MATERIALES Y MTODOS.

Se aplic la tcnica de Biorremediacin a un rea impactada con 58 barriles de petrleo crudo de 14 API de viscosidad aledaa a un pozo de petrolero situado en la costa norte occidental de la Repblica de Cuba. Debido a la poca homogeneidad de la contaminacin, se establecieron dos zonas para el seguimiento del tratamiento: Zona A (rea ms contaminada) y Zona B (rea menos contaminada). El seguimiento de los tratamientos se realiz mediante anlisis qumicos y microbiolgicos utilizando tcnicas valorimtricas, gravimtricas y espetrofotomtricas, mensualmente durante 369 das. El rea fue humectada y aireada peridicamente mediante un tractor con arado de disco. Debido a las caractersticas del petrleo crudo a degradar, l cual al derramarse en el suelo forma trozos muy grandes de difcil disgregacin, no fue fcil lograr una distribucin homognea sobre el rea de trabajo, razn por la cual se dividi la parcela en 2 partes: Zona A: rea ms contaminada Zona B: rea menos contaminada Es destacar que no se adicion suelo limpio ni material acondicionante para disminuir la concentracin inicial de hidrocarburos, solamente se removi el rea impactada con el arado y despus se homogeniz con el equipo pesado denominado raspador. Acondicionamiento nutritivo - ambiental inicial.

Independientemente de los contenidos iniciales de nutrientes existentes en el suelo, se adicionaron como fuentes de nitrgeno y fsforo, urea y diamino fosfato respectivamente, con el objetivo de estimular el crecimiento de los microorganismos de forma tal de obtener las siguientes relaciones: C/N = 60 C/P = 800 donde: C = HC * 0.78 C: contenido de carbono orgnico, expresado en g HC: contenido de hidrocarburos, expresado en % Sobre la base de la relacin HC-Nitrgeno-Fsforo prefijada, se incorporaron los siguientes nutrientes: . Fuente de Fsforo............... 0.047 kg / m 2 . Fuente de Nitrgeno........... 0.22 kg / m2 Seguimiento del tratamiento aplicado.

La toma de muestra de suelo para los anlisis del seguimiento del proceso de Biorremediacin se utiliz un muestreo tipo estrella recomendado por el especialista japons Dr. Itaru Okuda. Las muestras fueron colectadas y envasadas en bolsas de nylon, se preservaron en congelacin hasta su posterior procesamiento y anlisis. Adems, para la determinacin de grasas y aceites las muestras fueron homogeneizadas, secadas, y tamizadas a travs de un tamiz de 2 mm, de donde se tom una muestra representativa para ser analizada. Para determinar la efectividad del tratamiento aplicado se realizaron los siguientes anlisis:

