonoma y evolucin del gnero Chaetanthera (asteraceae): evidencias preliminares para especies que crecen en Chile. Gayana Bot. 66(1): 50-57, 2009 Cangiano M. A. and G. Bernardello. 2005. Karyotype analysis in Argentinean species of Caesalpinia (Leguminosae). Caryologia, Vol. 58, n 3:262268. DOI: 10.1080/00087114.2005.10589461 Gmez-Acevedo S.L. & F. Tapia-Pastrana. 2003. Estudio genecolgico en Prosopis laevigata, Acacia farnesiana y Acacia schaffneri (leguminosae). Darwiniana 41(1-4): 47-54. Levan A., K. Fredga & A. Sandberg. 1964. Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas, 52: 201220. DOI: 10.1111/j.1601-5223.1964.tb01953.x Silva P., M. Magalhaes, & R. Xavier. 2012. Karyomorphology of Caesalpinia Species (Caesalpinioideae: Fabaceae) from Caatinga and Mata Atlantica Biomes of Brazil. Journal of Plant Studies,1: 82-91. DOI: 10.5539/jps.v1n2p82 Souza M. G. C. and A. M. Benko-Iseppon. 2004. Cytogenetics and chromosome banding patterns in Caesalpinioideae and Papilionioideae species of Par, Amazonas, Brazil. Botanical Journal of the Linnean Society, 144, 181-191. DOI: 10.1111/j.1095-8339.2003.00230.x Poggio L., S.M. Espert & R.H. Fortunato. 2008. Citogentica evolutiva en Leguminosas americanas. Rodrigusia 59 (3): 423-433. Tapia-Pastrana F., P. Mercado-Ruaro & S. Gmez-Acevedo. 2012.Contribucin a la citogentica de Tamarindus indica (Leguminosae: Caesalpinioideae). Act. Bot. Mex. 98: 99-110. Zanin L. & M. Cangiano. 2001. El cariotipo de Hoffmannseggia glauca (FABACEAE). Darwiniana 39 (1-2): 11 13.

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Rev. peru. biol. 20(3): 245 - 248 (Marzo 2014)

Rev. peru. biol. 20(3): 249 (Marzo 2014) FACULTAD DE C IENCIAS BIOLGICAS UNMSM

Depositorios de la especie COCCIDOpHILUS LOZADAI

ISSN-L 1561-0837

NOTA CIENTFICA Depositorios del material tipo de la especie Coccidophilus lozadai Gonzalez, 2012 (Insecta: Coleoptera: Coccinellidae)
Depositories of the type material of the species Coccidophilus lozadai Gonzalez, 2012 (Insecta: Coleoptera: Coccinellidae)
Pedro W. Lozada1 y Juana Aliaga-Camarena2

(1) Laboratorio de Entomologa, Centro de Diagnstico de Sanidad Vegetal, SENASA, Av. La Molina 1915, Lima 12, y Departamento de Entomologa, Museo de Historia Natural, UNMSM, Av. Arenales 1256, Apartado 14-0434, Lima 14, PERU. Email Pedro Lozada: plozada@senasa.gob.pe plozada57@hotmail.com (2) Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional Santiago Antnez de Mayolo, Apartado Postal 75, Huaraz, PERU. Email Juana Aliaga: jualica@hotmail.com

Resumen
Se designan 6 paratipos de la especie Coccidophilus lozadai Gonzlez, 2012, como depositados en la coleccin del Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA), Lima, Per. El holotipo y dems paratipos estn depositados en el Museo de Historia Natural (MUSM) de Lima y en el Museo de Historia Natural de Washington D.C. (USNM), EE UU. Palabras clave: Depositorio; paratipos; SENASA; Lima; Per.

Abstract
6 paratypes of the species Coccidophilus lozadai Gonzalez, 2012, are deposited in the collection of Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA), Lima, Peru. The holotype and remaining paratypes are deposited in the Museo de Historia Natural (MUSM), Lima, Peru, and National Museum of Natural History (USNM), Washington, D.C., USA. Keywords: Depositorie; paratypes; SENASA; Lima; Peru.

