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EFECTIVIDAD DE LA ESTERILIZACION POR MICROONDAS DE CULTIVO DE BACTERIAS E. coli K12.

Amelia Guerrero Laboratorio de Gentica II, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes. Ncleo la Hechicera. 5101, Mrida, Venezuela. RESUMEN: Una de las vas ms frecuentes de transmisin de algunas enfermedades bacterianas es la ingesta de alimentos contaminados. Actualmente, el uso del horno de microondas para cocinar o calentar alimentos se ha popularizado bastante, debido a la rapidez en el calentamiento que brinda. Sin embargo, es importante evaluar ese efecto trmico en la sobrevivencia de bacterias potencialmente patgenas, que frecuentemente se involucran en brotes de origen alimentario. Se evalu el efecto de la irradiacin con microondas a diferentes tiempos, sobre la sobrevivencia de una cantidad conocida de E.coli K12 en medio nutritivo lquido. Esta cepa result sensible al tratamiento, sin embargo por ser una cepa que forma esporas, que son estructuras de resistencia mostro una tendencia a crecer en medio agar nutritivo, luego de la esterilizacin por microondas como resultado de una estimulacin de la germinacin. Se determin que el grado de destruccin que tienen las microondas sobre estos microorganismos depende tambin de la composicin del medio del cultivo donde se encuentre ya que el xito de la esterilizacin con microondas depende de que el calentamiento sea uniforme. PALABRAS CLAVES: microondas, E. coli K12, esterilizacin. INTRODUCCIN: Durante todos los tiempos incluyendo nuestra poca muchos de los microorganismos representan un problema de contaminacin a diferentes niveles como; salud pblica hospitalaria, alimentos, medios de cultivo entre otros. La ubicuidad de los microorganismos en el medio ambiente, la resistencia de algunos de estos a temperaturas elevadas y a sustancias antispticas hace necesaria la bsqueda de algn mtodo de esterilizacin rpido y eficiente (1). En 1862 el padre de la microbiologa moderna Louis Pasteur desarrollo los procesos de pasteurizacin (conservacin del vino, vinagre y cerveza), revolucin industrial en la alimentacin, la asepsia y la esterilizacin propiciada por los resultados de sus trabajos (2). La esterilizacin: es un mtodo por el cual se logra la destruccin total de grmenes, esta no admite grados, tiene que ser absoluta y se puede llevar a cabo mediante varias tcnicas: a) por vapor (autoclave) con una presin de 18 a 20 libras y una temperatura de 121 C por 30 minutos, esterilizndose por este mtodo materiales de fibra de algodn, vidrio, goma, acero quirrgico, madera, teniendo cuidado con materiales de plsticos sensibles al calor. b) por calor seco (horno) usando 180 C por 30 minutos para la esterilizacin de pipetas y cristalera que se utiliza en laboratorios as como instrumental de ciruga; c) por ebullicin de agua para esterilizar instrumentos, suturas resistentes al calor,

no utilizndose para indumentaria de fibra de algodn y d) por sustancias qumicas (formaldehdo) para esterilizar objetos termosensibles. Por otra parte La desinfeccin, es un mtodo por el cual se realiza un control de la carga bacteriana sobre una superficie, piel, muebles, pisos, paredes, techos, aparatos de manejo y locales para alojamiento de los pacientes (1). Otro de los mtodos de esterilizacin usada, es el horno microondas, generalmente utilizado para la esterilizacin de alimentos, mediante el cual se reducen o eliminan las bacterias de los alimentos para el consumo humano o animal, aumentando el periodo durante el cual pueden ser conservados, esta tcnica comprende un tipo de tratamiento que utiliza microondas generadas a la frecuencia convencional de 2,450 MHz (3). En este sistema, energa y radiacin son interdependientes y las microondas al ser aplicadas hacen rotar a las molculas polares a gran velocidad, aproximadamente 2 450 000 000 veces por segundo. Esta vibracin genera una friccin en todas las molculas cercanas, lo cual produce una elevacin trmica en toda la masa irradiada en forma simultnea en cuestin de segundos a minutos dependiendo de la potencia aplicada (4). MATERIALES Y MTODOS: Para esta experiencia se prepara medio nutritivo lquido para realizar un cultivo de E.coli K12, luego partiendo del cultivo madre, preparar 5 tubos estriles con 8x1010 UFC en 100 ml del cultivo en cada tubo, cada uno de estos tubos se rotula a diferentes tiempos t0, t1, t2, t3, t4. Cada tubo tendr un tiempo de duracin en el

microondas para la esterilizacin, que se muestra a continuacin:

TUBO

TIEMPO DE DURACION EN EL MICROONDAS

t0 t1 t2 t3 t4

0 segundos 52 segundos 62 segundos 72 segundos 92 segundos

Luego de sacar cada tubo del microondas se realizan diluciones (900 microlitros de agua y NaCl 0,8 % y 0,1 ml de muestra) desde 10-1 a 10-5 y de cada una de estas diluciones se toman 20 microlitros y se siembran en placas con agar nutritivo previamente preparadas, se colocan en la estufa a 37C por 24 horas. Luego se realiza el conteo de las colonias y se determina al microttulo.