Grasas y aceites e hidrocarburos totales, HC Saturados Resueltos, Saturados, Aromticos, Resinas y Asfaltenos, Contenidos de nitrgeno total y fsforo total, Conteo de microorganismos, Produccin de CO2 (Respirometra), Metales totales La tasa de biodegradacin se calculo segn la siguiente expresin: Concentracin Inicial Concentracin Final Tasa (%) = -------------------------------------------------------- * 100 Concentracin Inicial RESULTADOS Y DISCUSIN. En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos de los parmetros fundamentales medidos para el seguimiento de la efectividad del tratamiento de Biorremediacin. Despus de los 4 primeros meses del tratamiento aplicado y debido a la disponibilidad de equipos pesados, se realiz la homogenizacin del terreno impactado, obtenindose una mejor distribucin de la contaminacin en el rea, observndose un incremento en los niveles de Grasas y Aceites e Hidrocarburos Totales del petrleo en las dos zonas y por consiguiente una disminucin en la tasa de biodegradacin. (Ver Tabla 1) Por otra parte, se observa que en la zona A, durante los primeros 38 das, ocurre una disminucin significativa en la concentracin de hidrocarburos totales, representada por una tasa de degradacin del 29,06 %, resultado ligeramente superior al 25 % recomendado por otros autores (Infante, 2001) (Ercoli, 2001). En general, a los 369 das se obtuvo una reduccin en el contenido de hidrocarburos totales del 78.08 %, favorable para este tipo de tratamiento. En la zona B se observa que a los 38 das de iniciado el tratamiento existe un aumento en la concentracin de hidrocarburos totales del petrleo (HCTP), que esta dado, por contaminacin cruzada de la zona B originada por las operaciones de laboreo del terreno con el arado de discos, ya en los 63 das siguientes y tomando como concentracin de inicio la de los 38 das, se obtuvo una tasa de biodegradacin de 39.70 %, superior a lo recomendado por muchos autores para continuar el proceso de Biorremediacin, al trmino del proceso existe una tasa de biodegradacin en esta zona de 40.13 %. Es de sealar que ambas zonas se obtuvieron niveles de hidrocarburos inferiores a los 10 000 mg/kg recomendados para este proceso en las normas internacionales consultadas (Louisiana, 2000). Es de destacar que como en esta zona se parten de valores cercanos a los 10 000 mg/kg de HCTP,para t = 0 das, la variacin en las concentraciones de stos resulta menos acentuada que en la zona A, esto se debe a que a estos niveles la velocidad del proceso de Biorremediacin resulta mas lenta y en ocasiones poco perceptibles debido al mtodo analtico empleado (gravimetra), que es muy efectivo para analizar altas concentraciones de HCTP. Si se comparan los valores obtenidos de Hidrocarburos Totales del Petrleo con la norma de referencia para este proceso en Lousiana, se observa que los niveles son inferiores en ambas zonas a los 10 000mg/kg (1 %), valor recomendado para suelos contaminados por hidrocarburos, ntese que estos valores en la zona A se obtuvieron a los 265 das, ocurriendo posteriormente un periodo de meseta o de saturacin, donde el decrecimiento en los das subsiguientes no ocurre, si no que ligeramente aumenta o se mantiene en los niveles alcanzados en esa fecha. Se debe sealar, que en ambas zonas se apreci visualmente una mejora desde el punto cualitativo de las condiciones del suelo, recuperndose casi totalmente sus condiciones iniciales antes de la contaminacin. Es bueno sealar que la variacin en los niveles encontrados, en algunos parmetros, se debe a la heterogeneidad de la matriz suelo y a la poca homogeneidad del rea impactada. Tabla 1. Resultados del seguimiento del tratamiento

Para ver la tabla seleccione la opcin "Descargar" del men superior (1)Criterios para los constituyentes restrictivos de tierras en Louisiana, Registro de Louisiana, EUA, 2000 (referencia 11) La figura 1 muestra la variacin de los niveles de concentracin de hidrocarburos totales reportados en tabla 1, para las zonas estudiadas. En el grfico se puede observar una disminucin marcada de los hidrocarburos totales en el tiempo, lo que corrobora la efectividad del tratamiento aplicado. Si observamos los valores de Hidrocarburos Totales del petrleo obtenidos en ambas zonas, se puede afirmar que desde t = 265 das existe un periodo estacionario o de meseta anteriormente sealado, donde la disminucin de la concentracin es casi inapreciable, es lo que se conoce como periodo de saturacin, alcanzado este periodo se puede dar por concluido el proceso de Biorremediacin. Si se requiere disminuir an mas este parmetro es necesario analizar si es factible desde el punto de vista econmico y del uso futuro que se le quiera a dar al suelo.

Figura 1 Variacin de la Concentracin de H/C totales del Petrleo en el tiempo Las Figuras 2 y 3 muestran las variaciones de los contenidos de nitrgeno y fsforo en ambas zonas, aprecindose una disminucin en el tiempo de los niveles de concentracin de nitrgeno y fsforo, debido a su utilizacin por los microorganismos como compuestos esenciales para su crecimiento ydesarrollo del proceso biodegradativo (Ver Tabla 1). A los 100 das de tratamiento (despus de haber tomado la muestra para ese tiempo), el terreno fue fertilizado mediante la adicin de las cantidades necesarias de DAP (fsforo) y nitrato de amonio como fuente de nitrgeno, con el fin de mantener la relacin C: N: P prefijada, observndose valores mximos para ambas curvas a los 166 das. Para ver el grfico seleccione la opcin "Descargar" del men superior Figura 2.Variacin de la Concentracin de Nitrgeno Total Figura 3 .Variacin de la Concentracin de Fsforo Total Adems, en las figuras antes citadas, se observa un decrecimiento ms marcado de las concentraciones de Nitrgeno y Fsforo a partir de t = 166 das, debido a que el laboreo del terreno despus de esa fecha se realiz semanalmente, ayudando as a una mejor utilizacin de los nutrientes por los microorganismos para su crecimiento y desarrollo. La tabla 2 muestra los niveles de concentracin de los componentes del petrleo total extrado del suelo de la Zona A y Zona B a tiempo = 0 (saturados, aromticos, resinas y asfaltenos). Como se puede observar la mayor concentracin de hidrocarburos totales del petrleo (reportadas en la Tabla 1), en ambas zonas corresponde a la fraccin de saturados y en menor cuanta se encuentran los hidrocarburos aromticos, siendo ambos considerados biodegradables. Los niveles de concentracin de resinas y asfaltenos constituyen una parte importante del petrleo