Citacin: Lozada P.W. & J. Aliaga-Camarena. 2014. Depositorios del material tipo de la especie Coccidophilus lozadai Gonzalez, 2012 (Insecta: Coleoptera: Coccinellidae). Rev. peru. biol. 20(3): 249 (Marzo 2014)

El gnero Coccidophilus fue descrito por Brthes en el ao 1905, con su especie tipo C. citrcola Brthes, 1905, por designacin original. Este gnero se encuentra distribuido en Amrica del Norte, el Caribe y Amrica del Sur (Gonzlez 2012). Gonzlez (2012) describi la especie Coccidophilus lozadai de material proveniente de Lambayeque y La Libertad, Per. En ese artculo, el material tipo fue depositado en la coleccin del Museo de Historia Natural (MUSM), Lima, Per. En esta nota cientfica, se asignan 6 paratipos a la coleccin del Laboratorio de Entomologa del Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA) de Per, cuyo acrnimo, SENASA, es designado en esta oportunidad, debiendo ser usado en adelante para citar esta coleccin. Como datos complementarios no reportados en la descripcin de esta especie, se encontr en un fichero elaborado por Juan Wille en la coleccin de insectos del SENASA informacin biolgica referente a observaciones realizadas en el campo, como sigue: los espcimenes citados de La Libertad corresponden a la ciudad de Trujillo; un espcimen se cita como predatando queresas de naranjo fuertemente infestados; dos espcimenes se citan como predatando Lepidosaphes en ctricos. En gran cantidad; otros cuatro espcimenes se citan como asociado con Orthezia en plantas de sapote silvestre. Literatura citada
Gonzlez G. 2012. Revisin de los gneros Coccidophilus Brthes y Microweisea Cockerell (Coleoptera: Coccinellidae: Microweiseinae) en Amrica del Sur. Bol. SEA 51: 61-88

Presentado: Aceptado: Publicado online:

03/12/2013 23/12/2013 14/03/2014

Los autores. Publicado por la Revista Peruana de Biologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Este es un artculo de acceso abierto, distribuido bajo los trminos de la Licencia de Atribucin Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 de Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed. es_ES), que permite el uso no comercial, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citadas. Para uso comercial, por favor pngase en contacto con editor.revperubiol@gmail.com.

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Lozada & Aliaga-Camarena

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Colofn

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Suscripciones y Canje Subscriptions and Exchange programs La Revista Peruana de Biologa es publicada en abril. agosto y diciembre y esta dedicada a la publicacin de los resultados de investigaciones originales e inditas en las reas de Biodiversidad, Biotecnologa, Manejo ambiental, Ecologa y Biomdicas. Los trabajos recibidos son evaluados por rbitros segn criterios internacionales de calidad, creatividad, originalidad y contribucin al conocimiento. The Revista Peruana de Biologa is published in April, August and December, the aims is to disseminate the results of original research in Biodiversity, Biotechnology, Environmental management, Ecology and Biomedical areas. Papers in Spanish or English are peer-reviewed using international criteria of quality, creativity, originality and the knowledge contribution. Revista Peruana de Biologa Suscripcin anual, costo incluye envo. Annual subscription, mailing is included. Per 300 nuevos soles Other countries US$ 250

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PAUTAS PARA LA PRESENTACIN DE LOS ARTCULOS EN LA REVISTA PERUANA DE BIOLOGA Diciembre 2013 IDENTiDAD Y PROPSiTO La Revista Peruana de Biologa es una publicacin cientfica arbitrada producida por el Instituto de Investigaciones de Ciencias Biolgicas Antonio Raimondi, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Per; es publicada tres veces al ao y los nmeros aparecen en abril, agosto y diciembre, tanto en su versin impresa como online. La Revista Peruana de Biologa publica artculos completos, originales e inditos que contribuyan al conocimiento cientfico en los temas de biodiversidad, biotecnologa, ecologa, manejo ambiental y biomedicina elaborados segn las normas indicadas en las presentes pautas. Los trabajos que cumplan con las pautas solicitadas sern incluidos en el la lista para evaluacin. Un editor ser encargado de conducir el proceso enviando el trabajo a rbitros. El trabajo ser evaluado segn criterios internacionales de calidad, creatividad, originalidad y contribucin al conocimiento. El artculo ser aceptado luego del proceso de revisin por rbitros y de realizadas las modificaciones indicadas. El artculo aceptado ser editado y una prueba enviada al autor para la aceptacin y consentimiento de publicacin.

