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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONIA PERUANA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS BIOMEDICAS Y BIOTECNOLOGIA PRACTICA DE LABORATORIO DETERMINACION

DE pH y SOLUCIONES BUFFER ACIDOS Y BASES Entender la química Ácido-Base es fundamental si queremos comprender las propiedades de las moléculas biológicas. Una gran cantidad de los metabolitos de bajo Peso Molecular de los componentes macromoleculares de las células !i!ientes" son #cidos bases por ello son capaces de ioni$arse. %as cargas eléctricas de estas moléculas son importantes" en la estabilidad conformación de las proteínas" en la !elocidad de las reacciones catali$adas en$im#ticamente" en las interacciones entre macromoléculas entre éstas con peque&os iones" en las técnicas analíticas de purificación utili$adas en el laboratorio. 'uando un #cido pierde un protón" se produce una B()E. El #cido original la base resultante se define como un par ('*+, - B()E conjugado. %a sustancia que acepta el protón es otra base que al aceptar el protón se transforma en un ('*+,. Por tanto cualquier ioni$ación de un #cido o una base" est#n implicados dos pares ('*+, - B()E conjugadas. -( . B (cido Base +ébil 'onj. ( . -B (cido Base 'onj. +ébil

pH y pOH Por definición" el p- es el logaritmo negati!o de la acti!idad del ion /idrógeno" de manera similar el p,- es el logaritmo negati!o de la concentración de la acti!idad de iones /idro0ilo. Pero en la pr#ctica se toma generalmente la concentración de ion /idrógeno a que la concentración acti!idad son pr#cticamente los mismos" e0cepto en soluciones fuertemente #cidas. p- 1 - log p,- 1 - log ,(mbas ecuaciones se utili$an para calcular el pel p,- de (cidos Bases fuertes.

+E2E3M*4('*,4 +E% pEl p- de una sustancia líquida se puede determinar mediante5 Papel indicador de p-. )olución indicadora de p-. Potenciometría. E% p- 6 %( 7*+( %a ma oría de las células pueden funcionar 8nicamente dentro de límites estrec/os de p- por lo tanto" requieren de sistemas amortiguadores que se opongan a los cambios de p- que de otra forma ocurrirían a causa del metabolismo. Entre los grupos débiles de #cidos bases presentes en estos compuestos" los m#s comunes son los grupos amino carbo0ilo. %os grupos fosfato est#n distribuidos mu ampliamente encontr#ndose en constitu entes celulares tan di!ersos como a$ucares fosfato" (c. 4ucleico"

de la sangre. A. -... C. SISTEMA AMORTIGUADOR BICARBONATO-ACIDO CARBONICO Es el amortiguador m#s importante del plasma" también est# presente en el eritrocito pero en ma or proporción.alrededor de B.><"DE F E"GC F <="AC? %os p:a est#n considerados en condiciones similares a las del citoplasma.A>#cido? -P. en el p.A1 . C--=P. El grado de ioni$ación de las drogas est# dado por el par#metro p:a. bicarbonato Carbónico . %a ma oría de las drogas utili$adas son #cidos o bases org#nicos débiles" o sea que est#n parcialmente ioni$adas en el agua.-emoglobina >-b? @. %os fluidos intra ó e0tracelulares de los organismos !i!os contienen pares conjugados (cidosBases" los cuales act8an como tampones al p.normal de dic/os fluidos. El sistema que inter!iene en amortiguamiento de #cidos se muestra en el ejemplo de --'. Este amortiguador es sumamente efica$ para amortiguar -. El tampón fosfato es el tampón intracelular m#s importante. pero cuando la sustancia esta en solución" dic/a ioni$ación depende también del p.Prot . -.@5 --'. -='C@ Ion Acido. El amortiguador fosfato reacciona con #cidos con bases como sigue5 -P.@ b#sicos )in embargo esta función es insignificante si se compara con la de los sistemas amortiguadores de -b@ -'.C? resultan de interés particular dado que pueden estabili$ar el p. SISTEMA AMORTIGUADOR DE PROTEINAS DEL SUERO %a capacidad amortiguadora de las proteínas depende del n8mero de grupos #cidos en las moléculas" el cual !aría con el p-.A? es un ejemplo" este #cido tiene C@ grupos ioni$ables. %os fosfatos org#nicos tales como la glucosa-E-fosfato el (2P contribu en también a la capacidad de tamponamiento en la célula. -=C >base? Este sistema tiene importancia en la eliminación de #cidos en la orina" como se e0plica en el mecanismo de compensación renal.@.@.A?. El #cido fosfórico >-@P.A1 . +ado que las sales del #cido fosfórico los deri!ados de fosfatos est#n presentes en las células en cantidades considerables" se deben esperar que sean importantes en el mantenimiento del p. Prot. %os principales sistemas tampón en los seres !i!os son5 <. -. 9osfato.de la célula.Bicarbonato A.fisiológico >de p.mu importantes. -'. %a ubicuidad de los fosfatos inorg#nicos fosfoésteres org#nicos /acen de ellos tampones biológicos de p.A. SISTEMA AMORTIGUADOR FOSFATO %os #cidos que tienen su p:a cercano al p.de la solución de acuerdo con la ecuación de -enderson--asselbalc/. -=P.Proteínas =.9osfolípidos muc/as en$imas.B. B.@ . --'.fisiológico" >p.

