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Espectroscopías UV-Visible e Infrarroja de moléculas poliatómicas.

1. Introducción.

En espectroscopia se estudian las interacciones de la radiación electromagnética (luz) con la materia. Entre los fenómenos que producen estas interacciones están la absorción, emisión y dispersión de luz por la materia.

La mayoría de nuestra información experimental sobre los niveles de energía de los átomos y moléculas proviene de la espectroscopia. A nivel molecular, las diferentes técnicas espectroscópicas también nos permiten conocer las estructuras moleculares (conformaciones, longitudes y ángulos de enlace), las frecuencias moleculares de vibración, descubrir la composición de una muestra, seguir la concentración de especies reactivas en función del tiempo en una reacción química, determinar intermedios de reacción y un largo etc.

En este bloque utilizaremos tres técnicas diferentes: absorción ultravioleta-visible (UV- visible), emisión de fluorescencia y absorción infrarroja (IR) para caracterizar la fotofisicoquímica de un alcaloide denominado norharmano de gran interés farmacológico cuya presencia se ha detectado en diferentes tipos de plantas e incluso en el cuerpo humano. La estructura de este compuesto se muestra en la figura 1. Está compuesta de un anillo piridínico deficiente en electrones π unido a otro anillo indólico con exceso de electrones π. Las interesantes propiedades fotofísica que este derivado presenta son debidas a cambios fotoinducidos en la distribución electrónica que originan un fuerte incremento en la basicidad del núcleo piridínico en el primer estado electrónico excitado y que, consecuentemente, modifican la reactividad de esta molécula.

Espectroscopías UV-Visible e Infrarroja de moléculas poliatómicas. 1. Introducción. En espectroscopia se estudian las interacciones de

Fig. 1.- Estructura del Norharmano

La técnicas de absorción y emisión de luz en la región UV-visible se encuadran dentro de la espectroscopia electrónica y la técnica de absorción IR se encuadra dentro de la espectroscopía de vibración. Mediante la absorción y la emisión de radiación en la región UV-visible caracterizaremos los espectros de absorción y fluorescencia de las dos formas que pueden existir (neutra y catiónica) en disolución acuosa en el intervalo de pH entre 1 y 10. Obtendremos el rendimiento cuántico de fluorescencia de la forma catiónica y la constante de acidez de este alcaloide una vez protonado, tanto en el estado fundamental como en el primer estado excitado. Utilizando la espectroscopia de absorción infrarroja obtendremos la constante de formación de un complejo de tipo NH-π entre este alcaloide y el derivado fenantreno.

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Este bloque se realizará en tres sesiones

y consta de un fundamento teórico y de una

metodología experimental para cada una de las técnicas utilizadas, así como, de prácticas

tres

2 Fundamento Teórico

2.1 Espectroscopía Electrónica. El estudio de los espectros electrónicos, además de permitir explicar los colores de las sustancias, también proporciona importante información sobre los estados excitados de las moléculas. La distribución electrónica de una molécula determina las propiedades físicas y químicas de ésta, de esta manera, puede ocurrir que reacciones que se producen fotoquímicamente (estado excitado), no lo hagan térmicamente (estado fundamental), ya que son el resultado de una distribución electrónica diferente en la molécula producto de la excitación.

2.1.1 Espectros de absorción UV-visible.

La energía total de una molécula es el resultado de las interacciones atractivas entre el núcleo y los electrones, repulsivas electrón-electrón y núcleo-núcleo, vibraciones de los núcleos, rotación nuclear e interacciones magnéticas resultantes de los spines de los electrones y núcleos. Resolviendo la ecuación de ondas podríamos conocer el valor de esta energía, sin embargo, en la práctica, esto es imposible y es necesario recurrir a aproximaciones. Si suponemos que los núcleos y electrones son masas puntuales y despreciamos las interacciones spin-órbita y otras interacciones relativistas, mediante la

aproximación de Born-Oppenheimer podemos separar la función de onda molecular como un producto de funciones de onda electrónica y nuclear. Esta aproximación se basa en que los electrones se mueven mucho más rápidamente que los núcleos y es una buena aproximación, considerar a los núcleos fijos mientras los electrones realizan sus movimientos. De esta manera, podemos separar la función de onda molecular en un producto de funciones de onda electrónica y nuclear. Por otro lado, un tratamiento similar para la función de onda del movimiento nuclear demuestra que ésta puede separarse en funciones de onda rotacional, vibracional. Esta separación se basa en que la vibración molecular es mucho más rápida que la rotación molecular, por lo que podemos usar una separación internuclear media para calcular el momento rotacional de inercia. Por tanto, aunque la siguiente ecuación no es exacta ya que conlleva las aproximaciones anteriormente descritas, podemos considerar la energía total de una molécula como la suma de las energías electrónicas, vibracional, rotacional y