total extrado (40 - 56 %) y los mismos son considerados resistentes a la biodegradacin., se debe destacar que una vez finalizado el tiempo del tratamiento aplicado existe biodegradacin de esas fracciones, alcanzndose en la zona A un 41.10% y 23.4 % (respectivamente de las fracciones de resinas y asfaltenos) , lo que corrobora lo sealado por otros autores (Ercoli, 2002, Infante, 2001), que todas las fracciones del petrleo son biodegradables. En ambas zonas se observan incrementos de las diferentes fracciones, pudiendo deberse a la heterogeneidad de la contaminacin en el suelo. Con relacin al contenido de hidrocarburos aromticos se aprecia una disminucin en ambas zonas al final del periodo analizado de un 32.32 % para la zona A y de un 25.21 % para la zona B. Por otra parte, en dicha tabla se observa una disminucin significativa de la concentracin de los hidrocarburos saturados en el tiempo, debido a que esta fraccin la conforman los sustratos ms susceptibles de degradar por los microorganismos. Los niveles de concentracin relativamente bajos de Hidrocarburos Saturados Resueltos muestran el carcter poco parafnico del petrleo contaminante del suelo tratado. De forma grafica, en la figura 4, se aprecia la variacin de los niveles de hidrocarburos saturados en ambas zonas, ntese la disminucin de las concentraciones de estos compuestos antes sealadas. Para ver el grfico seleccione la opcin "Descargar" del men superior Figura 4. Variacin de la Concentracin de Hidrocarburos Saturados. La Tabla 2 muestra los contenidos de Metales Pesados obtenidos al trmino del tratamiento aplicado, los cuales se encuentran por encima de lo estipulado todos los casos, exceptuando el Zn, a la normativa internacional consultada y en la referencia de CUPET. Los altos contenidos de Fe resultan significativos debido a las caractersticas ferralticas del suelo. Tabla 2. Contenido de Metales Pesados, expresados en mg/kg base seca Para ver la tabla seleccione la opcin "Descargar" del men superior (1) Regulaciones Ambientales 01/95 y 07/96, CUPET (referencias 1y 6) (2) Se regula Cromo VI. (23Criterios para los constituyentes restrictivos de tierras en Louisiana, Registro de Louisiana, EUA, 2000 (referencia 7) Si este suelo en un futuro se decidiera utilizar con fines agrcolas, que no es el caso debido a su ubicacin, (cercano a una zona cenagosa), donde la concentracin de metales pesados fuera un parmetro importante a valorar, sera necesario utilizar la Fitorremediacin, donde con la utilizacin de plantas adecuadas para este proceso, se logra la disminucin del contenido de metales pesados, terminado el proceso, estas plantas son cortadas y tratadas adecuadamente. Comportamiento de las Poblaciones Microbianas. En la tabla 3 se reportan las concentraciones de microorganismos encontrados en el tratamiento a diferentes tiempos, pudindose apreciar la variacin de stas durante todo el periodo analizado. A partir de los 265 das, comienza el decrecimiento de la concentracin de microorganismos hetertrofos totales, coincidiendo con el periodo de saturacin alcanzado en los niveles de hidrocarburos. Es de destacar que la concentracin de microorganismos viables se mantuvo durante todo el proceso en el orden entre 106 y 108, valores favorables para que se efecte el proceso biodegradativo. Tabla 3. Conteo de microorganismos hetertrofos totales, expresados en UFC/g x 108 Para ver la tabla seleccione la opcin "Descargar" del men superior