EVALUACiN DE LOS TRABAJOS

SUMiSiN PARA EDiCiN Y LiCENCiA DE USO 1. CONSiDERACiONES SOBRE LA EDiCiN El envo del trabajo a la Revista Peruana de Biologa, implica el consentimiento de los autores para la revisin por pares, la correccin, la edicin y posteriormente el CONSENTiMiENTO DE LA PUBLiCACiN del trabajo tal como se presentara despus de la Prueba Final del trabajo. Los autores reconocen que la Revista Peruana de Biologa se adhiere a la poltica de ACCESO ABiERTO dando inmediato acceso libre a su contenido bajo el principio de: hacer disponible gratuitamente la investigacin al pblico fomenta un mayor intercambio de conocimiento global. TODOS LOS AUTORES garantizan la calidad del trabajo mediante una CARTA DE PRESENTACiN, la carta ser considerada una declaracin jurada y debe afirmar que: a. Garantizan que han ledo las pautas de presentacin y entendido los requerimientos legales y ticos que se mencionan en las PAUTAS PARA PRESENTACIN DE TRABAJOS. b. Garantizan que todos los datos contenidos son exactos y todos los hechos declarados proceden de observaciones o investigaciones realizadas por los autores. c. Garantizan la autora de todos los nominados en el trabajo y su participacin de manera relevante en el diseo, ejecucin y anlisis y se responsabilizan por el trabajo publicado. d. Garantizan que el trabajo presentado no presenta problemas de competencia en los resultados o conclusiones vertidas. e. Garantizan que el manuscrito enviado, nunca ha sido publicado en su totalidad o en parte, en el idioma presentado o en cualquier otro idioma, y no se encuentra sometido otra revista. f. Los autores garantizan que no infringieron leyes ni normas ticas o bioticas nacionales ni internacionales en la elaboracin del artculo. g. Esta carta debe ser enviada por cada uno de los autores, por email debidamente firmada. 2. ENTENDiMiENTOS SOBRE LA LiCENCiA DE USO Entrando en vigencia en el momento de su CONSENTiMiENTO PARA PUBLiCACiN, los autores convienen que el artculo ser publicado por la Revista Peruana de Biologa, en medio impreso y digital, adems de ser adaptado a sistemas informticos que amplen su visibilidad y difusin, incluyendo su reproduccin o publicacin en formatos aptos para ser ledos por mquinas y su incorporacin en sistemas de recuperacin y bases de datos bibliogrficos. Los autores, en conocimiento que la Revista Peruana de Biologa tiene una poltica de Acceso Abierto (Open Access) aceptan las condiciones de la LICENCIA CREATiVE COMMONS ATTRiBUTiON-NON COMMERCiAL-SHARE ALiKE 4.0 INTERNATiONAL (CC BY-NC-SA 4.0) [http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/] que permite copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra. Esta Licencia ser colocada en toda forma y medio en los cuales el artculo se publique por la Revista Peruana de Biologa. Todas las copias de los artculos de la Revista Peruana de Biologa, en papel o digitales, o cualquier otro uso de la informacin debern incluir una cita de la fuentes de publicacin en su totalidad. Una vez terminado el proceso de edicin, el Editor Jefe de la Revista Peruana de Biologa enviar a los autores una Prueba Final del trabajo en formato PDF, para su revisin final; debern efectuar los cambios pertinentes, corregirn los errores de impresin y una vez subsanados los errores el autor enviara la CARTA DE CONSENTiMiENTO para publicacin del artculo, en la cual: acepta la publicacin del trabajo en la Revista Peruana de Biologa y est de acuerdo con la LICENCIA