traslacional. E total =

E elect + E vibr + E rot + E trasl

Los valores relativos de estas energías son importantes. Las energías implicadas en los cambios de las distribuciones electrónicas de las moléculas son del orden de varios electrón-voltios (1eV equivale a unos 8000 cm -1 ) por tanto los espectros electrónicos aparecen en las regiones del visible y ultravioleta del espectro electromagnético que se

extienden desde unos 14000 cm -1 para la luz roja hasta 21000 cm -1 para la luz azul y unos 50000 cm -1 para la ultravioleta. Las transiciones vibracionales corresponden a absorciones en la región del infrarrojo (sobre 100 cm -1 a 1000 cm -1 ). Las transiciones rotacionales corresponden a la absorción en la región de microondas (sobre 0.03 cm -1 a

10 cm -1 ).

Así, la separación entre los niveles de energía electrónicos es mucho mayor

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que la separación entre niveles vibracionales, y ésta, a su vez es mucho mayor que la separación entre niveles rotacionales (figura 2). De esta manera, a nivel molecular, una transición electrónica siempre irá acompañada de transiciones vibracionales que a su vez van acompañadas de rotacionales. Como la energía traslacional no hace mas que sumar una cantidad constante a la energía total, las frecuencias de una transición vienen dadas por hν = (E´ elec - E´´ elec ) +(E´ vib - E´´vib )+ (E´ rot - E´´ rot ) donde cada término entre paréntesis es sustancialmente menor que el término precedente.

que la separación entre niveles vibracionales, y ésta, a su vez es mucho mayor que la

Fig.2.- Esquema energético de separación de niveles.

Tipos de transiciones electrónicas en moléculas poliatómicas. La solución de la parte electrónica de la ecuación de ondas da los niveles de energía (orbitales) y las distribuciones electrónicas aproximadas para unas determinadas coordenadas nucleares. Es costumbre, aunque no es rigurosamente cierto, situar los electrones en orbitales moleculares y considerar la absorción de luz como una transición uni-electrónica entre orbitales. Podemos hacer una clasificación de las transiciones electrónicas en términos de orbitales σ (enlazante), σ * (antienlazante), π (enlazante), π*(antienlazante) y par solitario (no enlazante, designado por n). En la figura 3, mostramos los niveles de energia de los orbitales moleculares del formaldehído/y algunas posibles transiciones electrónicas que pueden ocurrir entre estos orbitales, tales como σ→ σ*, n →σ*, π→π*, n →π*. Las energías de estas transiciones electrónicas sigue, generalmente, el siguiente orden:

n → π *< π→π*< n →σ*< σ →π*< σ→ σ*

Otros dos importantes tipos de orbitales que se consideran en estas transiciones son el orbital molecular ocupado de mayor energía denominado HOMO ( Highest Occupied Molecular Orbital) y el orbital molecular desocupado de menor energía denominado LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital). Ambos orbitales se refieren al estado fundamental de la molécula.

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Fig.3.- Diagrama de energía de los orbitales moleculares de l Formaldehído y posibles transiciones electrónicas. En

Fig.3.- Diagrama de energía de los orbitales moleculares de l Formaldehído y posibles transiciones electrónicas.

En las cuatro transiciones que se muestran en la figura 3, el electrón que promociona no varia su spin y por tanto el número cuántico de spin total permanece igual a cero (S=Σs i , con s i = +1/2 ó -1/2 ). La multiplicidad de spin (M=2S+1) en ambos estados, tanto fundamental como excitado, es igual a 1, por tanto todos estos estado son estados singlete ( usualmente se denota como S 0 el estado fundamental y S 1, S 2, S 3, … para los siguiente estados excitados). Todas las transiciones mostradas en la figura 3 son , por tanto, transiciones singlete-singlete. Si por lo contrario, el electrón promocionado cambia su spin, el momento angular total de spin es 1 y su multiplicidad 3. El estado excitado que produce la transición es un estado triplete. De acuerdo con la regla de Hund, para una misma configuración electrónica, el estado triplete tiene menor energía que el correspondiente singlete (figura 4).

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Fig.4.- Distinción entre estados singletes y tripletes. Ejemplo del formaldehído. Probabilidad de las transiciones. Ley de

Fig.4.- Distinción entre estados singletes y tripletes. Ejemplo del formaldehído.