RESULTADOS: TABLA 1: La siguiente tabla muestra el nmero de colonias que crecieron de las diferentes diluciones de los cultivos luego de la esterilizacin por microondas a los diferentes tiempos.

T u b o

t0

Tie mpo s de ester iliza cin (seg) 0

Diluci n 10 -2

Dilu cin 10 -3

Dil uci n 10 4

Diluci n 10 5

Disminucin de la densidad poblacional a medida que aumenta el tiempo de esterilizacin

25 20

***

***

***

t1

52

t2

62

2 colonia s (104UF C) 1 colonia (0,5X10 4 UFC) ***

***

22 colonia s (1,1X1 08 UFC) *** ***

15 10 5 0 t(0) t(1) t(2) t(3) t(4)

***

***

***

t3

72

***

***

***

GRAFICO 1: el grafico muestra la disminucin de la densidad poblacional a medida que aumenta el tiempo de esterilizacin en el microondas. En el eje X tenemos el nmero de colonias de E.coli K12 que crecieron en el agar nutritivo luego de la esterilizacin y en el eje Y el tiempo de esterilizacin. DISCUSIN:

t4

2 *** *** *** colonia s (104UF C) *** No hubo crecimiento bacteriano

92

Luego de la experiencia se obtiene que la poblacin bacteriana disminuyo un 99,9% al esterilizar en el microondas durante 92 segundos, es decir que la esterilizacin por microondas en bastante efectiva. El 0,1% de la poblacin bacteriana que crece luego de la esterilizacin, est representado por las estructuras de resistencia. Se reporta que en Bacillus cereus, las esporas no pueden ser destruidas en su totalidad en un horno de microondas de tipo casero, por el contrario, es capaz de estimular la germinacin de las esporas hasta llegar a un aumento en el recuento final. (5) Sin embargo, los intentos hechos hasta ahora en el campo de las microondas a

escala industrial no han podido desarrollar un mtodo de pasteurizacin continua por el que los productos alimenticios envasados no pueden ser sometidos a un calentamiento uniforme y estable a travs de toda la superficie del horno; tampoco la esterilizacin ha tenido xito, ya que el nivel de temperatura requerido tiende a producir una presin de gas interno de un orden que a menudo causa el estallido del envase. (3) BIBLIOGAFIA: (1) Risco, G., Koga, Y., Fernndez, D., Tinoco, R., Alvarado, A., Villacorta, K. El horno microondas en la esterilizacin de material de fibra de algodn. Bioservice SRL, Lima 35, Per. (2) Martnez, M.C. (2005). Louis Pasteur en Espaa. Siglo XIX [versin I.S.S. No 0210-8615] ILUIL, vol. 28, 2005, 107129.

(3) Barilla, G. (1996). Un mtodo para pasteurizar y esterilizar materias alimenticias utilizando micro-ondas y un horno para llevar a cabo tal mtodo. Oficina Espaola de Patentes y Marcas. N de publicacin: ES2088875. (4) Castillo, C. (1998). Efecto de la radiacin de las microondas de 2450 MHz sobre la viabilidad, ultraestructura y actividad enzimtica de Candida albicans. (5) Castro, V., Arias, L., Anliln, F., Jimnez, M. (1997). Efectos del microondas sobre la sobrevivencia de algunas bacterias patgenas en comidas populares costarricenses. [Versin ISSN 0253-2948] Revista costarricense de Ciencias Mdicas, vol. 18. No. 2. San Jos. Jun. 1997.

RASGOS MONOGNICOS COMO UNA PRIMERA APROXIMACIN PARA EL ESTUDIO DE GENTICA DE POBLACIONES HUMANAS. Amelia Guerrero Laboratorio de Gentica II, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes. Ncleo la Hechicera. 5101, Mrida, Venezuela.

LOS TRANSPOSONES Amelia Guerrero Laboratorio de Gentica II, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes. Ncleo la Hechicera. 5101, Mrida, Venezuela.

Quiero que me hablen del descubrimiento de los transposones en maz y del porqu los hallazgos de Brbara MacClintock son los mismos en esencia que los que posteriormente fueron evidenciados en Bacterias.