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de uso. 3. Los autores retienen sus derechos como: a. Los derechos de marca y patente y derechos sobre cualquier proceso o procedimiento descrito en el artculo. b. El derecho de compartir, copiar, distribuir, ejecutar y comunicar pblicamente la obra. c. El derecho posterior a la publicacin, de utilizar el artculo o cualquier parte de aquel, en una compilacin impresa de sus propios trabajos, como ser una seleccin de escritos o notas para conferencias, en una tesis, o para ampliar el artculo a formato de libro para publicacin, siempre que se haga cita de las fuentes de la publicacin en su totalidad. CARTAS DE PRESENTACiN Las coordinaciones se llevaran entre el Editor Jefe y el responsable del trabajo. El trabajo ser acompaado de una carta del responsable y dirigido al Editor Jefe, indicando haber ledo las presentes Pautas para Presentacin de Trabajos; asegurando la originalidad, carcter indito y completo del trabajo presentado y su disposicin para que sea revisado y editado. Esta carta tendr carcter de declaracin jurada segn lo estipulan las directivas del Vicerrectorado de Investigacin de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos referidos a las autoras de trabajos publicados. Cada autor del trabajo deber de enviar por correo electrnico una Carta de Presentacin del trabajo dando las garantas mencionadas anteriormente. Los archivos del trabajo sern enviados por correo electrnico al editor: editor.revperubiol@gmail.com Los trabajos pueden ser presentados en idioma ingls o castellano. Los autores deben asegurarse que las ecuaciones matemticas sean editables, no imgenes. El trabajo debe tener tres partes bsicas: (a) identificacin, (b) cuerpo y (c) literatura citada (a) LA iDENTiFiCACiN debe contener: TTULO (en ingls y castellano), escrito en altas y bajas, con una longitud no mayor a 150 caracteres, incluidos espacios. NOMBRE Y APELLiDO del autor o los autores. AFiLiACiN iNSTiTUCiONAL de los autores, direccin postal de la institucin, correo electrnico de cada uno de los autores, e indicar la direccin postal del autor para correspondencia. RESUMEN no mayor de 250 palabras (en ingls y castellano), PALABRAS CLAVE, cinco (en ingls y castellano). INFORMACiN ADiCiONAL, debe contener: INFORMACiN intereses.
SOBRE LA CONTRiBUCiN

PRESENTACiN DE LOS TRABAJOS

de cada uno de los autores y de no incurrir en conflicto de

FUENTE DE FiNANCiAMiENTO. Debe indicarse la fuente de financiamiento del trabajo, e incluir el cdigo o numero de referencia. AGRADECiMiENTOS. Deben dedicarse solamente a las personas e instituciones que colaboraron directamente en la realizacin del trabajo. (b) El cuerpo del trabajo. Variar segn la seccin de la Revista: TRABAJOS ORiGiNALES. Son artculos primarios, inditos que exponen los resultados de trabajos de investigaciones completas y finales, y que constituyen aportes al conocimiento. Aqu tambin se incluyen las descripciones de especies nuevas, que cumplan con las NORMAS Y CARACTERSTiCAS DE LA iNFORMACiN EN LOS TRABAJOS (ver abajo). El cuerpo est organizado en: Introduccin, Material y mtodos, Resultados y discusin (Resultados, Discusin). Debe abarcar un texto promedio de 30 pginas, las ilustraciones (Tablas y Figuras) deben ser slo las necesarias para una mejor exposicin de los resultados. La introduccin: proporciona el contexto y permite a los lectores que no son del campo comprender el propsito y la importancia del estudio. Define el problema abordado y por qu es importante. Presenta la literatura mas relevante sobre el problema. Seala las controversias o desacuerdos relevantes en el tema. Concluye con una declaracin del objetivo general del trabajo y un comentario de los resultados y conclusin. Material y mtodos: debe proporcionar suficiente detalle como para permitir a otros investigadores replicar completamente su estudio. Los protocolos de los nuevos mtodos deben ser incluidos en detalle. Si los materiales, mtodos y protocolos estn bien establecidos, los autores pueden citar artculos en los que esos protocolos se describen en detalle, pero la presentacin debern incluir informacin suficiente para ser entendido independiente de estas referencias. Protocolos detallados de los mtodos nuevos o no muy conocidos pueden incluirse en Apndices como informacin de apoyo. Las investigaciones con

