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Determinacin Cuantitativa de la Hormona Estimulante Tiroidea (TSH)

Objetivos Realizar la determinacin de la TSH en una muestra de suero humano. Conocer el fundamento de un Ensayo Inmunoabsorbente Enzimtico (EIA). Determinar la importancia de la medicin de la TSH y su correlacin clnica.

Contenido Las hormonas tiroideas son los nicos compuestos que contienen yodo con actividad biolgica. Poseen dos funciones principalmente. En animales y seres humanos en desarrollo, stos compuestos son determinantes esenciales para el desarrollo normal, especialmente para el sistema nervioso central (SNC), pero adems, en adultos, las hormonas tiroideas ejercen un papel en la conservacin de la homeostasis metablica, al afectar la funcin de casi todos los sistemas. Para llevar a cabo tales funciones, hay grandes reservas de hormona preformada dentro del tiroides. El metabolismo de las hormonas tiroideas se lleva a cabo, principalmente en el hgado, aunque tambin existe metabolismo local en algunos tejidos diana, como el cerebro. Las concentraciones sricas de dichas hormonas son reguladas por medio de la hormona hipofisiaria, tirotropina (TSH), mediante un sistema clsico de retroalimentacin negativa. Los principales efectos de la hormona tiroidea estn mediados por la unin a receptores de hormona tiroidea nuclear, as como por la regulacin de la transcripcin de genes especficos. A ste respecto, las hormonas tiroideas comparten un mecanismo de accin con las hormonas esteroides, vitamina D, y retinoles, cuyos receptores conforman una superfamilia de receptores nucleares. Hasta 1980 en que se pudo disponer de tecnologa que permita la preparacin comercial de anticuerpos monoclonales, no se contaba con un mtodo realmente fiable para la valoracin de la TSH, primeramente por tcnicas de RIA y ms adelante por tcnicas de quimiofluorescencia. Entre 1960 y 1980 se utilizaron tcnicas tambin de inmunoanlisis pero poco sensibles (tcnicas de 1 generacin). En 1980 se incorporaron las tcnicas de 2 generacin. A partir de 1990 se dispone ya de tcnicas denominadas "ultrasensibles" que permiten valorar niveles de TSH en sangre de 0.01 microunidades/mililitro, son las tcnicas de 3 generacin. Con este nivel de sensibilidad, la valoracin de TSH se ha convertido en el mtodo ms valioso para el estudio de las alteraciones funcionales tiroideas, tanto en lo que respecta a las situaciones de hiperfuncin, como a las de hipofuncin. Valoracin de los Niveles Sanguneos de TSH Si se define la "situacin de disfuncin tiroidea preclnica" como una fase en la que se aprecian alteraciones en las valoraciones hormonales en sangre, sin que el paciente llegue a advertir ninguna alteracin que le resulte extraa, aunque cuando el clnico profundiza las encuentra. El nivel de sensibilidad del sistema de regulacin hipotlamo-hipofisario es tan exquisitamente preciso que las variaciones del nivel de TSH en sangre reflejan con absoluta precisin la demanda o saturacin del organismo en hormonas tiroideas. Mientras que no se disponga de nuevos marcadores, la TSH es el elemento ms til que permite identificar disfunciones tiroideas antes de

que el paciente llegue a sentirse mal, a veces incluso antes de que llegue a preciar ninguna molestia. Es el diagnostico de lo se ha denominado como "Estados Preclnicos". Las unidades en las que se mide la TSH son: microunidades/mililitro (UI/ml) o miliunidades/litro (mUI/l). Se han considerado durante tiempo como valores normales de 0.1 a 5.0 UI/ml. Todava muchos laboratorios dan este rango de normalidad, pero si queremos diagnosticar Estados o Situaciones Preclnicas tenemos que afinar un poco ms. Consideramos como valores normales entre 0.4 y 4.0 UI/ml. Quiz haya que establecer el lmite superior de la normalidad en 3.0 UI/ml y Wickham en un estudio de seguimiento de pacientes durante aos encontr un aumento de riesgo de hipotiroidismo en personas con niveles sricos de TSH > 2.0. En el nivel bajo un valor de 0.1 UI/ml es ya sospechoso de una situacin de Hipertiroidismo subclnico aunque el resto de los valores hormonales sean normales. Estableceramos, por tanto, la siguiente tabla de valores para la TSH. Niveles de TSH en Diversas Situaciones Funcionales TSH UI/ml Situacin Funcional 0.1 o menor Probable Hiperfuncin 0.2 a 2.0 Rigurosamente Normal 2.0 a 4.0 Situacin Dudosa (mantener control) 4.0 a 10.0 Hipotiroidismo Subclnico Mayor de 10.0 Hipotiroidismo Clnico