CARACTERIZACION DE PLASMIDOS DE RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS DE DIFERENTES CEPAS. Amelia Guerrero Laboratorio de Gentica II, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes. Ncleo la Hechicera. 5101, Mrida, Venezuela. RESUMEN: Loa plsmidos le confieren a las bacterias gran variedad de propiedades que les confieren mayor capacidad de adaptacin para conquistar nuevos nichos, entre ellos la resistencia a antibiticos, que han generado gran problemtica hospitalaria. Es por esto de gran importancia caracterizar cada una de las cepas, para saber con exactitud a que antibitico presenta sensibilidad cada una de ellas y as saber cmo actuar ante una emergencia hospitalaria o en nuestro caso, saber que cepas usar como donadora o receptora al momento de realizar una conjugacin en el laboratorio. En el siguiente trabajo se determin las resistencias y sensibilidades de 28 cepas de la coleccin del Laboratorio de Gentica II de la Universidad de Los Andes, Mrida Venezuela. PALABRAS CLAVES: resistencia, plsmidos, antibiticos, bacterias. INTRODUCCION: La resistencia bacteriana a antibiticos es un fenmeno creciente con implicaciones sociales y econmicas enormes dadas por el incremento de la de la capacidad infecciosa causando gran porcentaje de mortalidad y aumento de los costos de los tratamientos y de las largas estancias hospitalarias generadas. Existen gran variedad de factores que han contribuido a su aparicin como: la presin selectiva ejercida al prescribir formal o libremente medicamentos para uso teraputico en humanos o animales, la utilizacin generalizada de antimicrobiano, uso de dosis o duracin inadecuada de la terapia antimicrobiana, el desconocimiento de los perfiles de sensibilidad de los diferentes microorganismos (1). La vigilancia de la resistencia bacteriana se ha realizado, en la mayora de los casos, con microorganismos aislados de muestras clnicas; sin embargo se debe estudiar a las bacterias aisladas de muestras ambientales a fin de conocer su posible papel como reservorio de genes codificadores de resistencia y su capacidad para transferirlas horizontalmente mediante la transferencia de plsmidos a las bacterias patgenas humanas transferencia de transposones (2). . La caracterizacin bacteriana es un til y comn procedimiento en laboratorios de microbiologa o en ceparios, manteniendo as un seguimiento de las caractersticas genticas de una bacteria, evidenciadas a partir de su fenotipo, sirviendo en la confirmacin de genotipos y tambin en casos en los que se desconoce el genotipo, pruebas de este tipo dan una aproximacin para

determinar el posible genotipo de la cepa, al menos en algunos marcadores. METODOLOGA: Preparacin de las cepas: Se tomaron cepas de la coleccin del Laboratorio de Gentica 2, de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Los Andes Mrida- Venezuela, estas deben ser refrescadas para el momento del procedimiento. Las cepas utilizadas son las siguientes: 132, DH5, VE797, VE777, TAQ0, PBS, 120, PUC19, TAQFrance, 16*, 280, XL1BLUE, NG1, NG2, 332, 4*, XC3, 303, 134, OEG100, 22*, PUC18, VE798, 356, Trf2, 291, 263, CI857, cepa1. Preparacin de los medios de cultivo diferenciales: Se preparan 7 placas control de agar nutritivo y porcada antibitico. Es decir; 7 placas con ampicilina (100g/ml), 7 placas con tetraciclina (10g/ml), 7 placas con estreptomicina (100g/ml) y 7 placas con canamicina (15g/ml). Luego se siembra cada una de las cepas en cada una de las placas con los diferentes antibiticos y las placas control y se dejan a 37C durante 18 horas aproximadamente y se toma nota de las cepas que crecieron y las que no crecieron en cada uno de los antibiticos, en las placas control todas las cepas deben crecer.

RESULTADOS: TABLA 1: en esta tabla se muestra todas las cepas que se caracterizaron con los diferentes antibiticos. Se indica con (-) la sensibilidad al antibitico y con un (+) la resistencia. CEPA 132 DH5 VE797 VE777 TAQ0 PBS 120 PUC19 TAQ France 16* 280 XL1BLUE NG1 NG2 332 4* XC3 303 134 OEG100 22* PUC18 VE798 356 Trf2 291 CI857 CEPA 1 DISCUSIN: Los resultandos mostrados en la tabla 1 describen las cepas que crecieron en medios con antibitico, teniendo en casi Kn + + + Amp + + + + + + + + + + Str + + + + + + + + + + + + + + Tc + + + + + + -