Probabilidad de las transiciones. Ley de Lambert-Beer y Fuerza de Oscilador. Experimentalmente, la eficiencia de absorción de luz a una determinada longitud de onda, λ, por un medio absorbente se caracteriza por la absorbancia a esta λ, A(λ), o la transmitancia T(λ) que se definen como

A(λ)= log (I λ 0 /I λ ) = -log T(λ)

siendo T(λ) = I λ /I λ 0 , donde I λ 0 y I λ son las intensidadesde la luz que entra y sale del medio absorbente, respectivamente. En muchos casos, la absorbancia de una muestra sigue la ley de Lambert-Beer

A(λ)= log (I λ 0 /I λ )= ε(λ) l c , donde ε(λ) es el coeficiente de absorción molar

(comúnmente expresado en L mol -1 cm -1 ), l es la longitud de paso de luz y c es la concentración ( mol L -1 ). El coeficiente de absorción molar expresa la habilidad de una molécula para absorber la luz a una λ y un determinado disolvente. Según la teoría clásica, la absorción molecular de luz puede ser descrita si consideramos a la molécula como un dipolo oscilando, lo cual nos permite introducir la llamada fuerza de oscilador, la cual está directamente relacionada con la integral de la banda de absorción mediante la siguiente ecuación:

f = 2.303 mc 0 2 / N a π e 2 n ∫ ε(υ) d υ

donde m y e son la masa y carga del electrón, respectivamente y c 0 es la velocidad de la luz, n es el índice de refracción. f es una cantidad adimensional y sus valores están

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normalizados, de tal manera que las transiciones más eficaces o probables tienen f ≈ 1 que se corresponde con unos valores de ε 10 4 -10 5 M -1 cm -1 . La ventaja de introducir la fuerza de oscilador estriba en que tiene una conexión directa con las funciones de onda de los estados excitados inicial (Ψ i ) y final (Ψ f ) implicados en la transición. El tratamiento mecano-cuántico de la interacción entre la radiación y la materia demuestra que la probabilidad de absorción o emisión entre dos estados estacionarios es proporcional al cuadrado de la magnitud de la integral llamada momento de transición. Esta integral se define mediante la siguiente expresión

µ fi = ∫Ψ f * µ

Ψ i dζ,

µ = -er

que es una medida del momento dipolar asociado con el desplazamiento de carga que se produce cuando tiene lugar la redistribución electrónica. La fuerza de oscilador se relaciona con este momento por

f = (8π 2 /3) (mν/h e 2 )

µ fi 2

Así pues, se puede estimar lo probable que es una transición si se conocen las funciones de onda, lo que es una relación importante entre la teoría y la experimentación. En las parejas de estados para los cuales esta integral es cero se dice que es una transición prohibida. Cuando el valor de esta integral es distinto de cero se dice que la transición entre estos estados está permitida.

2.1.2 Espectros de emisión

En la figura 5 se muestran todos los procesos que pueden ocurrir a una vez la molécula interacciona con un fotón de una determinada longitud de onda en la región UV-visible y lo absorbe. A estos procesos se denominan como fotofísicos y pueden ser definidos como transiciones que convierten un estado excitado en otro estado excitado o en el fundamental.

Vamos

empezar

normalizados, de tal manera que las transiciones más eficaces o probables tienen f ≈ 1 que

a

Fig.5.- Posibles vías de desexcitación de una molecula excitada. Empezaremos describiendo los procesos fotofísicos que son unimoleculares. Estos procesos se clasifican en radiativos y no-radiativos, y para ilustrarlos, nada mejor que utilizar el diagrama de Perrin-Jablonski de la figura 6. En esta representación la dirección vertical corresponde a un incremento de energía y la dirección horizontal no

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tiene ningún significado físico. Los estados electrónicos son representados por los símbolos S 0 , S 1 , S 2 y corresponden a los estados singlete fundamental, primero y segundo excitado, respectivamente. T 1 y T 2 representan los correspondientes estados tripletes de S 1 y S 2 , respectivamente. Los procesos radiativos están dibujados con líneas rectas y los no-radiativos con línea ondulada. Vamos a describir brevemente estos procesos:

Transiciones radiativas

Absorción S-S (S 0 + hν → S 1 ), caracterizada experimentalmente por el coeficiente de absorción molar ε. Este proceso transcurre en un tiempo de aproximadamente 10 -15 s.