Una TSH de 0.1 UI/ml o inferior puede indicar un Hipertiroidismo, si se acompaa de elevacin de las hormonas tiroideas, o un Hipertiroidismo Subclnico si estas son normales. Tambin se puede encontrar estas cifras en pacientes hipotiroideos que estn tomando ms medicacin de la que realmente precisan; sera en este caso un Hipertiroidismo Iatrognico, es decir, inducido artificialmente por la medicacin. Pero pueden encontrarse tambin estos valores en personas con un "Ndulo Inhibidor" en una Hiperplasia Multinodular o con un Adenoma Funcionante Inhibidor. Al hablar de Situaciones Preclnicas se refiere a circunstancias en que los niveles de hormonas tiroideas en sangre son normales o lmites. Cuando los niveles de hormonas tiroideas son anormales ya se habla de Situaciones Clnicas, pues generalmente se acompaan de sntomas (las molestias que siente el paciente) y signos (los datos que recoge el mdico por observacin o exploracin) de carcter anormal. Utilidad de la TSH en el Control del Tratamiento de Disfunciones Tiroideas La actuacin mdica, tanto en el control del Hipertiroidismo, como en el del Hipotiroidismo, pretende mantener los niveles de hormonas tiroideas dentro de sus lmites normales. Las variaciones de la TSH son un ndice ms sensible que la propia determinacin de las hormonas tiroideas. En el tratamiento de un Hipertiroidismo con medicacin antitiroidea (que acta bloqueando la organificacin del yodo en el tiroides), lo ideal es mantener la TSH entre 0.2 y 2.0 UI/ml. Si la TSH persiste en 0.1 UI/ml o por debajo de esto, el bloqueo de la produccin hormonal tiroidea es insuficiente. Una elevacin de la TSH por encima de 2.0-3.0 UI/ml indica que el bloqueo puede ser excesivo y permite rebajar la dosis de antitiroideos. El tratamiento del Hipertiroidismo es para el Endocrinlogo o el Medico General un fino trabajo de artesana y por que no decir que un arte, manteniendo el