todas un resultado positivo, es decir cada cepa tiene resistencia a por lo menos uno de los antibiticos, solo 7 cepas de las 29 cepas caracterizadas presentan sensibilidad a todos los antibiticos utilizados, entre las cepas sensibles est incluida la cepa 1, ya que como se sabe es la cepa silvestre de E.coli, es decir, es una cepa poco modificada genticamente en comparacin con el resto de cepas de E. coli por lo que su papel en este experimento ser el control negativo. Por otra parte se determin que las cepas 332 y 356 son resistentes solo a la estreptomicina y son reportadas en la bibliografa por ser Estreptomicina resistentes, es decir estas cepas portan el gen de resistencia a este antibitico. Durante la experiencia se realiz un experimento respecto a la prueba de termosensibilidad de CI857, se sembr la cepa y puestas a crecer a 30C y a 42C. A 30C no se report crecimiento alguno, es a 42C donde se observa crecimiento debido a que la cepa CI857 lleva el alelo CI857 sensible a la temperatura del gen represor del fago

lambda y que carece de la funcin de CRO lambda. La caracterizacin bacteriana es un til y comn procedimiento en laboratorios de microbiologa o en ceparios, manteniendo as un seguimiento de las caractersticas genticas de una bacteria, evidenciadas a partir de su fenotipo, sirviendo en la confirmacin de genotipos y tambin en casos en los que se desconoce el genotipo, pruebas de este tipo dan una aproximacin para determinar el posible genotipo de la cepa, al menos en algunos marcadores. BIBLIOGRAFA: (1) Sussmann, O., Mattos, L., Restrepo, A. Resistencia Bacteriana. Hospital Universitario San Ignacio. (2) Ronconi, M., Merino, L ., Gustavo, F. Caracteizacion e perfil de susceptibilidad antibitica de cepas de Enterococous aislado de la Latuca Sativa (lachuga). Chaco. Argentina.

EXTRACCION DE BACTERIFAGOS DE LA CEPA (CI857) Amelia Guerrero Laboratorio de Gentica II, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes. Ncleo la Hechicera. 5101, Mrida, Venezuela. RESUMEN: Los bacterifagos son virus que infectan exclusivamente bacterias, y por esta razn se utilizan para atacar infecciones causadas por bacterias patgenas que son resistentes a antibiticos utilizando las enzimas producidas por los fagos, es por esta y muchas otras razones la importancia del estudio de la extraccin y purificacin de los bacterifagos. En el siguiente trabajo se usa la cepa CI857 que lleva el alelo CI857 sensible a la temperatura del gen represor del fago lambda y que carece de la funcin de CRO lambda. Este episoma puede ser fcilmente transferido a la cepa de Escherichia cualquier F-y F 'coli, facilitando as la construccin y la regulacin de sistemas de expresin dependiente del promotor lambda sin el uso de profagos defectuosos. PALABRAS CLAVES: bacterifago, cepa CI857. INTRODUCCIN: En 1896 EH Hankin inform que el agua de los ros Ganges y Jumna, en la India tenan una accin bactericida que se mantena an cuando sta pasara por un fino filtro de porcelana y que desapareca si se herva. Hankin, adems, estudi este efecto en particular sobre el Vibrio Cholerae y sugiri que si se ingera sta agua, la epidemia del clera no se extendera pues en ella se encontraba la sustancia responsable de la accin bactericida. Las primeras investigaciones con fagos estuvieron relacionadas con la definicin de la naturaleza de estas partculas, sin embargo su capacidad de provocar la lisis celular de microorganismos patgenos constituy la base de muchos trabajos encaminados a su uso en medicina (1). Representando una alternativa viable como tratamiento ante bacterias resistentes a antibiticos (2). Los antibiticos han sido utilizados en forma intensa y satisfactoria, por ms de cincuenta aos. Sin embargo, se han presentado muchos problemas, que ha obligado a hacer una re-evaluacin acelerada y ms completa de la situacin. Los problemas que surgen de la resistencia bacteriana a los antibiticos y la resistencia que se transfiere a otra bacteria dentro del mismo gen o a otro gen es mucho ms complejo (3). La interesante alternativa al uso de fagos intactos para combatir a las bacterias patgenas se centra en el empleo algunos productos fgicos, como enzimas lticas codificadas por el genoma de los fagos, estas enzimas de los fagos se utilizan para destruir la pared bacteriana desde el interior de la clula infectada y as facilitar la liberacin de la descendencia fgica (4). Todo este proceso se da gracias a la activacin de los genes lticos del fago otro tipo de existencia del fago es la va lisogenica que es la existencia del fago integrado al genoma de la bacteria del modo latente y se conoce como profago (5). La cepa CI857 lleva el alelo cI857 sensible a la temperatura del gen represor del fago lambda y que carece de la funcin de CRO lambda. Este episoma puede ser fcilmente transferido a la cepa de Escherichia cualquier F-y F 'coli, facilitando as la construccin y la regulacin