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humanos, tejidos humanos, animales de laboratorio deben incluir declaraciones de los procedimientos de tica pertinentes y la aprobacin de los comits de biotica. En los casos pertinentes, los trabajos con colectas deben declarar los permisos de las autoridades correspondientes. Resultados y discusin: Esta seccin puede presentarse como dos secciones separadas, es decir una sobre Resultados y otra sobre Discusin. En general esta seccin se pueden dividirse en subsecciones ms especificas, segn sea apropiado. El lenguaje debe ser claro y conciso. En general, estas secciones deben describir los resultados de los experimentos, la interpretacin de estos resultados, y las conclusiones que se pueden extraer. Los autores deben explicar cmo los resultados se refieren a la hiptesis presentada como la base del estudio y proporcionar una explicacin sucinta de las implicaciones de los resultados, y en particular establecer la relacin con los estudios previos relacionados y posibles direcciones futuras para la investigacin. NOTAS CiENTFiCAS. Son artculos primarios, se incluyen aqu: (a) Trabajos de inters taxonmico como reportes de distribucin, inventarios taxonmicos, notas taxonmicas, con la informacin necesaria para cubrir los estndares de Darwin core. Tambin se incluyen resultados de ensayos de laboratorio, cuya informacin es de inters para la comunidad cientfica. La extensin del texto no ser mayor de 15 pginas. El cuerpo de la Nota puede estar organizada: Introduccin, Material y mtodos, Resultados y Discusin y Agradecimientos. COMENTARiOS. Son artculos donde se discute y exponen temas o conceptos de inters para la comunidad cientfica. Se incluyen aqu ensayos de opinin y monografas. Deben contar con las siguientes partes: cuerpo del comentario y Agradecimientos. Todo el artculo debe tener un texto promedio de 10 pginas. COMENTARiOS DE LiBROS. Son artculos que comentan recientes publicaciones de inters para la comunidad cientfica. Puede solicitarse al Comit Editor la elaboracin de un comentario enviando dos copias del libro a la direccin postal de la Revista Peruana de Biologa. CiTAS EN EL TEXTO Las citas en el texto deben incluir el apellido del autor y ao sin comas que los separen. Ejemplos: ... (Carrillo 1988) o ... de acuerdo a Snchez (1976) Cuando dos autores son citados en el texto se usa la conjuncin y: la concentracin de nitrgeno fue medida segn Rios y Castro (1998). Cuando son citados entre parntesis se usa el smbolo &: de nitrgeno se midi por el mtodo colorimtrico (Rios & Castro 1998). Citas de varias referencias entre parntesis, van separadas por comas, en secuencia de importancia: la diversidad de especies es considerada elevada (Simoniz 1968, Perez 2012, Aquino 1988). Si hay varios trabajos de un autor en un mismo ao, se citar con una letra en secuencia adosada al ao, ejemplo: ... Castro (1952a) ... (Rojas 2000a, 2003c) Autores institucionales (FAO, MINAM, etc.) se citan con sus siglas o iniciales y las fechas (por ejemplo: FAO 2009, MINAM 2012), en las referencias se colocaran estas iniciales y en parntesis el significado. Citas de leyes y normas: se citan indicando su categora y el nmero. Por ejemplo: "tal como se indica en la Ley N. 26821..." Cuando hay ms de dos autores se citar al primer autor y se colocar et al. sin itlicas: (e.g. Smith et al. 1981) o segn Smith et al. (1981)). Citas directas o literales se deben hacer entre comillas dentro del texto cuando son menos de 40 palabras, idiomas diferentes al texto en itlicas, indicar pgina del extracto: en cambio Robert Francis lo describe equivocadamente con costillas radiales muy poco insinuadas cruzadas por estras concntricas de crecimiento muy finas lo que le da aspecto liso (Francis 1971, p: 234). Citas directas o literales de ms de 40 palabras, deben separarse del texto en un prrafo sangrado, ejemplo: Accioly (2003), seala que: In many animal groups, early sex identification has enormous biotechnological value and is related with management practices that increase production. Moreover, dimorphic characters are useful in the taxonomic and ecological aspects. The sexual dimorphism is associated with functional structures related to adaptation in this species Subsequent researches based on these data will enable to estimate sexual differentiation during early ontogenetic phases subsidizing protocols to obtain monosex stocks with significant impact on commercial production (p: 20). (c) La LiTERATURA CiTADA incluir todas las referencias citadas en el texto dispuestas solamente en orden alfabtico y sin numeracin. La cita se inicia con el apellido del primer autor a continuacin, sin coma, las iniciales del nombre separadas