equilibrio de la funcin tiroidea con suaves movimientos de timn en la dosis de medicacin antitiroidea. Y la brjula que permite ajustar el rumbo es la TSH. Nunca se debe de prescindir de la valoracin de la TSH en el control del Hipertiroidismo. Y nunca puede el paciente considerase curado hasta que su mdico no le da de alta. Abandonar el tratamiento prematuramente solo conduce a una recidiva y a un volver atrs. En el tratamiento del Hipotiroidismo la situacin es parecida, solo que a la inversa. Aqu se trata de complementar al paciente con hormona tiroidea tambin en la medida justa, si la dosis de L-Tiroxina es baja la TSH persistir elevada y si es excesiva la TSH se aproximar a 0.1 UI/ml indicando que se est produciendo una situacin de sobredosificacin y pueden aparecer un Hipertiroidismo Iatrognico o inducido. Muestra: Tomar una muestra de sangre en tubo seco y centrifugarla para obtener el suero. Mtodo: Ensayo Inmunoabsorbente Enzimtico ELISA. Fundamento: El TSH-EIA es un inmunoensayo sndwich de un solo paso. Un anticuerpo monoclonal especfico para la cadena- de la TSH, es recubierto en las paredes de los pozos de microtitulacin como receptor de anticuerpos y conjugado de peroxidasa de rbano y anticuerpos policlonales anti-TSH se agrega como trazador en el ensayo sndwich. Las muestras a ensayar y estndares de referencia reaccionan simultneamente con los anticuerpos receptores y trazadores en los pozos. Despus de incubacin, se forma un complejo especfico de anticuerpo TSH enzima y anticuerpo conjugado. Se lavan los materiales no ligados y se agrega solucin de sustrato en cada pozo para desarrollo de color. La intensidad del color en el pozo es proporcional a la cantidad de TSH en la muestra. El Inmunoensayo es una prueba que usa complejos de anticuerpo y antgeno como medio para generar un resultado perceptible. Un complejo anticuerpo-antgeno tambin es conocido como inmuno-complejo. "Inmuno" se refiere a una respuesta inmunolgica que hace que el cuerpo genere anticuerpos, y "ensayo" se refiere a una prueba. Entonces, un inmunoensayo es una prueba que utiliza inmunocomplejos cuando se unen los anticuerpos y los antgenos. Los Inmunoensayos se diferencian de otros tipos de pruebas de laboratorio, como las pruebas colorimtricas, ya que usan complejos anticuerpo-antgeno para generar una seal que pueda medirse. En oposicin, la mayora de las pruebas de rutina de qumica clnica utilizan reacciones qumicas entre el reactivo (solucin de sustancias qumicas u otros agentes) y la muestra del paciente para generar un resultado de la prueba. Los inmunoensayos utilizan un anticuerpo selecto o ms para detectar analitos de inters. Los analitos que se miden pueden ser aquellos que estn presentes en el cuerpo naturalmente (como por ejemplo una hormona tiroidea), aquellos que el cuerpo produce pero no estn tpicamente presentes (como por ejemplo un antgeno de cncer), o aquellos que naturalmente no existen en el cuerpo (como por ejemplo una droga de abuso). Los anticuerpos poseen una alta especificidad y afinidad para un antgeno especfico. Es la unin especfica de un anticuerpo a un antgeno lo que permite la deteccin de analitos por medio de una variedad de tcnicas de inmunoensayo. Las categoras de las tcnicas de Inmunoensayo son: No competitivos y Competitivos, e inmunoensayos Homogneos y Heterogneos. Todos los inmunoensayos requieren el uso de material marcado para medir la concentracin de antgeno o anticuerpo presente. Una marca es una molcula que reacciona como parte del ensayo, por lo tanto un cambio en la seal puede medirse

en la sangre. Los ejemplos de marcas incluyen un compuesto radioactivo, una enzima que hace que cambie el color de una solucin, o una sustancia que produzca luz. La marca puede aplicarse durante la fabricacin del reactivo tanto al anticuerpo como al antgeno. La tcnica aqu utilizada es no competitiva (sndwich). Los formatos de ensayo no competitivos generalmente proporcionan el nivel ms alto de sensibilidad y especificidad del ensayo y se aplican a la medicin de analitos crticos. Se conoce como ensayo sndwich ya que el analito est unido (como un sndwich) entre dos reactivos de anticuerpo muy especficos. En los ensayos no competitivos, la medicin del analito marcado, generalmente un anticuerpo, es directamente proporcional a la concentracin de antgeno presente en la muestra. Esto puede representarse por medio de una curva de respuesta a la concentracin.

El eje X traza la concentracin de un antgeno. El eje Y traza la respuesta, que en este caso se trata de la seal. As, cuanto mayor sea la cantidad de antgeno presente, ms anticuerpos marcados se unirn. Metodologa Materiales Todo lo necesario para la toma de muestras. Tubos tapa amarilla. Pipeta automtica 50l. Gradilla. Puntas.

Reactivo Equipo Lector de ELISA con filtro de 450nm. Incubadora a 37C. Kit de TSH.