Absorción S-T (S 0 + hν → T 1 ), transición prohibida ya que son estados de diferente multiplicidad de spin y por tanto la integral momento de transición se anula. Esta transición está caracterizada experimentalmente por el coeficiente de absorción molar

ε (S-T) .

Emisión de fluorescencia (S 1 → S 0 + hν ), transición permitida y caracterizada por una constante de velocidad k f con valores entre 10 10 -10 7 s -1 .

Emisión de fosforescencia (T 1 → S 0 + hν ) transición prohibida y caracterizada por una constante de velocidad k p con valores entre 10 6 – 1 s -1 .

Transiciones no-radiativas

Conversión interna (CI). Transiciones entre estados excitados de la misma multiplicidad de spin (ej. S 1 S 0 + Q) caracterizadas por una constante k ic con valores entre 10 11 -10 9 s -1 . Cuanto menor sea la diferencia entre los estados excitados, mayor es la eficiencia de CI.

Cruce entre sistemas (CIS). Transiciones prohibidas entre dos niveles vibracionales isoenergéticos de estados electrónicos excitados de diferente multiplicidad de spin (ej. S 1 T 1 + Q o bien T 1 S 0 + Q) caracterizadas por una constante k cis con valores comprendidos entre 10 10 -10 8 s -1 . La presencia de átomos pesados incrementa el acoplamiento spin-órbita y por tanto favorece que se produzca con más probabilidad este tipo de transición.

Existe un tipo de transición no-radiativa que ocurre entre estados vibracionales de un mismo estado electrónico. Este proceso se denomina relajación vibracional y a temperatura ambiente, esta disipación de energía, se produce en un tiempo de alrededor

  • 10 -12 s. Este proceso es lento con respecto a la absorción, sin embargo es muy rápido con

respecto a la fluorescencia, CI y CIS. Esto explica que las propiedades fluorescentes de una molécula sean independientes del estado vibrónico, dentro de la banda de absorción S 0 S 1, al que la molécula es excitada.

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Fig.6.- Diagrama de Perrin-Jablonski. Posición relativa de las bandas de absorción, fluorescencia y fosforescencia. Estos procesos

Fig.6.- Diagrama de Perrin-Jablonski. Posición relativa de las bandas de absorción, fluorescencia y fosforescencia.

Estos procesos no-radiativos son los responsables de que no fluorezcan el 100% de las moléculas excitadas, que la fluorescencia se origine siempre desde el estado S1, que su perfil no varíe con la longitud de onda de excitación y que el máximo de emisión siempre se sitúe a mayores longitudes de onda (menor energía) que el máximo de absorción. Este gap entre el máximo de la primera banda de absorción y el máximo de fluorescencia se denomina desplazamiento de Stokes. En general, las diferencias entre los niveles vibracionales son similares en el primer estado excitado y en el fundamental de aquí que los perfiles de la primera banda de absorción y la fluorescencia sean imágenes especulares (figura 7). La transición 0-0 es usualmente la misma en absorción y fluorescencia, por tanto podemos obtener la longitud de onda de esta transición del punto de corte de ambos perfiles. Aunque no entraremos en más detalles, mencionaremos que todos los procesos anteriormente descritos son espontáneos.

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Fig.7.- Bandas vibracionales en el espectro de absorción y fluorescencia de un hidrocarburo aromático. Además de

Fig.7.-

Bandas vibracionales en el espectro de absorción y fluorescencia

de un hidrocarburo aromático.

Además de k f , hay otros parámetros que caracterizan la emisión fluorescente, uno de éstos es el rendimiento cuántico de fluorescencia (Ф f )que se define como el cociente entre el número de fotones emitidos y el número de moléculas excitadas. Si no existieran canales de desactivación, el rendimiento cuántico de la molécula sería igual a uno. Si sólo consideramos procesos de desactivación unimoleculares, Ф f vendrá dado por :

Φ f = k f / (k f + ∑ k i )

Siendo k i la constante de desactivación de cada uno de los procesos no-radiativos unimoleculares.

Efecto de los procesos fotoinducidos intermoleculares sobre la emisión fluorescente. Transferencia protónica fotoinducida.

Las propiedades ácidas y básicas de una molécula pueden diferir significativamente del estado fundamental al excitado. Una de las causas posibles de esta observación es la diferencia en la densidad de distribución electrónica entre ambos estado y la ocurrencia de la transferencia protónica durante el tiempo de vida del estado excitado dependerá de las velocidades relativas entre los procesos de desexcitación unimoleculares y el proceso de transferencia protónica.