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con puntos y sin espacio. El segundo y tercer autor deben de tener las iniciales de los nombre y a continuacin el apellido. El ltimo autor se diferenciara por que le antecede el smbolo &. Si hubiesen ms de tres autores pueden ser indicados con la abreviatura et al. Los nombres de las publicaciones peridicas (revistas) pueden ir en la abreviatura oficial considerada segn su cdigo ISSN. El CDiGO DOI debe ser colocado al final de la referencia. En la literatura citada solamente se usa letra tipo normal, no itlica, no versalita. Ejemplos: Andrn H., & H. Andren. 1994. Effects of Habitat Fragmentation on Birds and Mammals in Landscapes with Different Proportions of Suitable Habitat: A Review. Oikos 71(3):355-366. doi:10.2307/3545823. Dormann C., J.M. McPherson, M.B. Arajo, etal. 2007. Methods to Account for Spatial Autocorrelation in the Analysis of Species Distributional Data: a Review. Ecography 30(5):609628. doi:10.1111/j.2007.09067590.05171.x. Buhrnheim C.M. & L.R. Malabarba. 2006. Redescription of the type species of Odontostilbe Cope, 1870 (Teleostei: Characidae: Cheirodontinae), and description of three new species from the Amazon basin. Neotrop. ichthyol. 4 (2): 167-196. http://dx.doi.org/10.1590/S1679-62252006000200004 Laub B.G. & M.A. Palmer. 2009. Restoration Ecology of Rivers, in: G.E. Likens (Ed.), Encyclopedia of Inland Waters. Academic Press, Oxford, pp. 332341. dx.doi.org/10.1016/B978-012370626-3.00247-7 Rohde K. 2002. Ecology and biogeography of marine parasites, in: Advances in Marine Biology. Academic Press, pp. 183. dx.doi.org/10.1016/S0065-2881(02)43002-7, McLachlan A. & A.C Brown. 2006. The Ecology of Sandy Shores. Elsevier Science & Technology Books. 373pp. Crawford D.J. 1983. Phylogenetic and systematic inferences from electrophoretic studies. In: S.D. Tanksley and T.J. Orton, eds. Isozymes in Plant Genetics and Breeding, Part A. Elsevier, Amsterdam. Pp. 257-287. Pianka E.R. 1978. Evolutionary ecology. 2nd edn. New York: Harper & Row. Carroll S.B. 2005. Evolution at Two Levels: On Genes and Form. PLoS Biol 3(7): e245. <http://biology. plosjournals.org/archive/1545-7885/3/7/pdf /10.1371_journal.pbio.0030245-S.pdf >. Acceso 31/07/2005. FDA (Food and Drug Administrations). 2001. Fish and Fishery Products Hazards and Controls Guidance. Third Edition June 2001. <http://www.cfsan.fda.gov/~comm/haccp4.html> (acceso 24/12/07). CONAM. 2005. (en lnea). Informe nacional del estado del ambiente 2001. <http://www.conam.gob.pe /sinia/ INEA2001.shtml>. Acceso 31/07/2005. IMARPE. 2002. (en lnea). Segundo informe del BIC Jos Olaya Balandra. Paita Salaverry. 24 febrero- 05 Marzo 2002. <http://www.imarpe.gob.pe /imarpe/informeolaya02-032002.php>. Acceso 01/07/2005. Solari S.A. 2002. Sistemtica de Thylamys (mammalia: didelphimorphia: marmosidae). Un estudio de las poblaciones asignadas a Thylamys elegans en Per. Tesis, Magster en Zoologa, mencin Sistemtica y Evolucin. Facultad de Ciencias Biolgicas Universidad Nacional Mayor de San Marcos. <http://www. cybertesis.edu.pe/sisbib/2002/solari_ts /html/index-frames.html>. Acceso 31/07/2005 Ley N. 26821. 1997. Ley orgnica para el aprovechamiento sostenible de los recursos naturales. Compendio de la legislacin ambiental peruana. Volumen I. Marco normativo general. Ministerio del Ambiente MINAM, Editado por la Direccin General de Polticas, Normas e Instrumentos de Gestin Ambiental del Ministerio del Ambiente. Actualizado al 30 de junio de 2010. pp: 85-91 DS N. 012-2001-PE. 2001. Aprueban el Reglamento de la Ley General de Pesca, Ministerio de la Produccin. 13 de marzo de 2001. El Peruano Normal Legales: 199905-199921 DS N .179-2004-EF. 2004. Texto nico ordenado de la ley del impuesto a la renta. 08 de diciembre de 2004. El Peruano Normas Legales: 281912-281940 Las citas de artculos en prensa deben incluir el volumen, el ao, el nombre de la revista y el DOI respectivo; de lo contrario debern ser omitidos. No se aceptan las citas a resmenes de eventos acadmicos (congresos y otros). NORMAS Y CARACTERSTiCAS DE LA iNFORMACiN EN LOS TRABAJOS La Revista Peruana de Biologa se gua de los conceptos ticos y buenas prcticas de publicacin mencionados en los lineamientos del COMMITTEE ON PUBLICATION ETHICS (COPE - http://publicationethics.org/). Respecto de la autoria, la Revista Peruana de Biologa asume la veracidad de la carta de presentacin y de la carta de consentimiento de publicacin. Cuando el artculo exponga sobre experimentos con humanos y animales, los procedimientos deben de ceirse a la Declaracin de Helsinki de 1975 y a las leyes peruanas vigentes (Ley 27265). Deben ser presentadas las declaraciones pertinentes y mencionadas explicitamente en el texto. Cuando el artculo exponga sobre nuevas especies, nuevos registros, ampliaciones biogeogrficas o inventarios taxonmicos debe tomarse en cuenta la informacin requerida en el Darwin Core. Tambin debe indicarse el depsito de los ejemplares en una institucin taxonmica reconocida, comprometida en la preservacin del material, que permita el libre acceso al