de sistemas de expresin dependiente del promotor lambda sin el uso de profagos defectuosos. METODOLOGA: Para el inicio de la metodologa, se necesita el cultivo de la cepa que tiene establecido en su genoma el fago , en este caso se utiliza 100 ml de la cepa CI857. Se procede de la siguiente manera: Resuspender el cultivo en 20 ml de medio ML fresco, con mucho cuidado para no romper las clulas, mantener a 30C. Luego en una fiola con agitador magntico, se agrega de medio ML caliente a 52C, la cantidad suficiente para alcanzar 40C. Alcanzando los 40C incubamos por 15 minutos en agitacin. Luego colocar la plancha en la estufa y lo dejamos all para que alcance 37C por 2 horas. Centrifugar, obtener el pellet y resuspender en 10 ml de magnesio MgCl2 0,1M. Luego en un vaso precipitado agregar gota a gota cloroformo hasta que estalle. Se debe agregar ADNasa y ARNasa para que el moco se vuelva lquido. Centrifugar por 1 hora. Obtener el sobrenadante y luego lo purificamos.

RESULTADOS: No podemos titular el fago, pero las altas concentraciones de triptfano en la capside del fago muestran un color azul violeta a tras luz. DISCUSIN: tiene una mutacin amber que no permite que los genes lticos se expresen

BIBLIOGRAFA: (1) Fernndez, R., Puchades, Y., Vispo, N. Los Bacterifagos en la Biologa Molecular Pasada y Actual. Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa. Ave. 31 e/ 158 y 190, Playa. AP 6162, CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba. (2) Bedoya, J. (2010). Aislamiento y deteccin de Bacterifagos especficos para Pseudomonas sp., obtenidos a partir de muestras de tierra. Armenia Quindo. (3) Gauthier, R. Nuevas Alternativas en Teraputica Aviar. Jefo Nutrition Inc., St Hyacinthe, Qc, Canada, J2S 7B6.

(4) Ronda, C., Vsquez, M., Lpez, R. (2003). Los bacterifagos como herramientas para combatir Infecciones en acuicultura. Revista AquaTIC, n 18, pp. 3-10. Madrid Espaa. (5) Lewin, Benjamn. (2008). Genes IX. Mxico. Editorial mexicana.

DETECCION, PURIFICACION Y ESTRACCION DE ADN PLSMIDICO DE DIFERENTAS CEPAS BACTERIANAS Amelia Guerrero Laboratorio de Gentica II, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes. Ncleo la Hechicera. 5101, Mrida, Venezuela. RESUMEN: PALABRAS CLAVES: plsmidos, cepas bacterianas, purificacin. INTRODUCCIN: METODOLOGA: Preparacin de las cepas: Se seleccionaron las siguientes cepas para cultivarlas; PBS, TAQ0, VE777, PUC 18, PUC 19, 134, XC3, 4*, XL1 Blue, TAQ France, Tfr2R, 132, 332, CSH36, 16*, OEG100, 22*. Luego de obtener el crecimiento de las cepas se procede a la deteccin de plsmidos de cada cepa. Metodologa para la deteccin de plsmidos: Para la deteccin de plsmidos se utiliz la metodologa de Eckhard (1), consiste en un aislamiento de colonias por rayado y al obtener estas colonias nos va a permitir resuspender con un palillo en un buffer B (tris HCl 10 Mm, pH 8,2), una vez resuspendida la colonia se agrega un volumen de lisozima (20 mg/ml), esto sensibiliza la pared celular porque debilita el peptidoglican. Los cidos nucleicos se obtienen en pedazos y los plsmidos enteros y algunos en pedazos. La metodologa consiste en los siguientes pasos: 1) Cultivar los microorganismos a 0,4-0,6 unidades de absorbancia a 600nm para obtener de 4-6X108 UFC/ml. Luego llevar a 0,5 UFC/ml a 600nm. 2) Centrifugar 1,5 ml de las bacterias que estn a una D.O: 0,5UA. Centrifugamos a temperatura ambiente a 12000g x 15 segundos. 3) Se descarta el sobrenadante y nos quedamos con el pellet y lo lavamos con el buffer A (10mM Tris HCl, 1Mm EDTA, pH 8,2). Lavar 2 veces. 4) Realizar moldes con plastilina de bionalista y preparar agarosa a 2,4%. 5) Resuspender las clulas en buffer B (6mM de tris HCl a pH 8, NaCl 1M, 100mM de EDTA 0,05% tritnX-100, 0,5% SDS, 1mg/ml de lisozima) y calentar a 40C se incuba a 37C x 48 horas un cambio a las 24 horas. 6) Luego con buffer C (500 mM EDTA, 1%SDS a pH 8), lavar los cubitos con este buffer con 2 a 3 ml. Se hace dos veces y entre cada lavado se dejan los cubitos quietecitos por 5 minutos.