En la figura 5 se puede observar de forma grfica el comportamiento de la concentracin de microorganismos en ambas zonas durante el proceso de Biorremediacin aplicado al suelo impactado en reas del Pozo Gusimas 18, ntese las variaciones que se observan en las mismas debido al tiempo del proceso analizado en que de forma cclica, crecimientos y decrecimientos, se repiten las fases de desarrollo de los microorganismos: adaptacin, crecimiento acelerado, rgimen estacionario y muerte sbita. Para ver el grfico seleccione la opcin "Descargar" del men superior Figura 5. Comportamiento de la concentracin de microorganismos Lo niveles de microorganismos degradadores de hidrocarburos encontrados fueron: Zona A: 7.2 x 105 a t = 229 das Zona B: 4.8 x 106 a t = 229 das En ambos casos estas concentraciones resultaron superiores al rango de 103 y 104 recomendado en la literatura (Ercoli, 2000) para que se efectu el proceso de Biorremediacin satisfactoriamente. De las concentraciones de microorganismos degradadores de hidrocarburos anteriormente sealadas, se aislaron un total de 7 cepas diferentes en medio agar - petrleo, 5 de bacterias y 2 de hongos. Las cepas de bacterias se identificaron por el API 20 NE y resultaron ser: Pseudomona putida, Pseudomona stutzen, Pasteurella spp, Sphingo spiitevorum y Brevum vesicularis.. Estas bacterias son bacilos, aerobias, Gram negativas. Las Pseudomonas sp es reportada por otros investigadores (Lawlor y colaboradores, 1997) como el grupo de bacterias hetertrofas aerbicas degradadoras de hidrocarburos mas comnmente encontradas en el pool de microorganismos en suelos contaminados por petrleo. En la tabla 4 se muestran los valores de la produccin de CO2 para el caso de estudio. Los valores obtenidos para la produccin de CO2, se corresponden con las concentraciones de microorganismos encontradas para cada zona siendo los valores mayores para la zona A de acuerdo con los microorganismos presentes. Tabla 4. Produccin de CO2, expresada en mg de CO2/ cm2. h 0 Zona A Zona B 86 86 41 91 95 76 112 85 122 106 111 166 109 100 201 106 111 229 109 100 265 89 86 293 80 83 329 79 82

De forma grafica (Figura 6) se puede observar que en ambas zonas se observan patrones tpicos de procesos biodegrativos, valores de produccin de CO2 entre 80 y 140 mg de CO2/ cm2. h, segn experiencias de los autores en otros trabajos realizados a escala de campo (lvarez, Ramos, Nez y otros, 2003), indicando que se est llevando a cabo la biodegradacin del crudo. Para ver el grfico seleccione la opcin "Descargar" del men superior Figura 6. Variacin de la Produccin de CO2 Se sembraron plantas en el rea tratada (Pion de jardn), lo cual, no result efectivo debido a las condiciones existentes en el suelo, siendo el crecimiento de las plantas autctonas de la zona indicativo de la recuperacin del suelo,

Se realizaron ensayos de toxicidad al suelo tratado por dos mtodos diferentes, bioensayo con lombrices de tierra y por el equipo MICROTOX, no encontrndose toxicidad por ninguno de los mtodos empleados. El anlisis econmico del proceso de Biorremediacin arroj valores dentro del rango internacional estipulado para este tratamiento (51.10 USD/ m3), CONCLUSIONES. 1. El tratamiento de Biorremediacin aplicando la tcnica de bioestimulacin al rea impactada del pozo result efectivo, observndose una disminucin en la concentracin de hidrocarburos totales del petrleo hasta obtener valores inferiores al 1% recomendado por las normas internacionales Mediante la adicin de nutrientes esenciales para el desarrollo de los microorganismos existentes, aireacin y humectacin peridica del rea tratada., se logr recuperar el suelo impactado en un periodo de un ao. Se han identificado las especies de microorganismos degradadores de hidrocarburos en el suelo tratado. De acuerdo a los ensayos toxicolgicos, los suelos remediados no presentan toxicidad para el desarrollo de la biota del suelo y confirman que la contaminacin. La reforestacin artificial con la especie de planta seleccionada no result efectiva, creciendo en el suelo recuperado la vegetacin autctona del lugar. La evaluacin econmica del tratamiento aplicado di valores dentro del rango internacional para la tecnologa de Biorremediacin, resultando muy atractiva desde este punto de vista para ser generalizada en el tratamiento de suelos contaminados por hidrocarburos en pases en vas de desarrollo. Se ha desarrollado un esquema tecnolgico para aplicar el proceso de Biorremediacin en nuestras condiciones naturales, aunque debe sealarse que no existe un tratamiento de Biorremediacin nico para los suelos contaminados ya que todos difieren entre s y como tal se deben tratar.

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