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material, publique constantemente la relacin del material que posee en custodia y que brinde la informacin necesaria sobre los ejemplares cuando sea requerido. No son consideradas las colecciones particulares. Los nombres cientficos del gnero y especie irn en cursivas. La primera vez que se cita un organismo deber hacerse con su nombre cientfico completo (gnero, especie y autor); posteriormente podr citarse solamente la inicial del nombre genrico y el nombre especfico completo. Para el caso de las abreviaturas de autores en nombres botnicos pueden referirse al International Plant Names Index (IPNI - http://www.ipni.org/), la base de datos TROPICOS (http://www.tropicos.org/) y AlgaeBase (http://www.algaebase.org/). Las localidades y puntos de colecta deben ser referenciadas geogrficamente, usando coordenadas cartesianas sexagesimales, tanto en el texto como en las ilustraciones. Deben usarse los smbolos de las unidades del Sistema Internacional de Medidas. Si fuera necesario agregar medidas en otros sistemas, las abreviaturas correspondientes deben ser definidas en el texto. Debe usarse el punto decimal (ejemplo correcto: 0.5; incorrecto: 0,5). Las cifras deben mantenerse juntas (ejemplo correcto: 1994, 30302; incorrecto: 1,994; 30 302). Las ilustraciones deben ser creacin de los autores, en caso contrario deben indicar procedencia y crditos. Las Figuras (mapas, esquemas, diagramas, dibujos, grficos, fotos, etc.) sern numeradas correlativamente con nmeros arbigos; de igual manera las Tablas. Las leyendas de las Figuras y Tablas deben presentarse a continuacin del texto y ser suficientemente explicativas, y con toda la informacin necesaria para que se puedan entenderse. Las fotos y dibujos escaneados deben guardarse en un archivo TIFF, tamao del original a 300 dpi. Los grficos estadsticos y diagramas deben de enviarse en formato nativo editable (achivo.xls, archivo.svg, archivo.eps), NO COMO iMGENES (JPGE, TIFF, PNG). Los mapas pueden enviarse en formatos SHP, o imgenes de alta resolucin. Pueden enviar las fotos de cmaras digitales mayor a 3 Mpixel en su formato de salida. Otros archivos de imgenes en TIFF, BMP, JPGE de alta resolucin y tamao, y figuras vectoriales en Ai, EPS. Formatos procedentes de software como R, en formatos editables de PDF, EPS (Postscript). Costos por ilustraciones a color sern asumidos por el autor. PRESENTACiN DE LOS ARCHiVOS Los archivos deben presentarse por separado, esto es: Un archivo con el texto y leyendas en formato MS-Word. Otro archivo para las tablas en MS-Excel o como tablas en MS-Word. Otros archivos en formatos nativos, NO COMO iMGENES iNSERTADAS O PEGADAS EN UNA HOJA DE MS-WORD O EXCEL.