Determinación del pKa en el estado excitado mediante el ciclo de Föster. El pKa de un ácido débil puede determinarse teóricamente utilizando el ciclo de Foster junto con medidas espectroscópicas.

De acuerdo con este ciclo que mostramos en la figura 8

N a AH + ΔH 0* = N a A - + ΔH 0

donde ΔH 0 y ΔH 0* son las entalpias molar de ionización estándar, hν AH y hν A - son las diferencias de energía( correspondiente a la transición 0-0) entre el estado excitado y

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fundamental de AH y A - , respectivamente y N a es el número de Avogrado. Esta ecuación puede ser escrita como

N a (hν A - - hν AH ) = ΔH 0* - ΔH 0

fundamental de AH y A , respectivamente y N es el número de Avogrado. Esta ecuación

Fig.8.- Ciclo de Foster para la determinación del pK del estado excitado.

Asumiendo que las entropías de ionización ΔS 0 y ΔS 0* son iguales, las diferencias de entalpía puede ser reemplazada por la diferencia de energías libres ΔG 0* - ΔG 0 . ΔG 0 está relacionada con la constante de equilibrio mediante

ΔG 0 = - RT ln K = 2.3 RT pK

de la misma forma, ΔG 0* = - RT ln K* = 2.3 RT pK*

donde R es la constante de los gases y T la temperatura absoluta. Usando estas

ecuaciones y convirtiendo las frecuencias a números de onda, la ecuación expresarse como

pK*-pK = 2.1 10 -3 (υ A- - υ AH )

puede

Esta ecuación muestra que si la banda de emisión de la forma básica está localizada a mayor longitud de onda que la forma ácida, pK* es menor que el pK del fundamental. Por el contrario, si la emisión de la forma básica está desplazada hacia el azul (menor landa) con respecto a la banda de emisión de la ácida, el ácido en el estado excitado es más débil que en el fundamental. En la práctica, la diferencia entre υ A- y υ AH corresponde con la diferencia entre las transiciones 0-0 de A - y AH , las cuales no son fáciles de determinar . Normalmente se estiman promediando los números de onda de los máximos de absorción y fluorescencia

υ 00 = ( υ abs max + υ em max )/2

Sin embargo la mejor aproximación se encuentra utilizando el punto de intersección de los espectros normalizados de absorción y fluorescencia. En el caso que el desplazamiento de Stokes sea muy grande, será difícil encontrar este punto de intersección y será preferible tomar υ abs max como el promedio de los números de onda de la mitad superior de la banda de absorción (S 0 →S 1 ) y realizar la misma operación para obtener υ em max pero, en este caso, con la banda de emisión fluorescente.

1

La determinación de la energía de esta transición 0-0 es el mayor factor de error en la estimación del pK*. La ventaja de este método es su sencillez y que puede usarse incluso cuando no se establece el equilibrio en el tiempo de vida del estado excitado.

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2.

Espectroscopia de Vibración. Espectros de absorción IR .

La espectroscopía de absorción infrarroja (IR) es una técnica analítica de gran importancia para los químicos. Está basada en las vibraciones de los átomos de las moléculas. Un espectro de infrarrojo consiste en un espectro de absorción que implica transiciones entre niveles vibracionales diferentes dentro del mismo estado electrónico. Dado que una molécula poliatómica tiene 3N-6 ( 3N-5 si es lineal) grados de libertad vibracionales, su espectro de infrarrojo puede presentar dicho número de bandas de absorción, cuyas energías corresponderán a la frecuencia de cada modo vibracional. Para que una vibración dé lugar a una absorción de infrarrojo, debe causar un cambio en el momento dipolar de la molécula. Así, la intensidad de una banda de infrarrojo será mayor cuanto mayor sea el cambio en el momento dipolar con la vibración. La principal utilidad de la espectroscopía de infrarrojo deriva del hecho de que los grupos funcionales mantienen cierta individualidad dentro de las moléculas, afectando sus vibraciones fundamentalmente al enlace considerado. Según el modelo clásico del oscilador armónico, la frecuencia vibracional de dos átomos unidos por un enlace viene dada por la expresión