7) Encubar por 12 a 18 horas ms con buffer CP (es el buffer C pero con una proteinasa k, 2 mg/ml), a 50C por 12 a 18 horas. 8) Los guardamos con el buffer C diluido 50 veces y se colocan en la nevera, deben estar translucidos. 9) Luego procesamos los cubitos, se realiza una electroforesis colocando cada cubito en un pozo del gel de agarosa. Mtodo para la purificacin y extraccin de ADN plasmidico: Se trabaj dos mtodos, que en realidad es la misma metodologa pero en una se usa acetato de potasio 5M y en la otra se usa acetato de amonio 8M. la metodologa consiste en lo siguiente: 1) Luego de tener cada una de las cepas en tubos ependorf se resuspenden en 200l de la solucin 1 que contiene lisozima 4g/ml a partir de una solucin 2 mg/ ml, tambin contiene 25mM de tris HCl, 50 mM de glucosa, 10mM de EDTA, pH 8. Resuspender muy bien. 2) Se agregan 400l de la solucin 2, que contiene 0,2 M NaOH Y 1% de SDS. Resuspender muy bien pero de manera suave durante 5 minutos. 3) Agregar 200l de la solucin 3, debe estar bien fra, esta solucin es la que hace la diferencia entre los dos mtodos en uno se usa acetato de potasio 5 M y en la otra acetato de amonio 8 M. dejas durante 5 minutos. 4) Centrifugamos en frio por 10 minutos a 12000g para obtener los cidos nucleicos. 5) Luego se recupera el sobrenadante 600l y se le agrega 360l de isopropanol, esto cambia la constante dielctrica y precipita el ADN. 6) Centrifugar a 12000g por 15 minutos y dejar a 37C par que se evapore el isopropanol. 7) Se resuspende con 50 l de agua. 8) Luego se coloca en bao de mara a 55C. 9) Se procede a realizar la electroforesis. RESULTADOS: Luego de realizar la metodologa de deteccin de plsmidos antes descrita, se realiz una electroforesis y se obtuvo que PBS, PUC18 y PUC 19 tienen plsmidos y se aprecia en la siguiente imagen de la electroforesis:

Luego de realizar la purificacin y extraccin de ADN plasmidico con acetato de potasio 5 M y acetato de amonio 8 M. se obtiene que las cepas que contienen plsmidos y los cuales fueron purificados son: XL1Blue, 22*, VE777 tiene un plsmido enorme, 134, 4*, XC3, TAQFrance. Lamentablemente las fotos de este gel no me las mandaron mis compaeros. DISCUSIN: acetato de amonio es ms efectivo que acetato de potasio BIBLIOGRFA: (1) METODOLOGIA DE ECKHARD

CONJUGACIN BACTERIANA Amelia Guerrero Laboratorio de Gentica II, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes. Ncleo la Hechicera. 5101, Mrida, Venezuela. RESUMEN: Los plsmidos conjugativos movilizables son las estructuras extracromosomales responsables de la propagacin horizontal de mltiples genes de resistencia mediante el proceso de conjugacin bacteriana. En este trabajo se realizaron cruces entre cepas de E.coli ya caracterizadas, que poseen plsmidos de resistencia a antibiticos y se determin entre que cepas ocurre la conjugacin y entre cules no. PALABAS CLAVES: conjugacin, plsmidos, bacterias, resistencia a antibiticos. INTRODUCCIN: Los plsmidos son molculas de ADN forneo circular autorreplicante son independientes del ADN cromosmico. Se basan en un mecanismo especfico para ser segregados de manera equivalente en cada divisin bacteriana. Estn presentes normalmente en bacterias. Su tamao vara desde 1 a 250kb. El nmero y variedad de plsmidos en un hospedador puede variar, dependiendo de su tipo de mecanismo de regulacin de replicacin de los plsmidos y el mecanismo de particin de estos en el hospedador (1). Los plsmidos se clasifican de diferentes maneras una de ellas es a travs de su capacidad de transferirse o no a otra bacteria, entre ellos los plsmidos movivlizables y no movilizables respectivamente. Los plsmidos movilizables o conjugativos contienen genes tra, los cuales codifican para un complejo de protenas que se encargan de la formacin del puente conjugativo y del traslado del plsmidos del donante al receptor; plsmidos no movilizables o noconjugativos, que son incapaces de iniciar una conjugacin, y requieren de la asistencia de los plsmidos conjugativos para ser transferido. Otra forma de clasificarlos es a travs de la habilidad que le confieren a su hospedador, como son los plsmidos de resistencia, que confieren genes para la eliminacin, explosin o modificacin de antibiticos que daan a la bacteria,otro tipo de plsmidosson los bacteriocinogenos con genes para para sntesis de bacteriocinas que son protenas producidas por algunas cepas bacterianas y tienen una actividad letal para cepas relacionadas con la productora (2). La conjugacin es una remarcable caracterstica de muchos plsmidos, es la capacidad de transferirse a s mismo de una clula a otra clula competente (3), una clula competente es aquella que tiene la capacidad de llevar a cabo la