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REVISTA PErUANA DE BIOLOGA

Rev. peru. biol. ISSN 1561-0837

Volumen 20

Marzo, 2014

Nmero 3

TRABAJOS ORIGINALES 205 Agrotransformacin y evaluacin de la resistencia a Phytophthora infestans en Solanum tuberosum L. variedad Dsire Agro-transformation and evaluation of resistance to Phytophthora infestans in Solanum tuberosum L. variety Dsire Jeanette Orbegozo, Mara Lupe Romn, Cristina Rivera, Jos Carlos Tovar, Willmer Prez, Soledad Gamboa, Greg Forbes, Jan Kreuze y Marc Ghislain 211 Identificacin de genes relacionados a sequa en papas nativas empleando RNA-Seq Identification of genes related to drought in native potatoes using RNA-Seq Yerisf Torres, Roberto Lozano, Carlos Merino y Gisella Orjeda 215 Diversidad gentica de papas nativas (Solanum spp.) conservadas en cultivares nativos del Per Genetic diversity of native potatoes (Solanum spp.) conserved in landraces from Peru Julin Soto, Tulio Medina, Yeny Aquino, Rolando Estrada 223 Efecto de Maytenus macrocarpa Chuchuhuasi en el sistema reproductor masculino del ratn (Mus musculus) Effect of Maytenus macrocarpa Chuchuhuasi in the male system reproductive of mouse (Mus musculus) Lyonal G. Acosta, Jonathan Vsquez, Vctor Nez, Jos Pino1, Betty Shiga 227 Efecto ahorrativo de la protena usando niveles altos de energa y obtencin de la relacin optima energa digestible/protena digestible en dietas para el crecimiento de Oreochromis niloticus (L) Protein-sparing effect with high energy levels and obtaining the optimum digestible energy/digestible protein ratio in growth diets to Oreochromis niloticus (L.) Felix Walter Gutierrez, Mximo Quispe, Luz Valenzuela 233 Desarrollo reproductivo de Krapfia weberbaueri (Ranunculaceae) en condiciones controladas de luz y temperatura Reproductive development of Krapfia weberbaueri (Ranunculaceae) under controlled conditions of light and temperature Beatriz Roca, Mery Suni, Asuncin Cano NOTA CIENTFICA 241 Parmetros reproductivos de Hypsiboas punctatus (Schneider 1799) (Anura: Hylidae) en el extremo sur de su rea de distribucin Reproductive parameters of Hypsiboas punctatus (Schneider 1799) (Anura: Hylidae) in the south limit of its distribution area Carolina E. Antoniazzi, Romina Ghirardi, Javier A. Lpez, Andrea P. Armando 245 Caracterizacin citogentica de Caesalpinia spinosa de los distritos de Tarma y Palca (Junn) Cytogenetic characterization of Caesalpinia spinosa from Tarma and Palca (Junn) Alberto Lpez, Mara Siles-Vallejos, Diego Orihuela, Jos Linares, Shary Ros, Yvette Villafani, Misael Guevara, Olga Bracamonte 249 Depositorios del material tipo de la especie Coccidophilus lozadai Gonzalez, 2012 (Insecta: Coleoptera: Coccinellidae) Depositories of the type material of the species Coccidophilus lozadai Gonzalez, 2012 (Insecta: Coleoptera: Coccinellidae) Pedro W. Lozada y Juana Aliaga-Camarena

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