Procedimiento Remueva el nmero apropiado de tiras de micropozos de la bolsa y reactivos necesarios para una previa atemperacin. Asegure que las tiras restantes sin utilizar permanezcan en la bolsa bien sellada y que regresen al refrigerador. 1. Agregar 1 gota o 50 m l de cada uno de los estndares, suero control y muestras en sus respectivos pozos. 2. Agregar 2 gotas o 100 m l del conjugado enzimtico a cada pozo. Complete las adiciones dentro de los 5 minutos siguientes. Mezclar suavemente por rotacin de la placa evitando la formacin de burbujas. Selle con parafilm o de otra manera e incube a 37C en un bao de agua por 30 minutos a 1 hora. 3. Remueva la covertura. Decante o aspire el sobrenadante de cada pozo. No raspe el fondo de los pozos. Seque por inversin de los platos y golpee vigorosamente en un papel absorbente para remover el exceso de fluido. 4. Lavar cada pozo 5 veces con solucin de lavado diluido. Despus de cada lavado desocupe completamente los pozos como se describi en el punto anterior. No deje que los pozos se sequen. 5. Agregue 2 gotas o 100 m l de solucin TMB sustrato a cada pozo. Complete las adiciones dentro de los 5 minutos siguientes. Mezclar suavemente, cubra el plato e incube a temperatura ambiente (22- 25C ) durante 15-30 minutos. 6. Agregar 2 gotas o 100 m l de solucin STOP o de parada a cada pozo. Mezcle suavemente evitando salpicaduras. 7. Realizar un blanco del lector de ELISA, utilizando un pozo de control blanco o con aire. Leer los valores de Densidad ptica (absobancia) en todas las muestras a 450nm en no ms de 30 minutos del paso anterior. 8. Prepare la curva estndar, dibujando las absorbancias en el eje Y contra la concentracin en el eje X de los estndares sobre una grfica de logaritmo lineal en papel milimetrado. 9. Las muestras con concentracin de TSH mayor de 40 m UI/ml deben ser exactamente diluidas con el Standard de 0.0 m UI/ml y re-ensayarse si se necesita de un valor exacto. Valores Esperados 105 muestras de suero de voluntarios normales (hombres y mujeres) fueron ensayados con el kit TSH ELISA, y los valores normales arrojaron un rango entre 0.4-6.05 m UI/ml. La media fue 2.17 m UI/ml. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores de TSH normal. Interpretacin de resultados A continuacin se presentan los resultados de una corrida estndar tpica. TSH UI/ml 0 0.5 2.5 5.0 10 20 D.O 450nm . 0.040 0.123 0.221 0.435 0.810 1.525

40 Evaluacin

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Teniendo en cuenta lo aprendido y consultando la bibliografa desarrolle las siguientes preguntas: 1. Enumere 5 causas de hipotiroidismo e hipertiroidismo. 2. Esquematice el flujo de informacin en el eje Hipotlamo-Hipofisiario-Tiroideo implicado en la regulacin de la funcin tiroidea. 3. Describa en qu consiste el programa de deteccin de hipotiroidismo neonatal. 4. Enumere y explique otras metodologas de laboratorio diferentes a la ELISA por las cuales se pueda determinar la concentracin de TSH en muestras sanguneas. 5. Describa 10 pruebas o exmenes especializados en los cuales se utiliza la tecnologa del inmunoensayo para su medicin. Bibliografa Ref. 1 Ref. 2 Ref. 3 Ref. 4 Ref. 5 HENRY B.J., El laboratorio en el diagnstico clnico. Editorial Morbon. 2001. pg. 309 313. ESCOBAR. I.D., Mtodos diagnsticos en Medicina Clnica. Editorial Celsus. 2007. Seccin 11, Cap. 2. BEAS. F., Endocrinologa del nio y del adolescente. Editorial Mediterraneo. Segunda Edicin. 2002. Cap. 10 y 11.
http://www.abbottdiagnostics.es/ciencia/pdf/1_d.pdf

GREENSPAN F. S. Gardner G.D. Endocrinologa Bsica y Clnica. Manual Moderno 2005. Cap.7.