J I(-J I-(J Es decir" que e0iste una relación constante entre las concentraciones de -(" -.=?.= una disminución en p. por este grupo es afectado por el grado de o0igenación de la molécula de -b.@-" respecti!amente" a medida que necesita.= . I(-J +e acuerdo con la le de acción de las masas" la constante de disociación >:a? se define como5 :a 1 I-. %a -b tiene acción amortiguadora efecti!a a causa de su presencia como #cido libre como sal5 -b.= -' 11 ' -b El sistema amortiguador de la -b amortigua principalmente el -='. El bicarbonato puede ser eliminado o preser!ado por acción del HMecanismo de compensación renalH.en el equilibrio.J . ambas son el resultado de la función del mecanismo de la respiración.=-F--b.%a eficiencia del amortiguador de bicarbonato se basa en su alta concentración en el /ec/o de que el -='C@ puede ser eliminado como '. %a acción amortiguadora m#s importante de la -b" sin embargo" es la aceptación de protones >-. -='. por el grupo imida$ol. El grado de aceptación de -. D.B Mm de -. %a eliminación de . (sí los pulmones los ri&ones aumentan la eficiencia del amortiguador bicarbonato suministrado o eliminando --'. como -b deso0igenada >-b? en forma de sus sales pot#sicas >:-b. m#s fuerte" p: E.? por el grupo imida$ol de /istidina en la molécula de -b. 6 (.@- DETERMINACION DE pk %os #cidos bases débiles en soluciones se ioni$an parcialmente se obtiene por lo tanto un !erdadero equilibrio entre del #cido la base conjugada o la base el #cido conjugado. de la solución.@ producidos mediante los procesos metabólicos. -'.= .D? da por resultado la separación de -. %a importancia del sistema aumenta por el /ec/o de que un aumento de P'. SISTEMA AMORTIGUADOR DE HEMOGLOBINA (Hb) %a /emoglobina >-b? est# presente en la sangre como /emoglobina o0igenada >en general es designada como o0i/emoglobina ó -b.= -b-F--b.B? en --b >(c. .= del /ierro de -b da por resultado el aumento en la !elocidad de aceptación de -.@ -'.=" permitiendo así que sean aceptados m#s iones de -idrógeno por el grupo imida$ol.= que se disocia de -b" son eliminados C. %a transformación de --b.= de la --b.@ --b . .= :-b?.=.= >(c. ' 4 4 . Por cada mM de . m#s débil?" p: B. 4 ' 4- -' 111 ' -b.fa!orecer#n la disociación del . )i -( representa un #cido débil" entonces5 I-(J I-. de la solución conforme a la siguiente ecuación5 -b.

. Un tampón #cido contiene un #cido débil una sal de éste >base conjugada?" un tampón b#sico contiene una base débil una sal de la base débil >#cido conjugado?.inicial de trabajo. 9uera de este rango" disminu e r#pidamente..de una solución para un proceso bioquímico" debe /acerse con los siguientes criterios5 Escoger el buffer de modo que su p:a" a la temperatura de trabajo" esté mu pró0imo al p.es igual al p: del #cido componente. %a E !" #$% &' H'%&'()*% .al cual se !a a trabajar..o tampón es una sustancia o me$cla de sustancias que permite a las disoluciones e!itar grandes cambios en el p. Proporción de sal >Base conjugada?F#cido. (quella me$cla que tenga una proporción IBase conjugadaJFI#cidoJ igual a <" tiene el óptimo tamponamiento contra #cidos fuertes bases fuertes su p.en el cual el LC M del #cido est# disociado. %as me$clas son una preparación I(JFIBJ entre C. %a Elección de un tampón para estabili$ar el p.J 1 : p.1 p:b . +e la ecuación de la constante de disociación : se deduce que" cuando el #cido se /alla disociado en un LC M I-(J 1 I(-J.cae entre < unidad por arriba" por abajo del pKa del #cido componente.de una disolución de esta base débil.H"))'+b" . Utili$ando la Ec.inicial. log I(-J I-(J p. si el p. %os #cidos bases débiles en solución se ioni$an parcialmente se obtienen por lo tanto un !erdadero equilibrio entre el #cido la base conjugada o entre la base el #cido conjugado" para estos casos se puede deducir una e0presión mu 8til que relaciona5 %a constante de disociación >p:a? del #cido débil -( el p. p. u . %as sustancias que !an a emplearse deber ser /idrosolubles con un alto grado de pure$a" a fin de e!itar efectos o reacciones espurias.1 p:a . de -enderson--asselbac/ se puede deducir que el p.!a a descender durante el proceso bioquímico" escójase el buffer cu o p:a sea algo menor que el p.!a a aumentar" el p:a debe ser algo ma or que el p.cuando se adicionan peque&as cantidades de iones -. %a constante de disociación >p:b? de una base débil el p.a la disolución.-J SOLUCIONES AMORTIGUADORAS (TAMPON O BUFFER) Un regulador de p. %as soluciones amortiguadoras corrientes contienen dos sustancias" un #cido una base conjugada.'omo para los #cidos bases débiles m#s usuales" los !alores de : suelen ser bajos" en consecuencia" se recurre a utili$ar el pK" concepto que se define por analogía" como el logaritmo de : con el signo cambiado5 p: 1 . )i se espera que el p.< <C" tiene un tamponamiento significati!o su p.de una disolución del #cido débil. log IB-J IB.de una solución buffer depende de5 7alor del p:a.-.1 p: Por lo tanto" puede definirse el p: como aquel p.log : recíprocamente5 : 1 <CPK En la escala del p:" los #cidos débiles suelen tener !alores inferiores a B las bases débiles" superiores a B. 'uanto m#s fuerte es un #cido" menos es el !alor de p:. En consecuencia5 I-.