1 k  ν = 2πc  μ
1
k
ν
=
2πc  μ

donde K es la constante de fuerza del enlace y μ la masa reducida del sistema. Como resultado, se encuentra que los diferentes grupos funcionales se caracterizan por diferentes frecuencias vibracionales, que naturalmente van asociadas a bandas distintas en el espectro de infrarrojo. Siempre que obtengamos un espectro IR, en condiciones que no sean de vacío, la radiación infrarroja va atravesar el aire y será inevitable que parte de esta radiación sea absorbida por algunas de las moléculas que lo componen. Esta absorción, junto con la correspondiente a las ventanas que utilicemos como soporte, constituirá el fondo del espectro. Analizaremos brevemente la absorción por parte del aire. Interpretación del espectro de infrarrojo del aire: entre los componentes mayoritarios de la atmósfera terrestre, los gases de N 2 y O 2 no producen absorción de radiación infrarroja, ya que son moléculas diatómicas apolares. En cambio, el vapor de agua y el dióxido de carbono absorben radiación infrarroja y por tanto serán observados siempre que se realicen medidas de absorción de infrarrojo en presencia de aire, y deben corregirse (espectro de referencia) a la hora de estudiar una muestra problema.

O H H
O
H
H
 

1

|| (dos ramas)

O

C

O

 

1

No activa IR

O H H
O
H
H
 

2

|| (dos ramas)

 

O

C

O

2

|| (dos ramas)

 

1

O H H 3 (tres ramas) O C O , 3 4
O
H
H
3
(tres ramas)
O
C
O
,
3
4
Degeneradas (tres ramas)
Degeneradas
(tres ramas)

La molécula de agua tiene una estructura no lineal y por tanto presenta tres modos vibracionales: una tensión simétrica (v 1 ), una flexión simétrica (v 2 ) y una tensión asimétrica (v 3 ). Generalmente se requiere menos energía para deformar un ángulo entre tres átomos que para estirar un enlace, por lo que la banda v 2 debe aparecer a menores frecuencias que v 1 y v 3 . Las vibraciones v 1 y v 3 cambian el módulo del momento dipolar (vibraciones paralelas) mientras que la vibración v 2 cambia la orientación de dicho momento (vibración perpendicular). Como consecuencia, estas tres vibraciones deben dar lugar a bandas vibracionales activas en infrarrojo. La molécula de CO 2 presenta una estructura lineal y por tanto sus grados de libertad vibracionales son cuatro. Dado que el momento dipolar permanente de la molécula es nulo, la vibración de tensión simétrica no será activa en el espectro de infrarrojo. En cambio la vibración de tensión asimétrica (vibración paralela) producirá una banda de absorción, así como las dos vibraciones de flexión (vibraciones perpendiculares), que son degeneradas en energía y por tanto aparecen como una sola señal en el espectro. Por otra parte, como las moléculas de H 2 O y CO 2 pueden girar libremente en su estado gaseoso, sus absorciones de infrarrojo implican transiciones entre los distintos niveles rotacionales de los estados vibracionales implicados. De ahí que las bandas de infrarrojo de estos compuestos sean bandas de vibración-rotación, es decir, que sus bandas de vibración presentan estructura fina de rotación. Así una molécula poliatómica como H 2 O o CO 2 presenta bandas paralelas con un contorno PR, mientras que sus bandas perpendiculares tienen contornos PQR.

Los espectros de infrarrojo se pueden utilizar para identificar componentes de muestras comparándolos con una colección de espectros de sustancias conocidas. Además de la identificación y comparación de componentes se puede obtener información estructural. Los grupos funcionales se pueden identificar debido a que sus bandas de absorción se encuentran en zonas relativamente estrechas. Los espectros de infrarrojo de los compuestos orgánicos se pueden dividir en las siguientes regiones generales:

La región de los grupos funcionales: 4000-1300 cm -1 La región de la huella dactilar: 1300-910 cm -1 La región de los aromáticos: 910-650 cm -1 . Las bandas en la región de los grupos funcionales indican la presencia de grupos orgánicos funcionales específicos. Existen tablas donde se indican en qué intervalo absorben los diferentes grupos. Entre lo grupos funcionales fácilmente identificables se encuentran el grupo carbonilo, C=O, y el grupo hidroxilo, -OH. La región de la huella dactilar contiene picos que aparecen por modos normales complicados que conllevan movimientos de flexión y no son fácilmente asignables. Sin embargo, es la región más sensible a la diferencia de estructura de los compuestos, es decir, representa la huella dactilar para un compuesto específico. Los picos en la región de los aromáticos no indican automáticamente la presencia de anillos aromáticos, debido a que aparecen también en esta región las bandas correspondientes a enlaces carbono-halógeno. Las bandas se originan por los movimientos de flexión de los enlaces C-H fuera del plano del anillo aromático. En la realidad, se requiere mucha práctica para interpretar los espectros IR ya que aparecen numerosas desviaciones a la apariencia esperada. En la actualidad los instrumentos con transformadas de Fourier pueden obtener espectros en varios segundos, para que, posteriormente, utilizando el software que desarrolle la comparación entre picos, se pueda identificar cada componente.