transformacin, esto ocurre naturalmente en ciertas etapas del ciclo de vida de las bacterias. METODOLOGA: Tomando en cuenta los resultados obtenidos en CARACTERIZACION BACTERIANA DE CEPAS RESISTENTES A ANTIBIOTICOS, se seleccionaron las cepas donadoras y receptoras para la conjugacin, como se muestra en la tabla1. TABLA 1: Cepas donadoras y receptoras seleccionadas para la conjugacin y su respectiva caracterizacin mediante antibiticos. Cepas DONADO RAS VE797 XL1BL UE PBS DH5 CI857 VE797 PUC19 En presencia delos siguientes antibiticos St Am T K r p c n + + - + + + + + + + + + + -

3) Donadora: XL1BUE X Receptora: CI857 4) Donadora: XL1BUE X Receptora: VE797 5) Donadora: XL1BUE X Receptora: PUC19 Para la mezcla se usa 80l de la cepa donadora y 20l de la cepa receptora y 100l de medio ML. Esta mezcla se siembra en las placas con antibiticos respectivos para observar si se da o no la conjugacin. Un ejemplo de ello es el siguiente, para el cruce 1 se usa 1 placa con tetraciclina por que la cepa receptora es resistente a este antibitico, una placa con canamicina porque la cepa donadora presenta resistencia a este antibitico y por ultimo una placa con la mezcla de los antibiticos para observar el crecimiento de los exconjugantes en el caso de que sede la conjugacin. En cada placa se siembra la cepa donadora, la receptora y la mezcla. Para cada placa se utilizan 25ml de medio de agar nutritivo con antibitico, las placas que se preparan son las siguientes, 1) 5 placas con tetraciclina (10g/ml) 1) 2 placas con canamicina (15g/ml) 2) 2 placas con estreptomicina (100g/ml) 3) 1 placas con ampicilina (10g/ml) 4) 2 placas con tetraciclina ms canamicina. 5) 2 placas con tetraciclina ms estreptomicina. 6) 1 placa con ampicilina ms tetraciclina.

RECEPTO RAS

Luego se establecen los cruces ms idneos para la conjugacin partiendo de las resistencias y sensibilidades de cada cepa mostradas en la tabla 1, los cruces son los siguientes: 1) Donadora: VE797 X Receptora: PBS. 2) Donadora: XL1BUE X Receptora: DH5

7) 15 placas con MLB para el control. RESULTADOS: TABLA 2: Resultados obtenidos de los cruces bacterianos.
Cru ce Placa con respectivo antibitico. Conclusi n

DISCUSIN: La conjugacin es una tcnica en la biologa molecular para la recombinacin del ADN entre organismos, en este caso se utilizaron cepas resistentes a los antibiticos; estreptomicina, ampicilina, canamicina y tetraciclina y se demuestra que existen gran variedad de plsmidos pero que pueden ser transferidos o no por su incompatibilidad con los ya presentante en la clula receptora ya ser por que comparten el mismo mecanismo de particin o por sus mecanismos de replicacin que restringen el nmero de copias en el hospedador. Para llevar a cabo la extraccin de ADN es necesario mantener el pH cercano a 8 dado la carga y conformacin que el ADN posee ante estas condiciones, facilitndose as su extraccin y que las concentraciones del ARN sean bajas, el cual al hacer la extraccin se considera un contaminante. El papel del EDTA ya que es un agente quelante, es decir, que tiene la capacidad de capturar iones metlicos como Mg++ y Ca++ los cuales sirven como cofactores para la ADNasas, de este modo inhibe la accin de estas enzimas que degradan el ADN. La lisis o rompimiento de la clula se realiz para la obtencin de ADN plsmidico a travs de lisozima, altas concentraciones de sales de acetato ya se de sodio en el hervido, de acetato de amonio o acetato de potasio en las lisis alcalinas y SDS; las lisozimas para degradar la pared celular, el SDS es un detergente que estabiliza la membrana y favorece su rompimiento al igual que lo las diferentes sales.