G <=.A .rina Potenciometro" Buretas " )oporte Uni!ersal" placas petri peque&as. 4a-=P.ETIVOS DE LA PRACTICA/ (l final de la pr#ctica el estudiante ser# capa$ de5 Preparar una solución tampón aplicando la Ec.= a partir de las sales5 4a=-P. (cético A. BeaKers" Pipetas" Erlenme er" tubos de ensa o.= M PB) p. R'" 2#3*) 4a=-P.@ -EPE)>)ulfato de 4-= -idro0iMetilpepera$ina 4-= etano B.requerido. 'alcular el p.4 .A.E OB.B. de -enderson . )i las sustancias empleadas interact8an con cationes" aniones o tienen efectos salinos" éstos deben ser mínimos bien conocidos. 4a-=P. .preparar LC ml de una solución de C.G L.G 23*)>4-tris>-idro0imetil? amino Metano? G. 4o deben absorber lu$ en las regiones !isibles ni U7. %a composición real del tampón requerido se puede calcular apro0imadamente usando la Ec.A. 9osfórico <.A (c. +eben tener adecuada Hcapacidad bufferH en el rango de p.< A.A <C. -idró0ido de sodio C"<4. @Estos materiales son de responsabilidad de los alumnos. BUFFERS USADOS EN BIO-UIMICA -----------------------------------------------------------------('*+. de -E4+E3).< (c.DE E. 'arbónico E. PROCEDIMIENTO E0PERIMENTO 45 (plicando la Ec. de -enderson .@ Nlicil Nlicina @. 'ítrico @.A. -'l C.-asselbac/ la concentración de sus componentes elegidos para obtener una me$cla de capacidad de taponamiento eficiente como para ser capa$ de mantener un pconstante durante el curso del e0perimento.< 4.de algunas fluidos biológicos PARTE E0PERIMENTAL Materiales 19luido biológico5 )ali!a . +eben ser sustancias químicas en$im#ticamente estables.En la elaboración de un buffer no deben usarse sustancias citotó0icas o que tengan acción in/ibidora de en$imas.-asselbalc/. B()E p:a< p:a= p:a@ -----------------------------------------------------------------(c. )i forman complejos con iones" éstos deben ser /idrosolubles.A (c.-())E%B('.

OPue relación presentan las cur!as de titulación con respecto al p:a de los #cidos débilesQ. Edit.M. '. C<-CG. Programa (cadémico de 9armacia Bioquímica. <-<. Edit. Mencione a que !alor de p. 3epetir estos procedimientos con C"< ml. <DG<.%uego" con el potenciometro" papel indicador de p-" medir el p. =T Edición..C<@.de la solución preparada. Bogot# .%. 2. (&adir C"< ml de -'l C. pp. OPorqué se dice que el fosfato el bicarbonato son tampones biológicos importantesQ. de sali!a p-. pp.<4 al agua destilada medir el p..celularQ >!ariaciones por debajo por encima de B.S" M. *ntroducción a la Bioquímica Pr#ctica.<4 a la solución preparada medir el p. McNraV--ill" %atinoamericana" ). .'olombia. =T Edición. (note todos los resultados de p. DA-<C@ Uni!ersidad 4acional de 2rujillo. <DG=. E0plique 3E9E3E4'*() B*B%*. +e un ejemplo con su respecti!a gr#fica. de /idró0ido de sodio C"<M. Principles of Bioc/emistr .como en el caso anterior. E0PERIMENTO 46 En un BeaKer peque&os poner <C ml. Medir el p.con el potenciometro. Uort/ Publis/ens.%. En cada caso analice el problema con la a uda de un esquema químico de la molécula proteica. P%UMME3" +.(.4" +.N3(9*'() %E-4*4NE3" (.alcalino uno neutroQ. %uego a&adir C"<ml de -'l C. (nalice sus resultados e interprete <C ml de orina con el potenciómetro medir el CUESTIONARIO OPué consecuencias traería un cambio en el p.@ R B.e interprete los resultados. 4eV 6orK. pp.presentan su efecti!idad m#0ima. 4E%). Manual de Pr#cticas de %aboratorio del 'urso de Bioquímica.A? O'ómo se comporta una proteína cuando tiene un medio circundante con un p. <DD@.de LC ml de agua destilada.