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3. Medidas experimentales de absorción, emisión y excitación de fluorescencia.

  • 3.1 Espectros de absorción

Las técnicas experimentales para espectroscopia de absorción en las regiones, UV, visible e IR son similares. En ellas se pasa un haz de luz, conteniendo un intervalo continuo de frecuencias, a través de la muestra, la luz que sale de ésta (luz transmitida) se dispersa usando un prisma de difracción reticulado y, en cada frecuencia, se compara la intensidad de luz transmitida (I t ) con la intensidad del haz de referencia que no ha pasado a través de la muestra (I 0 ) . La medida de un espectro de absorción se basa en dos principios importantes: ley de Lambert y la ley de Beer . La ley de Lambert establece que la proporción de luz absorb ida por un medio es independiente de la intensidad de luz incidente, Ι 0 . La ley de Beer establece que la cantidad de luz absorbida es proporcional a la concentración de cromóforo en la muestra. De la combinación de estas dos leyes podemos expresar:

A=εbc

donde A se define como absorbancia y viene dado por A = log (I 0 /I t ) , ε es el coeficiente de molar que es una constante de la molécula y que depende de la longitud de onda de la luz incidente. c es la concentración molar y b la longitud de paso de luz (anchura de la cubeta). La intensidad de la luz absorbida I a viene dado por:

I a =I 0 - I t

y a partir de la le ley de Lambert-Beer

I a = I 0 (1-e -2.3εbc )

Cuando A>2, I a = I 0 es decir toda la luz incidente es absorbida.

Un espectro de absorción viene descrito por una gráfica donde se representa la intensidad de absorbancia en la ordenada y la longitud de onda de la luz absorbida en la abcisa. Sin embargo, en espectroscopia IR es más habitual presentar los espectros como un gráfico %Transmitancia frente al número de onda (cm -1 )

  • 3.2 Espectros de fluorescencia

La ley de Lambert-Beer también puede ser expresada como.

I t = I 0 10

-εbc

(1)

Si asumimos que la intensidad de la luz absorbida viene dada por I 0 - I t , tenemos:

I a = I 0 (1-10 -εbc )

La intensidad de la fluorescencia I f viene dada por I a ϕ f

1

I f = I 0 ϕ f (1-10 -ϵbc )

Haciendo un desarrollo en serie 10 -ϵbc

I f = I 0 ϕ f {1-[1-2.303ϵbc+(2.303ϵbc) 2 /2!+

.....

]}

Si bc < 0.05 todos los términos del desarrollo después de pueden ignorarse, de manera que I f puede expresarse como:

-2.303ϵbc

I f = 2.303 I 0 ϕ f ϵbc

(2)

Se ha determinado que para una absorbancia de 0.01 se producirá un error del 1% en la intensidad de fluorescencia. Sin embargo, no solamente existen errores en la I f debido a la rotura de la aproximación matemática, sino que estos errores también se debe al efecto de filtro inerte de la disolución. Bowen y Wokes establecieron que para obtener una respuesta lineal, la disolución debe absorber menos que el 5% de la luz de la fuente. El verdadero espectro de fluorescencia es una representación de la intensidad de fluorescencia (a una intensidad y longitud de onda de absorción fija) como una función de las frecuencias o longitudes de onda de emisión. Los espectros obtenidos en el fluorímetro no son, generalmente, los verdaderos espectros debido a la dependencia de la respuesta del sistema instrumental con la longitud de onda.

Los parámetros que caracterizan la emisión de fluorescencia son: Perfil ( I f frente a λ), rendimiento cuántico (I f relativa a I a ) y tiempo de vida ( decaimiento de I f con el tiempo) de fluorescencia.

  • 3.2.1 Espectro de excitación

A la representación de la intensidad de emisión (a una longitud de onda de emisión fija) en función de la longitud de onda de excitación ( I 0 constante) se le llama espectro de excitación. Si la molécula cumple la regla de Kasha y Vavilov, ϕ f es independiente de la λ de excitación.

Así, si fijamos la concentración de la especie que emite (fluoróforo), I I0 y b;

I f α ε.

En otras palabras, el espectro de excitación observado variará con ε. En estos casos, el espectro de excitación tendrá el mismo perfil que el espectro de absorción. Una ventaja de la espectroscopia de excitación sobre la absorción es la mayor sensibilidad de la técnica de fluorescencia que permite observar el espectro de excitación a concentraciones más bajas que en absorción y sobre todo, la gran utilidad de un espectro de excitación está en que nos informa de cual es la especie que está produciendo esa emisión.

  • 3.2.2 Determinación del rendimiento cuántico

1

Factores que afectan al rendimiento cuántico. La medida del rendimiento cuántico de fluorescencia de un compuesto en disolución está afectada por una serie de factores que hay que tener en cuenta a la hora de obtener buenos valores de este parámetro.

Efectos de autoabsorción y filtro inerte La relación lineal entre concentración y

fluorescencia sólo puede aplicarse a absorciones muy bajas. A altas absorciones los factores de corrección dependen de la geometría del instrumento. Por otro lado, si hay un fuerte solapamiento entre absorción y fluorescencia la autoabsorción es importante y aumenta con la concentración. De aquí, que los valores de ϕ f se obtengan de disoluciones muy diluidas. Efecto de la longitud de onda de excitación Es muy común asumir que el ϕ f es independiente de la λ de excitación. Sin embargo, se han observado excepciones a esta regla, de aquí que sea necesario verificar el cumplimiento de la ley de Vavilov en el derivado cuyo ϕ f queremos medir.

Una corrección del índice de refracción entre un estándar y la muestra se

requiere de manera que se compensen las diferencias de la geometría óptica entre la disolución y el estándar. Efectos de la temperatura. La fluorescencia es un parámetro que puede depender

fuertemente de la temperatura por lo que la medida del ϕ f hay que realizarlo a una temperatura determinada y si se realizan varias medidas hay que tener la precaución de mantener constante la temperatura. Efectos de las impurezas. Para evitar la presencia de posibles desactivadores de la fluorescencia, es necesario utilizar disolventes grado uvasol

.Dispersión de la luz. Toda la luz incidente no es absorbida o trasmitida por la muestra, sino que es también dispersada. Esta dispersión se origina por las mismas moléculas (dispersión Rayleigh) o por partículas en suspensión coloidal (dispersión Tyndall). Ambos tipos de luz dispersa son recogidas junto con la fluorescencia y hay que tomar las debidas precauciones para separarlas. Otro tipo de dispersión es la llamada dispersión Raman. Las bandas Raman aparecen separadas de la radiación incidente por la misma diferencia de frecuencias que la λ de excitación. De esta manera, si la fluorescencia coincide con la banda del disolvente, la separación puede efectuarse cambiando la λ de excitación a valor más bajo. La dispersión Raman es solamente importante si recogemos la fluorescencia con alta sensibilidad, ya que este fenómeno es débil, no obstante hay que tenerla siempre en cuenta. Por consiguiente, antes de medir la fluorescencia, hay que realizar un ensayo en blanco. Todos los disolventes conteniendo átomos de hidrógeno ligados a carbono u oxígeno, muestran un Raman desplazado 3000 cm -1 de la radiación incidente.

Métodos utilizados para determinar el rendimiento cuántico de fluorescencia. Si analizamos la historia de las determinaciones de los rendimientos cuánticos, observamos que la mayor parte de los autores sobreestiman su método y que es muy difícil determinar el ϕ f )con un error menor del 5%. El método que utilizaremos en esta práctica consistirá en comparar la integral de fluorescencia de nuestro sistema con la integral de un patrón cuyo valor de ϕ f ya es conocido (estándar de fluorescencia). La expresión del rendimiento cuántico de la muestra vendrá dada por:

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fs = fr

Α r λΙ r λΑ s λΙ s λ

D

s

n

2

s

D

r

n

2

r

Donde los subíndices s y r se refieren a la sustancia problema y de referencia respectivamente, ϕ f es el rendimiento cuántico; A(λ) es la absorción de la disolución a la longitud de onda de excitación; n, el índice de refracción; I(λ) es la intensidad de la lámpara a la longitud de onda de excitación y D la integral de fluorescencia. De la expresión anterior vemos que el rendimiento cuántico relativo puede ser determinado midiendo el área de la banda de fluorescencia de la muestra y del estándar. También comentar que para minimizar los errores en la obtención del rendimiento cuántico, es conveniente excitar la muestra y el patrón de fluorescencia a la misma longitud de onda y así evitaremos los errores de corrección del perfil de la lámpara. El principal error de este método está en la corrección de los espectros de fluorescencia. Este error será tanto más pequeño cuanto más solapen los perfiles de fluorescencia de la muestra y del estándar.

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