Tetraciclin a: Creci cepa receptora y exconjugant es

Canamici na: Creci cepa donadora y exconjuga ntes

Tetraciclin a ms Canamicin a: Crecieron solo exconjugant es

Se dio la conjugac in

Estreptomi cina: Creci cepa receptora y exconjugant es

Tetracicli na: Creci cepa donadora y exconjuga ntes

Estreptomi cina ms Tetraciclin a: Crecieron solo exconjugant es

Se dio la conjugac in

Estreptomi cina: Creci cepa receptora y exconjugant es

Tetracicli na: Creci cepa donadora y exconjuga ntes Tetracicli na: Creci cepa donadora

Estreptomi cina ms Tetraciclin a: Crecieron solo exconjugant es Canamicin a ms Tetraciclin a: No se observ crecimiento

Se dio la conjugac in

Canamicin a: No se observ crecimiento

No se dio la conjugac in

Ampicilina: Creci cepa receptora y exconjugant es

Tetracicli na: Creci cepa donadora y exconjuga ntes

Ampicilina : ms Tetraciclin a: Crecieron solo exconjugant es

Se dio la conjugac in

Comnmente se utiliza Proteinasa K, pero se utiliz la bromelina para eliminar las protenas contaminantes, entre ellas la ADNasas. La bromelina posee un ptimo como proteasa de 65C durante 2 a 3 horas. Luego de obtener el ADN plasmidico de cada una de las cepas y realizar los cruces se obtuvieron los exconjugantes. En el cruce 1 la donadora VE797 y la receptora PBS, el exconjugante es resistente a la canamicina adems de su resistencia original a ampicilina y tetraciclina ya que recibi el plsmido de la cepa donadora VE797. En los otros cuatro cruces se utiliz como donadora la cepa XL1BLUE, que posee un plsmido con el Tn10 que codifica para la resistencia a la tetraciclina, es por esta razn que las exconjugantes poseen resistencia a

tetraciclina, ya que recibieron el plsmido. Solo el cruce 4 no fue exitoso la cepa receptora no creci, pudo ser que no se tom suficiente muestra para sembrar. BIBLIOGRAFA: (1) Lewin, Benjamn. (2008). Genes IX. Mxico. Editorial mexicana. (2) Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. (2002). Gentica, Sptima Edicin. McGRAW HILL. Interamericana. (3) Snyder, L., Champness, W. (2007). Molecular Genetics of Bacteria. Tercera Edicin. ASMpress. Washington.

PURIFICACIN DE ADN GENOMICO DE CLULAS EPITELIALES. Amelia Guerrero Laboratorio de Gentica II, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes. Ncleo la Hechicera. 5101, Mrida, Venezuela. RESUMEN: PALABRAS CLAVES: purificacin, ADN genmico, clulas epiteliales. INTRODUCCION: METODOLOGA: Durante el procedimiento se extraer ADN genmico de clulas epiteliales, para esto se procede de la manera siguiente: Se toman clulas epiteliales de la boca de algunas personas voluntarias. Resuspender en NaCl 0,85%. Luego centrifugar a 12000g por 10 minutos, descartar el sobrenadante. Agregar NaCl, resuspender, centrifugar y descartar el sobrenadante. Resuspender en 400l de solucin TE (NaCl 0,4M). Agregar 8 a 10 l de bromelina y 40 l de SDS10% ms ananasa (degrada membranas, protenas y libera el ADN), mezclar muy bien. Esto se deja 1 hora y 30 minutos. Luego se coloca a 65C por 15 minutos para inactivar la ananasa (si se usa proteinasa K hay que dejar hasta 1 hora para inactivarla). Agregar 300l de NaCl 6M Centrifugar durante 30 minutos a 12000g. Tomar 650 l del sobrenadante y mezclar con 650 l de isopropanol. Guardamos a 20. Centrifugamos durante 15 minutos. Llevamos al estufa para que evapore el etanol. Agregar 50 l de agua destilada.

RESULTADOS: DISCUSIN: BIBLIOGRAFIA:

ENZIMAS DE RESTRICCIN. Amelia Guerrero Laboratorio de Gentica II, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes. Ncleo la Hechicera. 5101, Mrida, Venezuela.

RESUMEN: PALABRAS CLAVES: INTRODUCCION: METODOLOGA: RESULTADOS: DISCUSIN: BIBLIOGRAFIA: