TEXTO ILUSTRADO ODE Biologia Molecular e Ingenieria Genética (CTL Kee M Meu aK TOC UCKKI CHET) José Luque Angel Herraez eo.TEXTO ILUSTRADO DE Biologia Molecular e Ingenieria Genética Conceptos, Técnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud José Luque Cabrera Catedrético de Universidad Angel Herréez Sanchez Profesor Titular de Universidad Departamento de Bioquimica y Biologfa Molecular Universidad de Alcala Alcala de Henares. Madrid ELSEVIER SCIENCE ‘Madrid - Barcelona - Amsterdam - Boston - Filadelfia Londres - Orlando - Sydney - Tokio - Toronto,Es una publicacién © MMI Elsevier Espafa, S.A. Velazquez, 24-5.° Deha 28001 - Madrid, Espaia An Elsevier Science Imprint Fotocopiar es un delito (Art. 270 C.P.) Para que existan libros es necesario el trabajo de un importante colectivo (autores, traductores, dibujantes, correctores, impresores, editores...). EI principal beneficiario de este esfuerzo es el lector ‘que aprovecha su contenido. Quien fotocopia un libro, en las eircunstancias previstas por la ley, delinque y contribuye a la «no» existencia de nuevas ediciones. Ademés, a corto plazo. encarece cl precio de los ya existentes. Este libro esté legalmente protegido por los derechos de propiedad intelectual. Cualquier uso, fuera de los limites establecidos por la legiskacién vigente, sin el consentimiento del editor, es ilegal. Esto se aplica en particular a la reproduceiGn, fotocopia, traduccién. grabacidn o cualquier otro sistema de recuperacién de almacenaje de informacién. ISBN: 84-8174-505-7 Depésito legal: M-47839-2002 Impreso en Espatia por: Grifieas Marte, S.A.Prdlogo En la Presentacién de este libro, que tengo ol honor de prologar, los autores afirman que pretenden ceunir os con- ‘ceptos actuales de la Biologia Molecular y las modernas metodologias de la Ingenierfa Genética con vistas a su aplicacién a fa Patologia Molecular, humana’y animal, en sus diversos aspectos: etiologia, fisiopatologia, diagnéstico, pronéstico, terapéutica y prevencién de las enfermedades, y promocién de la salud. Y pretenden hacerlo desde una perspectiva pluridisciplinar e integradora dirigida, fundamentalmente, a los estudiantes que cursan las licenciaturas de Farmaci Medicina, Odontologia y Veterinaria, y las orientaciones biosanitarias de Biologia, Bloquimica y Quimica. Se trata, sin du- {da, de una empresa tan oportuna y ambiciosa, como comploja y dificil. Pero, a la vista del resultado alcanzado, puede afiimarse quo el éxito ha sido total. La elaboracion de un texto de las caractersticas mencionadas es oportuna y necesaria. En los titimos decenios, la Biologia ha experimentado un proceso de progresiva ‘molecularizacién’” que ha conducido a un nuevo paradigma biolé- gico que trata de entender lo que se ha denominado ‘la logique du vivant” (F. Jacob, 1970) o “the molecular logic ot the living state” (A. L. Lehninger, "Biochemisty’, 1970): las bases moleculares subyacentes a los procesos biolégicos. El reciente desciframiento del genoma de dlversos organismos, y muy especialmente del genoma humano, constituye una etapa fundamental que ha de hallar su continuidad en el no menos importante estudio de los proteomas. Siguiendo los pasos de la Biologia, la Medicina y la Veterinaria estan experimentando un proceso de “molecularizacién™ creciente que hha hecho emerger la que se ha llamado Patologia Molecular. Hoy en dia, el nivel molecular no es s6l0 un nivel de i vestigacién biomédica, sino también un nivel de actuacién diagnéstica, prondstica y terapéutica. Por ello, es imprescin- dible preparar adecuadamente a los futuros profesionales de la salud, ya que sélo si disponemos de protesionales ‘competentes podremos hacer frente con éxito a los rotas dol futuro, El ejercclo profesional de los aos venideros exigira ‘competencia para abordar a nivel molecular los problemas de la salud, Por ello, har falta profesionales que posean los Conceptos y los elementos de lenguaje molecular necesarios para comprender las bases moleculares de la salud y la en- ‘ermedad. Profesionales capaces de adquirr constantemente la informacién bioquimica necesaria para mantener su com- petencia, y capaces de aplicar dicha informacién a la solucién de los problemas que les concierman; profesionales con ‘capacidad de autoaprendizaje para poder susttur los conceptos caducos por los nuevos, haciendo uso de todas las posi- blidades que las modemas tecnologias de la informacién pondrén a su alcance. Para la formacién basica de tales pro- fesionales tienen gran valor los textos que resumen los nuevos elementos concepiuales de las diversas areas de la Biolo- gfa junto a las correspondientes téonicas y metodologias; ya que permiten que el estudiante adquiera una base sdlida ® partir de la cual podra ampliar los conocimientos acuciendo, luego, a las monografias especializadas, a las revisiones ©, incluso, a los articulos originales. Por todo allo, y por abarcar un campo hasta ahora insuficientemente cubierto, con- sideramos que la obra de José Luque y Angel Herréez responde a una necesidad urgente e importante. ‘Ahora bien, como hemos indicado, la empresa no era nada facil. Y no lo era por su cardcter de obra basica, dirigi- dda a estudiantes de varias licenciaturas y, por tanto, con formacién versa, y por su pretension de seguir un tratamiento pya eae) ans ps ones) “Tambor ass tic) fetomeratas (oniucdn) Copis de1 NA fom ol | Mis scones TRADUCCION [FRANSCRIPCION] ribonuclestidos (NTPs) ———=—__p [pp sermm sen Sep iam aa ae smomse patio comenlo trancenpiasas | SaiRs [FRADUCCION| Se iealva ce crore (coma erp por RNAS y ‘a min pe Fon RNA Ts rts om ence eet Sines Sie sesso Ca Zaina encima: epation sides neem Ica [un RSA componente da ribo2 INTRODUCCION Y ASPECTOS GENERALES EN EUCARIOTAS. Francis Crick intradujo el término “Dogma central de la genética molecular” para describir, incluso antes de Cconocerse su importancia real en los seres vivos, el flujo de la informacién genética y la ullizacién celular de dicha informacion. En conereto, la transmision de la Informacién contenida en la secuencia del DNA a las oéiulas y organismos descendientes mediante la replicacién, y su expresién en biomoléculas funcionales mediante los procesos de transcripcion y traduccién. Comprende, pues, el Conjunto de relaciones generales existentes entre el DNA, el RNA y las proteinas, Debe resaltarse que la representacién abreviada DNA > RNA — Proteina no indica la transformacién de una molécula en otra, tal como se indica normalmente en las rutas metabélicas, sino que cada elemento en la secuencia ‘porta la informacién necesaria para la sintesis del siguiente. En este sentido, es importante el concepto de plantilla 0 ‘molde molecular: aunque cada paso esta calalizado por una enzima, los sustratos (nuclestides, aminodcidos) no son ‘seleccionados por ella, sino que vienen especificados por la intervencién del molde, en conereto por su secuencia de nuclestides. El progreso en el conocimiento de los procesos de transmisién de la informacién genética obligé a la ampliacién de este esquema basico original para acomodar otros procesos que también ocurren, al menos en algunos organismos particulares, como es el caso de algunos virus: Siaess do una moléoula de FRNA como duplicado de un RNA eromosémco, Catalizade [por RNA replcasas Seda en ‘algunos virus, como el del ‘mastica del abaco, licack replicacion de! RNA ve ae replicacién plicac transmision de Ta { ) _tonsaioaon | (>) informacién genética (dogma central de la DNA RNA —Haduscion_ Proteina i ~__ Senet moleesley ) transcripcion inversa Formacin de DNA span dt RNA cromotiico, Calzada oa wanes inves. Por dh en los earevins 4.2 EL DNA COMO MATERIAL GENETICO: PASADO, PRESENTE Y FUTURO El conacimiento de la estructura de las Acidos nucleicos se inicia en el siglo XIX con el aislamiento en el nicleo celular de una nucleina formada por una parte dcida (hoy, DNA) y una parte basica (proteina), asi como con el estudio parcial de las propiedades de la nucleina y de su relacién con la herencia celular. Sin embargo, la estructura stlo se conocié a mediados del siglo XX, al mostrarse que el DNA era el componente cromosémico depositatio de la informacion genética. Cabe destacar en este sentido, como antecedentes clave, los experimentos de Oswald T. Avery, olin MacLeod y Maclyn McCarty, en 1944, y de Alfred D. Hershey y Martha Chase, en 1952, que constituyen un hito en el conocimiento del material genético a escala molecular. ‘Tras estas aportaciones iniciales, el verdadero inicio de la Biologia Molecular moderna lo constituyé la propuesta de estructura en doble hélice para el DNA, formulada, en 1953, por James D. Watson y Francis Crick. A partir de este ‘momento, casi todo el esfuerzo realizado se centra en el estudio del DNA genémico, desde el punto de vista estructural ¥ funcional, en procariotas y eucariotas, con una atencién especial a mamiferos en general y humanos en particular. Los ‘avances logrados, tanto tedricos como técnicos y aplicados, han sido enormes. A ello ha contribuido la aparicién de la Ingenieria genética, como principal area derivada de la biologia molecular. Queda pendiente para un futuro préximo la conclusion del Proyecto Genoma Humano (gendmica funcional), el andlisis de las funciones de cada gen (genémica funcional) y la diseccién de la estructura y funcién de las prote!nas (proteémica). Como expresién de estos nuevos ‘conocimientos, ha surgido una gran variedad de campos de actividad en las Ciencias de la Salud (Medicina, Farmacia y Veterinaria), tales como anticuerpos monoctonales, métodos inmunoquimicas, biochips para el diagndstico, clonacién ‘molecular y clonacién animal, farmacogenes, ingenieria de proteinas, proteinas recombinantes de interés diagnostico y terapéutico, sondas de hibridacién, terapia celular y terapia génica, transferencia de genes, vectores, virus, etc. Nuestto ‘objetivo no es descriir los aspectos concretos de estos campos, sino sélo poner de manifiesto las bases molecuiares ‘que les sirven de soporte, como punto de partida para un estudio detenido de cada campo en su correspondiente area ) . 01 4 10 100 1000 Peso ota del DNA (pg) Por otro lado, no existe correlacién alguna entre el tamario det genoma de distintas especies y el nimero de ‘cromosomas que fo componen. Por ejemplo, mientras que el genoma humano diploide (6,6 10" pb) esté repartido en 46 cromosomas (23 pares, n=23), las células de ratén, con un genoma menor (3 10° pb), poseen menor numero de ‘cromosomas (40); pot el contrario, en las células de cebolla un genoma 2 veces mayor que el humano (1,5 10" pb) ‘est contenido en solo 16 cromosomas. De forma similar, la mosca de la fruta, con un genoma (1,7 - 10° pb) mucho mayor que el de la levadura (1,6 - 10" pb), posee un niimero muy inferior de cromosomas (8 frente a 32). «4 304 ‘evi nematodes ae e (© Dicyostatum ‘Numero de cromosomas (2n) w4 ° Dreeophila 0 108 10 10° ‘Tamario del genoma (pb) Esta ausencia de correlacién entre cantidad de material genético y complejidad del organismo sugiere que el tamafio de los genomas de organismos superiores es muy superior al necesario y, por tanto, que una gran parte es 10 ccodificante, es decir, no esta organizado en genes, nunca traduce su informacién a un producto génico (RNA 0 proteina). Esta hipétesis ha sido confirmada al estudiar con detalle el genoma. Par ejemplo, se ha encontrado que los ‘genes tienen una longitud media de alrededor de 1.000 pb. Asumiendo esta cia, el genoma humano haploide podria ‘contener, en teoria, unos 3,3 millones de genos (pues cada aminodcido esta codificado por 3 nucleétides) y, sin OO ——————————————————————————8 INTRODUCCION Y ASPECTOS GENERALES EN EUCARIOTAS. embargo, se estima hoy en dia que sblo contiene unos 100.000, de modo que la proporcion codiicante s6lo alcanza alrededor det 3% de! DNA total. ‘Aungue la funcién de los genes esté bien establecida para una pequefia fraccién del total presente en el genoma humano, la Inexistencia de una correlacién entre cantidad total de DNA en el genoma y grado de complajidad del ‘organismo superior puso de manifiesto la necesidad de estudiar con mayor precision la organizacién estructural, a nivel ‘molecular, tanto del genoma (tema 10) como de los genes (tema 19). Los hechos més caracteristicas en relacion con la ‘complejidad del genoma nuclear son la presencia de grandes reglones que no codifican producto génico lguno (DNA ‘no codificanta) y la existencia de secuencias de DNA que se repiten un numero mas 0 menos elevado de veces (DNA repetitive). Como se estudiara con detenimiento posteriommente, hay que unir a ello la existencia de una enorme diversidad de secuencias (polimorfismo, tema 26) en distintas regiones del DNA, tanto sencilas como repetitivas, codificantes 0 no, 1.3.3 Magnitud y caracteristicas del genoma mitocondrial El genoma de organulos (mitocondrias en animales, mitocondrias y cloroplastos en plantas) es, posiblemente, un vestigo del cromosoma de bacterias arcalcas que accedieron al ctoplasma de eucariotas primitivos, para dar lugar tras la evolucion a dichos organulos. Se cree que la mitoconcria (organulo que aporta el 90% de la energia que necesian las células) surgié al acumularse el oxigeno en la atmésfera terrestre. Posiblemente, la mitocondria y el ndicleo de la célula eucerota se crearon a la vez, al Incorporarse por endoctosis células procarotas aerdbicas al interior do la cdlula ‘eucaritica anaerdbica y fusionarse ambas. Con el tiempo, la mayoria de los genes procaridticos. (genes protomitecondrales) se integraron en el genom nuclear, con lo que el eucariota primtivo anaerébico ya podia vir en una atmésfera aerdbica, rica en oxigeno; sdlo una pequefia fraccién de! genoma procaridtico primigenio permanecio en la mitocondra Las células animales poseen un niimero muy variable de mitocondrias, dependiendo del tejido. Cada mitocondria posee varias copias de un Unico cromosoma, situadss en la matriz mitocondrial y ancladas a la membrana interna. En ‘consecuencie, el nlmero de copias de DNA mitocondrial (mDNA) en una céluia oscla entre 200 y 100.000. El ‘eromosoma mitocondrial es bicatenari y circular, como el de procariolas, aunque de tamafo muy inferior: 16.569 pb en hhumanos, con una longitud de 5 yim y una masa molecular de 10 MDa; esto supone unas 3.000 veces menos que la tongitud del cromosoma nuclear més pequefio. Teniendo en cuenta el nimero de copias totale (2 del genoma nuclear y ‘mittiples, y muy variables, del mitocondrial), se puede calcular que el DNA mitocondrial total supone, dependiendo del telido, entre un 0,05 y un 20% del DNA toial de la celula, Finalmente, el cromosoma de cloroplastos es igualmenta Dicatenaro y circular, pro de mayor tamafo que el mitocondal. ‘diferencia del DNA nuclear, do gran compojitad, con rogiones codicantes y no codicantes, el {DNA os en su ‘asi tolaidad codiicante y no repeitv, En concreto, el cromosoma ritocondrial humano contiene un total de 37 genes: 2 para rRNA, 22 para tRNA y 13 para proteinas que forman parte de los complejos enziméticos respiratorios I, II, IV y V. Estas suponen solo el 5% de las proteinas mitoconériales, mientras que el resto estan codificades por DNA nuclear. meTema 2 Componentes fundamentales de los acidos nucleicos 24 Componente acido: Fosfatos.. 241.1 Monofosfates... 242 Difosfatos... 24.3 Taifosfatos. . 2.14 Tipos de enlaces fostaio. 22 23 Bases nitrogenadas mas frecuentes: 2 tipos.. 2 232 _Otras bases de interés biolégico y ciinico. 1B 23.3 Propiedades fisicoqulmicas de las bases purinicas y Pirie. 4 23.3.1 Existencia de dipoles. 14 2.33.2 Hidrofobicidad 14 233.3. Disposicion coplanar de los enlaces de cada anillo. (EN y CH 6). 14 2.33.4 Tautomeria o isomeria dinémica 14 2.3.35 Caracter basico... 16 233.6 Absorcién de la luz en el ultravioleta 7 Los acidos nucieicos (DNA y RNA) estan constituides por la unién de numerosos nucleotides, de 4 tips. Como introduccién a su estudio, se consideran algunos aspectos de interés para cad uno de los componentes estructurales de dichas unidades, los nucleétidos: Fosfato(s) Nucledtido: +. Aziicar Nucleésido Base nitrogenada ms 2.1 COMPONENTE ACIDO: FOSFATOS 2.1.1 Monofosfatos El osfato inorganico (P), mezcla de las especies quimicas resultantes de la disociacién de la moléoula de acido fosfoico, aparece como anién a pH acido, como dianion a pH fisiolégico y como trianién a pH alcalino. En la célula, el fosfato se encuentra en forma libre (P,) 0 formando parte de numerosos compuestos organicos (R-P), por ejemplo, ios udedtides.40 COMPONENTES FUNDAMENTALES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS “Tres eaulibrios de dsoincii en nein dt pH Acido fostérico: Gaon 2 oth or? wothon BE" oho ortofsfirice)! §— Ho—F—on "== oho == noSt—o" == “oro HPO, bu 1H & & —————osfato inorgénico (P;) ——— alcohol R-O! (> mezcla de las 3 formas iénicas del 4c. fosférico, on diferente proprcion segin el pH) Dos equlibvis de disociacién en fancién del pt: or R-o8P-07s= R081 a bu — fosfato orginico (R-P)—~ (Compuesto orgénico fosftado) 2.1.2 Difosfatos El difosfato © pirofosfato (PP)) se presenta a pH fsiolégico como trianién (una de las 4 formas iénicas del écido plrofostérico). Es estable en disolucion a pH neutro 0 alcalino; sin embargo, dentro de la célula es inestable por accion de las pirofosfatasas, formande 2 P;. Aparece combinado fundamentalmente en nucledsides-difosfato (por ejemplo, ADP), oto Castro equlibvios de dsoiacin en fms dl pl: (+ merc de as 4 formas ibnicas dt. pirofostric, ‘en diferente proporién seine pl) oo ° erie OO oud on 2) ~pirfosfato orginico (R-PP)— ‘(Compuesto orgnieo pirofosfatado) 2.41.3 Trifosfatos El trifosfato (PPP,) se presenta a pH fisiolégico como tetraanién. No aparece en forma libre, sino formando parte, ‘esencialmente, de nucledsidos-trifesfato (por ejemplo, ATP). acide trifostorieo oa Hto-f ou ——trifostato orginico (R-PPP) —— TealeesCOMPONENTE NEUTRO: AZUCARES "1 2.1.4 Tipos de enlaces fosfato Pueden distinguirse cinco tipes de enlaces fosfato que van a formar parte de los nuclestides. Obsérvese le estructura y nombre de todos ellos, asi como la diferencia entre enlace éster y anhidtido en los nuclestides aifosfatados: ytifostatados. SOLO CON ENLACES ESTER, (ON ENLACES TER Y ANHIORIDO; — q ° fonoéten, fstunhidido 7 R-o-lLo-n 4 R-O-F0-fo fosfoéster fosfodiéster: Caan: (osforonosster, un éster dable con Tafa fosfato, monofosfaio): ‘dos moléculas (irofostao, difesfeanbidrido) Sepa tetelansi ad ‘ferences fosfotser, oanhitrido — ffanbirido ° ° ° NIA. ~ 9 g bP OF 0 oo & é ake (citosfoanidr os fosfomonoéseres en sites diferentes de una (itosfoanhirido) misma molécula 2.2 COMPONENTE NEUTRO: AZUCARES El aziicar (inicialmente llamado ose) siempre es una pentosa (5 tomos de carbone), bien la D-ibosa 0 la D-desoxiribosa. La ribosa (nombre derivado de osa del Rockefeller Institute of Biochemistry, 1908) interviene en rudleésidos y nucledtidos bajo su forma mas estable, f-D-ribofuranosa, 1 @ i No=¢ ton = or] HOF o ONG —HOFTL_o oH x ix I 4 f wabon Me ncbon 9 o> KE F ( wy L H A 4 H hong He ‘non cuz0n fon nar cn on forma tincal, ‘forma cictica, (Proyeccién de HAWORTH) B-D-2-desoxirribofuranosa cncaemosieiden “Song f-b-ibofuranosa (@-desoiribosa) (ryecn de FISHER) om SA) RIBOSA) Semel oa [ cchertstemettn, ws yy OH HOCH: 6, " La formula representada como ejemplo puede extenderse a otras muchas moléculas de interés bioquimico: D-glucosa, D-galactosa, 3-desoxi-D-vibosa, etc.12 COMPONENTES FUNDAMENTALES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS 2.3 COMPONENTE BASICO: BASES NITROGENADAS ‘Son moléculas heterocialicas, con més de un tomo de nitrégeno, formadas por un anillo Unico (pirimidina) o por dos anilos condensados (purina). Obsérvense en los ejemplos de bases que intervienen en los dcidos nucleicos ta ‘numeracién de los étonos del helerocicio y la posicién de los susituyentes externos. 2.3.1 Bases nitrogenadas mas frecuentes: 2 tipos Férmulas y nomenclatura de BASES PIRIMIDINICAS Ni r Hy Z m mM 3 4 Wy (oy H H Ne icles citosina timina LJ a (Coxo-Laminopiinidig) —@24-dixo-Smeipirimiing) Sy7_ Pieinidina (G-metiracilo) Sistema de numeracion vl (QUB) de os tomes dl anil piriniina. N (Ait pin: = entdo hora) Formulas y nomenclatura de BASES PURINICAS (0 PURICAS) we) \ es y Pisimiina imiderol ry ‘ nicleo oy purina q adenine guanine (6-aminoprina) €@-amio-6onoparina Sistema de numeracién (UB) de los ‘toms dl nil purin aston eto enor: oil dz ss tre) amy | -0 |, mode de i 6 A resumen, i posiion de los e a z sustituyentes presenter aya enada una dels 5 7 x bases nitrogenadas es T aa [5COMPONENTE BASICO: BASES NITROGENADAS. 413 2.3.2 Otras bases de interés biolégico y clinico Existen otras bases purinicas y pirimidinicas, en general poco frecuentes, que surgen por modificacién de las bases principales A, G, C y U 0 de alguno de sus anélogos (hipoxantina, H). Son de origen natural o sintético, Interienen en procesos como ta metiiacién del DNA en la célula y muestran distintas propiedades (antibisticas, antivircas, antitumorales, ete). oatural, DNA bacteriano) (siti, etotdxiea) G6 soo obo &y, xanioa Aida rico cst ) (2,6-dioxopurina) —_(2,6,8-trioxopurina) (,3,7-trimetilxantina) itty poy ‘cons ‘eat wy en ny 9H BAN ao op! "hI S IL 26 OLD fer nycmtn Sy Moy NSW Shun HC-0* HyC-CH, 7 esmetiguanina scivi ACY penicori, rcv Wen (paturad) ©-Gcidroxictoximei)guanina) _ (949,4-dhidroxibutguanins) "GIL > -Axlogos sitticos usados en taps atv nS can 3 yo N N, sunna ® ye ; By CS IC poe 7S Ban“ Syo Nh Tet Han SN ‘H,C-O 3CH,OH Hycen-cH,on maigaina ganccovi, CV idyOrcrion (rats RNA) 0413-2 propoieteuaina lob BY (0423-bshidenimatpclbuilevria) rey een 2 cmon Cc) j ri oe] omy oy ¥ y y ctusing | Smetciosin —_—_Shidoxinetlctosina (cane, DNA vercbraon) (rata DNA bata) ° ° 9 ° ws |e ny ON Au) a) a A J AS OW} OW ow oy ° u ¥ " t y asia | ‘iownclo aiisrounctoS-beomounilo_s-tvracilo (ratral, RNA) (natural) into) (smn > anitumoral)14 COMPONENTES FUNDAMENTALES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS 2.3.3. Propiedades fisicoquimicas de las bases purinicas y pirimidinicas 2.3.3.1 Existencia de dipolos ‘Todas las bases poseen atomos electronegativos de © (excepto adenina), en posicién exociclica o extranuclear, y de N, tanto exocicticos como en el anillo, nucleares. Como consecuencia, son abundantes los enlaces polares, lo que les permite interaccionar entre si mediante puentes de hidrdgeno, que poseen una importancia capital en la estructura secundaria de los dcidos nucleicas, en especial del DNA. 2.33.2 Hidrofobicidad La naturaleza aromatica de fos anillos hace que las bases tengan un marcado cardcter apolar, sean hidrofébicas y poco solubles en agua al pH celular, cercano a la neutralidad. A pH acido 0 alcalino adquieren carga y se hacen més solubles en agua, Como ya se estudiard, las interacciones hidrofébicas de apilamiento, que tienen lugar enire bases 7 NH Destposde | R a me ce tautomerias | EEC ce c encrales ; forma amina & forma ceto forma enol forma imina primaria Son muchos los compuestos organtioos que existen como mezclas de 2 0 més de estas formas tautomérica interconvertbies y en equllbrio. Entre los compuestos heterociclicos son de especial importancia las tautomerias en la ‘bases purinicas y pirimidinicas, on las cuales la migracién del H tiene lugar desde un tomo de N nuclear hacia otro ‘tomo extranuclear, y viceversa: Tautomeria Tautomeria lactame-lactima imina-amina primaria + Dostiposae [ if NH ie tautomerias | « eA 5 py enlasbases | HY iN N “Ny is nitrogenadas 1 tactama factima ; forma amina (efomacer, | | («fom cnet, ocuos ising ipimana’ Sat mciary Nowa) (Nt nucle vet) neste caso, ef grupo ceto forma pate de wh ‘onlace aids cfeies, 0 aciama. Al migrar cl ‘tomo de H desde el N nuclear a O grupo cot, se conviore en el tautbmero cima Psa tautomers afecta 9G, nica purina oxo-sustituds, ya 1383 pirimidinas, CUyT, grupo exocicico es wna mina, aque al tecbir el duomo de H desde 'N nuclear se converte en wn ‘grupo amina primaria, Esta fautomeriaafecta ala nica pirimidina smino-sustiuida, Cy @ as2 purinas, Ay G.COMPONENTE BASICO: BASES NITROGENADAS. 15 En consecuencia, las tautomerias de las beses ntragenadas son las siguientes: Wh at La tautomeria de A es iy Oe imina-amina primaria. na 1 \ A SN 1 \ “Los tqutémers imine nomban ie u Fovienlounastericosobciaiemade SN ~N Noe base amina imina — Ty U muestran tautomeria oop doble lactams-lactima ~~ lactima doble — On ~— vy og Js, J = Sy lactima doble Gy C muestran tautomerias imina-amina primatia y lactama-lactima, Los taut6meros imina se nombran pponiendo un asterisco sobre Ia Tactama y letra de la beso, rina lactima e imina Desde el punto de vista quimico, en las bases libres las formas tautoméricas lactima (enol) @ imina son menos estables, y por ello son unas 10,000 veces menos abundantes que sus correspondientes tautomeros lactama (cet0) y ‘mina, con lo que el equilbrio se encuentra desplazado hacia la lzqulerda.16 COMPONENTES FUNDAMENTALES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS 2.3.3.5 Caracter basico ‘Todas las bases nilrogenadas son bases débiles, pues sus atomos de N, tanto nucleares como extranucleares, se pueden protonar, con valores de pk, comprendidos entre 9 y 10. Como elemplo representatvo, obsérvese la ionizacion de la adenine: uo a ron cic gy os = oH ocx oO as, ors (vatido samba => para G, C, T, U) ‘Sin embargo, este cardcler basico, propio de los anillos purina y pirimidina, se ve disminuido por la presencia de algunos sustituyentes. En conereto, el grupo -OH de los enoles (y lactimas) es ligeramente acide y puede disociarse: Ht eee ow AN Cas ‘Como consecuencia, las bases nitrogenadas que poseen grupos lactama (ceto) pueden actuar como acidos, @ través de sus tautémeros lactima (enol), con lo cual se ve reducido el cardcter basico propio de los anilos, en mayor medida cuanto mayor sea el nimero de grupos -OH. Véanse los ejemplos siguientes: a) Aes la Unica base que no tiene grupo ceto/enol y, por tanto, no muestra ningén cardcter acido y es la mas basica de todas. b) En Gy G, el nico grupo OH aporta un caracter acido muy débil, por lo que siguen comportandose como bases: NH NH Nt (vido también <) tewongre ry“) design O © a maa Ye)“ ‘ (forma lectama) (forma lactima) (forma lactima ionizada) ©) En Ty U, la presencia de dos grupos OH compensa en mayor grado el cardcter basico: 9 | . cH eee , y I ‘autogeria oe isociacjén aH + a A (forma (forma (forma lactima lactama doble) lactima doble) doble ionizada) > nveledsidos purinicos Base “eee <= ps pitimidinicn E> nuclessidos pirimidinicos Nucledsido: union covalente (N-heterdsido) ribosa => rbonucledsidos Acar desoxirribosa => desoxirribonucledsidosNUCLEOSIDOS Y NUCLEOTIDOS 1 Caracteristicas generales La union covalente (enlace N-glicosidico) entre la base y el azticar (ribosa o desoxirribasa) se establece entre el ©-1" (carbono anomérica) del azucar y el N-1 del anilo plrimidinico o el N-9 del anillo purinico, con pérdida de una ‘molécula de agua, OH (OH 3.1.2 Tipos de nucleésidos ete distinguirse entre nucle6sidos constituyentes de dcidos nucleices y otros nucledsidos de interés biolégioo y clinico. Su descripcién siempre se hace en funcién de fa naturaleza quimica de la base y del aziicar: 3.1.24 Nucleésidos que forman parte de acidos nucleicos honacle ribomcltnidon (se cnsuentancnctNA)y | “ewNay | desoxritonucessido desoxirribonucledsidos (sc encuentran cn el DNA) [esoxieribonucledsido (en DNA) (@0 DNA) timidina (oerise eo RNA, kcepconalmete 2, }2"-desoxitimidina (cologuial: tnidina) eden -BD- eon eon Seema wire ‘inion | (ocho NA) La distincién entre ribonucledsidos y desoximibonucledsides estriba, obviamente, en la presencia de ribosa © desoxirribosa en la molécula,ESTRUCTURA DE NUCLEOSIDOS 31.2.2 Otros nucleésidos de interés bioldgico y clinico 2 ‘Ademés de los componentes de nuclestides y dcidos nucleicos, existen en la naturaleza olros nucleésides en forma libre o combinada. Algunos de ellos son significativos por su localizacién o accién bioquimica, e incluso por sus aplicaciones clinicas. Deben citarse los siguientes: ‘COMPONENTES ESTRUCTURALES (poe Gemplo, en RNAS) on on ij inosina (1) 9.(B-D-ibofuranesi) hipoxantina ANTIBIOTICS: op psendouridina (y) \ SUB-D sbofuanes waco "AGENTES ANTIVIRALES V ANTICANCERIGENOS Hogi ay | bu co ina ||]|_ arabinasitadenina ae ilalnilamido) (Arad) fone " jena, (1"--D-arabinofuranosil) eS 1-8 pti — on arabinosileitosina (AraC) 1{0-B arabinfirmsi)NUCLEOSIDOS Y NUCLEOTIDOS ‘COMPONENTES DE COENZIMAS [por ye Cori Soi pico: A, yD Sauce Me= ‘cai ane Grn cei) P=-cH-cHCON, Gente propia ccobalamina S*-desoxiadenosina HOH |ESTRUCTURA DE NUCLEOTIDOS. 23 3.4.2.3 Andlogos de nucledsidos, inhibidores de la transcriptasa inversa ‘Se emplean para combatic los retrovirus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2), causantes del SIDA. En realidad actian como proférmacos, ya que la célula anfitiona los convierte en los correspondientes desoxinuclebsidos- 85-tllostato, que son los verdaderos férmacos, pues compiten con los desoxirribonuclestides normales, impidiendo que Ja tanscriptasa Inverse, propia del virus, sintetice e! DNA complementario al RNA virico. ANTIRRETROVIRALES age — cian a Bsructura a a 3 a Bi : wl " sot wor, ok 3arido- 23-didesoxi- 2 3-didesor Giipley | 2°3"Aidesoxi- citidina inosina ‘timidina Nombre AZT aT aac 31e mucledtidos purinicos , Base ntgogenada i ane Vv ribosa (> ribonuclestidos roasted Cf ae) EDD Antcar << -desoxirribosa >> desoxirribonuclestidos 321 Caracteristicas generales Launién, de cardcter covalente (fosfomonoéster), se establece entre uno o varios grupos fosfato y sendos grupos (OH del aziicar del nucledsido. La importancia de los nucledtidos es excepcional, principaimente porque son los monémeros constituyentes de los ‘cidos nucleicos y, por tanto, los productos normales de su hidrdlisis. Al mismo tiempo, porque aparecen en forma libre fen distintas localizaciones subcelulares, formando parte de moléculas de gran interés bioquimico (especialmente coenzimas), Para estudiar los nucleétidos se emplean distintos eriterios de clasificacién, atendiendo a: Caracteristicas estructurales, criterlo utiizado normalmente: E|ndmero y posicién en el azicar de los grupos fosfato: nuctedsidos-monofosfato, -bisfostato y -trisfosfato, Eltipo de azticar: ribonuctestidos y 2'-desoxirribonudledtidos. El ipo de base nitrogenada: nucledtidos purinicos y pirimidinicos. Cardcter lineal o ciclioo (determinado por el fosfato).24 NUCLEOSIDOS Y NUCLEOTIDOS + Otras caracteristicas, alas que s6lo se alude ocasionalmente: Sere eens ER riose icon — EET] mio e re wd a on 3.2.2 Nucleétidos sencillos ‘Se consideran nuclaétides sencilos los que presontan fosfato(s) en una sola posicién del azticar; esto incluye tanto los que tienen un Unico fosfato (monofosfates) como los que tienen dos o tres fosfetos que estén unidos entre si (ifosfates trfostatos). Se muestran como ejemplos los correspondientes a aden Nucledsidos-Monofostato: " Nilcledsides-Difosfato: (@ nomalmenteen3 05% rarmenteen2) | (Pconeetvo,nomatnente or 5) Ny Nib AN Eaae yen tr eres” fe] CL > Sy: 5 0 % gy ON’ y aame | O-fofoce io | aapr y "AMP ok ADP HOH OH En forma libre y como monémeros Sélo en forma libre; tienen funcién energstica consttuyentes de los dcidos nucleicos a ‘Sato en forma fibre. ‘Son los mas importantes por su flncién encrgética y/o ccoenzimitica, Ademés, son preeursores en la biosintesis de écidos nucleicos: aATP "ATP. Los nucleétidos que forman parte de los cidos nucleicos son siempre NMPs con un fosfato en posicion 5’. Su ‘estructura y nomenclatura se estudian de forma dotallada a continuacién. Los nucledtidos con 2 6 3 fosfatos consecutives en 5° (dfesfatos o NDP y trfosfatos o NTPs, rospectivamente), dada su importante funcién bioquimica, son objeto de estudio en cursos de Bioquimica General. Finalmente, otfos nucledtidos, con fosfatos en multiples: posiciones del aziicar, se estudian posteriormente como nuclebtides ciclices 0 complejos (pag. 28).ESTRUCTURA DE NUCLEOTIDOS 25 3.2.2.4 Nomenclatura Los nucledtidos se nombran segin dos criterios: a) Como ésteres fosfato del nucleésido. Por ¢): adenosina-monofosfato, guanosina-difosfato, uridina-tifosfato, tc. (abreviados, respectivamente, como AMP, GDP, UTP). 'b) Como dcidos, sustituyendo la terminacién del nombre de la base por el sufljo -llco. Este criterio sélo se utliza rormalmente para les nucledsidos-monofosfato. Por ej.: acido adenilico, Acido guantlico, Acido uridlico, etc. (‘espectivamente, para AMP, GMP y UMP). En el caso de nucledsidos-difosfato y -tifostato, se emplearian los nombres: Giadenitico,triadenilico, diguanilico, etc. (para ADP, ATP y GDP). Si se quiere tener en cuenta que los restos fosfato estan ionizados a pH fisiol6gico, se uiiza el sufijo ato: adenitato, quanilato, urdiato, ete. Correspondencia entre los nombres de bases, nucleésidos v nuclestid abreviatura comin: A G v T c base: adenina —guanina—_uracilo timina ——_citosina nucleésido: | adenosina guanosina _uridina imidina —_citidina nuclestido: . uridilato, _timidilato, _citidilato, (nucledsido~ ico fe. uridilico 4c. timidtlico 4c. citidilico monofosfato, NMP) UMP oTMP 0 CMP Bajo ambos criterios, para indicar de forma més detallada la estructura, se especifica el numero y la posicién de los fostatos. Pore} adenosina-S'-monotosfato Acido 5'-adentico S-AMP adenosina-3'-monofostato ‘cido 3'-adentlico 3-AMP ‘adenosina-5'-fosfato ‘Acido -diadenilico 5-ADP adenosina-5'-tifesfato ‘Acido 8'triadentfica S-ATP ‘Cuando no se especifica el nimero, implickamente se asume que el fosfato ocupa la posicién 5'. En este sentido, los dos ditimos ejemplos se nombran simplemente como ADP y ATP. Estos sistemas de nomenclatura se aplican tanto @ desoxiribonucledtidos como a ribonucleétides. Légicamente, para los primeros debe anteponerse el prefijo desoxi- 0 su forma abreviada, la letra d. Por ejemplo: desoxttimidina manofosfato, dTMP, desoxitimidiiato, 5- CL » caer fe K cme | Ato te 9 ox}, 3 oof we bn 0 Ht '-fosfato ciclico de adenosina 3',5’-fosfato ciclico de guanosina (AMP ciclico, cAMP) (GMP ciclico, eGMP) 32.5 Nucledtidos complejos Finalmente, se engloban en este apartado aquellos nucledtidos, no components de los dcidas nucieicos y con funciones diversas, que estructuralmento differen de los nucleétides sencilos en uno o varios de los siguientes espectos: + Vatios grupos fosfato esteriicados en posiciones mtiples del ezticar (bis-y tis-fosfatos, CoA, NADP"), + Presencia de dos nucledsidos, unidos entre si por un “puente” de grupos fosfato (FAD, NAD", Ap,A); éstos entran dentro de a categoria de dinuclestidos, + Presencia de otras bases ritrogenadas (FMN, FAD, NAD’, NADP’. ‘+ Presencia de azicares distintos de la ribofuranosa (FMN, FAD). ‘+ Grupos funcionales adicionales (CoA), BISFOSFATOS DINUCLEOSIDO POLIFOSFATOS Adenosina-3”,5"-bisfosfato, 9 Nuclesido-S—of Nucldsido hn (do 2.6,yencralente) jem $. indenosina isto, ‘ABA30 NUCLEOSIDOS ¥ NUCLEOTIDOS ‘COENZIMAS REDOX ‘Mononucledtido de flavina, FMN: Dinucledtido de flavina y adenina, FAD: nton u-t-0n or o=ho (ibosa + avina = rboflavina = Vitamin B ,, procursora de FMIN y FAD) Dinucledtido de nicotinamida y adenin Fosfato del dinuclestido de nicotinamida y adenina, NADP*: (icoinato = niaina,vtarina precursora de les eoenzimas NAD y NADH) Cocnzima A (CoA 0 CoA-SH): (coenzima de acetilacisn: transportador universal de grupos acetlo) Nh want lg nhl Srmeraptctlamina —Pealnima de. pantoco ‘ paniotnico| pantiinaTema 4 Estructura primaria de acidos nucleicos 441 Aspectos generales. 4.4.1 Niveles estructurales.. 42 Estructura primaria... 43° Formas de representacién lineal. 43.1 Formula completa — 432 Representaciones esquematicas.. 43.3. Representaciones abreviadas. : 44 Dos tipos de acidos nucleicos segin su composicién 45 _Propiedades fisicoquimicas de los Acidos nucleicos, 4.5.1 Propledades en disalucion 452 Reactividad. vv 453 Hidrlisis quimica de acidos nucteicos... 45.3.4 Hidrdlisis acida...... 453.2 Hidrlisis alealina 4.54 Absorcion en el ultravioleta. 44 ASPECTOS GENERALES ‘Tradicionalmente se considera que los cidos nuctoicos forman parte de los nucleoproteidos, el grupo més Importante de heteroproteidos o “proteinas conjugadas’, entre los que también se incluyen glicoproteidos y lipoproteidos 1y,€n ocasiones, también fosfoproteidos y cromo- 0 metaloproieidos. Efectivamente, los nucleoproteidos resultan de la Interaccion, mediante enlaces electrostaticos fuertes, de los residuos basioos (cationicos) de ciertas proteinas (histonas, Protaminas) y los grupos fosfato (aniénicos) del acido nucleico. El estudio detenido de estas asociaciones Rudecprotelcas se haré una vez conocida la estructura de los cidos nudleicos a todos sus niveles. Por su composicién quimica elemental (C, H, O, N y P), derivada de la presencia exclusiva de nucledtides en su estructura, jos acidos nucleicos se diferencian de las proteinas, esencialmente, en su mayor contenido de fosforo (10%) yen la ausencia total de azute. Funcom ‘en ndcleo celular J enTa zona nucleoide| dentro dela | Depostario y wanemisor de a (varios cromosomas), del citoso! capsida informacién genética, ‘en matriz mitocondrialy | (uncromosomay | (sdloen organizada en genes que ‘en estroma de varios plésmidos) | algunos tipos | codifican productos génicos loroplasios de virus) (proteinas o RNAs) fen nucleo celular ‘en cllosol “dentro de la_| Interviene en la transmision de (emporaimente), cépsida | Ia informacion desde el DNA en ctosol,, {en otros ipos | hasta los productos génicos ‘en matriz mitocondrial y de virus) enestroma de clovoplasios32 ESTRUCTURA PRIMARIA DE ACIDOS NUCLEICOS Existen dos tipos de acidas nucleicos, denominados ribonucieico o RNA y desoxirribonucleico o DNA, que differen en los nucledtidos componentes. Antes de describir su estructura, recordemos brevemente que ambos acidos ‘nucleicos se encuentran en todo tipo de células, tanto procariotas como eucariotas; como excepcién, los virus contienen séla DNA 0 sélo RNA, En todos los casos, sus diversas funclones en la transmisién y expresi6n de a Informacién genética vienen determinadas por su localizacién subcolular y su estructura de orden superior (conformacién tridimensional). 4.1.4 Niveles estructurales Desde un punto de vista estructural, en los cidos nucleicos se pueden considerar varios niveles, similares on cierto mado 2 los descrtos tradicionalmente para proteinas: ‘+ Estructura primaria, descrita por Ia uni6n de numerosos nuciedsidos mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar 2 un polimera lineal. El arden de los nucle6sidos (0 sus bases) en la cadena define la secuencia del écido nucieico. + Estructura secundaria, con la que se inicia el andlisis espacial do la molécula, correspondiente a la conformacién local, es decir, la disposicién relativa de nucledtides que estan proximos en la secuencia. Para el DNA este nivel ‘estructural viene definide por la asociacion de dos cadenas polinucleotidicas a través de las bases nitrogenadas que ssobresalen del esqueleto az(icar-osfato. En el RNA sélo se presenta en determinadas regiones de la molécula. + Estructuras de orden superior: Se englaban bajo este término genérico todas aquellas estructures tridimensionsles que surgen a partir de las niveles primario y secundario. En eucariotes son complejas, variables y ‘en ocasiones escasamente conocidas. En el caso del DNA pueden inciuirse aqul las estructuras resultantes de! superenrollamiento y de la asociacién con proteinas basicas para formar la cromatina. Sin embargo, y a diferencia de lo que ocurre en proteinas, en general la estructura adoptada a este nivel no viene determinada por las de los riveles inferiotes, En el caso de algunos RNAS (especialmente los tRNAs) se observa un plegamiento tridimensional bien definido, equiparable a la estructura terciaria de las proteinas. Aun en este caso, no se observa una estructura cuaternaria, ya que dicho plegamiento solo afecta a una molécula y no a varias asociadas entre si, como en las proteinas. 4.2 ESTRUCTURA PRIMARIA La estructura primaria, comin para DNAs y RNAs, consiste en la presencia de cadenas, generaimente targas, de ‘cardcter macromolecular, formadas por la unién de nucleésidos mediante enlaces covalentes 3'-5'tosfodiéster. Por tanto, la unidad monomética es el nuclestido, o nucledside-monofosfato (generalmente contempiado como 5-NMP).. Los cides nuctoicas son, por tanto, pollmeras de nucledtidos 0 polinucleétides, con un esqueleto lineal {formado por unidades alternas de fosfato y pentosa (parle constante de la secuencia), del cual sobresaien lateralmente las bases (parte vatiable, que define la secuencia), unidas al azicar respectiva por enlaces N-glicosidicos. Por converio, la secuencia siempre se indica en direccién 5' > 3', es decir, con el extremo 6" terminal (5-P) ala Tequierda y el extremo 3" terminal (3-OH) a la derecha. 9 ° z a: 5*..-P-0ba-P-osa-P-osa-P-osa-...3” Dentro de este nivel estructural se estudiaran a continuacién las distintas formas de representacién, las diferencias ‘en composicién quimica de los dos tipas de dcidos nucleicos y sus propiedades fisicoquimicas mas representativas. 4.3 FORMAS DE REPRESENTACION LINEAL Pueden emplearse hasta 6 niveles, de simpliicacién creclente. En general, se hace uso de la letra inicial de tas, bases, en mayisculas, para representar a éstas o a sus nucle6sidos. El cido nucleico propuesto como ejemplo es un RNA (azicar: tlbosa y bases: A, G, U y C), poto las representaciones son igualmente validas para un DNA (azicar: desoxirribosa y bases: A, G, Ty C). 4.3.1 Férmula completa Por razones de espacio y fundamentalmente didécticas, es aconsejable comenzar con una representacién vertical del esqueleto del Acide nucieico (natacién 1 en le figura), que permite apreciar con detalle los enlaces fosfodiéster entre rucledsidos consecutives (uniones azicar-fosfato) y la situacién perpendicular al esqueleto de los enlaces Nglicosidicos (uniones azicar-base). Para mantener la orientacién 5° —> yal extremo 3-OH en la Inferior. 0 sitda ol extremo 5°P en la parte superiorDOS TIPOS DE ACIDOS NUCLEICOS SEGUN SU COMPOSICION 33 [jemple un tetranucleido Represetacones equcmiticns Esqueletocovalene lineal de mucedsidos ‘unis por enlaces fosfodidtr, com las bases Dacia fers, ae 3 z. © acue exqueleto (emepolary (piel onan) yar). 43.2 Representaciones esquematicas Como peculiaridad de esta representacion, el anillo furandsloo del azucar se simplifica mediante un solo trazo vetical, cuyo extremo superior corresponde al C-1" y el inferior al C-5' (notacién 2 en la figura). En una forma atin més simple se omiten los fosfatos intermedios y la numeracion de los aziicares (notacién 3). 43.3 Representaciones abreviadas La simpificacién se puede aumentar indicando cada nucledsido mediante la letra inicial de su base nitrogenada (lo Sica variable en la secuencia), El polinuclestido queda as! reducido a una sucesién de letras mayisculas intercaladas con letras p mindscules (notacién 4). El extremo 5'P (a la izquierda) viene representado por una letra p seguida por la letra del primer nucledsido. El extremo 3'-OH, a la derecha, viene dado por la letra del ultimo nucledsido. Los ‘udeésidos intermedios llevan la p a izquierda y derecha, correspondientes a las posiciones &' y 3',respectivamente, En la descripcién colidiana de secuencias de cides nucieicos se suprimen las letras p inlermedias, con fo que la ‘epresentacion se reduce @ una secuencia de letras precedida por una letra p para el fosfato en ol extremo S° (otacin 6), 0 se asume la presencia del fosfato en 5" y se omite incluso esa primera p (notacién 6). 44 DOS TIPOS DE ACIDOS NUCLEICOS SEGUN SU COMPOSICION ‘cide aio: [_ Acido ribonucleico (RNA) __ | Acido desoxirribonucleico (DNA) Monsmeros: Ribonuclestidos Desoxirribonuclestidos 2 rae ‘rlazando Tox nonbrieror enlace Tosfodxte) + |e Ribosa F-Desonieribors q ‘Adenina, A (6-aminopurina) 3 Purina 2 | ames Guanina, G (2-amino-6-oxopurina) b Citosina, C 2-oxo-4-aminopirimidina) E | Pirimiainas é Uracilo, U Q.4-dioxopirimidina) | Timina, T (S-metiluracilo)34 ESTRUCTURA PRIMARIA DE ACIDOS NUCLEICOS ‘Sagan la notacion de f6rmula completa, la representacion de ambos dcidos nucieicos es la siguiente: PERNA ; DNA 4.5 PROPIEDADES FISICOQUIMICAS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS ‘Los acidos nucleicos presentan propiedades importantes en relacién con sus funciones de almacenamiento, ‘ransmisién (replicacion) y expresion (transcripcion y traduccién) de la informacién genética. Se comentan aqui brevemente algunas de ollas, relacionadas con la estructura, y el resto se iran estudiando a medida que surja su aplicacion al propio estudio de estas moléculas (por ejemplo, Ia renaturaizacion de un DNA desnaturalizado se ‘analizaré como fundamento de la hibridacién). 4.5.1 Propiedades en disolucién Las cadenas polinucleotidicas de DNA y RNA son hidrofilicas, debido a la posibilidad de formacién de enlaces de hidrSgeno con el agua por parte de los numerosos grupos fosfato y -OH libres del azticar a lo largo del esqueleto, Por otto lado, a pH fisickigico los grupos fosfato (pK, préximo a 6) se ionizan casi por completo, haciendo que las moléculas de DNA y RNA se comporten como acidos y tengan numerosas cargas negativas. Debido a este cardcter ppolianiénico, los dcidos nuclelcos se encuentran casi siempre neutralizados por interaccién iénica con las cargas positivas de otras moléculas. Concretamente, el DNA del genoma nuclear eucariético se encuentra unido a histonas, protelnas ricas en Arg y Lys, cargadas positivamente a pH fistol6gico, dando lugar a nucleoproteides; la importancia de ‘sia asociacién se consideraré posteriormente (pg. 84). En los espermatozoides, el papel de las histonas es desempefiado por pequetias proteinas ricas en Arg, lamadas protaminas y también con fuerte carga positva, En otras ‘ocasiones, el DNA se une a pollaminas (principalmente espermina y espermidina, asi llamadas por haber sido I Tortuga 27 279 220 213 | 108 103105 | 33 Salman 297 21 208 moa] v2 102 102 | 443 Erizo de mar we m1 7 wa] 12 102 102 | 185 leactoras: Escherichia cot 247 236 260 256 | 105 102 103 | 094 Staphylococcus aureus} 308 292 210 190) 105 nt tor | 1.50 Ghlostidium peringend 368 363 140 128] 102 109 104 | 273 bay Brucala abortus 210 211 290 289] 00 400 © 400 | O73 ‘Sarcina ite 138 124 371 37.1 | 108 1100 102 | 035 Fago $174 (monofiar) | 243 327 24,1 185 | 074 190 095 | 1.34 Fagogt74,forma | 26.3 264 «22,9 223] 100 100 4.00 | 48 replicativa (bier) 5.1.1 Algunas relaciones entre bases son iguales en todas las especies ‘Appesar de que la composicién varia entre especies, en todas ellas se cumplen clertas relaciones entre las bases, {ormuladas como las tres primeras reglas de Chargaff, que se exponen a continuacién. 5.1.1.1 Relacién entre bases En practicamente todas las especies, el contenido de A se aproxima al de T, y el contenido de G al de C: Ax T + Razon AT TIA = 1 Gec > Razin GiC= C/G = 1 Esta observacion fue esencial para que Watson y Crick postulasen los pares AT y GC, que definen le ‘complementariedad de bases en el DNA de doble hebra. Hay que destacar que esta regia no se cumple para las pocas especies cuyo material genético esté formado por RNA o DNA de hebra sencila (comparense en Ia tabla los ejemplos del virus $174, en sus formas de hebra sencila y de doble hebra). 5.1.1.2 _ Relacién entre purinas y pirimidinas Como consecuencia de lo anterior, el contenido de bases purinicas (A + G) se aproxima al de bases pirimidinicas (T+ ),es decir, hay un 50% de purinas y un 50% de pirimidinas: AMG = THC 50% -» Razin (A+G)/(T+C) a1 > — Razén_purinas//pirimidinas = 1MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA 39 5.1.1.3 Relacién entre aminobases y oxobases Al observarse que A/T = GIG = 1, también se ha de cumplir (por razones estrictamente matematicas) que (A*C) / (TG) = 1. Por tanto, puede concluirse, como relacién adicional (sin un significado especial), que: 6-aminopurinas (A) + 4-aminopirimidinas (C) = 6-oxopurinas (G) + 4-oxopirimidinas (T) 5.1.2 Otras relaciones son diferentes segun la especie tres relaciones entre bases no se maniienen constantes entre especies; de entre ellas, resulta Util la denominada raz6n de asimettia: AtT Gc ‘que, ademés de tener un valor diferente para cada especie, no se aproxima a la unidad como las razones anteriores {Ver tabla). Por ejemplo, en animales la razon de asimetria es siempre superior a uno; lo mismo ocurre en plantas ‘superiors y hongos. Por contraste, en bacterias y virus los valores son mucho més veriados, superiores o infeiores a la vnidad, La razén de asimetria puede también calcularse directamente a partir del contenido en G+C, pardmetro habitual en otros tipos de estudio, como la desnaturalizacién del DNA: WALT _ (AID, _ 100-4(G4O) az6n de asimetia = Ce GHC) AGC) De acuerdo con el, los animales, plantas superiors y hongos muesran un exceso de AsT (50-65%) sobre GC (50.25%), mientras que en bacleriasy vius se apreca la gran varablidad en G+C (75-25%), 02s 04s ows sas g ALT GC ——— a m7 wo 3 20%GHC aimalos En resumen, con estos estudios se ha observado que los DNAs de especies evolutivamente relacionadas tienen ‘na raz6n de asimetria similar, mientras que las especies muy alejadas tionden a tenor una raz6n diferente. A pesar de ser ésta la menos conocida de las reglas de Chargaff, el hecho de que permita distinguir entre especies hace que pueda ublzarse como criterio en las relaciones evolutivas y las ciasificaciones taxonémicas de los organismos. 5.2 MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA £1 modelo tridimensional, como estructura de referencia para las propiedades del DNA. fue postulado por James Watson y Francis Crick en 1953. Corresponde a la actualmento denominada forma B del DNA, la mas comin en las ‘Bilas y la més estable de todas las que puede adoptar un DNA bajo condiciones fisioldgicas. Este modelo se bas6 tania en las observaciones por rayos X como en las reglas de Chargaffy, por tanto, esté de acuerdo con ellos, asi como ‘on ottos estudias realizados modiante un gran nimero y variedad de técnicas. Simulténeamente se propuso la adeaiacion del modelo a la funcionalidad de la molécula de DNA para la conservacién y transmision de la informacion genética (pq, 49), Presenta las siguientes caraceristicas basicas: 5.2.1 Complementariedad de las bases nitrogenadas La estructura quimica de las bases permite la formacién de enlaces por puente de hidrégeno (dos étomos lectronegativos, como N y O, comparten un tomo de hidrégeno). En concreto, dos nucleétidas pueden interaccionar e forma especifica mediante dichos enlaces y so habla de “bases complementarias", “pares de bases” 0 “apareamiento de bases”.40 ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA Para una mejor comprensién de la complementariedad, es conveniente establecer unos eriterios previos en cuanto ‘ala escritura de los nuclestidos en cada pareja de bases. Se trata con ello, simplemente, de faciltar la descripcién de ‘unas estructuras relativaente complejas: Férmulasde | Formulas con la base girada 180° vane se eet Sito, (eta "Saal finde deca ert athe dente Suc omain pan Eats “ tte ame ett ‘ ~ Aceptor de u 0 A “ Cdeeptor de 1) "1 0) bi xr Dowactor den T/U terse Aceplor det en en G 3 se Dar det o acne c Aes de fata disposi, con abate _Exta disoscn, con a base Sigue siendo fobreclaviea i enomina lj el area se denomina contri aut ‘conformacion sin tonformacibn antiMODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA. a Al representar un par de bases, se emplea la fSrmula de tipo 2 para el nucleéido situado a la iquierds, y lade tipo 3 para el stud ala derecha (ambas conformacin ann) _y Timina (o Urailo) pueden formar 2 enlaces por pucnte de hidrgeno: del rupo C-OenC-4deT con H del grupo NH en C6 de A. HenN-3deT. con_Nelde A. ‘Guanina y Citosina pueden formar 3 enlaces por puente de hidrOgeno: del grupo NH; en C-4deC con del grupo C=Oen C-6 de G NB dec con Hen N-l deG. del grspo C=O enC-2deC con _H de grupo amino en C-2 de G Las interacciones Optimas se forman entre G y C (tres enlaces de hidrégeno) y entre A y T, 0 bien Ay U (dos. enlaces de hidrégeno). El par G=C establece asi una interaccion més fuerte que el par A=T (en el DNA) o el par (en el RNA), Obsérvese que siempre se forma un enlace de hidrégeno entre los dos atomos de N nucleares, mientras {ve os restantes se forman entre un grupo amino exociclico y un grupo earbonila ‘Son también posibles otros apareamientos entre bases, denominados “de tipo Hoogsteen’, que aparecen menos ‘recuentemente y no forman parte del B-DNA. Por ejemplo, en el RNA (pag. 73), en las triples helices de DNA © RNA (089.60) y en la interaccién codén-anticodén (pag. 296). 5.2.1.1 Consecuencias de la complementariedad Gracias a la complementariedad descrite, dos cadenas polinucleotidicas se pueden asociar siempre y cuando {odas sus bases sean complementarias. Este apareamiento completo de las dos cadenas da lugar a un acide nucleico de doble hebra o doble cadena, estructura habitual del DNA. Esio quiere decir que siempre que en un DNA exista A, 6,CoTenuna cadena, se encontrardn T, C, Gy A, respectivamente, en la otra Es importante destacar que la complementariedad entre las dos hebras del DNA es fundamental para su papel ‘como portador de la informacién genética. Por un lado, porque se reduce la posibiidad de que las bases se modifiquen uimicamente, Por oo, porque se facta la carreccién de mutaciones y de errores producidos durante la repicacién del DNA. Finalmente, porque la informacion esta en cierto modo duplicada, aunque las secuencias de ambas hebras son dierentes entre si (p49. 44). ‘Ademas, la existencia de la complementariedad explica las reglas de Chargaff (pég. 38), y justifica dos ceracteristicas estrucurales importantes, la heliidad y el antiparalelismo, que se estudian mas adelante.42 ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA Tustracion, mediante un ejemplo hipotético basado en la composicién del DNA humano, de ‘camo la doble hebra del DNA permite explicar ls reglas de Chargaft ‘Composicién de bases ‘% moles en %moles en % moles en hebra! —hebra 2 ladoblehebra | Regia de Chargatt ysus y sus, y; ee ‘correspondiente: 2a By 25 i asx" 2s ‘AG =purinas 7 8 (C+T =pimicinas a sr purinas/pimiinas | 1.33 0.75 ‘AeC=aminobases | 47 iS) GHT = oxobases ar ar aminoloxobases | 1,08 0.92 Relacién entre bases individuales: C= Relacién entre purinas 'y piimidinas: AG ICH ssjsses Relacién entre ‘aminobases vyoxobases: =t oes El apareamiento implica que el contenido de una base en una obra ha de sor igual al desu base complementaria en Ia otra heb. Por ello, la reglas de Chargaff se cumplen euando se considera Ia composicién total del DNA de doble hebra, pero no para cada hebra por separado, ya que en este caso, AZT y CG, Tampoco se cumplen las teglas en ls dcidos nucleic de eadena sencilla (2), RNAy DNA virieo), nde A#U, Ae T y C26. 5.2.1.2 Efecto del pH sobre el apareamiento de bases Los cambios de pH, al afectar a la ionizacién de los grupos funcionales de las bases nitrogenadas y al equilibrio de tautémeros, modifican las posibllidades de formacién de enlaces de hidrogeno y, por tanto, el apareamiento de bases. ‘Gada base tiene otras Tormas resonantes y laulomericas, no indicadas) Como consecuencia, a valores de pH Inferiores 0 superiores al fisll6gico el menor numero de enlaces de hidr6geno posibles provoca la separacién de las hebras componentes del DNA, fenémeno denominado desnaturalizacion (pag. 164). No debe confundirse este efecto con la hidrélisis Acida o alcalina, bajo condiciones més ‘exiremas, de las cadenas de Acido nucleico (p49. 35).MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA 43 52.2 Geometria de los pares de base! A pesar de fa diicultad de visualizar la geometria de un par de bases en ausencia de un modelo cercano a la ‘eal (modelo tridimensional, sea material oinformatco), se describe a continuacion dela forma mas fel posible a farmacién de un enlace de hidrégeno requiere que los tres étomas implicados (dos electronegavos yun H) se sien sobre una linea recta, Esta condicién sdlo se puede cumplir cuando los dos enlaces Neghcosidions do ioe ‘ucledsidos complemontarios forman un éngulo, inferior a 90°, con la linea imaginaria que une los C-1" de. amos penloses. Este geometria del par de bases determina la disposicion espacial relativa de las dos hebras en el DNA (helcded) y 0 la causa a nivel molecular de la presencia de sufcos menor y mayer en su estructura uidimossionel ‘ambos eepectos se analzan en detale mas adelante (pags. 45 y 48), representacién bidimensional modelos tridimensionales del par de nucledtidos del par de bases (90 se mwestan los H) 1 desoxirribosa casi perpendicular it perpendicular a ““inbase (0 anibr queda hacia” i, Tnbase (10 anor Qucda nace aris y el PS" hacia detente, | delantey el P-S" hacia ats, “._, fespecto al plano del papel) _/ __‘respeetaal plano del papel ao Ee aes ~N cdots Prinapl, AA —.08 sm —__p> ATO A+B) 2 <2 como consecuencia: YA*G)neprat > MAG) pebea2 MP+Chetat <%T*OeadMODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA 45 En principio, a existencla de hebras equiliradas 0 no se reflere a regiones localizadas de una molécula de DNA, Exist, sin embargo, un ejemplo singular en el DNA mitocondrial humano: considerado en su conjunto (16,5 kb), sus dos hebras son desequilbradas, pues una es mas rica en purinas que la otra (58 y 44%, respectivamente). A la primera se le lama habitualmente *hebra pesada" (o hebra "H’, del inglés heavy, recuérdese el mayor tamatio del anillo purinico} y ala ota, "hebra ligera” (0°L", de igh? 525 Helicidad y caracter dextrogiro Las restricciones estéricas impuestas por la geometria de los pares de bases (que incluye los enlaces entre base, pentosa y fosfato, pég. 43) hacen que el apareamiento completo de las dos hebras solo se pueda establecer silos pares ‘de bases sucesivos van gitando unos con respecto a otros (coneretamente, 34,6° en el B-DNA). Como consecuencia de le ecumulacion de estos giros, las hebras de DNA adoptan una disposicion hellcoidal (as decir, cada hebra describe une hiélice)yla cadena de doble hebra os una “doble hélice". ‘Geométticamente, una hélice (genérica, no de DNA), sea sencilla o doble, puede ser de dos tipos: oe haloes helices dextrogies, levégias, a ders, ee Sensenido ss Snort hilice lice lice belie senciia— dobie sencila dob En el caso de la forma B del DNA ambas hebras se enrollan alrededor de un eje comin, longitudinal, formando. luna doble hélice dextrégira. La observacién de modelos moleculares tridimensionales permite una mejor comprensién de este carécter helicodal pltno. 5° “Modelo tridimensional dela asosiacion de dos i.” hone ZN rl estabilizan la Ce fasta doble hélice del meracel -azéicares y | DNA: fmereocinecs fostatos) | (i a Tuerzas hidrofébicas | {e apilamiento de I bases 5.2.8 Superficie de la molécula: surcos en el DNA Como se ha observado, la geometria de los pares de bases (pag. 42) y el antiparalelismo de las hebras (pag. 43), nevesarios para la formacién de los puentes de hidrégeno, hacen que los C-1" de los azicares de los dos nucledtidos ‘complementarios no se dispongan simétricamente con’ respecto a las bases , por ello, que los esqueletos desoxinibosafosfato de las dos cadenas no se sitien en puntos diametralmente opuestos de la doble helice. Como ‘consecuencia, a todo Io largo de la estructura en doble hélice se forman dos surcos, uno mayor (o hendidura profunda) y ‘otro menor (0 hendidura pequefia), que van girando de forma helicoidal, al igual que los dos esqueletos. Los surcas, ‘especialmente el mayor, dejan espacio suficiente para que moléculas externas puedan contactar con las bases; éste es ‘1 fundamento de la intoraccién del DNA con numerosas proteinas capaces de reconocer secuencias de bases, (Pq. 60), con funciones tan importantes como la regulacion de la expresién génica (por ejemplo, factores de \anscripcién). En cierto modo, es com si las proteinas “leyeran” la secuencia a través de los grupos funcionales de las bases que “asoman” dentro del surco mayor del DNA.MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA 8 DEL DNA 49 ‘gener et genera el T + 2 Ac (3s G MOM = we? No ee Modelo simplificado para apreciar la Tormacidn de los surcos, como cconsecuencia dela asimetria de los pares de nuclstides: 5.2.9 Significado biolégico: idoneidad para la replicacién 1 modelo de doble hélice de Watson y Crick permite explicar ‘que se mantenga una estructura regular a pesar de la varlacién de sequendia y que se produzca, mediante un mecanismo muy simple, 4a duplicacion det material genético. En resumen, la replicacién procede de una manera légica, con dos procesos: (a) la separacion elas dos hebras, y (b) la sintesis, a partir de ellas como molde, de ‘ras dos cadenas complementarias (los detalles de este proceso se estuaiaran posteriormente, tema 12). También permite la raparacién {de mutaciones y daftos en una hebra, al disponerse de la otra como relerencia de la secuencia correcta.Tema 6 Variaciones en la estructura del DNA 64. Variantes en doble hebra: formas A y Z.. = 8.4.1 Forma A del DNA, en comparacién con la forma Bs... 6.1.2 Forma Z del DNA, en comparacién con las formas B y A. 62. 'Variantes locales de la estructura secundaria del B-DNA.... 621 Curvatura de la doble hiélice. ee 622 Palindromos ve 62.2.1 Concepto y caracteristcas. 62.2.2 Repeticiones de secuencia 6.2.2.3 Palindromos en moléculas de hebra seni 62.2.4 Consecuencias estructurales de los palindromos. 4) En dcidos nucleicos de hebra sencilla... b) En DNA de doble hebra... 62.2.5 _Funcionalidad de los palindromos. 623 _H-DNA: triple hélic. ns — . 63 Motives estructurales responsabies de la unién del DNA con proteinas... 6.3.1 Descripeién de los motives estructurales mas frecuentes... 8.3.1.1 Motivo héice-giro-hélice o hélice-vuelta-hélice, 6.3.1.2 Motive hélice-bucle-hélice 6.3.1.3 Motive homeodominio 6.3.1.4 Motive dedo d9 ZINC nnn 63.1.5 Motiv cremellera de leucina...... La molécula de DNA no es una estructura estatica, sino flexible y dinamica. Gracies a la capacidad de rotacién 2,53 nm (25,3 A) 3,54 nm (35,4 A) “4,56 nm (45,6 A) Tnclinacion del pigno de tos 19 “WP (casi perpendicular e pares de bases * (graninclinacién) __“alejedelahelice) __igerainctinacién) ‘Surco mayor 0 grande Estrecho, profunde _Ancho, profundidad media_Plano, sin profundidad Sureo menor © pequefio ‘Ample, no profunde—Esteco,prundad— Esrcho, proundo media Enlace N-gicosidico Ant Anti ‘Sin (Ty Anti (G) Notas: Distancia entre pares de bases, medida al largo del ee dela hace. 2 Retacién por cada par de bases, o gro respecto al par anterior (+ dextrégiro, levi). 3 Longjtud deta wela de hice, medida a lo largo doje: coloqualmonto "paso do rosea" 0 “paso de hélics” “+ Inctinacin respecte al plano perpendicular al eje dela hice. 6.1.1. Forma A del DNA, en comparaci6n con la forma B La reduccién de la humedad relativa por debajo del 75% (por ejemplo, en disoluciones muy concentradas, es decir, deshidratadas) hace que el B-DNA tienda a transformarse, como ejemplo de la flexiiidad de la molécula, a otra ‘conformacién, denominada A-DNA. Aunque esta forma no se ha encontrado bajo condiciones fisiolégicas, su estucio es de interés por ser la que adopta el RNA cuando pose regiones de doble hebra, as! como la de los hibridos DNA-RNA, Estructuralmente, e! A-DNA es similar @ la forma B: es igualmente una doble hélice dextrégira, con hebres ‘complementarias y antiparalelas unidas por enlaces de hidrégeno. Sin embargo, difiere en sus dimensiones: la hélice A ‘95 mas ancha (mayor dimetro), mas corta para un mismo nimero de nucledtides (menor distancia entre pares de bases) y tiene mayor némero de bases por vuelta, Como consecuencia, son menores la rotacién por cada base y el paso de hélice. Ademés, las bases no se disponen casi perpendicularmente al eje de la helice, sino claramente inclinadas, y se sitdan més separadas del ojo de la hélice. La superficie de la molécula es también diferente: el surco mayor es més estrecho que en la forma B y muy profundo, mientras que e! surco menor casi no se aprecia por ser ‘anche y poco profundo. Mientras que la forma 6 puede acomodar en su surco menor una columna de moléculas de diferencia explica, al menos en parte, por qué ‘agua, el surco superficial de la forma A no ofrece espacio sufciente; la deshidratacion favorece la forma A.VARIANTES EN DOBLE HEBRA: FORMAS AY Z 53 Para mostrar las diferencias estructurales se puede emplear un modelo de “cintas”, donde el esqueleto se representa por una cinta, de la cual se destacan los anillos pentagonales de desoxirribosa, sus dtomos de oxigeno (esferas) y los grupos fosfato (varillas que sobresalen). Cada nucledtido est representado en un color diferente. La secuencia en ambos casos es la misma: (5°) GEGTATACGC (3') G’) CCCATATECE (5') [A-DNA B-DNA yor inclinacion pe ees bases doxrdgica Este mismo modelo (visto desde su parte superior) permite ilustrar que la hélice A es mas abierta, con mayor didmetro y una disposici6n de las bases mas alejada del eje de la hélice: 2,55 am cree 237m —__oOv!"— <=. eje de la hélice54 VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DNA Una visién complementaria a la anterior, ala vez que més cereana a la realidad, es la del modelo espacial compacto. Las bases estén coloreadas en rosa y el esqueleto de pentosas y fosfatos en verde. |A-DNA B-DNA 237m, stad Waices feos 25m aa oa am bases inclinadas: 19° mis corta| dexindgira Las diferencias, recién comentadas, en la estructura de las dobles hélices A y B vienen originadas en altima instancia por la diferente disposicién de los pares de bases, debida concretamente a una distinta conformacién de la desoxirribosa: En el A-DNA, el C3’ sobresale del plano formado por fos otros cuatro carbonos de a ribafuranosa {(conformacion C3'endo), mientras que en el B-DNA es el C2’ el que no es coplanar (conformacién C2'-endo).. P i 3 Hag be* t e 7 a ereceeyoonmm gf ‘conformacién C3"-endo (A-DNA) Esta distinta conformacién del anillo de ribosa hace que en el A-DNA los dos grupos fosfato consecutivos estén ‘més proximos entre si, lo que explica que los pares de bases sucesivos se acerquen, acortando la cadena ‘Similarmente, el cambio en la geometria conduce a los diferentes parémetros geométricos ya comentados.VARIANTES EN DOBLE HEBRA: FORMAS AY Z 55 6.1.2 Forma Z del DNA, en comparacién con las formas B y A La existoncia de la forma Z surge por primera vez de la observacién, mediante difraccién de rayos X, de una doble hice del hexanuclestide CGCGCG, con caracteristicas distintas a las formas B y A; entre ellas, como muy signictive, su giro a izquierdas 0 levégiro. Posteriormente, se ha encontrado esta estructura en otros oligonucledtidos. sintSicos con secuencias de purinas y pirimidinas alteras. Aunque in vivo predomina el B-DNA, se ha podido obsorvar la presencia de algunas regiones Z en el genoma de células eucariéicas, empleando anticuerpos contra esta dltima confermacién. Su funcién, ain por confirmar, parece estar relacionada con el control de la expresién génica y con la recembinaci6n, En cuanto a sus dimensiones, observadas ahora comparativamente con las otras conformaciones, se observa que Iehilice Z es la mas estrecha (1,84 nm de diametro), la mas larga (mayor distancia entre bases: 0,38 nm) y la que tiene mayor ndmero de pares de bases por vuelta (12), lo cual supone una menor rotacién por base (30°) y un mayor eso 0 longitud de una vuelta de hélice (4.56 nm). Es, en resumen, una hélice muy estirada. En su superficie forma un +00 surco, profundo (correspondiente a la posicion del surco menor en A- y B-DNA). ‘Modelos espaciales compactos: [A-DNA, [B-DNA [Z-DNA Sto vue de hice ppso seam Birt ea) SK ct suo miyor exit may peas = ae mage rat 7 Sarecho ne ees atte oe La consideracion de esta estructura a nivel molecular muestra que sus diferencias respecto a las formas A y B se eben también a una distinta conformacién, en este caso alrededor dol enlace N-glcosidico. En las formas A y B todas la bases nitrogenades se orientan alejadas del anilo de pentosa, en la Hamada conformacion anti, mientras que ‘41 Z-DNA s6lo lo hacen las primidinas; las purinas tnden a situarse sobre la pentosa (conformacién sin). Por ello, ‘las secuencias de purinas y primidnas altemantes (por ejemplo, CECGCGCG), tipicas del Z-DNA. se favorece la sucesiin de ambas conformaciones, sin (G) y anti (C), abigando al esqueleto azticarfosfato a plagarse en zig-zag para poder establecer los enlaces de hidrogeno.56 \VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DNA conformacién anti (oda as bases en A-y B-DNA, ‘pitimins en 2-DNA) ° 6 Onto. Soc, i / Z Z - ‘itn en conformacitn ant s ase alejada dela pentose ru tridimensional del par de ~ nucledtidas CaG enun Z-DNA . ts fosfatos quedan en posiciones. relativas muy diferentes a las del B-DNA La disposicion en zig-zag del esqueleto de la forma Z del DNA se aprecia de forma dptima en este ‘modelo de varillas, donde los grupos fosfato se han unido con una linea verde hipotética. Se muestra, ‘ efectos comparativos, cémo cl B-DNA no presenta esta ordenacién, sino que su esqueleto describe ‘una hélice continua. Obsérvese que el Z-DNA es el tinico con hélice en sentido levogiro. ‘igen ane linea ox grapos foto 50 en ncvenan ms (Ge thie nombre pedximos ete que Z-DNA) Sy ALY BONA. tor requiere una clevada lectrotiticas ene los yas poder ‘conformacion Los grupos fof siuen ‘ana helice dextigira levy 6.2 VARIANTES LOCALES DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA Los estudios de difraccion de rayos X también revelaron la existencia de variaciones en la conformacién en determinadas secuencias del B-DNA. Aunque dentro de este apertado también podria inclulrse el superenrollamiento del DNA, se ha preferido describ este aspecto como una estructura de orden superior de los acidos nucleicos, dada su implicacién en la organizacion del cromosoma.VARIANTES LOCALES DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA 57 6.21 Curvatura de la doble hélice A pesar de la regularidad del modelo de Watson y Crick, existen pequefias diferencias locales en la estructura de los DNAs depeniendo de los nuclestides integrantes. Por ejemplo, en determinadas secuencias los pares de bases no son exactamente coplanares, lo que puede ocasionar una desviacién del eje de la doble hélice. En otros casos, frecuentes, la curvatura no se origina por una secuencia particular de nucledtidos, sino que es forzada por la unién de a proteina a la cadena de DNA (como, por ejemplo, la mostrada en pag. 61) 622 Palindromos 6221 Concepto y caracteristicas ‘Se denomina secuencias palindrémicas, o simplemente palindromos, a aquellas regiones de un DNA cuya seqencia es la misma en ambas hebras. Son bastante comunes, y tienen un significado especial por varies razones: (@) ser lugares-diana de las enzimas de restriccién (herramientas experimentales para escindir acides nucleicos en la teendagia del DNA recombinante); (b) actuar como centros reguladores de la expresion génica; {c) dar lugar a estucturas secundarias pecullares en DNA y RNA, etc. Gramatcalmente, un palindromo (del griego palin = de nuevo, dromos = carrera) es toda palabra o frase que so deletrea igual de izquierda a derecha y de derecha a izquierda. Por ejemplo: RADAR, ANILINA, DABALE ARROZ ALA ZORRA EL ABAD. En los palindromos hay un centro de simetria (a la vez eje y plano de simetria), que es la letra cera ola posicion entre las dos letras contrales. Sin embargo, la extensién de este término al campo de la Biologia Molecular no es directa: se dice que una region e DNA es palindrémica cuando la secuencia de una hebra, leida de izquierda a derecha, es igual que la de la otra hhebra, lelda de derecha a izquierda. Por tanto, los palindromos se observan en las dos cadenas conjuntamente, y no en ma sda. Por ejemplo, a secuencia TTAGCAC-CACGATT seria un palindromo gramatical, pero no es una secuencia palndrémica. Teniendo en cuenta que, segin el convenio de escritura de los DNAS, ambas hebras se deben leer de 5a 3, se concuye que las dos hebras de un palindromo tienen la misma secuencia; ésta puede considerarse una ‘elniign de patindromo. tes patindrimica en un DNA de dob e heb Hiebra I, Jeida de izquierda a derecha (5'—93"): TTAGCACGTGCTAA Hiebra 2, leida de derecha a izquierda (S'93"). TTAGCACGTGCTAA s (Er [a eyveya T[G[e|TJAla]* z alelefalri[r|s je binario de sierra ‘oxacionl) s [2] PF a[eTeyaye 3° s[ayatrletetr[elelatetelaltit|s Como una extensién del concepto de palindromo, se Haman palindromos intorrumpidos aquélos en los cuales na pequeia secuencia separa ias dos milades del palindrome y acta, por tanto, como centro de simetria no puntual {enlugar del espacio entre dos nucledidos de un palindrome esticto). En cualquier caso, todo palindromo esta formado fr dos “mitades" de secuencia idéntica, separadas por un cento de simetia, puntual 0 no punta Karine in:e212ih—<— na suena (leatoria) A coms cone de siete s F]F]ayeye ae G[e]tlayals 7 g[tle efejaltir|* A\cumplrse tanto la simetria propia del palindromo como la complementariedad de las dos hebras resulta que las seovencias de una misma hebra que quedan a ambos lados del centro de simetria son complementarias entre si; se dice por ello que las secuencias palindrémicas son autocomplementarias,las dos hcbras son complementarias entre si En ocasiones se utiliza como sinénimo de palindroma el término repeticiones Invertidas, puesto que si se leen en sentidos ‘opuestos, las dos mitades tienen a misma secuoncia (a ambos lados del centro de simetia, puntual 0 n0). Otro término relacionado es el de repsticlones directas, que se emplea cuando ‘en un DNA hay repeticion de una secuencia {(unided de repeticion), lelda siempre en el ‘mismo sentido. No son palindromos porque no se cumple el crtetio de igualdad de secuencias Ieidas en sentido opuesto, ni hay ‘centro de simetria, por o que no se habla de “mitades". Estas repeticiones tienen interés porque aparecen con enorme frecuencia en fl _genoma (pag. 109), tanto en posiciones ccontiguas 0 adyacentes (repeticiones en tandem) como separadas por un numero elevado de pares de bases (repeticiones disporsas). Finalmente, se habla de repeticiones especulares cuando la seouencia se repite, de forma invertida, dentro de ta misma hebra. De nuevo, no son palindromos, pues no hay centro de simetria rotacional, sino plano de simetria especular. Estas dos ultimas _posibilidades, ‘aunque aparecen con frecuencia en los DNAs, ocupando una parte importante de su ‘secuencia, no tienen consecuencias en cuanto a la estructura secundaria de los ‘cidos nucleicos, por lo que a partir de este momento solo se trataran los palindromes. CTRTETSTAT ETE)» hebra 2 \VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DNA 3] TET) »[RIXTFTeTST TS] sEEREERTE y ERT TeTe Te Te] Ja hebra 2s aulocomplementaria, on es autocomplementaria 2.2 Repeticiones de secuencia palindromos = repeticiones invertidas: (cjemplo: palindromo discontinuo, con un centro des RGCTAR 3 GATT 5! ‘centro o je de simetri no puntual) Las secuencias son iguales si se leen en sentidos opucstos: Secuencia |! mitad (-»): ‘Secuencia 2 mitad (<-) 5’ TTAGCAC 3’ ==__«S*TTAGCAC 3 ARICGTS = AATCGTG repeticiones directas: (jemplo: separadas por 4p) eae aE > [Scaatesrserersarcors 8, _—— 2s no hay eje ni plano de simetia Las secuencias son iguales si se leen en el mismo sentido: Secuencia 18 repeticién (-»): Secuencia 2 repeticidn (>): 5/ TIRGCAC 3’ =_S? PTAGCAC 3 aabeete RanCere repeticiones especulares: (ejemplo: separadas por 4 pb) nor AConT S| NSTGCTAA 5? \—— plano de simetria (no punta) Las secuencias son diferentes: ‘Secuencia 14 repeticién (-9): _-Seewencia 2*repeticibn (<=): Ss’ THAGCAC 3 ok” RATCGTG 3" AATCGTS. ‘raccac Sélo iguates sila segunda se lee en sentido no convencional, de 3° a5": Ss’ Tragcac 37 0 3 TTAGCAC 5 AATCGTG I AATCGTS.VARIANTES LOCALES DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA 59 62.2.3 Palindromos en moléculas de hebra sencilla Para el caso de acidos nucleicos de hebra sencilla, la definickin de palindromo no se puede aplicar estrictamente, ‘Sin embargo, dada la relacién de complementariedad entre la secuencia de un RNA y Ia de una de las hebras del DNA (qe lo codfica, las secuencias de RNA de hebra sencilla codificado por un DNA palindrémico son también ‘autocomplementarias y se consideran como palindromos. Bajo este criterio, cada una de las dos hebras de un ONA, paindromico también es una secuencia palindrémica de hebra sencila. 622.4 Consecuencias estructurales de los palindromos a) En dcidos nucleicos de hebra sencilla La eistencia de palindromos, por ser secercias autocomplementarias, puede afedr de forma importante 2 la estructura secundaria. As, las hebras sencilas de ONA o RNA pueden plogarse ocasionalmente sobre si mismes pera formar una estructura on ‘orqulla. Si el centro de simetria no es puntual (palinéromos. intorumpidos), suv secuencia farms un ducle en el extremo de la horquila La formacion de horquilas posee gran revancia en la estructura tridimensional de digunas RNAS. El ejemplo mas significative lo cansituyen los brazos de los 1RNAS, regiones an estuctura de tallo y bucle (p89. 74), fomados por secuencias palindrémicas. Por {io lado, este tipo de plegamiento on el RNA centbuye, en algunos casos, a la terminacion de la tanscripcién; concretamente, on ol mecarismo de torminacion independiente de p 2 procarotas y los mecanismos equivalentes deexcorotes. En ol caso de hobras sencilas de DNA también pueden encontrarse horqullas, por eenploen el DNA desnaturalizado, que carece dena estuctura secundaria defini. También 0 propone su formacion en. situaciones Paticdares, por ejemplo durante la sintesis en llabortorio del cDNA (ONA complementario) 2 patr de un mRNA, donde el extromo 3° del DNA de hebra sencila se repliega sobre si misma y sive asi de cobador para la pekmeresa (pa. 208). ) En DNA de doble hebra En el caso de un DNA doble, las hebras al palindromo pueden separarse y reasociarse 4e otra forma, generando estructuras de doble horgila 0 cruciformes (en forma de cruz). Similarmente al caso anterior, los palindromos interumpidos forman cruciformes con dos bucles. Hebra sencilla (DNA 0 RNA) pslindrome extito: pllgdrome interumpido cont de seta punt secdenin com centro de sitia oe STA oS 1 1 reasociacion de una hebra 2 Horguilla sin bucle orga conbucle Doble hebra (s6lo DNA) palindrome estct: pallsdromo iterumplo: cz desimetta puntal ——_seeuencia como een de sims srg som y rp sVnnitoremacaser +s) iyyrbabkbeater ts reasociacion de las dos hebras AL Hr Cruetforme sin bucles Cruciforme ‘con bucles 6.2.2.5 Funcionalidad de los palindromos Los palindromos en DNA diplex actian como sefiales de reconocimiento a las que se unen numerasas proteinas Feguladores, que poseen estructuras diméricas que les permiten unirse de forma simétrica a ambas mitades dal palindromo (pag. 61).VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DNA 6.2.3 H-DNA: triple hélice Se trata de una estructura poco habituel, formada por 3 hebras: una triple hélice, también llamada triplex 0 triplc. Se descubrié por primera vez en un RNA, aunque es en el DNA donde se encuentra con mas frecuencia. Se orman en regiones ricas en pirimidinas (Secuencia (CT), ) en una hebra y ricas en purinas (secuencia (AG), ) en la hhebra complementarla. En condiciones normals, dichas Secuencias se encuentran totalmente apareadas sin alteracién ‘alguna en la doble hice. Sin embargo, puede ocurtir que parte de la doble hélice se abra y la hebra rica en Cy T se repliegue y se aparee con la otra hebra (AG), mediante una nueva clase de enlaces de hidrégeno (conocidos como ‘enlaces de Hoogsteen), en una zona donde ésta atin forma doble hélice, Aparece asi una triple hélice (CT), / (AG)y / (CT), en dicho segmento de! DNA. La otra hebra sencilla (rica en A y G), desapareada, forma una especie de bucle. Organizacién de las cadenas en et plano: dobe shige ‘zona cn tiple hice hnbesj.denen€T. S'—GGACAGGTCTETeTeTCTETCTC-7, Esquematicamente: 18) Las dos hebras (1 y 2) forman una doble bélice. 28) Una de las hebras gira volviendo hacia ats (1*) {y se aparea.con ls dos hebras anteriores, MT {formando el segmento de triple helice. bea 2.sceen GA 3° -CORGTC Arg? 38) La otra hebra (2) queds desapareads, hasa que ALLTEL ek se refine de nuevo con la hebra } para formar uo Tore BTTONCHORCRCDCTODE SA NE te de dol ae, aR, eee g PRE Ncxccncncaancns”” os ‘ aceaaa ee Tmonohetrsdesaparcadn Organizacién espacial de las cadenas: Ejemplo de apareamiento de 3 bases que da lugar a la triple hélice en el H-DNA (TAT). EL ‘otro apareamiento es entre citosina, guanina y Citosina protonada: CGC. En el caso de RNAs, Ia interaccién TAT ‘vendria susttuida por UAU. 7 ‘S tamafo aproximadoS 2 delahelice—N enlaces de H mT \ a re" a ‘apices ay Sekai2 ’ ae lacs deft C Obstrvese a implicacién de lisicos ome Nauelewesdstny de Walson-Criek) ay) - Este tipo de estructura ha despertado gran interés por su aplicacién en terapias de inhibicién de la expresion ‘génica, mediante la unin de un oligonuclestido sintético a la doble hélice del DNA en la regién promotora de un gen, formando una triple hélice que impide la expresién det gen. 6.3 MOTIVOS ESTRUCTURALES RESPONSABLES DE LA UNION DEL DNA CON PROTEINAS ‘Son numerosos las procesos biolbgicos en los que la funcién del DNA depende de su interaccién especifica con proteinas; destaca entre ellos el control de la expresion génica, ejercido por proteinas denominadas genéricamente actores de transcripcién (cuyo papel se estudia més adelante, pag. 264). El estudio de estas proteinas tiene interés deniro del contexto de las variantes estructurales del DNA, precisamente por su capacidad de reconocer & interaccionar con secuencias coneretas del DNA. Este reconocimiento tiene lugar gracias a la posibiidad de variaciones locales en la estructura tridimensional del DNA, asi como a la interaccién directa de Ia proteina con las ‘bases, sin necesidad de que se separen las hebras de la doble hélice. En la mayor parte de los casos, los numerosos ‘contactos establecides (de tipo iénico, hidrofébico y enlaces de hidrogeno), aunque individualmente débiles, se ‘combinan para dar una interaccin especifica y muy fuerte entre DNA y proteinaMOTIVOS ESTRUCTURALES RESPONSABLES DE LA UNION DEL DNA CON PROTEINAS 61 El reconocimiento se ejerce a través de regiones o elementos estructurales, que son sélo una parte de la estuctura terciaria completa de la proteine, y que se pueden encontrar, con una estructura espacial muy similar, en Protenas distintas, interviniendo en una misma funcién en todas ellas. Si se cumplen estos requisites, reciben la ‘denominacién genérica de “motives” estructurales proteicos (en inglés, motifs), en este caso “motives de unién a DNA, La interaccién tiene lugar con el exterior de 1a doble hélice, especialmente sobre el surco mayor. Como eammeenens A reap hap gro hdleca donde los subindices representan el numero de residuos (aminodcidos variables, X) que separa los aminodcidos ‘consenso (constantes). Estas secuencias adquleren esponténeamente gracias al Zn® la conformacion apropiada para ‘qe el segmento a-helicoidal interaccione con tres bases expuestas en el surco mayor del DNA. Los restos variables permten que se reconozcan distintas secuencias del DNA. ( acT inion toss TINA, nei li ene) conscetivs (se mustran 3) sguehe surco mayor del DNA} atructura lisica de un dodo de zine) (Cys, con 2 hoja B | hale y Vion Zn st ata vista Me ee Las dos icras del DNA se mucstran com cintas azul, {Loe motivos dedo de ne de la proteina TFIMA, en rosa fs a-licos, on ‘narana Tas hoja fy en nogro el Yesto dela cadena sn estructura secundaria, [Los fones Za" en verde Cistcinus Hisiinas En otras casos se observa una variante de dedo de zinc llamada C,, donde el ion metalico se coordina con cuatro Cys en le secuencla consenso Dys-Xp- Cys X4g-CysXyCys- que no forma hojas , sino dos segmentos en achélice. Esta estructura aparece, por ejemplo, en los receptores de homonas esteroides,64 VARIAGIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DNA 6.3.1.5 Motivo cremallera de leucina Se trata de una regién de la proteina cuya secuencia tiene un residuo de leucina cada 7 aminodcldos. Al adopter la conformacién c-helicoidal se concentran en un lado los aminodcidos hidrofébicos, de tal manera que Leu se repite en Ja misma cara cada dos vueltas de hélice (2 vueltas de 3,4 residuos = 7 aminodcidos). Dos cadenas peptidicas de este tipo pueden asociarse hidrofébicamenta, intercalando sus restos de Leu como si se tratara de los dientes de una cremaliora (en inglés, leucine zipper). En el otro extremo dat mative las dos a-hélices encajan en el surco mayor del DNA y presentan en la cara exterior abundantes aminodcidos basicos que interaccionan favorablemente con los fosfatos. De alguna manera, este modelo se asemeja a una "Y", en le que el tallo corresponderia a la cremallera de leucina y los brazos a los tramos de las hélices que contactan con el DNA, Estructuras de este tipo aparecen, por ‘ejemplo, en las proteinas reguladoras de la transcripcién llamadas bZIP. (CMotivo cremallera de leucina y su interaceién con el DNA_) se ” ‘ilo eadenas Intrates de: * Le (emaritoTema 7 Estructuras de orden superior de DNA y RNA 7A Superenrollamiento del DNA. . 7-11 Superman del DNA on procartas (y mitoondis y derpletse de euCsHa) wn 8 7.1.1.1 Conformacién relajada . 7.1.1.2 Conformaciones superenrolladas.. 7.1.1.3 Demostracion experimental de! perenlaen 7.1.2. Aspecios tedricos del superenrollamiento . 7.2. Estructura de los RNAS... ——— 69 7.2.4 Composicién de bases y estructuras primaria y secundaria del RNA 68 7.2.2 Estructura tridimensional de los RNAs en general 70 72.3. Tpos de RNA: prpledadesyexuctras partelares 70 7.23.1 RNAmensajero (MRNA) .. _ n 7.23.2 RNA de transferencia ((RNA)..... x 74 a) Especifcidad de los tRNAS por los aminoscides m b) Presencia de nucleésides infrecuentes.. c) Apareamiento de bases intracatenario.. 4) Estructura secundaria en tbo... 2) Estructura terciaria en "L” 7.2.3.3 _ RNA fbosémico (fRNA). Ribozimas: funcién catalitica de algunos RNAS. 7.2.4.1 Accién catalitica en la maduracion de RNA.. 7.24.2 Acckén autocatalitica en la eliminacién de intrones.. 7 7.243 Acdlin cataltca y autocataitica en vioides: ribozimas de posible aplicacién ‘erapeucn. 78 7.2.44 Accién catalitica transpeplidasa en la sintesis de proteinas, 7B 73. Los ribosomas. ns . 73 7.3.1 Localizacion celular... "78 73.2. Caracteristicas diterenciales de los ribosomes procibicosyaueaibcas 80 TRAV Ofgem - 80 732.2 Composicién. 80 73.23 Estructura at 7.3.3 Separacion de los ribosomes, subunidades y componentes. at Los acidos nucteicos no se encuentran en las células en las formas extendidas correspondientes a su estructura ‘rimaria y secundaria, sino molecularmente més compactades, lo que hemos denominado (p. 32) nivel estructural “de ‘rdan superior’. En el caso del DNA, parte de esta compactacion o condensacién viene representada por el denominado ‘superenroilamiento, 0 retorcimiento de la cadena sobre s{ misma, mientras que para el RNA se plasma en estructuras triimensionales variadas. En ambos casos, la condensacién se completa por la asociacin estrecha eon proteinas que Inducen el plegamiento de la doble hélice del DNA o de la cadena lineal de algunos RNAS (p.e., el RNA ribosémico, ig. 79). La contribucién de esta asociacién con proteinas pose una relevancia especial en el caso del DNA nuclear eucaritico (tema 8).66 ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DE DNA Y RNA 7.1 SUPERENROLLAMIENTO DEL DNA El superenrollamiento, como parte de ta condensacién del ONA en general, posee especial significado pare entender la organizacion dal cromesoma. En concreto, contribuye a explicar como un DNA de tan gran magnitud puede alojarse en el interior de la célula (procariotas) 0 del nucleo (eucariotas), de dimensiones muy inferlores a la longitud te6rica del DNA en doble hélice. Por elemplo: DNA Tamario | longitud en forma de B-DNA | dimensiones en las que se compacta Ecol 4710" pb 4,6 mm = 1.600 um 2 um (cella) ‘Cada cromosoma humano | 50 — 250-10" pb 17-85 mm ‘Genoma humano diploide | 6,610" pb 22m pact ‘Se entiende por superenrollamiento (enrollar algo que ya ‘esié envollado) del DNA al retorcimionto © giro sobre si misma de ee la doble hélice (que ya leva implicito el enrollamiento mutuo de Taaobiehelce dos hebras), de forma que el eje de la doble heélice no sigue una ma linea recta, sino otra helica (una “superhélice”). Su causa, como ‘Fillowopeoaes ‘se vera a continuacién, es la introduccién de una tensién estructural en la propia molécula. Aparece de algin modo en todos los DNAS celulares (ya enrollados) y se encuentra estrethamente regulado in vivo por la accién de las topoisomerasas (pag. 151). En resumen, las dos hebras del DNA sufren un enrollamiento, mientras que la doble hélice sufre un superenrollamiento, Un ejemplo intuitive del concepto de superenrollamiento es el cordon del teléfono, que de por si presenta un tenrollamiento helicoidal y, con el uso cotidiano, termina por adoptar un enrollamiento adicional {cordén retorcido). Este simil se utiiz6 para explicar muchas propiedades del DNA virico (circular y pequefto). Un modelo més proximo a la estructura del DNA es una cuerda formada por dos cabos arrollados entre si. Aunque la cuerda tiende a mantener ese arrollamiento, puede ser forzada manualmente a un mayor o menor nomero de vueltas entre sus cabos (torsion), con lo {que se genera una tensin que se libera mediante la formacién de superenrollamientos. 7A Superenrollamiento del DNA en procariotas (y mitocondrias y cloroplastos de eucariotas) ‘Aunque afecta tanto a procariotas como a eucariotas, el superenrolamiento es mas conocido y de comprension ‘mas sencilla en los primeros, por lo que ast se abordara a continuacion. Estas consideraclones son igualmente vidas para el DNA de plasmidos procaritcos y el de cromosomas mitocondiales y cloroplésticos de eucarotas. En todos ‘estos casos, la molécula de DNA muestra una estructura circular 0 cerrada (una doble hice con sus extremos unidos entre si, ena que es facil apreciar los fenémenos de superenvollamiento. 7.1.1.1 Conformacién relajada La conformacién adoptada por el DNA en su forma B (aprox. 10,5 pb/vuelta) corresponde a un estado estable, de ‘minima energia, que se considera no superenrollado o relafado, cuando el oje de ta doble hélice se puede disponer ‘completamente sobre un plano. * ESTADO RELAJADO 0 NO SUPERENROLLADO (conformacién de minima energia, méxima estabilidad) ‘Gromosoma circular hipottco, con 210 pb: 20 vuets de hice eon 10,5 pivuelta (ge emplean doe colores para iar pstrrent le vualizaie d s rbecs esis Gna debi hea cl) Por RRS. en una rgitin de 63 pay 6 volts de hice con TOs phivelia:estuctura B-DNA, por fo tanto elgjadaSUPERENROLLAMIENTO DEL DNA 67 74.1.2 Conformaciones superenroliadas En las células, el DNA generalmente no se encuentra en la conformacién relajada, sino en un estado no relajado, superenrollade y mas compacto. Este es producido por topoisomerasas que, mediante el corte transitorio de una © anbas hebres, introducen un aumento o una disminucion en el ndmero de vueltas de hélice (pg. 151). En ambos casos s# produce una tensién estructural, debida a un plegamiento local de las hebras y a una posicién relativa de los nuclides diferentes de su geometria energéticamento mas estable, la del B-DNA. Esta tensién se conirarresta en la mmolécula mediante la formacion de un superenrollamienio: la cadena entera del DNA gira sobre si misma de forma que las bases puedan disponerse de nuevo del modo mas préximo a la conformacion B-DNA, En primer lugar, si se reduce el ndmero de vueltas de hélice, la tension se libera formando una superhélice a la ‘queso le asigna un valor negative de superenrollamiento, ESTADO NO RELAJADO o TENSO (de energia Conformacién de minima energia, ‘supcrior) originado por desenrollamiento obtenida mediante un de la doble (pérdida de vueltas) SUPERENROLLAMIENTO NEGATIVO eamolécula de DNA ha sudo una pérdida de una voela: lewmosoma de 210 p contin ahora 19 vuelts de hic, con 11,1 phivuclta Ja tension sefibere ee arc hams = os ‘ise considera que la pérdida de una voli de hice ha El cromosoma superenrllad tiene locuid en a rgion de 63 nb, esta tendréS vueltas de hice 20 vuelta con 10,5 pbivuclts cor 126 pelts: > 10,3 pivuela, es deci, tensa onformacién ne tensa Si, por el contrario, se aumenta el nimero de vueltas de hélice, Ja tensién se libera por formacion de una -supethdice de sentido opuesio, con un superenrollamiento positive. ESTADO NO RELAJADO o TENSO (de energia. Conformacién de minima energia, superior) originado por superenrollamicnto obtenida mediante un de la doble hélice (aumento de vueltas) SUPERENROLLAMIENTO POSITIVO “amos de DNA ba suid un aumento de una welt: Leromosoma de 210 pb contene ahora 21 vuctas de hélice. can 10,0 pbivueta (Génie energy compaction dea solide DNA ceular a tucleo spericice POF wn superenrolliento Gdesentdocontario positive ‘al anterior) ‘Sige considera que cl aumento de una via de hice El cromosoma supcrenoliad tene ccuido en region de 63 ph étatendrd 7 welts de hice 20 vueltas con 10.5 ph/vue: an 9,0 phvelta: < 10,5 phvuelta, por anc tensa onformacién no tensa TA’ 3 Demostracién experimental del superenrollamiento De estas dos posiblidades, el DNA se encuentra normaimente en tas oélulas en un estado de swperenrollamiento negative. La primera evidencia experimental que llevd a proponer la hipétesis del ‘sperenrollamiento de las cadenas se obtuvo gracias a la aplicacién de la técnica de ultracentritugacion isopienica (tesada en e! equiibrio de sedimentacion en un gradiente de densidad de cloruro de cesio, pag, 137). ‘Se abservé que el DNA de poliome, un pequefio virus que causa cancer a ratones, se separaba en tres bandas en A gredente. Las tres fracciones, sin embargo, tenian la misma masa molecular, por lo que la diferencia debia estar en ‘stforma 0 estructura, Se pudo comprobar que las moléculas menos densas eran ineales, miontras que las dems eran ciauares. Sélo tras la hipétesis del superenroliamiento se pudo explicar la diferencia entre esas dos fracciones mas densos,68 ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DE DNA Y RNA band 14 {reno orf de soimenacén QQ) Btkes , ecctrs coos compet ali See ‘banda Il, 16S se a — {eed Se sediment intermedia FF SRXiedsicetacheateseao” VEE I eee anda 1, 208 5 COO) Liiyer cles de setimenacin: LY DNA de doblehcbra circular, superenrollado cxiuctura mis compects 7.1.2 Aspectos teéricos del superenrollamiento El empleo de la Topologia (rama de las Matematicas que estudia las propledades de posicién relativa de las partes de un objeto, propiedades que no cambian al ser sometido a deformacion) ha permitido aclarar la estructura del DNA superenroliado. El signo y magnitud del superenrollamiento se asignan con base en dicho estudio topolégico, det ‘val s6lo se comentan aqui los aspectos mas elemeniales. Posibles disposiionesteicas de dos hebra (pr ejemplo, dos cabos de cuerds) con diferente grado de enrllamiento entre s (diferente nimero de enlace). = nimero de gnlace~ n° de Ves qu las hebras se cazan (Etmodslo dela dreha, son L=20, corespondriaal DNA rej de 210 p considera ateormente) SOOO bo 120 Se define el indice o némero de enlace topolégico (L 0 Lk, de linking number) como el numero de veces que Iss dos hebras se cruzan entre sf; mis especificamente, el numero de veces que una hebra cruza el plano definido par la Ctra (como anillo o curva cerrada). Se le asigna valor positivo cuando las hebras se cruzan hacia la derecha. Se habla de enlace topolégico porque cuando L#0 las dos hebras estan fisicamente ligadas (es decir, no se pueden separar), a pesar de que no hay enlaces covalentes entre ellas. Sdlo se podrian separar (L=0) rompienda algin fenlace covalente (es decir, cortando una hebra). Lo mismo es aplicable para cualquier cambio del valor L. Por la misma razén, la deformacién, plagamiento, etc., de las hebras, sin cortarlas, no alteran el numero de enlace ni el ndmero de superenrollamiento. Para ol caso del DNA, la conformacion relajada posee, por tanto, un nimero de enlace igual al nimero de vueltes de hélice, siempre positive puesta que la dable hélice de! DNA es dextrogira. Como ya se ha estudiado, las situaciones de superenrollamiento surgen de cambios en el nimero de vueltas de hélice, es decir, en el nimero de enlace L. Para discerir y cuantificar los estados superenrollados se refiere su valor de L al del estado relajado, definiendo ‘un nuevo valor numérico de superenrollamianta como la diferencia (AL) entre et nimero de enlace de una conformacién cconcreta del DNA y el nlimero de enlace de su forma relajada. Este valor de superenrollamiento puede, l6gicamente, ser positivo o negative, Para un DNA doble circular de 210 pb de longitu, ta estrcturaB tiene 210 ph / 10,8 phivulta = 20 vuelta. Por tanto, 1a ‘conformacinrelajada de ere DNA seria lade L=20. Por encima y por debajo de L=20 se habla de un superenollamiento positivo o negative, respectivaments. (Todas las Formas representadas son ls de minima energia para eada caso) coo CO C) eS ovo speenoaniat nagaio ‘superna posting : Law S2 boas ba sspeenaamo=0 womens? ageensinlno=-1 spscraaniio= +1 spree #2ESTRUCTURA DE LOS RNAS 69 7.2 ESTRUCTURA DE LOS RNAs Como ya se ha indicado (p49. 33), los RNAS son polribonucledtidos (polinuctedtidos con ribosa, y U en lugar de 1 formados par cadenas lineales, de hebra sencilla, de varias decenas o millares de unidades, pero de longitud muy Inferior a las de DNA. No se presentan como cadenas dobles de hebras complementarias. 724 Composici6n de bases y estructuras primaria y secundaria del RNA La estructura primaria de los RNAS ha sido estudlada anterornente (tema 4). En cuanto @ la secundaria, es caradersica la ausencia de una estructura repeliva y bien definida, a diferencia del DNA; realmente s6lo cxisie tstucura secundaria en parte de la molécula de tRNAs y ¢RNAS ‘A no existr un apareamiento sistematico de dos hebras, la composicién de bases en los RNAS es mucho mas \erada que en ol DNA y no se cumpien las reglas de Chargett (p89. 38). Por otro lado, en algunos RNAS hay cirta {undancia de nucledidosdistintos de fos cuatro principales (A, G, Cy U), aunque en proporcibn baja con respecto ala de esos, Composicion de bases de varios RNAs (%) ‘Organismo [Tipo de RNA A G Cc w Rata nuclear 202 25.7 295 26 (higedo) | mitocondrial 178, 318 284 209 ribosémico 200 305 316 20.2 detransferencia | 20.9 309) 28.5 204 mensajero 23.8 283 214 205 Tevaduras | ribosémico 249 207 194) 26.7 de transferencia 185 29.2 28.4 200 mensajero 275 25.1 203 27.1 E coli | ribosémico 25 31 = 22. 21 de transferencia, 193 32.0 283 160 mensajero, 24.1 207 24.7 23.5 Obsérvese cémo, a diferencia de lo que ocurre con el DNA, + Ta composicién de bases varia dentro de una misma especic (segiin el RNA considerado) + no existe una equivalencia entre bases (A¥U, GxC, purinasepirimidinas) ‘Algunos RNAs adoptan estructura secundaria en pequefias regiones de su molécula, gracias al plegamiento de su Unica hebra sobre si misma, siempre que éste permita el apareamiento intracatenario de dos zonas cuyas secuencias sean complementatias, a pesar de estar separadas en la estructura primaria, se forma asf una doble hélice local, de cardcter antiparalolo. De manera similar se forman también dobles hélices entre una molécula de RNA y una hebra sencila de DNA (hibridos RNA-DNA). En estos casos, si el grupo 2-OH de la ribosa adopta la conformacién C2'-endo presenta impedimentos estéricos con attos élomos de la cadena de RNA, lo que impide que se forme la doble hélice (que seria de tipo B). En concreto, 2-0H estaria muy cerca de los étomos del grupo fostato contiguo y del C8 de la base adyacente. En cambio, en la ‘canfarmacién C3'-endo el grupo 2-OH se proyecta hacia fuera, lejos de otros atomos del esquelelo y no aparece impadimento estérico alguno, por lo que es posible la formacién de la doble hélice, en este caso de tipo A. En resumen, la nica doble hélice en la que puede partcipar un RNA es la de tipo A (el DNA, al carecer del OH en 2", puede adoptar tanto la A como la B, como ya se ha estudiado en el tema 6). ‘ste grupo O1T Fncracctonrla esfavorblmente on los nucledtidos (CP eendtpine) 2 as pin) naa positon mo tay imeraceton con Tosrucledtidos ‘conformacién C3'-endo (forma A, Giniea posible para el RNA) conformacién C2'-endo (esta conformacién es vilida para la forma B ‘en el DNA, pero es imposible para el RNA)70 ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DE DNA Y RNA 7.2.2 Estructura tridimensional de los RNAs en general Existe una gran diversidad en la estructura tridimensional de las moléculas de RNA. Esta es compleja, Unica para ‘cada tipo de RNA, y resulta de la combinacién de estructuras secundarias locales, estabilizadas por enlaces de hidrégeno y por interacciones hidrofbbicas de apilamiento de bases. Su estudio concreto se hara mas adelante, para AY horquilla << si saliente burbuja 5 ucle 0 lazo Ea a a) wees fe tallo A pesar de Ia inexistencia de una estructura secundaria propiamente dicha para toda la molécula, la cadens ‘sencilla de cualquier RNA adopta localmente variadas estructuras: horqullas, cruciformes, bucles, lazos, etc. Algunas de ‘lias se deben al apareamiento de bases intracaterario formando cortos tramos de doble heélice de tipo A, como se ‘acaba de indicar. La proporcién de zonas helicoidales varia ampliamente entre distintos RNAS, pero puede alcanzar hasta un 60% de la estructura total. 7.2.3. Tipos de RNA: propiedades y estructuras particulares ‘Tanto en procariotas como en eucariotas existen tres tipos principales de RNA: mensajero (mRNA), de transferencia ({RNA) y ribosémica (RNA). Ademas de ellos, en eucariotas existen RNA nuclear heterogéneo (hnRNA), ‘nuclear pequefio (snRNA) y citaplasmico pequefto (scRNA), y RNAS de orgénulos (mitocondrias y cloroplastos). Todos ellos tienen en comin una funcién relacionada, directa 0 indirectamente, con la expresiin génica (maduracion postranscripcional y traduccién). Adicionalmente, en algunos virus el RNA Juega el papel de portador de la informacion ‘genética, que en el resto de organismos corresponde al DNA. Las diferencias fundamentales entre los distintos tipos de RNA se resumen en la tabla, sr is] “asec partes citoplasma (P y E) }-3,000 | esta seni nes! citoplasma (P y E) ay S00 diferentes, expects pra ada a2 citoplasma (Py E) 3 tipos, en oon pare ela sbuniudpequeta dl inom roca rnd asi neon ie oma pre a sobuniedpequta dl itosoma ribesomas de ucaions Somaa pre de asebaniadyrnde dl boom nicleo (E) 30.000 | anit primarn prosusr del mRNA releo (E) forma pane eibonuceopoeas nucle pequtas (SARE) (n+])pcptidiLtRNA + tRNA libre AA nivel fisiolégico, la RNasa Py la peptiditransferasa ribosémica son posiblemente las que mejor reflejan el Perecido de tas ribozimas con las enzimas proteicas, a saber: actan sobre un sustrato especifico, aceleran la reaccién, vatios érdenes de magnitud, no se destruyen durante la catdlisis y al parecer se comportan de acuerdo con la cinética michael, 7.3" LOS RIBOSOMAS Los ribosomes son perticulas subcelulares, u orgénulos, de importancia crucial para la transmision de la informacion genética, al constitulr el lugar fisico donde se realiza la sintesis de proteinas. Se pueden considerar como festucturas quimico-mecénicas pues, por un lado, se desplazan sobre el mRNA ordenando la interaccién de sus codanes con los correspondientes anticodones del tRNA y, por oro, proporcionan el entomo necesario para que los ‘aminaacides formen los enlaces peptidicos del polipéptido en crecimiento, Estructuralmente, los ribosomas son conjuntos plurimoleculares de proteinas y rRNAs (35 y 65% en peso, ‘espectivamente), con un tamafo de 20 a 23 nm. Es decir, son nucleoproteidos. El estudio de otros nucleoproteidos ‘aracteristicos, los Virus, ya se aborda generelmente en una materia propia, la Vicologia. 73.1 Localizacién celular En cada célula existen varios miles de ribosomas (por ej, mas de 15,000 en un E. col), que legan @ suponer un uarto del peso seco de la célula. Se encuentran en el citosol, asi como en la matriz mitecondrial y en el estroma de doroplastos, Pueden estar en forma libre, como partculas discretas, pero a menudo se observan en forma de hilera, ‘agupados sobre un mRNA; en este caso se les llama polisomas 0 polirribosomas; su grado de agrupacién o Polmerizacion depende de la actividad metabslica celular. Los ribosomas del citosol de eucariotas son mas complejos en composicién y mucho mayores en tamafto que los fibosomas bacterianos. Los ribosomas de mitocondrias y cloroplastos eucari6ticos son semejantes a los bacterianos (Gtosclicas). Evolutivamente para todos los tipos se ha conservada una misma estructura secundaria, pero no la Seovencia que la crea, EUCARIOTAS (animales, plantas, levaduras, hongos) . PROCARIOTAS mas grandes (bacterias) semejantes80 ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DE DNA Y RNA 7.3.2 Caracteristicas diferenciales de los ribosomas procariéticos y eucaridticos 7.3.2.1 Origen Los precursores del FRNA muestran una gran diversidad en su secuencia, que se manifesta en la aparcin (durante el proceso de maduracion postranscripcional) do distitos tipos de fRNASs, caracterizados especialmente por su diferente coeficiente de sedimentacion, s. 7.3.2.2 Composicién Los ribosomas estan formados por dos subunidades de tamaho diferente y forma iregulr, cada una consttuida por uno o mas fRNAs y varias proteinas de diversa masa molecular (entre 6 y 75 kDa). Tanto el ribosoma completo como sus suburidades y los rRNAs componentes ce denominan segtn su cocficiente de sedimentacién. Las proteinas, Por su parte, se designan por numeros consecutivos precedidos por L (large) o S (smal), segun pertenezcan a la subunidad grande o pequefia, respectivamente. Diferencias en origen, composicin y estructura de los ribosomas procaridticos y cucariéticos Simrad as reomieatnasepsnis | coer A ows eosin PERNA RNA) 305) ! seesRA gd 855) oto 3) ae] [SA] Par iw =| i Ne peateanserptionsl \ ee RNAI6S—FRNAZBS—RNASS FRNAIES —FRAS8SARNA2ES «RNAS = v0 uci, M,= 900,000 < 70S 4 } S i a | y ! mat 0 recuérdese que la suma de los valores S de ambas subunidades no es igual al valor S del, Fibosoma completo Qe polisoma ibosomas libresLOS RIBOSOMAS: 81 1 2.3 Estructura La estructura de los ribosomas, igual en todas las células, es muy caracteristica; se ha dilucldado empleando Aitrccién de rayos X, difraccién de neutrones, microscopia electrénica en combinacién con métodos inmunolagicos, etc. Debido @ su enorme tamafo (MDa) y la complejidad de su asociacién interna, el estudlo de la estructura, dinamica y {uncién de los ribosomas consttuyé un importante reto investigador. Les des subunidades se asocian por interacciones no covalentes, de una forma peculiar, como si la subunidad paquets llenase el hueco de la grande, dejando una hencidura o tinel entre ambas por la que pasa el mRNA a medida {ue el nbosoma se desplaza durante el proceso de traduccion y de la que emerge la cadena polipeptidica. Esc en oy obi de soso y Dispos abel osama de RNA y “nln bal cas ones ee ileum polopdice melons a ‘subunidad grande, ‘subunidad Sh rere ane es rol 3 vole —- ‘saben dad poqucta, subunida = ah iN anna cone de una “planed a a pein mine ee 7.3.3 Separaci6n de los ribosomas, subunidades y componentes ‘Tanto los ribosomas individuales como sus subunidades y sus componentes (RNAs y diferentes proteinas) se pueden separar mediante ceniritugacion en gradientes de sacarosa o de cloruro de cesio, en presencia de ‘ancerizacones definidas de Mg’®. Las subunidades alsladas no son activas. Por otro lado, si se mezclan los tamponentes (RNAS y proteinas) a pH y fuerza inica correctos, se asocian esponténeamente en unidades gaae 88 ‘iboscimas libres a “= Separacién _connfugacin on rabione de saceroda.con Mo?" 10 mit ey de los a UF ‘componentes de los ribosomas erga procaristicos ma contac on grasare db sscaosa,con Mg 0. mit sie 508; sas 305 ‘cont | gradiente de C3C, con elevad orice ie a en © css prone @ @ Og Sens ene a . “lea” 3 \ “piss » & ana) Presa iso aay Sos ot ¥ ree tomo roars Pa A roe ee -.. Ss _——- TAMAR Gp TRA O5% peoTema 8 Condensacion del DNA y cromosomas 81 Condensacién del DNA en eucariotas. 8.1.1 Protoinas componentes de la cromatina. 8.4.4.4 Histonas.. 8.1.1.2 _Proteinas no histor 8.1.2 _Niveles de condensacion del DNA nuclear eucariti 8.1.21 Disposicién en nucieosomas y fioras de 10 nm 8.1.2.2 Formacion de la fibra de 30 nm. 8.1.2.3 Cromatina 0 cromosoma interfasico... 8.1.2.4 Cromosoma metafésico 82. Estudio del cromosoma metatésico 8.2.1 Aspactos citogensticos. 8.2.1.1 Morfologia de los cromosoma: 82.1.2 Cariotipo y su andlisis.. 8213 Bandeado 82.2 Regiones con significado funcional. 8221 Centromero. 8222 Telbmeros, 83 Dotacién genética en eUcatiot]s nnn 8.9.4 Namera de cromasomas (n): carter hepoidey ‘iploide. 432 Contenido de DNA: valor C.. 833° Locus y AelO vr 83.4 Genotipo, fenctipo y dominancia. 8.1 CONDENSACION DEL DNA EN EUCARIOTAS Para completar la descripcién de la estructura del DNA como material genético y como requisite previo sl estudio el cclo celular (tema 9), es conveniente analizar el complejo problema de la condensacién del DNA nuciear, que ocurre lo largo de la interfase de dicho ciclo. Este aspecto, junto al proceso enzimético de la replicacion del DNA (tema 12) urent la fase S, os de la mayor importancia desde el punto de vista basico y de sus aplicaciones. Coma ya se ha indicado, ta condensacién del DNA comprende dos aspectos, tebricamente independientes pero {uncionalmente relacionados y subordinados entre si: Superenrollamiento propiamente dicho de la molécula de B-DNA (doble hélice dextrogira). Es analago al superenroflamiento ncgativo ya descito para procariotas (pig, 66); se conoce peor en eueariotas por su mayor Complejidad, debida en parte a la gran magnitud det genoma. Condensacién del DNA \Erapaquctamiento, plegamiento o compactacién de la motécula de DNA debido a a asociacién con proteinas, para dar ugar a nuclcoproteinas. Se estudia en este tema, Este aspecto apenas existe en procariotas y orginulos de eucariotas, donde no hay histonas y Ja condensaci6n se basa s6lo en el Superensllamieno dea doble hice84 CONDENSAGION DEL DNA Y CROMOSOMAS celular (tema 9), mientras que el proceso Inverso, la descondensacién del DNA, comienza después de la divsién Celular (fase M) y continia durante la fase G, hasta alcanzar de nuevo la condicién difusa, que permite la replicacion (fase S). No se conocen con precisién los aspectos moleculares de ambos procesos, aunque se asume una gran analogia y se considera, por tanto, que ambos transcurren por ls mismos mecanismos, en sentido inverso.. 8.1.1 Proteinas componentes de la cromatina 8.1.1.1 Histonas ‘Son las principales proteinas componentes del material genético de eucariotas (equivalentes en masa al DNA). Su funcién fundamental es estabilizar la estructura del DNA, contribuyendo a compactarla, para faciltar su fempaquetamionto. Estructuraimente, las histonas constituyen una familia de proteinas semejantes, de tamafo ‘elativamente pequeno y con elevado contenido (casi 1/3 del total) de aminodcidos basicos (pt de 9 a 10). Gracias 2 ello, muestran naturaleza policatiénica a pH fisiolégico (numerosas cargas posiivas en cada mokécula) y se asocian fuertemente, mediante interacciones electrostaticas, con los grupos fostato del esqueleto polianiénico del DNA. %Lisina_% Arginina %(Lys+Arg) N° de aminodcidos _Masa molecular Hi 24,8-29,5 1,3-2,6 274-308 215-244 21,1-23,0 kDa Ha 10.9 93 20,2 129 14,0 kDa Hp 160 64 224 125 13,8kDa HS 9,6 13,3 22,9 135 15,3 kDa He 108 13,7 24,5 102 1,2 kDa Existen einco tipes principales de histonas bien caracterizadas, que se diferencian en su composicién y, como se vverd después, en su Papel estructural en la organizacién del nucleosoma y cromosoma. La histona H1 se presenta con ‘mayor variablidad de secuencia y tamafio en distintas especies 0 tejdos, mientras que las otras cuatro estan altamente ‘conservadas. En algunos casos, H1 es susiituida por una variante, denominada H5, con especial afinidad por la cromatina, lo que refuerza el empaquetamiento y la inactividad transcripcional El grado de condensacion del DNA se regula en parte mediante la acetilacién y fosforilacién de las histones (pig. 326), afectando asi a le accesibilidad del DNA para la transcripcién; de este modo las histonas intervienen en el control de la expresién génica, 8.1.1.2 Proteinas no histonas En la cromatina se pueden encontrar otras proteinas, menos abundantes, mas variables entre tejidos y especies y ‘en general peor caracterizadas: a) Con funcién estructural + Proteinas basicas: ++ Protaminas: Desemperian la funcién equivalente a las histonas en tipos celulares concretos, particularmente el espermatozoide. Son proteinas pequefias (50 aminodcidos, en algun caso) con elevada proporcién de Arg, Alay Ser, y estructura predominantemente a-helicoidal. Su menor tamafo permite la compactacién del DNA en el ‘espacio minimo disponible en el espermatozoide. ‘+ Proteinas acidas: ‘+ HMG: Hasta un 5% de las proteinas nucleares coresponden al grupo llamado HMG (high mobility group), proteinas del grupo de alta movildad electroforética, por su cardcter Scido, relativamente pequefias. Algunas se ‘asocian al nucleosoma (al menos in vio), mientras que otras interaccionan con el DNA espaciador (pg. 86). Este ‘grupo incluye algunos factores de transcripcion. + Proteinas del esqueleto 0 matriz nuclear. Esta estructura, que sirve de soporte o guia en el empaquetamiento de la cromatina (pag. 87), esta formada por diversas proteinas, incluyendo algunas HMG y otras proteinas de ‘cardcter acido, ») Con otras funciones ‘+ Asociadas @ la cromatina, aunque en minima cantidad, se pueden encontrar numerasas proteinas, muy diferentes, {ue intervienen en la replicacién y transcripcién (temas 12 y 18) y en la propia regulacién det grado de ‘ondensacién de la cromatina: DNA- y RNA-polimerasas, sus proteinas auxiiares, factores de replicacién, factores de transcripcién, receptores hormonale, topoisomerases, et.CONDENSACION DEL DNA EN EUCARIOTAS: 85 8.1.2 Niveles de condensacién del DNA nuclear eucariético ‘Se puede resaltar el grado de condensacién alcanzado recordando que la longitud del DNA es varios ordenes de magnitud superior a las dimensiones de las estructuras celulares que lo albergan (pag. 66). Se denomina grado de condensacién o de empaquetamiento al cociente entre la longitud del B-DNA en doble hebra y el tamafo del mismo ‘na vez condensado; este parametro se utiizaré para comparar los distintos niveles de compactacién, La condensacion del DNA puede estudlarse en cuatfo niveles, aunque esta division es relativa, ya que todavia no © comprende con detalle cémo acontece este fendmeno a nivel molecular. Es importante indicar que ta condensacién y descondensacién a través de esos niveles esta estrechamente asociada a la progresion por las distintas fases del ciclo ‘ala (pags. 100-101). Cromosoma metafésico (@crométidas) Heterocromatina va SS. condensacidn: 6) Fibra de 10 nm 55 am a (nucleosomas) fe tre Sk rat N. 7 emcitoe \, Cadena de DNA (doble hélice) é E 5 5 2 7 ' 2 Bucles de eromatina ‘( 53 om) . = 3 & 5 3 Evoromatina end tO ag s . Cromosome interfisico, nd de ond zg ‘Ass (iba 30 nm) -> Fees 1 g Esgueleto mclear-> 7 ‘reins. | : = Fibra de30 nm +7 a Z 1 7 (eelenoide) oa £ Nivel2 Be 3 Faas (endode SS 5 conden: 40) yy 2 2 < z Nivel 1 . a : (gato de 3 = 3 i g 3 3 2 5 S 8.1.2.1 Disposicién en nucleosomas y fibras de 10 nm Elnucleosoma es la unidad basica o elemental de la cromatina y los cromosomas. Constituye un patron regular de inforeooén entre ONA e histonas, responsable de la organizacién estructural del material genético en todos los ‘cxganismos eucariotas (en cualquier tipo celular y etapa del cicio). Tanto el nucleosoma como sus componentes y las fras en las que se integra han sido obtenidos y analizados por digestion con DNasas, técnicas de entrecruzamiento {crossinking),hibridacién, difraccién de rayos X, microscopia electrénica, difraccién de neutrones, dicrofsmo circular, Utrecentrfugacién analitica, etc. La propuesia de la existoncla del nucleasoma surgié del estudio de la accién dé ‘DNasas: sobre un DNA nativo, el tamafo de los fragmentos producidos es siempre mili de 200 pb, mientras que si86 CONDENSACION DEL DNA Y CROMOSOMAS ‘actan sobre un DNA previamente liberado de histonas, los fragmentos son de cualquier tamaito, Esto sugitié que la ‘union de tas histonas protege regiones de DNA de unos 200 pb. Cada nucleosoma estd formado por 9 moléculas de histonas y un tramo de DNA. Bajo ciertas condiciones ‘experimentales puede liberarse la histona M1, localizada extemamente, lo que hace accesible a la DNasa una parte ‘adicional de! DNA. El nuceosoma queda as! reducido ala lamada particula ndcleo (core), formada por un octémero de hhistonas rodeado por DNA. El arrollamiento levogiro de! DNA sobre las histonas supone un superenrollamiento negetvo ‘de la cadena de DNA (en procariotas el superenrollamiento se consigue por simple retorcimiento del DNA circular, sin Implicacion de proteinas, y no existen nucleosomas). ‘Moléculas: 2 Ha, [componente 2B, ‘del 2H, "1 pucleosoma: | DNA de doble hélice 2H (200 pb) Histonas 9 en oa) ‘Nucleosoma { * 200 pb DNA. , +145 pb DNA ‘completo: | + (H2AH2aH3,H4), miicleo: | = (H2A,H28,H3.H4), Ht Tatisons HI, de mayor mao que = ol exter dea Ta dob hora de DNA (hoe deatogira) rodea (1,73 vues) ‘sootimera de istonas on ue iporenrllamieno de ado Tevbaheo Casini cextoaa del DNA ‘abe el cctamero de ‘istonas sccesible par Las pres rls rofibics de asf Histon se Gisponce havi interior, mfcares que ela superfiie del octimero se sian los, reridans basen, be asl intracionanelcetosttcameste cone DNA poliaiénico. Los extremes N-erminales dels histonasSobresalen de a pate ‘cle, son danas do metlacia, acculseay osfrlci, odiicasanes que aleran a condensacion del romatn Gas vachas de DNA alotedor de otimera Finalmente, otras proteinas no histonas también partcipan en la estructura: HMG-14 y HMG-17 se asocian, al ‘menos in vitro, con cada nucleasoma, mientras que HMG-t y HMG-2 interaccionan con el DNA espaciador. Una misma molécula de DNA envuelve sucesivamente a distintos nucleosomas y los conecta entre si. La porcién presente entre dos nucleosomas sucesivos se denomina espaciador, ligador o DNA internucieosémico (linker): su longitud puede variar entre 20 y mas de 100 pb, dependiendo del organismo o incluso del teido dentro de un mismo ‘organismo. Esta estructura de nucleosomas espaciados a la largo de la molécula de DNA se denomina fibra basica de ‘cromatina © fibra de 10 nm, pues su grosor cotresponde al didmetro del nucleosoma. El grado de empaquetamiento ‘alcanzado es unas 6 veces superior al de la doble hélice del DNA extendida. La fibra de 10 nm también se llama “estructura en cuentas de rosario’, por su aspecto caracterstico al microscopio electrénico, generalmente sélo ‘observado cuando se prepara in vitro a baja fuerza rnica (por ejemplo, 1 mM), mientras que dentro de la célula la ‘cromatina se encuentra mayoritariamente en formas mas condensadas, y su disposicion en este estado relativamente cextendido se limita, en todo caso, a pequefias zonas.CONDENSACION DEL DNA EN EUCARIOTAS 87 8.1.2.2 Formacién de la fibra de 30 nm En las preparaciones de cromatina obtenidas in vitro a mayor fuerza iénica (por ejemplo, hasta 100 mM), la fibra de 10 nm se arrolia en sentido levégiro para dar lugar a una forma més condeneada, denominada solenolde o fibra de 230 nm, que supone un grado de empaquetamiento 40 veces superior al de la doble hélice original. Esta fibra contiene algo més de 6 nucleosomas por cada vuelta de solenoide. Aunque se desconoce su estructura exacta in vivo, se cree que [a histona Ht queda situada on el interior del solenoide, acercando los nucleosomas entre si. De hacho, erperimentalmente la formacion de la flbra de 30 nm, a diferencia de la de 10 nm, requiere la presencia de H1. Esta es, probeblemente la forma fisiolégica mas descondensada de la cromatina, adoptada por la mayoria del DNA durante la inerese, 8.1.2.3 Cromatina o cromosoma interfasico Este nivel de condensacion supone la presencia de lazos y superenrollamientos de la estructura anterior. Los bucles 0 asas radiales, formados por unos 60 6 100 kb de fbra de 30 nm, emergen de un armazén de proteinas no tistonas denominado nucleo o andamisle central, matriz nuclear o proteica, o esqueleto nuclear. Estos bucles sufren superenrllamionto, regulado por topoisomerasas asociadas al esqueleto. Parece que, ademas de contribuir al ‘empaquetamiento del DNA, los bucles constituyen unidades transcripcioneles, al haberse observado la presencia dentro 4e un sola bucle de un gen completo o bien de un grupo de genes regulados de forma comiin. Es tipica la observacién {e ases radiales en la interfase de cromosomas poiltnicos gigantes de larvas de insectos y en cromosomas plumosos itis de ooclos de anfibios. A partir de esta estructura se forman enrollamientos superiores, que hacen que la cromatina en la interfase fresente en el nuicleo un grado de condensacion variable; se calcula que se multiplica el grado de condensacion del DNA por 1.000 6 2.000. Esta diversidad local en la densidad de condensacion se observa en forma de la presencia sinultinea de eucromatina y heterocromatina en una célula en interfase. ' Eucromatina Petecocronmeana (cromatina verdadera ‘Aspecto al microscopio bajo Se fife intensamente con el colorante ‘Se tife dabiimente y con tain (definicién original) May-Grinwald-Giemsa aspecto dituso Grado de condensacion del NA Maxima condensacién de la cromatina (proxima, Forma menos ‘aunque menor, ala del cromosoma metatésico) __condensada Contibucién al total dela ‘Minoritari; s6lo algunas porciones del material __‘Mayoritaria durante la comatina genético se encuentran en esta forma: interfase Heterocromatina constitutiva: regiones det {genoma que se encuentran permanentemente on forma de heterocromatina (durante toda la interfase) yen todas las células ‘Se descondensa el tiempo minimo necesario para replicarse durante la fase S del ciclo celular. Inctuye el DNA satélite tema 10), concentrado ‘especialmente en regiones teloméricas y centromérica de los cromasomas (pag. 92) Heterocromatina facultativa: se encuentra como heterocromatina sélo en algunas células de un ‘mismo organismo 0 en algunos individuos de una especie; puede pasar a eucromatina, en respuesta a determinadas sefiales Uno de los ejemplos es fa inactivacién de uno de los 2 cromosomas X en la mujer, puesto que se puede inactivar tanto el X materno como el patemo. Uno permanece condensado como heterocromatina, mientras el otro esté en forma de eucromatina ‘A final de la fase Gz, previa a la division por mitosis ‘0 meiosis, toda la cromatina de la célula adopta la {forma de heterocromatina (antes de condensarse atin més para dar el cromosoma) ‘Accesiilidad de la molécula de No es accesible, debido a su elevada condensacion. Es accesible: cromatina DNA para suinteraccién con Se habla de cromatinatranscripcionalmente transeripcioneimente protinas (ONA polmeresas, inactive, Se replica al final dela fase S. Los genes activa. Se replica al RNA polimerasas, factores de que contiene no se expresan Brincipio dela fase S. transcripcion..; pig. 250) Sus genes se expresan88 CONDENSACION DEL DNA Y CROMOSOMAS 8.1.2.4 Cromosoma metafasico ‘Aunque al final de la profase cada cromosoma ya esta condensado como heterocromatina, durante la metafase se condensa ain més, adquiriendo el aspecto tipico de los cromosomas metafasicos, corplsculos observables a rmicroscoplo Gptico que muestran, en general, aspecto de bastoncillos con dos erematidas mas 0 menos separadas entre si Las fibras de heteracromatina se arrolan en una primera espiralizacién para formar una espiral menor de peso muy pequefio, que se arrolia a su vez sobre si misma (en unas 10-30 vueltas) para dar la espiral somatica. Con esa doble espiralizacién se acorta la cromatida a una vigésima parte, sin aumentar su diametro. Esto la hace mas visible al microscopic éptico. Algunas regiones de la cromatida so arrallan sdlo en espiral menor, como, por ejemplo, las del ceontrémero. 8.2 ESTUDIO DEL CROMOSOMA METAFASICO 8.2.1 Aspectos citogenéticos 8.2.1.1 Morfologia de los cromosomas ‘Se llama centrémero, constricci6n primaria o central a la regién mas estrecha del cromosoma, por la que permanecen unidas las dos crométidas hermanas, El centromoro delimit los brazos cromosémicos (cuatro antes d la mitosis, dos tras ella), Los brazos cortos se designan con la letra p (de peti y los largos con q (de queue). Cada brazo se nombra, pues, par el nlimero del cromosoma al que pertenece, seguido de la letra p 0 g. Por ejemplo, 6p es el ‘brazo corto del cromosoma 6, 8q el brazo largo del cromosoma 8, etc. Los cromosomas se clasifican atendiendo @ la pposiclén del centromero y, por tanto, segin el tamafio relativo de los brazos: Cromosomas ‘Cromosomas ‘Cromosomas metucentrieos: submetacéntriens: _acroeéntrices: brazosdetamaiio “brazos detamafio, un brazo muy ‘diferente Trio comes seretuien er creeisica lar requerio Uipresncin desis en ‘dlsarcacusum ie gnce antes de la mitosis sips detWNA 1889 25 \Gromosoma doble, DNA duplicate, 26, 2 eromitidas, 4 bazos) ‘sound tas a mits “BNA simple et cessteero "roma, 2 braros) En los brazos cortos de los cromasomas acrocéntricos (excepto ol Y) existen, ademas, otros estrechamientos de la cromatida, denominados constricciones secundarias, zonas en las que la espiral somaética presenta un didmeto més reducido, Delimitan una seccién terminal en el cromosoma, a modo de una pequefa esfera, a la que se lama satélite cromosémico.ESTUDIO DEL CROMOSOMA METAFASICO. 89 ‘Casificacin de los eromosomas homanos, se gin: ipo (Metacéntico, Submetacéntico © Actacénttico) tamaio (Grande, Mediano, Pequcio) + grupo de clasificacion (A,B,C.D.E,F,G) an mcf erm i af a 5 = oo 7 Wor the 3 ss timito: M MoM oe ¢ ce re i bf e2s,, : Pi trit seas ke ETRE 6 comm 4 1 6 17 ew mam x eA A AMS SMM AR 8 ami MOM MP OP OP Oh Pe oe DD DEEEFRFGOO ¢ 821.2 Cariotipo y su andlisis 120 > Cariotipo Soiled romonamas ‘Es rangoeuracteristico de esda specie: todos los eganismos de wna ect tienen el mismo cariapo, Sin cemargo, especies may similares pueden {ener eartotpos muy diferentes, conjunt de eromosomax ‘on bandead x20 > Cariograma (eq gatos textor a exo 6 {ellama también carp) reprsentacion exquemstica sri 121 D> ilogame CBee See, “Nuue pws aurea “uy ‘Son varios los métodos desarrollados para el andlisis del carfotipo. Normalmente, este estudio se realiza sobre tiomosomas en el estado de prometafase 0 metafase. Las preparaciones de cromosomas metafésicos se emplean ‘alemés pera analizar anomalias cromosémicas, determinar la presencia o ausencia de cromosomas extra. A.este fin, el método original y més sencilo de obtencién de cromosomas parte de leucocitos, como células hudleadas del organismo més asequibles.90 CONDENSAGION DEL DNA Y CROMOSOMAS Preparacion de cGlulas para Losers ov ol caioupo humana 5 claim en papas (AT 1,8. FyG) en faneién de su lato y dela posison del contre mero. iors Han ho, aractrizan tambien por ptr de bandas AW Wun eg foab abc ae ae oa Se clvan ls ciale ‘dena mics de sangeu cme eiben imine uo con ‘Genco ome begin) 7, Se aad up nhibidar eta formacion de uso mitted (antimitices, i colebilo) para | deter ol erection cola de lee Leseoctos allegra metatase om oney OH, 7 Sereca a0. fenton Se van ts caan com igi eo, stan argue schncor on ‘yee abade un fiedor “or cemplo, metant acto 3:1) 5. Las cus, que peraneceneneasy con {or ermmoromas imacion, “eetlende sobre un poranhjts y e observa ‘al mierosopio el fmt de cromoso. sos oparssen como ‘ompsates chido ‘iformemente 6 Para una cj caracterizucn individual ds os cromosormas ‘Cun las eenleas de bandeadoo bande. Par clo se ie la Peparaccn con dversos actives, dando fgara distnts Upos dobandeadoeromosdmico (bandeo G,Q,,T.C.-) Actualmente, se parte ya no sélo de cultivos de leucocitos, con la desventaja de su vida corta, de 3 a 4 dias, sino de cultivs a largo plazo de células de diversos tipos de tejdos (fibroblastos, médula ésea, liquido amnidtico, biopsis, etc.) Las més usadas son las de mayor potencial de division o mayor facilidad de cultivo. Asimismo, existe una vatiedad de tatamientos de desnaturalizacion ylo degradacién enzimatica de la cromatina, y de tinciones con colorantes ‘espocifices para el DNA. Por titimo, se han desarrollado sistemas de cariotpificacién que pueden ser informatizados de forma que seleccionen autométicamente las células @ analizar, el tipo de tincién y ol andlisis de los cromosomas. 8.2.1.3 Bandeado Aplicando dlstintas técnicas de tncibn, utllizadas de forma rutinaria en laboratorios de citogenética, se puede ‘observar en Tos cromosomas bandas palidas y oscuras alternativamente, que definen grandes regiones cromosémicas llamadas Isocoros. Este bandeo 0 bandeado de cromosomas no es consecuencia de agrupamientos fortutos, sino ‘que esta relacionado con la organizacién estructural del genoma, reflejando variaciones tales como la composicion de bases, grado de condensacién cromosémica, conformacion de la cromatina, secuencias repetiivas y no transcrtas, etc. Los patrones de bandas de cada cromosoma son précticamente idénticos en células diferentes, y en casi todos los tejdos, pero pueden diferir entre individuos; por ejemplo, al menos 12 cromosomas muestran variaciones en la longitud de ciertos segmentos en distitas personas. Se pueden llegar a apreciar hasta 500 bandas en un cromosoma; en {funcién de la resolucién microscépica alcanzada, las bandas principales se subdividen sucesivamente en subbandas y ‘subsubbandas. A todas ellas se les asigna un nombre, que incluye el cromosoma, el brazo y un namero correlative desde el centrémero hacia los extremos,ESTUDIO DEL CROMOSOMA METAFASICO 1 RESOLUCION CRECIENTE — a) crpmowona eda cmd vada bad xiograma (conzeromuanas) ““dosruse” (guises ses) sub-bandas -subub-bandas ras rea (Miss ee 7q21 3. SETI a COR. Bee REE (| ipa gasmemieciemans 8. (os mage Tenerife’ || wombs || Minera hear totes © JU E Csae ea “nice pce pee eed pa ambos braz03, Para el bandeado de cromosomas se emplean diversos métodos de tincién del DNA con colorantes especifioos: a) Bandeo G Es le técrica mas utlizada. Se basa en una desnaturalizacién contolada de las proteinas cromosémicas (generalmente por digestion con tripsina), seguida de tincién con Giemsa (de donde viene el nombre de bandeo G) y abservacion al microscopic (¢! reactivo de Giemsa es una mezcla compleja de colorantes). Cada par de cromosomas ‘muestra asi patrones caracteristicos de tincién, con bandas oscuras (G-positivas o bandas G) y bandas claras (Gregatives). b) Bandeo Q Los cromosomas se tifen con_un compuesto Muorescente, como mostaza de guinacrina (hidrocioruro de aunacing), 4,6-ciamidino-2-lenitindol (DAPI) 0 Hoechst 33258, que se intecalan en el DNA doble. Se require, por tart un examen mediante microscopia de fuorescencia. Apareco un patrén especfio de bandas brilantes (bandas Q 0G positives), que se corresponden casi exactamente con las bandas G (@-postvas, G-oscura). Las bandas G y @ contienen DNA que, en genoral, es algo més rico en pares AT (55-60%), pues la quinactina se inseta preferentemente entre estos pares. Coesponden a cromatina altamente condensada, con DNA de replicacion tagia dentra de la fase S del ciclo celular, relativamente inactivo transcripcionalmente. 0) Bandeo R Se basa en un tratamiento de los cromosomas con calor (para desneturalizar el DNA rico en AT), antes de la tindén con Giemsa. Resultan asi bandas oscuras (bandas R) que coinciden con las bandas G 0 Q claras (el nombre etva de patrén reverso). También se consigue el mismo patrén de bandas empleando olivomicina, un colorante can iridod por los pares GC. Las bandas R contienen DNA rico en GC (50-60%), de baja condensacién cromatinica, que se replica en tapas {empranes dela fase S y es relativamente activo transcripcionalmente. @) Bandeo T Idetiica un subconjunto de bandas R especialmente concentradas en ls telémeros, las de tinlén més intonsa, y se vsuaizan empleando un tratamiento térmico paricularmente severo antes de tefir los cromosomas con Giemsa o te conbinacin de tinciones y uorocromas. 2) Métodos especiales tres métades de cultive cromasémico y de tincién se utiizan para situaciones particulares: bandeo C, para regiones heterocromaticas; tinekén NOR, para la regién organizadora de! nucfeolo, que contiene los genes de rRNA 18S 28S; bandeo de profase y prometafase, 0 de alta resolucién, sobre cromosomas detenidos en una etapa tomprana ela mitosis, con un estado relativamente descondensade (su mayor longitud permite apreciar mas detalles, legandose ‘achservar hasta 850 bandas en un solo cromosoma), etc. Finalmente, la citogenética molecular emplea sondas de DNA clonado (preparadas por téonicas de DNA fecombinante, pag. 176) para examinar cromosomas, de forma similar a los ensayos de hibridacién molecular pero ‘sabre peparaciones de cromosomas completas. Esta es la técnica denominada hibridacién in situ con fluorescencia (FISH, orescence in situ hybridization, pag. 172). Se dispone de sondas especificas para cromosomas individuales y pare regiones cromosémicas, que permiten, por ejemplo, identiicar reordenamientos cromosémicos particulares U ‘obtener un diagndstico répido de la existencia de un nimero anormal de cromosomas,92 CONDENSAGION DEL DNA ¥ CROMOSOMAS 8.2.2 Regiones con significado funcional Los cromosomas eucariéticos muestran tres elementos esenciales para una funcién correcta del ciclo celular la division, imprescindibles para la expresién, duplicacion, y segregacién de los cromosomas: el centrémero (lugar do tunién del cromosoma a las flbras del huso acromatico), los telomeros (regiones situadas en los extremos de los cromosomas) y os origenes de replicacion (puntos numerosos en cada cromosoma donde se inicia la copia de as dos hebras de DNA). Se tratan a continuacién los aspectos morfoldgicos relacionados con los dos primeros; el andlisis de Jos origenes de replicacién se pospone hasta que se estudie el proceso de replicacién (pag. 150). 8.2.2.1 Centrémero ‘Se puede considerar el centro cinético del cromosoma, pues sobre é! se sitian las estructuras lamades cinetocoros, a las cuales se unen las flras que constituyen el huso acromatico © huso mitéico. Estas fibras, flamentos contréctiles © microtubulos, de naturaleza proteica, ejetcen la traccién necesaria para separar las dos cromatides durante la divisién celular. De esta forma se produce la segregacién ordenada de los cromosomas y cada célua his recibe una cromatida de cada cromosoma, es dec, idéntica dotacién genética. La ausencia de centrémero (cromasoma ‘acéntrico) implde que el cromosoma se Una al huso mitético y, por tanto, que se incluya en el nucleo de las células hijas. Las secuencias esenciales para la funcion de los centrémeros son muy ricas en pares AT, tienen unos 170 pb en humanos y se repiten entre 2.000 y 30.000 veces en cada centrémeta. Forman, pues, parte del lamado DNA repetitive (pag: 113) y ademas suponen una parte importante de la fraccion de heterocromatina constituiva, aquélla que sélo legs fa descondensarse un tiempo minimo en el ciclo celular, el preciso para su replicacién. 8.2.2.2 Telémeros Telémero es una palabra de etimologia griega: felos, extremo, y meros, parte o regién, que hace referencia 2 regiones situadas en los extremos de fos cromosomas eucaridticos, constituidas por secuencias especializadas de DNA asociado a proteinas y con caracteristicas estructurales y funcionales propias que las ciferencian de otras regiones, ‘cromosémicas. Los telémeros de la mayoria de eucariotas estan formados por dos tipos de secuencias de DNA. Una de elas, , ‘gradual del DNA:"" Fibra de 10am. Fibra de 30 nm, CCromatina o { eromasomainterfisico: 4 Wiest “Heterocromatina + Cromosoma metafisico Uns cs die 2, 4¢ dd dos haploidesn, 2C 2n cromosomas metaisicos ‘(Condensados) formados cada uno por? romantics unis por el eentriero. ‘Cha cromatida es una ‘ob hebra de DNA: ada eromosoma, dos dobles hebras. bi Cada cromosomainterfisico ‘(Gescondensado, cromatina) ‘std formado por cuatro hebras de DNA (una doble heb asociada con ota doble hebra, copia idéntca) Eerie SION eae Se estan duplicando los eromosomas, ‘que siguen descondensados, Hx CO CICLO CELULAR X coxites/espermatocitos aa germinal (Giploide)DIVISION DE CELULAS GERMINALES PRIMARIAS POR MEIOSIS 104 = évulovespermatozoide { coxitovespermatocitos majras separacion de las dos cromitidas que forman fda romosoma, ‘Una eélula haploid n, 2C an, Broo ABC 2g cuit 7 ic: orem elaine: 464 As Ba Ce = ih=> => hk=> ME 9.5 UNION DE LOS GAMETOS HAPLOIDES DURANTE LA FECUNDACION Cuando los dos gametos (n, ©) se unen en la fecundacién, el proniicleo macho del espermatozolde se funde con el prondcleo hembra del évulo, combinando sus dos genomas haploides para dar un genoma 2n, 2C en la célula huevo © cigoto. Esta es asi la primera célula somatica proplamente dicha, Como tal, entra en la fase G; y posteriores de le Interfase. A partir del cigoto se forman en definiiva todas las células somélicas. El mecanismo que rige le transformacién de una simple célula, el cigoto, en un individuo constituye un tema de gran interés blolégico, casi totalmente dasconocido desde el punto de vista molecular. Tras milliples divisiones colulares, se origina un amasio globular de células embrionarias, las cuales se autoorganizan y especializan hasta formar un fantastico conjunto de ccélulas (220.000 millones), subdivididas en casi 250 familias diferentes, cada una con una funcién y disposiién Cconcretas, on las distintas estructuras (cerebro, ojos, nariz, corazén, etc.) del organismo completo. La Biologia dd Desarrollo es un campo de activa investigacion y en los titimos afios se han alslado genes que controlan, por ejemplo, la disposicién dorsaliventral o derecha/izquierda de algunos érganos; sin embargo, aun estamos lejos de conocer los ‘mecanismos moleculares que gobieman la organogénesis. ema gts (Eo snaps {Che Bn |e snp 9.6 RESUMEN INTEGRADO ara terminar, e siguiente esquema resume los distintos procesos estudiados, recogiendo de una forma uniicada los cambios en la cantidad de material genético que sufte la célula durante los procesos de fecundacién, divisién rmeidtica y mitética y ciclo celular. pore = Gametogénes s jeter 2 of. germina inns a a aaa secundariss E> meds + aac 20,2¢ we an ae mae me 1GIG, Gy G ae SE, MEIOSIS, tence ecco NTERE eeeeterere cen Fecundacion de 2 gametos “célula somitica eae 2 eéhulas (idénticns), 7 Oe aE 2c EDP a, 4c E> a, BD inte i 5/6, a s o INTERFASE Mrrosis = + = + = + = + *Cicta celular: continuas divisiones mit6uicas de oélulas somiticas * ~*~ * STema 10 Organizacion del genoma eucaridtico 402 DNA de copia dnl 103 DNA repetitive... 103.1 DNA repetitive codtican 10.3.1.1. DNA repetitive codificante agrupado 2) Familias génicas clisicas, ») Familias mutigénicas de genes agrupados 10.1.1.2. DNA repetitive codificante disperso: familias multigénicas de genes dispersos. 10.1.2 DNA repetitive no codificante... {0.1.2.1 DNA altamente repetitive y agrupado: DNA satéite 10.1.1.2 DNA moderadamente repetitiv y disperso... 2) Bloques dispersos de repeticiones en tandem: DNA minisatéite y DNA microsatélte, 114 b) Repeticones dispersas: SINEs y LINES se 144 104 Estudio experimental de la complejidad en el genoma de eucariotas.. En procariotas, practicamente todo el DNA existe en forma de copia tnica y codifica productos génicos (proteinas RNAs). Sin embargo, esto no se cumple en el genoma nuclear de eucarlotas; por ejemplo, se calcula que sélo 100 {Mb de total de 3,300 Mb del genoma human haploide son codificantes. Ademas, ol genoma eucaridtico se caracteriza parla epeticion de secuencias, El objetivo de este tema es, por tanto, plantear esta distinc entre DNA de copia tnica {DNA repetiivo y estudiar con detalle este citimo en el genoma humano. E! carécter codificante, aunque se incluye Janbién aqui, se comprenderé mejor en temas posteriores, al estudiar la expresién génica (transcripcion, maduracion y ‘iatuccin). Los aspectos experimentales que han permitido la demostracion de la prosencia de DNA repatitivo en el genoma euceriético se descriten al final del capitulo. Baséndose en toda esta informacion, se podra abordar més aielaniesu aplcacién a problemas biotecnolégicos en general y clinicos en particular. 101 COMPLEJIDAD DEL GENOMA EUCARIOTICO. La presencia de DNA repetitvo da lugar al concepto de “‘complelidad” del genoma, Este término se define como lesuna de tamafos (pb) de todas sus secuencias diferentes (es decir, las secuencias repelidas se contabiizan solo una Y¥2) En consecuencia, para un tamario de genoma dado, a mayor grado de repeticion, menor “complejidad’ Nola: La interpretacién de este término se puede prestar a confusién, pues frecuentemente se usa con la ‘2eepcion comin de la palabra complejidad, que puede parecer contraria a la definicion anterior. Asi, un gonoma ‘en gran numero de secuencias repetidas es aparentemente més complejo, pero por definicion su “complelidad” ‘es menor, Para evitar confusiones, se usaré entrecomilado cuando se refiera a la definicion especttica dada, Pra el estudio de la *complelidad” dal genoma humano, éste puede dividirse en distintas categorias de DNA en ‘uncin de su repettvidad y su cardcter codificante:108 structural: exones (codifica protei Codificante: genes DNA de copia tinica No codificante (funcién desconocida)| Agrupado| Codificante Fara Disperso: Famili Agrupado (en regiones heterocrométicas)| DNA y Altamente repetitivo repetitive No codificante Disperso (por todo el genoma) 'y Moderadamente repetitive Genome naciear humano 3.300.000 kb en 23 moléculas lineales, 2 copias por célula diploide, aprox. 100,000 genes Gasper Bans aie Biss Regular Dison Fron SINE YL eae ORGANIZAGION DEL GENOMA EUCARIOTICO 1s 0 RNAS) Regulador (controla la expresién del gen) Intrones o DNA intragénico (intercalado dentro de los genes) DNA imtergénico (separa los genes) Genes repetidos en tandem ‘multigénicas agrupadas 15 multigénicas dispersas Repeticiones en tindem (DNA satélite) Bloques dispersos de inisatélites ‘epeticiones en tindem Microsatélites Repeticiones | SINE: secuencias Ai y otras dispersas LINE: secuencias Kpn y otras Genoma mitocondrial humano 16,5 kb en una molécula circular, ‘miles de copias por célula, 37 genes NA no coifigate 61%) Reguador 93.3% Fxones anal {woh zones sotieate “eves. 100% DNA de copia nica (co'hoy DNA repetitive) “eds as ifn son aroximadss yileren seg lo Toots) ‘Aiferencia det nuclear, el genoma de la mitocondria, de tamafio muy pequefio (16.589 pb en humanos, 200.000 ‘veces inferior al genoma nuclear haploid ‘std formado por DNA codificante casi en su totalidad, 10.2 DNA DE COPIA UNICA, SIMPLE O NO REPETITIVO Constituys la mayor parte del genoma, aunque en una proporcién variada dependiendo del tipo de organism (100% en procariotas, 80% en eucariotas inferiores, 50-70% en enimeles superiores). Parte de este DNA (-5%) cconstituye las secuencias de genes, que codifican los RNAS y proteinas celulares; otra parte (~5%) es responsable del control de la exprasién de esas secuencias, mientras que el resto, mayoritario (60%), es DNA no codificante, cuya funcién, si existe, apenas se conoce. EI DNA de copia sencilla fue considerado durante mucho tiempo como responsable Gnico del concepto clésico de ia parte del DNA repetitive forma algunos genes eucariétices, como se estud ‘gen; hoy se sabe que también una pequiDNA REPETITIVO 409 ‘8 continuecion. El concepto de gen, aunque ha sufrido una gran evolucién en eucariotas, para hacerse mas complicado ¥con méiiples Componentes, se sigue definiendo bajo un critero estrictamente funcional, siempre en relacién con la ttonsmision de la informacion desde DNA a RNA y desde mRNA a proteinas. Concretamente, un gen es aquella regién {de DNA que comprende, por un lado, las secuencias estructurales, que se transcriben exclusivamente en RNA (region estructural de genes de {RNA y ¢RNA) o bien se transcriben en un mRNA que a su vez da lugar a una proteina, y por el dr las secuencias reguladoras, que actian en ambos casos controlands la transcripcién de las regiones estructurales. Estudio detallado do las caracteristicas de los genes eucaridticos se deja para temas posteriores, cuando se analice su expresién. Gens par RNA Genes pr prot cxchvamette i ensoben a RNA setrascend mRNA Ye educen iin rion isin region regiladora estructural ropladora estructural IMA. pra carom NER. pacer vanes ast ten Sh on eal witty TP ely LC reneaipais 1 in inn NA tramerto non HMA tramserto a inti esBINA — bahia — mRNA maduro madre ee =e Repos erica mune se arse eae sod eane, protel ee 10.3 DNA REPETITIVO Las secuencias de DNA que aparecen en copias miltiples, o ONA repetitvo, constituyen entre un 20 y un 50% del ‘otal del genoma humano, segiin autores, Esta abundancia es la caracteristica determinante de la enorme “complejidad” del DNA eucariotico. Les secuencias repetidas, lammadas unidades de repeticién o simplemente repeticiones, tienen tamafios dversos y cada una se encuentra de forma idéntica o casi idéntica muchas veces en el genoma. Esta distioucién puede ser en forma dispersa por todo el genoma, entremezcladas con las secuencias de copia dnica, o tien en forma agrupada, localizada en regiones concretas del cromosoma, En ambos casos, el ndmero de copias de la nad de repeticién varia desde unos cientos o miles (DNA moderadamente repetitive) hasta clentos de miles (DNA atamente repetitive). Esto coincide en muchos casos con una distibucién en forma dispersa y agrupada, respectivamente, “id ei “epetcton de dstin.os . "Spmafios.peis9 pode repeticiones:3 1° de repeticiones saps SS ee mg “logue” de repeiiciones aprupades, “en ndem (adyacentes, contiguas): ‘amano del blogue: 27 pb repeticiones “dispersas™ ——_ distancia entre repeticiones Una parte del DNA repetitvo tiene cardcter codificante, es decir, contiene la informacién para expresar un Producto funcional (RNA o proteina). Para el resto de DNA repetitive no se conoce una funcién clara, alguno passlemente contribuya a mantener la estructura de los cromosomas, mientras que se ha llegado a proponer que una parte sea DNA chatarra 0 DNA basura, un vestigio evolutivo sin funcién actual. Finalmente, debe destacarse que ‘agunas de las secuencias repetidas no codificantes (concretamente, las denominadas minisatéltes y microsatelites), ‘un can funcién desconocida, tienen gran relevancia aplicada en pruebas de identificacién y estudios familiares, debido ‘331 variabilidad entre individuos, La repetitvidad del DNA tiene probablemente un origen evolutivo, Por un lado, las repeticiones agrupadas pueden ‘sgt por errores en la replicacién 0 en la recombinacién genética. Por otro, la separacién entre repeticiones dispersas puede praceder de translocaciones o transposiciones cromosémicas,110 ORGANIZAGION DEL GENOMA EUCARIOTICO, 10.3.1 DNA repetitivo codificante Se le llama también DNA repetitive funcional, pues forma genes que se expresan (aunque 10 todos, como se vera). Su tamafio se estima entre el 10 y el 15% del gonoma. Aparece en forma de “familias de genes", cuyos miembros terizan por su homologia, al haberse originado mediante duplicaciones (pag. 367) y variaciones de un gon Tipos de DNA repetitivo codificante y ejemplos caracteristicos : T. Agrupado: a) Familias génicas clasicas o conservadas, Histonas: Bj. 1 ‘con genes repetidos en tandem SRNAS| | Ej.2 “Muesian un alo grado de homologia de secuencia,es decir, son coniss | sRNNAS prcticamenteidnticas, lo que indica su relacin evoutva yfoneional Se eapresan todas las ropeticiones ’b) Familias multigénicas con genes agrupados ‘Sitwados en lovaizaciones espeeificas del genome (per sin relacion con las | Globinas: Ej. 3 ‘egiones centroméricasytelomérics) snRNAS ‘Sus repeticones presentan menor homolog: varanes, pseudogenes, genes | HLA-T teuncados yfragmentos de genes ( otras muchas) Solo se exprsan algunas de las repeticiones 2. Disperso: Familias multigénicas con genes dispersos ‘Aldolase ‘Normalmente, cade familia esta formada por un nmero pequetio de ‘Acting epeticionesrepartides por tod el genoma (incluso en cromosomasdistinos),] Ferritina siempre son todas furcionales GA3PDH 10.: .1 DNA repetitivo codificante agrupado a) Familias génicas clésicas Gd) coms son ese eo Perret act “Selmockoeoma y Hes exer el tan Hy regions "*ONA no sien) a unidad de repeticién (~5,8 kb), formads epee eae Peas TBs tet pstn depen C40. en manieoy as aie Genes de RNA ribosémico: subunidad eubunidad Las’ goes de eRNAs (7K etal) se ranaribon esa “range | conjuinamonte dando el pre-fRNA grande” (45S) que ef) “Grn ver ecindide orgies fs res RNAS madures, ribasoma bosom 7) 1 cuanto ipo de #RNA. de 55, est coifcado en un npc yoo ansrbe a resRNA pect GS) se da ugar tm iien RNA mao (Este tambien forma pre dela subunidad grande del ribosoms) ‘regia imtergéiea 0 cspncadar 7 ts DNA no cotiicnte) SO _____p a ‘Socesivasrepeticiones en Unde de Sa vatos ces, B y cgi espocis cn hamnos, 200 reparids en les 3 tuna sol “nid Se anscipeion parse ‘romosomas acrecenricos (1314521 22) Se ate DNA" DNA estate | precorsorernde dol RNA (pe-FRNA 458) 5} gen ge vRNA 3S exten eleromosome 1 tambien repel en tinder (100-20.000 conan, sex especies)DNA REPETITIVO 414 Contienen secuencias repetidas que codifican un mismo RNA o proisina, que puede asi sinttizarse con rapidez y en gran cantidad. Son ejemplos caracteristicos los genes de histonas y los de RNA ribosémico, productos ambos quie la célula necesita en gran cantidad (recuérdese que las histonas deben sintetizarse répidamente en la fase S del ciclo ‘elie, para asociarse al nuevo DNA procedente de la replicacién, y el RNA supone el 75% del total de RNA celular), ) Familias multigénicas de genes agrupados A diferencia de las anteriores, los miembros de cada familia son genes con mayor diversidad de secuencias. Se pueden inclu en este grupo tres tipos de familias: ‘+ Aquélias con homologia sélo en parte de la secuencia de DNA, que da lugar a proteinas con grandes regiones de secuencia y estructura comunes (dominios), + Familigs con homologia escasa en las secuencias del DNA, lo que genera proteinas con pequeflos motivos ‘comunes, cada uno de pocos aminoacids. ‘+ Grandes “superfamilias”, con muy débil homologia en la secuencia de DNA y, por tanto, en la de las proteines, a pesar de lo cual éstas mantienen una similitud estructural (en parte de su molécula, dominios comunes) y una ‘elacién funcional. Los genes que forman cada superfamilia parecen estar relacionados evolutivamente, pero mas distantes entre si que los miembros componentes de las familias anteriores. Familias de genes humanos de las cadenas oy B de globina: , Sn ancestral de globina (opr hace 500 lone de aos) gen de oie en de globina para migglobina para hemoglobina aa aS fama gin dee a gobinn (lobinas 6, 02 y (elobinas B,3, Ya, Ye y pscvdogenes ay G1) y pseudogén B) ‘pion ibe By Ha = LR ei de othe) & Vo" va, a2 ay 0 ‘Agrupamienta (cluster) de genes de ct-globina (~10 kb) en el eromosoma 16 ‘Agrupamiento (cluster) de genes de B-globina (-65 kb) en el romosoma 1] LCR (regiones decom detlocus) € Ya YG MB 3 6 ‘no hay repeticiones del agrupamicnto412 ORGANIZACION DEL GENOMA EUCARIOTICO Como conseovencla de os procesos evluivos que dan lugar afemios muligbnicas, aparecen con tecuerciaen elas mimes con caratristcasdfrondales: + Copias de genes (variants) con poquota derencias do secuencia, que coditcan productos géniosfunconales pero de caraceristeasIgeramente dts (po ejompl, derencias en alvdad enzinaica, parmots cnx, tspeccded por sta, aridad por su igando, et) Es comin quo se ative deforma aiteatva a expresn do una uota variant en funcin del estaso de desarl, de dferendacon cele, tpo de tei « Peeudogomes: se apices trmina (abroviado como ¥) a copiasinaclvas de un gen, 8 decir, que nunca se txpresan, 0 que aun expreséndose no son Rinconales. Generalmerte, la nacivacn se ha produido por fcumuacién do mutadones durante la evolucon ‘en lo ave iilamente era un dupicado del gen. Extn thos dversos de pavadogenes, en finddn de si_sooxprosan, si suten EEE] een origina! Procesamiento posanscrpconal, asi como de su oven ummm rove, + Genes truncados: se tata de copiasincomplelas dl ge, por padi dona region sivade en uno de los extamos (6103). — « Fragmentos de genes: on este caso se. conserva blo une fragmento de genes porcién del interior de la secuencia del gen (se han perdido = ambos extremos). ‘bviamente, slo las coplas idles (Camis clsicas) y las vaiantes conducon @ productos génics funconles, mines que lee paeaiogones, gone tuncados y agmentos de genes parcen ser Vestigios evltios sin fun atl Los genes de a gobina cnstiuyen une de ls eomples més representatives de fanilas muligénicas con gores grupos, mpleada en una fren fan importante como os ol Wenepete de oxigeno en la cortent sanguinea Su tstutio implica cons\deractnes evoutvas, de desarroloy dleronciacin, rguladon doa expresion gonica ‘genes truncados Tas wepienes de contol del Tends capa del demrolo Cada ea del desarrollo se tumino es un Ggano diferente el Tn eas aac, por ano pot a presencia uc exprst os genes de funias aigleas, ‘deftones bomoglobinas lobin’ Aerts on ea pan0 euro si de jy HBP (eal)= ony se avn goes fonts fe gree epencendo des HbA (aa) ~ ceapa de desarallo esano [Etapa de desurrollo] Genes que se expresan en la. Genes que se expresan en la y Sreano donde | aril ‘dela c-globina | familia genica de a P-gtobina | Hemoslobina() fas lobioas (enel eromosoma 16) (enel cromosoma 11) Yovave ay ay 0 BOS Embrién a ay a {aco vitelino) Mayer: ylobia& (zt) Mayan lobina Minor: globina'y . 5 Feto um joc 2 (higado y bao) Mayor: lobina Mayodtari 0 sao sina Sap | Minera: lobia Minar: Be Adulto Mayors: globine s (onédiula ésea) Mayor: fy Minorca ot 40.3.1.2 DNA repetitivo codificante disperso: familias multigénicas de genes dispersos Mientras que en las femiias muligénices anteriores las repeticiones se dlsponen agrupadas, préximas on secvencia lineal dol gonoma, en otras los genes que forman ia familia (copias idéntcas, variantes, pseudogenes ..) 58 localzan de forma dispersa por el genoma, a menudo incluso en eromesomas dstinios, Enire estas familias se encuentran genes que codcen proteinas de funciones dversas: enzimalicas, reguiadoras, de almaceranien, tetucturales ec: Por ejomplo, a fara de aldolasa comprende 3 genes funcionales y 2 pseudogenes, repartos en cromosomas; los genes de actina forman otra familia con 4 genes y al menos 16 pseudogenes.DNA REPETITIVO. 113 10.3.2 DNA repetitivo no codificante Esta es la fraccién del genome a la que el término DNA repetitivo se refiere de forma mas hebitual. Su tamafo se estima entre un 20 y un 40% del DNA genémico total. Como ye se ha indicado, se subdivide en dos categorias: ol moderadamente repetitive, que se ubica en forma dispersa, y el allamente repelitive, que ademés es agrupado. Su tisiibucién general en el genoma puede representarse gréficamente como se muestra en la figura, para dos ‘omasomas representatives. DNA satelite {ltamente repetitive y agrupado) cee , teldmeros Ielomeros «j: eromosoma 12 (submetacéntrico) «j eromosoma 13, (acrocénitieo) OUTTEE mE ents DNA repetitivo disperse (moderadamente reptiivo y disperso por todo el genoma, entremezclado con el DNA de copia iniea) nod de rept: gue ded 1.0003 -Agrupado (en regiones saison | Repeicione entindem (DNA saéite) 2506 gnstiln de unis g -y Altamente repetitivo: g ja 2 ide rep: we coos 3 satélites 10-65 ph a ‘miles de onitdades Bogue dispros de 2 repeticiones en tinder] una derepetciin: Hogue de hasta 0 3 Micromies esis E | bisgeno pat genoa f| vlstrinee means j iad ep: a E SINE: weenie Ayons WR; aide g Repaiciones ee os & ‘dapenen nid ein: mis depos, LINE:sevencios Kays i rst ees 10.3.2.1 DNA altamente repetitivo y agrupado: DNA satélite ‘Supone entre un 10 y un 30% del genoma, y se le lama también DNA repetitive en téndem. No debe confundirse tan el DNA minisatéite y microsatélite (ambos corresponden al DNA moderadamente ropettivo y disperso, pg. 114) ni ton los setélites cromosémicos, les pequeflas masas de cromatina que fornan él extremo de los brazos cortos de un tiamosoma aorocéntrico (pag. 88). Este tio de DNA esté formado por unidades de pequefio tamaifo (2-50 pb) repetidas en tandem entre miles y un niin de veces, con fo que el Bloque de repeticion abarca cientos de kb o incluso varias Mb. También es caracteristica {1 localizacién agrupada en lugares especificos de varios cromosomas, correspondientes a les regiones heterocromaticas, principaimente en tomo al centrémero y on los telémeras. Se conoce el papel de este DNA satélite ‘enlesregiones toloméricas (pags. 92 y 157), pero alin na su funcién exacta en el centromero. Elnombre de ONA sate tiene un origen metodolégico: debido a su alta tesa de repeticion, les regiones de este tipo de DNA poseen una composicion de bases diferente a la del resto del genoma, que es mas promediada. Cuando ol DNA total se fragmenta (por ejemplo, por fuerzas de cizalla) y se analiza en gradientes de densidad de CsCl (p89. 137), ks ragmentos procedentes de las regiones de DNA satélite, que poseen menor densidad debido a su menor contenido €1.G*C, se separan de la banda principal de DNA formando “bandas satéites’. Cada una de ellas corresponde a una ‘ablamilla de DNA satdlite (tales como 1, 2, 3, cy B), con distinta secuencia de repeticion ylo nimero de repeliciones.114 ORGANIZAGION DEL GENOMA EUCARIOTICO Sjemplos de ubicacion de DNA satéive en ceniromeros y tlomeros) —aitamiiag anaes] os vaimerteneneasionn) [_tpodermelie wind dept Seiten) se — ane (ona) a sic 5 ssatlites 2 y 3 Spb BD sstcsy sisite osfoide 171 26 een csi a0 oe tlic 6p Sy cattinn Scat a 10.3.2.2 DNA moderadamente repetitivo y disperso ‘Come su nombre indica, este tipo ge DNA se disttibuye a lo largo de todos los cromosomas, con un niimero de repeticiones no muy elevade (entre 10° y 10*). Se subdivide en dos categorias, en funcién de la forma como se LY Separacién por centrfugacién depende de la masa celular (am), det radio de giro del tubo, o radio del tsor donde se coloa la meta (1) y del velocidad aleanzaa pla entfuga (00) mv _ me? mgr? r re n =m. Qn vr =3948--¥r Rema Siendo: = fuerza centrifuga ‘Yeelt= velocidad lineal de la muestra en cl tubo (cmimin) +-=radio de giro, medido entre el punto medio del tubo de contig y el eje de rotacidn (on) = espacio lineal reorido, si el movimiento fuese lineal (2m) {t= tiempo de sedimentaci6n empleado al centrifuga (nin) ngulo rezorido en el movimiento de rotacién (tines = angul cio arene igual a) (@ = er) ) © @/t= velocidad angular, pues el movimiento es de rotaein (Fatianesimin= mi" ‘v= velocidad de giro (tevluciones por segundo = rps, 0 evoluciones por minuto = rpm); («= 2x v ) La fuerza centrifuga se suele expresar en forma de miltiplos de a fuerza de gravedad, llamindose ‘entonces fuerza centrifuga relativa (PCR). (Coloquislmente, se denomina nimero de “ges” y se ‘como 100g, 1.000g, ete. o bien 100xg, 1.000Kg,) Si,como oeuete normalmente, v se mide en revolucones/min (rpm) y en cm, se pueden expresar como v-(Z)~-(S)2 4 -(S lon Jen) ns (om) 60s aye yen consecuencia el valor anterior de FCR viene dado por mone ole Ejercicio resuelto: El n® de g alcanzado en un rotor de centrifuga, de 5 em de radio, que gira a una velocidad de 10.000 rpm es: FCR = (10.000)? $/ 89.365 = 5.600¢ XQ J ( esc acs ci (0 oo i ie i) ‘or la Ley de Stokes: Velocidad de sedimentacion = 4r2(p,-Py)FCR/ 187) ‘con las variables medidas en: cm/s (om)? giom® poise (1 poise= I g -s/cm?) Es dcr, es proporcionan forza centfugagenerad (PCR), l tama def cua (su radi, x) y la diferencia entre la densidades de Ia célula (P,) y la del medio de suspensién (P,,). ¥ es inversamente ropocina af viscosidad del medio (M). Las propicdades de seimentacén de una eda 0 paicul eindcan a menido mediante so coeficeme Cesinenecons: coceict e simsntacion = «= liad de sediment ‘expresado en unidades Svedberg (1 $= 10 segundos ). En algnos casos se centrifuga en un medio con cl que previamente se ha formado un gradiente de densa eeseme hacia a pre inferior dl tubo. Ea ee csi usenet hasta qu a desidad det mtio es gual suye pro en ete punto Ia velocidad de sodmentacon se hace ero In olla \ no sedimenta mis, es dei, ha aleanzado el equlbio124 PREPARACION DE MUESTRAS, EXTRACCION Y ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS 11.3.1.2 Centrifugacién en gradiente de densidad a) Métodos de barrera: centrifugacién a través de un medio de densidad constante Para conseguir separaciones mas eficaces (por ejemplo, fa de los leucocites respecto al resto de las cus sanguineas) se centrifuga la muestra sobre un lecho de densidad intermedia entre la de los tipos celulares que se quieren separar. Se emplean para ello medios comerciales como FicollPaque, Lymphoprep y otros muchos, formados densidad de los Componentes da mest, ‘Aalisacin:separacia de moléutas 4: seidonucleto,puriieaién de ‘eidos nucleic, ce 11.3.1.3 Elutriacién centrifuga La olutriacién consiste en la separacién de células (0 patticulas en general) de acuerdo con su velocidad de Secientacién. El proceso original, consistente en la realizacion de cicios sucesivos de sedimentacion y decantacion, {ue facltado por ia incorporacién al sistema de un flujo del propio medio liquido de suspension, en sentido contrario a la Sedimentaciin (contra la gravedad), Este fue finalmente combinado con el efecto de la fuerza centrifuga, dando lugar a lamodelidad de elutriacion de mayor uso actual, la elutriacién centrifuga, Aqui, las células se ven sometidas a dos {uerzes opuestas: por una parte, la fuerza centrifuga y, por otra, la fuerza de arrastre por el flujo continuo del medio en sendo cortrari. mato celular posce unas propiedades de 50H ‘Ellas més grandes sedimentan ii Terenas av totam mas se inradce im Ta furan eonitogaemput Tas eulas hacia el fondo de Ta efmare: las sediment Annie ‘grad el caudal se consigue que salgan scparadss las poblaciones cellars. emperande por ls ‘demenoe amano El fujo de medio liquide se opone ao fuera centrifuga, aa sedimentacion. ara un cierto caudal, la migracién de as eélulasaleaaza un equiibrio a 3 [ s sre tear (por entsion y exctacion, respecivamente) § Sehocemi Iengitud de onda con ‘Cada compuesto con esta propiedad, ireiesc are devominade forfor, posse eapetns cee cermeiteas de excnciny deemision 2 es eras (Glde exeiaciones nomalmente similar 32 Eieaitls, fl de absorcion, Si adem 3 un a ton aco meen colorante, se denomina fluoracramo.. Jongitud de onda (am) inguese ifominn ] empleo de fluoréfor0s y fluorocromes como moléculas marcadoras es de una gran utilidad, pues oftece la posbilidad de detecta distintas moléculas y células en muy pequetia cantidad y sin los Fiesgos asociados al mareaje eon isdtopas radiactivos. En concreto, en Biologia Molecular se ulilizan principalmente dos tipos de fuorocromos: agentes intercalantes que se unen al écido nucieico y irven asi para detceurlo en geles de electroforesis o gradientes de densidad (tales como bromuro de clio, naranja de acridina y colorantes Hoechst), y fluorocromos unidos de forma covalente a sondas ‘de hibridacion y a cebadores de PCR (fluoresceina, rojo Texas, rodaminas, etc). La deteccién se puede realizar mediante: + espectrofluorimetro y lector de microplacas: miden la fluorescencia promedio de la muestra + densitémetro de luorescencia: en geles de eleciroforesis, blots o cromatografias en + microscopio de fluotescenci forma semicuantitativa + citémetro de flujo: permite medic células individuales, de forma cuamttativa El procedimianto de citometria de flujo consta de dos etapas: caracterizacién y separacién. De hecho, algunos instrumentos (analizadores) sélo realizan la primera, mientras que otros (clasiticadores) son capaces ademas de lievara cabo la segunda @) Caracterizacion de la poblacion celular: analizador, citémetro de flujo 0 eitofluorimetro Et sistema consigue que la suspensién celular leque en condiciones de flujo laminar, formando un chorra muy fo ue, come consecuencia de la dlucién, contiene las células individuales en sucesién. Estas pasan asi de una en una través de un haz luminoso ldser, cuya longitud de onda permite la excitacién de los marcadores fluoresoentes incorporades previamente a le célula. En la luz emergente de cada célula se analiza la dispersin y la intensidad dela fluorescencia (emisién). Parémetre medido Propiedades celulares analizades Dispersion frontal dea luz Tamafo (diémetro y razon de volumen nacleo/etoplasma) (refraccién) 0 FSC. Dispersion perpendicular Arquilectura interna (grado de estructuracién subceluler, de la luz (feflexi6n) 0 SSC__contenido de orgénulos, granularidad, rugosidad Tntensidad de fluorescencia Cantidad de fluorocromos marcadores previamente incorporados, (@ una o varias 2) ala céiula, Comunmente se usan anticuerpos, marcados con ‘Muoracromos, contra antigenos de la superficie celular 0 bien colorants o sondas que se fjan al DNASEPARACION DE CELULAS. 127 sectors (sistema plc, tes, tho ‘otto et) sistema dc conel ‘ali (ARAUIZRDOR aes SRE Steer less CLASIACADOR (aver, FACS) ad jot sedeovaen un cafe eceica Sewn su cura Ta cual hase ‘termina po as propledades de fa ‘dla que Eontene Tee Bx sa Z iam meee a Sac tt voresceacia verde, resultados oa Simian +) Seperacion de células: clasficador de células activado por fluorescencia (FACS) La corfiente de liquido, tras pasar por el punto de deteccién, se transforma en una sucesién de gotas muy equefias (generalmente, como conseouencia de una vibracién aplicada por ultrasonidos ala cémata de flujo), las ‘cuales contenen como méximo una sola célula. Al mismo tiempo, en funcion de los resultados del andlisis anterior de la clus, el clasifcador aplica automaticamente a cada gota un pulso de voltaje (entre 450 y +150 V) que le proporciona una carga ekbctrica. El usuario define previamente el pulso que se ha de aplicar a cada gota (y, por tanto, el signo y cuantla de la carga que edquiriré), en funcién de criterios sobre los parémetros del andlisis en el citémetro. El sistema informatica que ‘ontola enalizador y clasificador permite tal decision en el breve intorvalo transcurtido entre el paso de cada célula por detector y la formacién de la gota que la contiene. Al mismo tiempo, todos los datos de cada odlula se almacenan pixa su estudio posterior. A continuacién, las gotas cargadas pasan por un campo elécttico, donde se desvian de acuerdo con su carga para caer en distintos tubos de recoleccién de muestra; de esta manera se consigue la separacidn de subpoblaciones «dures de acuerdo con los citer definidos (combinacion de tamafio, estructuraci®n y fuorescencia). Coma meros ejemplos de las innumerables aplicaciones de esta técnica se pueden citar: a) El estudio de la siperice celular con anticuerpos monocionales, siendo posible seleccionar una célula, con un antigeno especifico de siperice, de entre 1.000 que no lo tengan y clasificar miles de células por segundo. b) La valoracién del contenido en DNA y RNA de una célula (p.e)., en estudios del ciclo celular). c) La determinacién de su forma y tamatio, por ejemplo, enneoplasias. 11.33 Separaciones directas de tipos celulares ‘Aun slendo tun caso particular, es de uso habitual y no puede dejar de mencionarse la posibilidad de aislar ciertos ‘pos celulares gracias a su tendencia a adherirse fuertemente a la superficie de un soporte de vidrio 0 pléstico (adhesién celular), generaimente la propia placa de cultvo. Con a Hegada de los anticuerpos monoclonales este principio se pudo ampliar a précticamente cualquier tipo de silua. La posibiidad de disponer de estos anticuerpos ha contribuida notablemente a la separacion de células en el leboretorio clinica y de investigacién. Su exquisita selectivided en la unién a epitopes antigénicos de la superficie ha Pamitdo diseriar métodos diversos para aislar y caracterizar de forma directa los tipos celulares presentes en una ‘mezcia hetorogénea. Estos métodos pueden aplicarse, por ejemplo, para definr las células a trasplantar en caso de enfermedades graves (células precursoras de médula ésea evitando células T maduras inmunocompetentes), para128 PREPARACION DE MUESTRAS, EXTRACCION Y ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS determinar el fenotipo de tejidos para trasplantes, establecer los tipos celulares responsables de procesos en la respuesta inmune, cuantificar subpoblaciones celulares, etc. El uso de anticuerpos ha dado lugar a una gran diversidad de métodos inmunoanaliticas y de separacion, que ‘se pueden considerar parte de los métodos de afinidad. Por ejemplo, las células de un tipo pueden unirse, a través de ‘sus antigenos, a anticuerpos monoclonales previamente fjados en superficies de plastico (tubos, places de cultivo, varilas, microesferas ...) 0 matrices de colégeno, polisacérido, etc., Io que permite la separacién de ese tipo celular ‘Como ejemplo singular, de entre la multtud de variantes desarrolladas, se comentan a continuacion los métodos bbasados en el uso de microesferas magnéticas. 11.3.3.1 Separac nes por afinidad con particulas magnéticas ‘iets slur Reese ‘iotina (@) 0 con fluoresccina CR) 1, Marcaje: (Marcaje directo [Marcale indirecto | Gepcions abcenatves) Feoaive 2 Mleroostra magica ‘ida, respecuvamerte, con Snicverpe secundaria fan), Reactive: Missi api da de -YYY. Es RET mares ~ Set tsi especifvo 2 anmaces (comanmente ‘woneeloal) Tey eee sense i ts see oa, [Wena eapicoy Tpit, port oregon psn nconvenete prs caa tp de ela gu ne desea separa oxo prepara su aneverpn magneto especific. [Vea os eactvos mayne son comones par [ren nee ees soe 2. Seleccion: > co pension eli cee ae en + — ats sea Tesi sora =p aos Sven ‘clon aida Spon seco Paice ‘aie meee: cova. cae scone nies Eo ) ‘Seleccién positiva: Lax microesferas magica sc unen aes elas que interes conserva ara su esto. Es, por sa implica, ahorajerecomendado, Sin emborg,roqleredponer de un modo pra romper fa unin etre ul yb Imiroesfer, anus o avin (dependicndo del uso posterior que se quia da isc). ‘Seleccién negativa: se marca con as microcsfrs tos ls tips ceblres excepto ! de ints. Ba Gea sued caando oo se dspone de anicverpos pifca o existe interferencia de los antieucrps las miroeseras con posteriees ‘eperimetor, Pane a vetaa de que ac olienen ls cass ntact, sin nada ue els, yes se pueden ler drecamente. "Amend, el msjrrsulado oben eon vas selecciones negatives previs, que nequseen I mes antex de pocedcr a getecion posit fal,CARACTERIZACION CELULAR Y MEDIDAS DE VIABILIDAD 129 Eslos procedimientos, de gran sencilez y por ello en expansién actualmente, hacen uso de microesferas Aisponitles comerciaimente en varios tamafios (entre 0,5 y 10 ym, es decir, menores que las células) y con distintas posiblidedes de aplicacién. Estén formadas por un material superparamagnético (éxide de hierro) recublerto de una ‘ape fina de un polimero plastico que permite la adsorcién o la unién covalente de distintas moléculas. Frecuentemente 2 les une un anticuerpo, para formar enticuerpos magnéticos 0 microesferas inmunomagnétioas, © bien avidina 0 esteptavidina, proteinas ambas con gran afinidad por Is biatina (microesferas magnéticas de afinided). ‘Més adelante se exponen aplicaciones similares do estas mlcroesferas magnéticas para la extraccién directa de ‘cos nucleicos, 11.4 CARACTERIZACION CELULAR Y MEDIDAS DE VIABILIDAD Es importante proceder en esta fase preanalitica a la caracterizacién de las células por lguno de los Prcedimientos disponibles en Ia biologia modema: microscopla éptica, como punto de parida mas obvi micrescopia de contraste de fase, en paralelo al anterior, para observar con més detalle le superficie celular; microscopia electrénica de barrido (SEM, de scanning electron microscopy), para definr la superficie celular y la natucleze de las interacciones célula-célula, 0 microscopia electronica de transmision (TEM, de transmission ‘lecton microscopy), para observar cortes ceiulares y examinar los organulos 0 inclusiones. También se caracterizan les células por citometria de flujo o el uso de mnicroesferas magnéticas, técnicas ya comentadas, Es igualmente importante confirmar el estado vital de las muestras celulares durante una u olra etapa de la fase renalitca, El concepto de viabilidad alude a la capacided de una célula para realizar sus procesos fsiolégicos y bioquimicos, especialmente en lo que respecta a su metabolismo y su capacidad de division. Sin embargo, en la péclca el término es relativo, pues se utiliza con diversos eriterios; por ejemplo, es comin que se hable de viabilidad ‘efiéndose simplemente a la integridad de la célula, 0 bien a su actividad metabdlica o, finalmento, a su capacided de Aisén (proiferacion). Para todos ellos existen numerosos ensayos de viabilidad; los més empleados son 11.4.1 Ensayos de exclusion Corresponde al recuento de células que no incorporan un colorante, 7 colorante de exclusion El ejemplo mas conocido es el azul de ‘tipano, un colorante 4 soluble en agua cuyos > ‘gtupos cargados amino ¥ Sulfato Te impiden atravesar las tu ida mentee Cctitares | célulaintacta lula no tend intactas; por tanto, tine solo as fli mers ©) as “plicable w las. Las células vivas no se tifien, pero debe resaltarse que el ensayo | célula daiiada célula teftida s6lo valora la _ - %, " Hane intcaridad de om NH OU Seta J O-O-00.,130 PREPARACION DE MUESTRAS, EXTRACCION Y ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS 11.4.2 Recuento de células viables por incorporacién de un marcador ‘Método alternativo, basado en la entrada de un compuesto a través de la membrana de células intactas. colorante (¢.: ojo neutro) ‘plicable a ecules individuales (imicroscopia) y poblaciones celulares (ensayos en placa raultipocillo) —~ a ™ o- oa Ife “OOOC, En algunos casos, el colorante (generalmente un fluorocroma) se une a los acidos nucleicos, en especial a ‘El naranja de acridina entra libremente en todas las eélulas. yoduro de propidio | £1 yoduro de propidio es excluido de las células intactas, naranja de eit [entrando sélo en las dafladas. Ambos se unen al DNA. lavados {sotsnicos Tanto las cdlulas vivas Muorescencia verde| cétula Si Muorescencia roja Ta intensa fluoresecencia roja del yoduro de propidio unido al DNA enmascara la verde del naranja de acridina Ambos compuestos son agents intercalantes: su estructura ‘aromtia plana favorece su inserciGn entre los pares de bases lados de! DNA. Poseen propiedades uorescentes: al ser Wey ic fados con luz, UV emiten luz visible Nt Taran de acridina emite ura Avorescencin de COE eye i ido a ides Ne ay Senne Fe oserdc con DNA de dale hebra o uct "ons intermedios (le amano arena) con DNA parcialmente desnaturalizado + toa con DNA de hebra sencilla (desnauralizedo completamente) 0 con RNACARACTERIZAGION CELULAR Y MEDIDAS DE VIABILIDAD 131 11.4.3 Ensayos por medida de la funcién metabdlica + Actividades enzimaticas: La presencia en las células de actividades enzimaticas genéricas, tales como ‘esterasas y deshidrogenasas, permite plantear ensayos de viabilidad basados en la genetaclén de productos con grupos croméforos 0 fluordforos, procedentes de la ruptura enzimatica de sustratos sintéticos. Una alternativa, para tipos celulares concretos, es la determinacién de una actividad enzimética especifia, en cuyo caso es especialmente importante evitar que las condiciones experimentales afecten a dicha enzima, El diacelato de carboxifluorescetna, poco ionizado, atraviesa la yoduro | membrana por difusién; las esterasas citoplismicas lo hidrolizan de | a carboxifluoresceina que, al tener mayor carga eléetrica, ya no diacetato de propidio| “puede atravesar la membrana y queda atrapada dentro de la célula intacta 2 7 tas 2 "| pen, ole oe céulacon Alvorescencia ro ‘succinato asa mitocondrial y otras reductasas un formazano, celulares de color azul @® ni ‘ @® - N, MIT. (una sal de tetrazolio),432 PREPARACION DE MUESTRAS, EXTRACCION Y ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS ‘+ Sintesis proteica: incorporactén de radiactvidad a las protelnas formadas durante el cutvo de las célles en presencia de eminoacidos marcados (generalmente, con “C, 7H o[°°S]Met }. + Sintesis de DNA; incorporacién de nucleésides marcados. Refleja la viabilidad en términos de capacidad de crecimiento o, mas estrictamente, prolferacién colular. ‘BrdU es un andlogo = ‘metilo, Por ello se iin ray ‘at media de incorpor at BNA nev cao, tase durante la replicaccn, en incorpo al DNA Tague de dF Se detecia “dane la ‘dint anticuerpos rsplcacin espectins, generamente Sedeica la ‘areas con un rniactvidad de S-bromo-2-desoxiuridina. | Auoroeromo, en métodos las células, debida |(coloquialmente:timidina) (bromodesoxiuridina, BrdU)| de inmunofluorescencia o asu DNA (recuérdese que Ia timina es S-metiluracilo) ciclo. ce tio Sise afiade Ae desoxitimidina "er ‘marcada con 7H 11.5 LISIS DE LAS CELULAS Esta etapa supone el punto de enlace entre fa preparacién de la muestra celular y la de muestras de genoma o 4cido nucleico; comienza, por tanto, la fase anaitica, que comprende el fraccionamiento subcelular, la extraccién Girecta 0 el fraccionamiento de Acidos nucleicos y la fragmentacion del DNA. En general, lalisis celular se realiza con un medio hipoténico; en algunos casos esta etapa es simulténea con la preparacion de la muestra (p.e}., homogeneizacién). La lisis se puede aplicar tanto a células en suspensién como a las fiiadas por adhesin a placas de cultvo. En la preparacién de células sanguineas es frecuente la aplicacion de reactives de lisis diferencial (s6lo de determinados tipos celulares). Asi, para el recuento y estudio de leucocitos se lisan los eitrocitos con un medio dcido (por ejemplo, liquide de Tarck) 0 una disolucién de cloruro aménico.PREPARACION DE FRACCIONES SUBCELULARES 133 11.6 PREPARACION DE FRACCIONES SUBCELULARES El procedimiento general, empleado clasicamente, parte del sobrenadante que resulta de Ia disociacién mecénica de un taido por homogeneizacién en un medio isoténico y posterior lisis celular. Mediante centrfugacién diferencial se sparen sucesivamente ndcleos, organulos y otras estructuras celulares. er Disociacion’ 5 : es Ca DNs Santioeatar ettitaretahel wane sceimane cae “aes eae os eae RNA Sopp slip ea » 3' (ala inversa en la otra horauita).ENZIMOLOGIA DE LA REPLICACION 145 FORMACION Y AVANCE DE LAS HORQUILLAS DE REPLICACI en procariotas (DNA circular) en eucariotas (DNA lineal) i sintesis secueoah, ie titesipscveneial, TN tinier ores V wa a ada og lugar aa sins de na regin del BNA: ido urional Se repliaién orp sittin seven Teas se satay Simuleamene obras paternas . hobras de ' eva sintsis. wane de la horquila ' Ta horgulla no iene una ubiession fp sina que es un panto diaimico, en _movimieno, en a moldeula de DNA 12.1.3 Inicio monofocal o multifocal En el cromasoma circular Gnico de procariotas la replicacion comienza siempre en un punto determinado, enaninado origen (y marcado como ori); se dice que la replicacién es monofocal. En consecuencia, progresa fernando dos horquilas de replicacién. Por ol contrario, en eucariotas la replicacién es multifocel, pues en cada uno de les cromasomas existen multiples origenes de replicacion (centenares o miles), que dan lugar a un niimero doble de quills. Gracias a ello se hace posible completar en un tiempo razonable la replicacién de los cromesomas, mucho is argos que en procariotes, 122 ENZIMOLOGIA DE LA REPLICACION 12.2.1 Requerimientos de la reaccién de sintesis de DNA + Cebador: Le sintesis de una nueva hebra de DNA no puede comenzarse a partir de dos nucleétides, sino que require un fragmento de hebra iniciador, denominado cebador, que aporte un grupo 3'-OH libre, Se trata de un ‘lgenuctedtide, por lo comin RNA, que debe estar apareado a la hebra progenitora de DNA, de forma ‘omplementaria y antiparalela. Por tanto, se puede decir que la replicacién no es autoiniciadora (a diferencia de la ‘tanscripcién, pag. 248), sina que s6lo efonga o alarga moléculas preexistentes. + Sustratos: Se utiiza como sustratos el conjunto de los cuatro dNTPs: dATP, SGTP, dCTP y dTTP. De cada uno 6e ellos queda incorporado en el DNA nuevo la parte dNMP de la molécula. A estas efectos, los dNMPs y dNDPS. son inactivos. + Cofactores: Para una actividad éptima se requiere un ion metdlico divalente como cofactor, asociado @ los dNTPs. Aunque in vitro este papel pueden desempefiarto tanto Mn2* como Mg”*, es este ditimo el que acta in vivo. ‘+ Molde o plantilla: Esta es, quizé, la principal caracterstica de la reaccién. El orden correcto de incorporacién de los ¢NMPs viene determinado por su complementariedad de bases con la secuencia de cada hebra de DNA, que ‘acta asf como molde o plenti.146 REPLICACION DEL DNA 12.2.2. Mecanismo de la reaccién Se inicia la reaccién con el apareamiento de un dNTP complomentario al nuclestido de la hebra motde (DNA) ena posicién vecinal at extremo 3 de la hebra en crecimiento (inicialmente, el RNA cebador; luego, la hebra que se esé sintetizando). La reaccion propiamente dicha consiste en la unién del dNTP seleccionado, bajo la forma de dNMP, con liberacion de PP,. Ello implica la formacion de un puente fosfodiéster entre ot fosfato a det ANTP que se incorpora ye {3-OH libre de la cadena en crecimiento (Iniclalmente, del cebador). La ruptura del entace fosfoanhidrido (cB) det dNTP properciona la energia necesaria para impulsar la reaccién, ayudada por la subsiguiente hidroisis del PP, a 2 P, ‘aalalizada por la pirofosfatasa, Tras muchas reacciones similares sucesivas, el producto es la nueva hebra de DNA: DNA mold ny dATP + ny dGTP + ny dCTP +n, dTTP eee DNA. + (nytnytnytn,) PP, Mg, DNA polimerasa es] ——> ecbador NAY para rade DNAS fon de DNA bcete creumina (3°93) cadena de Nianstobtios ceadena de DNA con a N+I nucleotidos DNA naciente) 12.2.3 Direcci6n de la sintesis Puesto que la adicién de nucleétidos se realiza siempre a partir de 5trfostatos y sobre un extremo 3-OH tive, la hebra crece por su extremo 3’, y se dice que la sintesis transcurre en dlireccién 5'-»3'. Esto es valido para todas as DNA polimerasas, tanto de procariotas como de eucariotas (y también para las RNA polimerasas).ENZIMOLOGIA DE LA REPLICACION 147 12.2.4 Tipos de DNA polimerasas ‘Aunque la reaccién do sintesis de DNA es universal, es decir, tione lugar de idéntica forma en todos los ‘genismos y ubleaciones subcelulares, su caldlisis es efectuada en cada caso por distintas enzimas, bajo la enominacién comin de DNA polimerasas (abreviadas como DNApol). Estrictamente su nombre es mas completo, palimerasas de DNA diigidas por DNA (0 dependientes de DNA), para indicar tanto la molécula que sintetizan como la ‘qe emplean como molde. Mas adelante se estudiardn otras polimerasas de ONA o de RNA que utiizan distintos. ‘mades; para ofrecer una vision unificada se resumen a continuscién: rmolécula _ molBoula [ees aaa ombre completo ‘ejemplos (nombre comin) DNA DNA __polimerasa de DNA diigida por DNA» DNA palmerasas RNA. DNA polimerasa de RNA dirigida por DNA + RNA polimerasas o ranscrplasas + primasas DNA RNA polimerasa de DNA dirigida por RNA + transcripiasas Inversas + telomerasas. RNA RNA polmerasa de RIVA diigida por RNA RNA replicasas: 122.41 DNA polimerasas procariéticas: actividades polimerasa y exonucleasas Le primera DNA pollmerasa descubierta (Arthur Komberg, 1958) y la mejor estudiada hasta la fecha es la DNApol de Escherichia coll. La comprobacién de que su actividad no es suficiente para justiicar la velocidad de feplcecién del cromosoma bacteriano in vivo condujo al descubrimiento de otras enzimas: las DNApol-II y DNApol-III. las tes coexisten en E. coli, con funciones especializadas: pol-IlI realiza la mayor parte de la tarea de replicacion, ‘ienlres que poll y pol-tI se encargan de funclones auxiliares (sus caracteristicas particulares se mvestran en la tabla. ‘éepag, 148, junto con las de las polimerasas eucaridticas). Las tres DNA polimerasas presentan, ademas de su actividad enzimatica como polimerasa, una 0 dos actividades exonucleasa, La actividad 3'-exonucleasa (también liamada exonucleasa 3'-5') permite hidrolizar el tuclebtido situado en el extremo 3' de la hebra de DNA, sélo un nucledtido cada vez. Esta eliminacién tiene lugar ‘endo el nuceétido incorporado por la actividad polimerasa a la cadena en crecimiento es erréneo, es decir, no aparea ‘artectamente con el presente en la hebra molde de DNA. La polimerasa es asi capaz de reconocer el error, detener la ‘adcion de mas nuclestidos y liberar ese Gitimo dNMP mal incorporado. Los centros actives polimerasa y exonucleasa ‘son dierentes. En resumen, las DNA polimerasas corrigen sus propios errores, en sentido (3'>5') contrario al de la poimerizacién (5'-3'); por ello, a esta actividad 3'exonucleasa se la tlama también actividad correctora de pruebas {oe galeradas, por analogia al proceso en imprenta), 0 correctora de errores proplos. De este modo mejora ta fidelidad ‘ela replicacion, en un factor de entre 10° y 10° sobre la que aporta la incorporacién de nucledtidos complementarios Borla paimerass (que tiene una tasa de error de un nucledtido por cada 10° 0 10°). CARACTERISTICAS DE LA DNA POLIMERASA I DE E. coli DNApot-t(unida al DNA) Fragen ance” ast caca plipet, 109 2a (eno gle al eee pereiaaey N-terminal, 68 kDa, Presets tds polimerasa y sPexamceasa Muy bien estudiado, se ‘emplea con fecuencia para I - ‘nts trode DNA. ms : fn Fragmento “pequefio” ‘Citenminal, 35 Da Solo muestra ia actividad STexonucleasa. Estructura poco conoid, Nude ein insorpondo 2 Po J nea aera on ‘ies eng sr limita por la stds -exoneleaa Ewided 3 -exontal La DNApol! de procariotas es Gnica entre tas polimerasas por poseer ademds una segunda actividad tronuclessa, en este caso 5'-exonucleasa (0 exonucleasa 5'-»3"), que le permite hidrolizar secuencialmente DNA o RNA, part del extremo 8' de la hebra. De nuevo, el centro activo es independiente de los anteriores: en este caso esta Siuedo en el fragmento pequefio. Esta actividad juega un papel fundamental en la replicacién del DNA procaristico, al timinar el RNA cabador y susttuirlo por DNA, durante la sintesis discontinua de la hebra retardada (pg. 156). También148 REPLICAGION DEL DNA ccomplementa la actividad 3'-exonucleasa corrigiendo errores de dlstinto tipo, y se la lama en ocasiones actividad de reparacién; por ejemplo, intervene en la escision de los dimeros de primidina que se forman por exposicon del DNA luz UV. Experimentalmente, se aprovecha la actividad 5-exonucleasa, por ejemplo, para la preparacin de sondes ‘marcadas (pag. 182) Algunas caracteristicas de las DNA polimerasas, desde el punto de vista bioquimico y funcional PROGARIOTAS EUCARIOTAS Polimerasa: I i I a 5 £ (biaconsubeilar niles cleo il niles _nideo falvidades enindiewss J rinesa (ri mo" wm | is mo mo me re a ‘3-Exonucleasa (0 3'-5') ra eons | -Exonucleasa (0 5'-»3') ‘! no no {eliminacién de cebadores) is se we ae Lid we Funclon on cfu: 7 Repleacin (sists contnande Te Gohobrasruoves,conducora | no most came, m0 shh retarded) : eae de agentes do 7a Okazaki a = Pe me oP {con nucleases) Voloidad do opieac6 = 7 . Velocidad de polimerizacion = (nuclestidos/segundo) ed) 21 201000) : Proceed ; aaa — evade (riletos accos antes | ee media muy ata) baja bela elvada con PCNA. cosn de su disociacién) RUDY ICeAN sete 25.000 PCNA 12.2.4.2 DNA polimerasas eucariéticas: actividades polimerasa y exonucleasa En eucariotas, las DNA polimerasas son diferentes a las de procariotas, aunque presentan cierta similtud de secuencia y estructura, Se han descrito mas de cinco enzimas. La DNApol a se encarga, gracias a su actividad primasa, de iniciar la sintesis mediante la formaclén de un RNA cebador y, por su actividad polimerasa, de la elongacian inicial de ese cebedor. Esta tarea se code luego a las DNApol 8 y c, responsables de la mayor parte de la elongaciin de ambas hebras; de hecho, ambas tienen actividades similares, pero aun no esté claro si desempefian indistintamente ‘misma funcién 0 estén especializadas. La DNApol f no interviene en la replicacién, sino que esté implicada en le reparacion de errores 0 dafios en el DNA (procesos en los que también participan otras polimerasas, incluyendo 5 y ‘Mientras estas cuatro enzimas son responsable de la replicacion, reparacin y recombinacién del DNA nucear, el DNA ‘mitocondrial es sintetizado por una polimerasa diferente, la DNApo! 7. Por ttimo, se han descubierto recientemente otras polimerasas nucleares, ain poco conocidas ( [zeta], n ete, {otal ), que estén Implicadas sobre todo en reparacion y recombinacion. En cuanto a la actividad exonucleasa de las DNA polimerasas eucaridticas, s6lo las 3 que se encargan de ls Jongacién (6, xy ¢, ver tabla) poseen actividad 3'-exonucleasa, aquélla responsable de la capacidad de correccion de ferrores cometidos al incorporar los nucledtides a la hebra que se esta sintetizando, Ninguna de las polimerasss eucariéticas parece tener actividad 5exonucleasa; la funcién de eliminacién de cebadores la desempetian dos nucleasas independientes, aunque las polimerasas 8 y ¢ si se encargan de rellenar el hueco con DNA; los detalles se cestudian mas adelante (pg. 156). La funcién especifica de cada polimerasa solo se puede comprender en el contexto de los mecanismos de Iniciacion y elongacion de las cadenas de DNA, que se estudian con detalle dentro del mecanismo de la elongactin (p89. 154). Bajo el alcance de este libro no parece adecuado describir las propiedades estructurales de las cistintas polimerasas. En la tabla siguiente se resumen los datos relativos a tamafo y composicién en subunidades, pero debe tenerse en cuenta que todavia es muy elevada la variabilidad de cifras, en especial para las enzimas eucariéticas,¢ incluso la interpretacion de los mismos en los distintos organismos estudiados, como para su generalizacién a todos los eucariotas.ENZIMOLOGIA DE LA REPLICAGION 149 Caracteristicas estructurales de las DNA polimerasas PROGARIOTAS EUCARIOTAS ™ Polimerasa:| 1 i mm a B x 6 g M, total (kDa) © wo3_ 90900 | ase) SCNGOSCS CN IN? subunidades: 1 24 22 4 1 2 263~2 'M, subunidades: a w 125. ~«125~~=«S 35 48 55 Los datos corresponden a humanos. ® Masa molecular relativa de la holoenzima, o enzima funcional con todas sus subunidades. ®'La DNApol-II de E. coli esté formada por 22 subunidades de 10 tipos, con una composicién global (a.e.0)zr2(y.8,8 9.7), De ellas, la agrupaci6n (a,¢,0) se conoce como “niicleo” de la polimerasa. La subunidad «(130 kDa) tiene el centro activo polimerasa, la c el 3-exonucleasa o correctota de pruebas. La DNApol a humana esta formada por 4 subunidades diferentes: 180 kDa, con el centro activo polimerase; 48 kDa, con el centro activo primasa; 58 kDa, cofactor de la primasa; 70 kDa, reguladora de la polimerasa 122.5 Velocidad de replicacion Dado el gran tamafto del genoma de una célula, para que su replicacién completa se lleve @ cabo en un tiempo ‘azonable el proceso de sintesis debe ser muy répido. En procariotas, la velocidad llega a 1.000 nucleétides por minuto. En eucaritas, el mayor tamafio del genoma hace pensar en la necesidad de una gran velocidad de replicacién que, sin ‘embargo, no precisa ser tan elevada gracias a la existencia de varios origenes de replicacién en cada cromosoma, que reduce la longitud de ONA que debe sintetizar cada molécula de polimerasa. La consecucién de una alta velocidad de sintesis s6lo es posible gracias a un mecanismo peculiar, segin el cual la molécula de ONA polimerasa se mantione unida a la cadena de DNA molde, a la vez que asociada por su centro axtvo al extremo 3'-OH de la hebra creciente. De esta forma puede incorporar numerosos nucleétides sucesivamente, fan una reduccion del tiempo necesario para la adicién de cada uno: por ejemplo, la polimerasa puede tardar un minuto en otarse y volverse a unir al DNA (por mera difusién de las moléculas), mientras que para afiadir un nucleétido sin soltarse le bastan unos milisegundos. Esta capacidad de las polimerasas, variable entre ellas, se recoge bajo el término ‘procesvidad, que se define como el numero de nuctestidos que son incorporados a la hebra antes de que la enzima se. separe de! molde (coloquialmente se diria aftadidos “de un trén’). Un valor elevado de procesividad en una polimerasa ls mucho més importante para a replicacion que una velocidad alta de catalisis, Las polimerasas de mayor procesividad son las que intervienen en la elongacién de las hebras de DNA (tabla en pig. 48), mientras que las de baja procesividad se encargan de tareas que podtian llamarse auxilares, tales como la Sintesis y eliminacién de cebadores, su sustitucién por ONA o la reparacion. Generalmente, la alta procesividad se cansigue gracias a una molécula que “abraza” o rodea la cadena de DNA, evitando asi que la enzima se separe; este mmecenismo se denomina de “pinza deslizante’, pues permite el deslizamiento continuado de la polimerasa a fo largo de lacadena de DNA, sin separarse de ella (@xApaTTITA) vistas axiales vista lateral 2 moléculas de Ta subunidad B de Ta ‘3 moléculas de una proteina independiente, el DNApol IIf de E. coli'se asocian “antigeno nuclear de células en proliferacién” rodeando al DNA. y asi evitan que el (PCNA) se asocian formando un anillo que rodea al niicleo de Ia polimerasa (con su DNA y se une a las DNApol 8 y « de eucariotas, subunidad catalitica a) se separe del ‘aumentando su procesividad ‘molde, aumentando su procesividad. (en este caso, se muestra la posicin del DNA).150 REPLIGAGION DEL DKA 12.3 ETAPAS EN EL PROCESO DE REPLICACION 12.3.1 Iniciacién Mientras que en procariotas es probable que la replicacién tenga lugar en conexién con la membrana celular, pues el anico cromosoma esta anclado a ella en la zona nucleoide, en eucariotas el proceso ocurre, lbgicamente, en la mati, ruclear. E1 DNA se replica una vez por ciclo celular, durante la fase S. Inicio de [a replicacion: apertura de ia doble hélice en el origen de replicacién, creacion de dos horquillas de replicacién y sintesis de cebadores x DNA progenitor, de doblehebra 5 Fe ongende Tia union de protelnas de aicio a a secuencia del Ja separacion de las hebras Das molulas de elias induon Ta sprain do iniiameneen el ongen y luego avanrando en ios yerendo dos horgulias Las protenes de un ada mantcnch Isher Sopa A partir de ahora (en esta figura y las siguientes), sélo se representaré una horquilla; en la otra ‘ocurre lo mismo, aunque con los papeles de hebra conductora y retardada intercambiados: Ey = _ aS 12.3.1.1 Origenes de replicacion La replicacién siempre comienza en puntos de la molécula de DNA con secuencias caracteristcas. En el caso de procariotas, el cromosoma tiene un origen de replicacién tinico, llamado ori®; por ejemplo, en E, coli esta constitids por una secuencia de 245 pb. En eucariotas, como ya se ha comentado, la enorme longitud de los cromosomas Fequiere la existencia de numerosos origenes de replicacién; aunque peor conocidos, éstos poseen también secuenis ‘caractristicas, El proceso de replicacién se realiza en la unidad funcional del genoma denominada replicén, defnida cona ‘aquellaregién de DNA que puede ser replcada a parti de un mismo origen (p89. 145). Cada replicin contiene, pues in ‘origen de replicacion y se replica mediante dos horcuilas. Mientras en procariotas el cromasoma completo consituyé un solo replicén, en eucariotas son numerosos y sufren a replicacién de forme casi simulténea, lo que supone la existend de un complejo mecanismo de control que coordine et inicio, elongacion y terminacién en todas los roplicones de cata cromosoma. Estos aspectos estan pendientes de resolucion, al igual que muchos otros relacionados, por ejemplo, ca Ja rplicacion de los cantromeros y otras regiones heterocromalicas altamente condensadas. Centréndonos en et inicio y progreso de la replicacién en cada replicén, surgen igualmente grandes cuestones relativas @ cémo son las Interacciones especificas entre DNA y protelnas que desencadenan la iniciaciin, a la Consiguionte actuacién de estas proteinas y al control del proceso. Por delante de la horquilla de replicacién, apenas ‘conoce cémo tienen lugar la necesaria descondensacién de los cromosomas, la disociacion de los nucleosomes yl separacion de las protefnas histonas y no histonas (temas 8 y 9). Por detras de la horquila, debe también aclarase ‘como se reutlizan las histonas y no histonas para la reasociacién de los nucleosomas, cémo tiene lugar la lata ‘organizacion completa de la cromatina (que no parece establecerse hasta que la horquilla de replicacién se encuera ‘muchas kb més adelante), etc,ETAPAS EN EL PROCESO DE REPLICACION 151 12.3.1.2. Proteinas de iniciacién Tan(o en procariotas como en eucariotas, el origen de replicacién es reconocide por varias moléculas protaicas, (Ue provecen el pliegue de la cadena de DNA y crean una tensién superhelicoidal negativa que facilta la separacién de lashebres, generalmente ayudada por la abundancia de pares AT en esa regién. Por ejemplo, en la secuencia oni® esta azcén se debe @ la unién especifica de un oligémero de la proteina denominada DnaA, que atrae a otras proteinas, rncpalmente naB (una helicasa) y DnaC. También existen proteinas de iniciacién que se unen especificamente a las ‘sequencies de inicio eucariticas, formando un “complejo de reconocimiento del origen”. 423.1.3 Conexién entre la iniciacién y la elongacién: proteinas necesarias. Una vez formado et complejo de inicacin, la replcacion precisa el desenrollamiento dela doble lice, a fin de hacr acestles las bases como molde para formar las nuevas hebres. El desenrolamiento iil en amo caresjeciene al origen de repicaién, por efecto de as poteinas do iniciacin, debe continua avanzando por dolanto ela poimeresa, encabezando la horquila de repicaciin, Ademis, a medida que 80 van sintetizando las hebras nuevas se tebe Ir recuperendo el envolamiento on las nuevas dobies helices. En estas operaciones de desenroiamianto © réjaniono y enrolamiento 0 compactacin intevienen diversas protoinas especializads. El complejo multiproteice ‘famado por éstas y por las DNA polimerasas, que viaja asociado a cada horquilla y realiza la replicacion, se conoce cae replisoma, 4) Helicasas sas proteinas multméricas (generalmente hexémeros) se unen al DNA en el origen y actian separando sus dos hetras, en un proceso que requiere la hidrBlisis simulténoa de ATP. Se cresn asi dos horquilas de repficacion, que ‘onienzan a avanzar en sents opuestos, cada una liderada por una helicasa, que avanza por la cadena seguida inesitomente por el esto de componentes del repisoma o complejo de elongacion asociado a la horulla, 4) Proteinas de unién a hebra sencilla Una vez Separadas las hebras por la helicasa, intervienen las “proteinas de unién al DNA de hebra sencilla", que ailen el respareamiento de las hebras. De esta forma, las bases nitrogenadas pueden acoger a los nucledtidos que se Ineorporen en la repicacién. Se las denomina cominmente proteinas SSB (single strand binding proteins), en especial enprocariotas. En eucariotas desempetia esta funcion la proteina de replicacion A (RPA), ®) Topoisomerasas La separacion de hebras ocasionada por la progresién de Ia helicasa a lo largo de la cadena de DNA conlleva la ‘parcién de superenrollamientos positwos por delante de la horquilla. Si se tratase de un DNA lineal y corto, e! sperenrollamiento se podria F por simple rotacién de ta helice en sentido contrario. Sin embargo, ésta no es pasible en los DNAS circulares (procariotas) ni en los lineales de gran tamafio (eucariotas), que resuttan forzados Itglégicamenta, debido a su naturaleza circular y a su unién a proteinas, respectivamente, Para aliviar esa tension de lesén se requiere algun tipo de mecanismo giratoro; de lo contrario, el superenrollamiento acumulado por delante de la harqulla legaria a impedir el avance de la replicacion. Este problema se resueve gracias a la accién de las lopoisomerasas, enzimas que alteran ol estado de superenrollamiento de! DNA sin modifcar en otros aspectos su fstuctura. Es decir interconvierten topoisémeros modificando el numero de enlace del DNA (nf de vueltas que da una hebra respecto a la otra, pag. 68). Las topolsomerasas también intervienen en los procesos de recombinacion y, pesilemente, transposicion, constituyendo un mecanismo bésico general de modificacion topoldgica de la motécula do DNA.152 REPLICACION DEL DNA ‘Atendiendo a su modo de accién, se distinquen dos grupos de topoisomerasas: Las topeisomerasas de tipo I escinden transitoriamente una hebra del DNA (un enlace fosfodiéster), dejan pasar la otra por la brecha abierta y vuelven a soldar © ligar la primera hebra. Como consecuencia, el numero de enlace ‘aumenta 0 disminuye en una unidad. La reaccién transcurre a través de un intermediario covalente entre uno de los ‘extremos del corte y un residuo de firosina de la enzima. Al permanecer la enzima unida asi al DNA ablerto durante accién catalitca, se controla en todo momento el grado de tensién liberada, ‘Accién de las topoisomerasas de tipo f de tipo I: Las topoisomerasas de tipo I, cuyo ejemplo clésico 0s Ia girasa procariética, cortan transitoriamente las dos hebras del DNA, permiten el paso de otra doble hebra, continua, por la brecha abierta y finalizan resellando los oars. Por consigulente, el numero de enlace aumenta o disminuye en dos unidades. La misién de estas enzimes es generalmente inducir superenrollamientos negatives que facltan el posterior desapareamiento local. El consumo tenergético del proceso es importante: se hidroliza una molécula de ATP por cada corte de la cadena, indicado, las DNA polimerasas no son capaces de Iniciar la sintesis de una molécula de DNA, es decir, uni los dos primeros nuclestidos, sino sélo de elongar una hebra preexistente; por ello, el inicio de las hebas nuevas requiere un cebador. Este es sintetizado por una polimerasa de RNA dirigida por DNA (pag. 147), denominada primasa (de primer, cebador en inglés), que produce cadenas cortas de RNA, complementarias de cada una de las hebras desemparejadas en el origen de replicacion. En procariolas, la primasa es una proteina independiente que foma parte de un complejo proteico denominado primosoma, ascciado a la horqulla. En oucariotas, la actividad primasa reside en una de las subunidades de la DNA polimerasa a, distinta de la subunidad con el centro activo polimeras (tabla en pag. 149); por ello, se habla de DNApol alprim, 12.3.2. Elongacién La replicacién depende no sélo de la DNA polimerasa, sino de numerosas enzimas y factores proteicos (mas 20 en E. coll). Este conjunto de proteinas que, como se ha indicado, recite el nombre de replisoma o complejo de replicacin, se asocia en tomo a la horquilla de replicacién, para paricipar de forma directa o indiracta en la sires simulténea de ambas hebras. 12.3.2.1 Asimetria de la replicacién en ambas hebras Conceptualmente, el principal problema de la replicacion surge al constatarse que ambas hebras son copiadas simultaneamente, a medida que avanza la __hebra conductors: hhorquila, mediante enzimas (DNA polimerasas) que sentido de sintesis y s6l0 son capaces de sintelizar en creccién 5’. Al abritse la horqulla, una de las hebras progenitoras se va exponiendo en’el sentido comrecto para actuar de olde, 3'-95', por lo que la sintosis de su hobra ‘vance de Ta horquilla -de la polimerasa sentido de sintesis y 2 ‘complementarla puede transcurir por simple avance de “Ye avance opuestos. 5 la polimerasa a lo largo del molde a la par que avanza a horquila. A esta hebra nueva se la llama conductora, lider o guia (leading strand); en ocasiones, su hebra mol recibe el mismo nombre, pero para evitar confusiones la lamaremos “molde de Ia hebra conductora"”. Por el cana, la otra hebra progenitora se expone en sentido 5'-3', por lo que no puede actuar como molde a medida que avarza aETAPAS EN EL PROCESO DE REPLICAGION 153 haruita. Como se vera en seguida, la sintesis de su complementaria requiere un mecanismo particular que, entre otras ‘2325, supone un desfase con la sintesis de la hebra conductora, por lo que se la llama hebra retardada 0 retrasada (oping stra). La solucion al problema de sintesis de la hebra retardada se reveld al observar que durante la replicacién era potble aislar moléculas de pequefio tamafio de DNA recién sintetizado (menor en eucariotas que en procariotas), ‘camocidas como fragmentos de Okazaki (por Rell y Tuneko Okazaki, que los descubrieron). Se propuso entonces un ‘mecanismo que explicase [a sintesis de la hebra retardada en paralelo al desplazamiento de la horqulla de replicactén, ‘msistente en fa sintesis discontinua de la hebra retardada: cada fragmento de Okazaki cotresponde a una porcion de cha hebra, cuya sintesis solo comienza (de ahi el nombre) cuando el avance de la horquilla ha liberado suficiente Jingiud de hebra sencilla como para que la pollmerasa la utilice como molde, en sentido 3'-»5'. Se propone para ello que la hebra sencilla forma un bucle, arrollado sobre la propia enzima, para permitr la sintesis en el sentido 53" fmpio de Ja polimerasa. La sintesis conjunta de ambas hebras (la conductora, de forma continua, y la retardada, de fama discontinua), por dos moléculas de DNA polimerasa, se dice que es semidiscontinua. Logicamente, la sintesis de cada fragmento de Okazaki requiere un RNA cobador, sintetizado por una actividad piimasa (parte del primosoma en procariotas, DNApol a/prim en eucariotas) que viaja con la horqulla y que también Shieizé en el origen de replicacion el Unico cebador requeride por la hebra conductora, 123.2.2. Mecanismo de la elongacién “Avance de una de las horquillas de replicacion: la sintesis continua de la hebra conductora es simulténea a la sintesis discontinua de la hebra retardada, en fragmentos de Okazaki Para una mejor comprensién se muestran 3 etapas sucesivas en €l tiempo (A, B y C) con la sintesis de tres fragmentos (1, 2y 3) Ena hebra conductora se cecbador como punto de Ta horguilla de replicacién se desplaze ‘continuamente, ya vez se van sinttizando ‘amas ebras| Tala hebra rotardada se est sintetizando el primer fragmento de Okazakt Ta hcbra conductors ‘8 va clongando de forma continua (P= extrema’ en eroeimicnto) Tha vez rerminado el primer fragmento ‘de Okazaki Gracias a que la hobra ‘etardada forma un Duce, la sintesis se puede hacer 5'3" ala ‘vez que avanca la hhorquilla154 REPLICACION DEL DNA Para que la sintesis de cada fragmento de Okazaki se realice en el entomo de la horquilla, el bucle de heb ‘olde en toro al repisoma debe suttiralgin tipo de evolucién en cuanto a su tamatio y disposicion, desde que se ccomnienza la sintesis del fragmento hasta que, una vez terminado, se libera el bucle, ya de doble hebra. Este mecanism refuerza el concepto de discontinuidad en la sintesis de la hebra retardada: Progreso de la sintesis de un fragmento de Okazaki {sintesis del fragmento n° 2, durante el periodo de tiempo necesario para la etapa B Sie aa cise tm te cae ON meres eaponsabes He a en ecard one al eey Tag mola e DNApol 83a See DO soul ehgr oso iehede condor @ masse as DWAgoIaY 5 asin hla ome Naan cee medancoaont cers NA pes een Bienes nae Ten es 7 @O i TE ;DNA nid a Ta hcbra mole ca reconocido parla ‘Cambio de polimerass rotcna factor de replicacién C (RFC), que hace que nla hebra retardada fase spare del DNA 'y se ung el antigeno nuclear de (3800) proliferacién celular (PCNA), otra proteina que ‘vez alrae a pol 0 6, que contindan la elongaci.| (OOMU ‘DNApol 60 €), asociada Ta horquilla,continia la elongacién et dol Faymnento de Okazaki Se completa el fragmento dde Okazaki, al aleanzar el ‘extzemo 5” de fragmento anterior Se lbera el buele con ef ‘fragmento de Okazaki ccompletado, que queda contiguo al anterior _ J, ig @ ©ETAPAS EN EL PROCESO DE REPLICACION 155 Representacién global aproximada de la organizacién de las proteinas responsables de la replicacién (componentes del replisoma) en tomo a ta horquilla de replicacién. La situacién mostrada corresponde a un momento intermedio de Ia elongacién, con un fragmento de Okazaki sinttizado a medias (pj. cl m2 en las figuras anteriores, etapa B). Por clridad, no se muestran otros factores proteicas, comio el PCNA que va asociado a las DNApo! 3, el sistema de nucleasas FENI/RNasa HI que madura los fragmentos de Okazaki, la DNA ligasa 1, y las topoisomerasas que regulen el superenrollamiento en las dobles hebras progenitora chijas. Ta hebra conductora necesita ‘un ecbador sélo al comenzar, sintetizado por la actividad ‘prinasa de la DNApo! La DNApol 8 (0 la €) continéa la sintesis de la hebra conductora de forma continua, en sentido 5°53", recorriendo su hebra molde de 3° a 5° del RNA cebador de la nels de la hebra heb conductore po + molde de Ja hebra sau concn ot agmento de Ota, retrasada ul Hear i lonastn ee 38 YMetaut Beal sintczando shor) a ee anda oi cctador fragmento ‘molde de la hebraretardada Okra, sntetizado por la (eno $3 inden 5 actividad primase de la DNApol hebraretardada (en fragmentos de Okazaki) 3) La hebra retardada se sintetiza de forma discontinua, en fagmentos de Okazaki, cada fragmento lo inicia (ccbador + DNA) la DNApol at y luego lo contintia la DNApol & (0 8), siempre en sentido 5’93". La hebra molde se recorre de 3” a 5” localmente, pero globalmente de 5° a 3°158 REPLICAGION DEL DNA 12,3.2.3 Maduracién de los fragmentos de Okazaki Para completar la sintesis de la hebra retardada, deben unirse los fragmentos de Okazaki. Este proceso, DNA-S'-P"-DNA + AMP-+NMNIPP, Sons AD em rere 68 OA eee a ent ee ‘Ademas de este papel fisiolégico, las ligasas son enzimas de gran utiidad en el laboratorio, junto con ucleasas de restricién, especialmente para la preparacién de moléculas de DNA recombinante (tema 16)ETAPAS EN EL PROCESO DE REPLICACION 157 12.3.3. Terminacién Una vez descritos los dotalles particulares del iniclo y elongacién de la repticacién corresponde estudiar los ‘mecanismos de la terminacion. Debe indicarse que este proceso no se canoce tan bien como los anteriores, entre otras ‘azanes por la propia amplitud y complejidad del concepto de terminacion, Se tratara aqul de exponer los problemas que plantea la terminacion desde un punto de vista ldgico y asumiendo su insuficiente confirmacion experimental 12.3.3.1 Final de la elongacién Se pucde considerar, conceptualmente, que la terminacién comprendo varios aspectos. El primero de ellos es la finaizacicn propiamente dicha de la elongacién por la DNA polimerasa, que se verifica en las dos horquilles de repicacién de cada replicén, previsiblemente cuando en su avanco alcancen a las horquilas respectivas de replicones afyacentes. Este es un proceso pricticamente desconocido, pero cuya resolucién no plantea difeultad conceptual, pues i raleno de huecos y la unién de los dos tramos de nueva hebra puede resolverse de la misma forma que la maduracion y unién de los fragmentos de Okazaki en la hebra retardada. Por otra parte, como segundo problema, falta por aciarar cual es el numero de replicones implicados sinultineamente en la replicacion de cada cromosoma, asi como los mecanismos de control que coordinan el proceso entodes ells. A diferencia del caso anterior, no existe alin una hipétesis previsibl. Representacion esquematica de la replicacion de un cromosoma eucariotion replicon 1 repligéa 2 repligbn 3 replicgn 4 —ea_EOs,K origeney de i replcacon contnimeto telomere telémero . 7 7 ‘5 oO — = roth H ‘NH> H H urea formamida formaldehido Dependiendo del tipo de accién del agente desnaturalizante y de la forma como ese agente se elimine, se puede conseguir la renaturalizacién del DNA, de modo analogo a los casos anteriores. 13.1.2 Influencia de la desnaturalizaci6n sobre las propiedades del DNA En|a practica, la desnaturalizacién del DNA se puede seguir faclmente midiendo aquellas propiedades fisicas que permiten diferenciar el DNA de doble hebra y el de hebra sencilla. Varias de ellas experimentan profundos cambios thrante el proceso: aumento de le absorcién éptica, cambio en la rotacién éptica, aumento de la densidad de flotacion y descenso de la viscosidad. Las mas ullizadas son la absorcién en el ultravioleta (a 260 nm) y a viscosidad. A partir de fetes cambios también se puede obtener informacion de tipo estructural acerca del propio écido nucleico (aunque este ‘specto no se considera aqui). 13.1.2.1 Influencia sobre la viscosidad La elatva rigidez de la doble hélice y su inmensa longitud en relacién al diémetro hacen que las disoluciones de DNA de doble hebra sean muy viscosas. Por el contrario, en forma de hebra sencilla el plegamiento al azar de la cadena hace que la viscosidad sea menor. De acuerdo con ello, al aumentar Ia temperatura, el pH o la concentracién del agente ‘qiico y producirse la desnaturaizacion, s@ observa una disminuclén en la viscosidad de la disolucion de DNA. ‘Cambios en la viscosidad y absorcion Optica del DNA por efecto de la temperatura ‘A mayor temperatura, mayor grado de desnaturalizacion i : it 2 OS tm 5 (HO Temperatura (°C) Temperatura (°C) (similarmente, pH oconcentracién (simirmente, pH o concentracion ‘de agente desnaturaizanto) ‘de agente desnaturaizanto) Descanso de la viscosiéad ‘umento de la absoreion Optica 13.1.2.2. Influencia sobre la absorci6n ultravioleta Recuérdese que las bases nitrogenadas, las nucledsidos y los nuclebtides poseen valores maximos de absorcion {ela lz cercanos a la longitud de onda de 260 nm, debido a la presencia en su molécula de sistemas conjugados de Geties enlaces. Esta propiedad se mantione en os dcidos nuceicos, pera la magnitud de la absorcén no es la misma, jues el aplamiento y los puentes de hidrégeno la reducen (a esto se le lama efecto hipocrémico). Por el, el ONA de hetra sencila absorbe en magnitud similar 2 los nuctedtidos libres, mientras que el DNA de doble hebra absorbe eras. Como consecuencia, la desnaturalizacon de! DNA va acompafiada de un aumento en la Ago (al que slam tect hipercrémico).166 HIBRIDAGION DE AGIDOS NUCLEICOS: FUNDAMENTO Y METODOS DE ENSAYO ‘Riese que of concepto de “doble hebra” en a RNA hace referencia ala formacin de pares ‘de bases intracatenarios en cieriaszonas, y ‘no a existencia de dos moléeulas ascciadas {a absortivided moar (€) (ees Hamad eoeficente de exioeién mola) ‘Ta absorbancia (A) por mol (¢) { unidad de paso éptico (8): A=exbx6, Syq=Axe! (00) 1 todo Jo largo por pares de bases Tntercatenari, como en el DNA ‘efecto efecto hipocrémico hipererémico NAS iD [RNA ‘Ay ‘DNA de hebra sencilla Tore leontenido de dob omN, (coeficiente de extineiba poral de base nitogemtay $° Jnebra Pra que la comparacién en absorbancia sea correcta, debe considerarse un ‘nimero igual de moléculas (0 moles) de base nitrogenada por unidad de volumen; ‘de abi la representacin de la absorci6n, medida en el espectrofoémetto, en orma de absortividad molar. Por ejemplo, se podria compara la Ang de: + 200 motes de base, de nucledsido ode nucledtido + 1 mol de eadenas de DNA de doble hebra, de 100 pb de longitud + 2 moles dc eadenas de RNA o DNA de hebra sencilla, de 100 at de longitud + I mol de cadenas de RNA 0 DNA de hebra sencilla, de 200 nt de fongitud Obsérvese comparativamente la relacién existente entre disminucién de la viscosidad y aumento de A269 an 0 el proceso de desnaturalizacién del DNA, EIRNA, al presentar en su molécula un grado variable de doble hebra, presentaré una absoreién intermedi ent Ja de un DNA duplex de tamafio equivalente y uno de hebra simple (desnaturalizado); la magnitud depende de complejidad de su estructura secundaria y, por tanto, también del tipo de RNA (mensajero, ribosémico 0 de transferencia). 13. 3. Significado practico de las curvas de desnaturalizacién La representaci6n grafica de la variacién de viscosidad o de Aza frente a la temperatura (0 concentracion de agente desnaturalizente) permite obtener las curvas de desnaturalizacién, que son caracteristicas para cada DNA disolucién. El cardcter sigmoidal de estas curvas indica que la desnaturalizacién se produce bruscamente, en un margen uy estrecho de temperatura, de pH o de concentracién de agente desnaturalizante, Esto contrasta con la transit més gradual observada en la desnaturalizacion térmica de protelnas, y sugiere que las interacciones que mentenonis doble hétice (apiiamiento y puentes de hidrégeno) son cooperativas, es decir, la separacién de las hebras en un pu favorece que se sigan separando en el resto de la molécula, Al ser la transicién tan brusca, la desnaturalizacion térmica del DNA es similar en cierto modo a la fusion de ‘lida, por lo que se habla también de curvas de fusién, y a la temperatura central del intervalo de transicién (60% de desnaturalizacién) se la llama temperatura de fusién (Ty 0 Tm, del inglés metting). Bajo condiciones defnidas, cit DNA muestra una curva de fusién con valores caracteristicos de Tr y de magnitud del efecto hipercromico (die ‘entre Azao maxima y minima, o cambio de viscosidad). Estos datos son una medida de la establlidad estructural molécula de dcido nucleico. Su valor depende ademas del pH y la fuerza iénica del medio, y de la composicion en del Acido nucielco. Es importante resaltar la relacién entre Try 6l contenido en pares de bases (© A=T del DNA: Cuanla ‘abundantes son C=G, més desplazada hacia la derecha aparece la curva, es decir, se necesita mayor temperatura la desnaturalizacién, Tm es mayor. Y viceversa, cuanto més pares A=T, mayor desplazamiento a la izquierda y men Try Esto se debe a que, al ser mas fuerte la interaccién entre pares C=G (3 puentes de hidrégeno), necesitan m ‘energia para disociarse.ANALISIS MOLECULAR DE LA HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS: 167 3 & i 2 - Rel con i of i . a9 a ne CT om Temperatura (°C) % (G40) En efecto, al determinar la temperatura de fusién para varios DNAs de origenes diversos, se ha encontrado una ‘arelacion lineal con su contenido de G+C (que, de acuerdo con una de las reglas de Chargaff, ya estudiadas (p59, 39), via entre especies y puede emplearse como indice en estudios evolutivos). Ello permite ullizar la Ty, de una muestra ‘DNA para estimar su composicin en bases. Por ejemplo, se puede ullizar para determinar la presencia de regiones teas en G*C 0 do “islotes CpG", asociados frecuentemente en el genoma eucariético a regiones promotoras, requladoras de la transcripcion y comdnmente metiladas. Finalmente, la representacién gréfica de las curvas de desnaturalizacion y renaturalizacion de un DNA permite ‘cbeervar, como se indicb al principio, que la similtud entre ambos procesos depende de las condiciones en las que se iene Ia renaturalizacion. Obviamente, ambas curvas discurren en sentidos opuestos, pero s6lo si el enfriamionto es keno iene lugar una renaturalizacién, mientras que un enitiamionto répido impide la ressociacion correcta de las hebras: +00 hebra 5 sencilla i Enfriamiento ripido: Boo No hay renaturalizacién 5 3 (Anu permanece casi constante) g 40 é Enfriamiento lento: 3 Renaturalizacién z E de Arga) 13.2 ANALISIS MOLECULAR DE LA HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS Debe tenerse en cuenta que la renaturalizacién depende sblo de la complementariedad de secuencia de las hebras. Por ello, aunque lo més probable es que éstas se reasacien formando las mismas parejas 0 diplex originales, pueden darse otras reasoclaciones. En particular, si se parte de una mozcla desnaturalizada de moléculas distintas de DNA, pero con secuencias parecidas en parte (por ejemplo, de DNA que codifica la misma proteina en especies Gtintes), al renaturalizar se puede producir la asociacién parcial de dos hebras procedentes de moléculas diplex dstntzs. Se forman asi DNAs hibridos de doble hebra, con regiones de apareamiento y de no apareamionto. Esta famacién de moléculas diplex de DNA cuyas hebras tienen distinto origen (distinta espocie 0, en general, distinto Acido rudeico)recibe el nombre do hibridacién. Es caracteristco e! cardcter artificial de su consecucién, de ahi que también ‘se considere hibridacion la formacién de hibridos entre DNA y RNA, o entre un dcido nucleico y un oligonuctedtido ‘natural o sintétco, siempre en funcién de la existencia de secuencias total o parcialmente complementarias. Le estabilidad del hibrido es tanto mayor cuanto més elevada sea la proporcion de bases complementarias y ‘mayor la longitud de las secuencias apareadas. El hecho de que cadenas diferentes de Acide nucleico hibriden entre si india que los organismos de donde proceden comparten un cierto grado de herencia evolutiva comin, y que sus RNAS ¥ proieinas tienen estructuras y funciones similares. Se dice quo los Acidos nucleicos que codifican estas proteinas y RNAs tienen secuencias similares, homélogas. A mayor grado de hibridacion, mayor conexién evolutiva entre ‘e:pecis, y viceversa; por ejemplo, el DNA humano hibrida en mayor proporcién con el DNA de ratin que con el de168 HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS: FUNDAMENTO Y METODOS DE ENSAYO levadura. Sin embargo, no es ésta la tnica utlidad de la hibridacion, sino que da lugar a numerosas aplicaciones, ‘muchas entre elas en el diagnéstico clinico. 13.2.1 Principio basico del ensayo de hibridacién ‘Todos los ensayos de hibridacién se basan en la gran especificidad de la interaccién entre bases ‘complementariss. Para que la hibridacién permita identificar en un genoma, u otra muestra cualquiera de Acido nude, una secuencia particular se requieren dos elementos basicos: ‘+ La presencia de la secuencia diana en uno de los fragmentos, generalmente obtenides con enzimas de restrccién, de la muestra de acido nucleico. ‘= Un fragmento corto de Acido nucieica, llamado sonda, de secuencia conccida y complementaria a la secuenda diana, marcado de forma que permita su deteccién (radiactivo, coloreado, fiuorescente... tema 14). eis ane senda de DNA mareada, con mezcla de fragments | — 3 ‘secuencia (diana) que se busca i) = ~s = en la musta, loble ee, T 6: gen-de ta Beglobina, que su (of Betes3e dl pon oa) dlespaturatzacén por car smezca y renaturazacén ree — emneaing. pleco) ae DNA de bcbra a sencila — ONA dna) T= T i = = == = — oii homodiperdetDNA 42 acca MUN original Macondecon ened los renaturalizade) (DNA renaturalizado) (et toe ie la est ‘de DNA — 13.2.2 Influencia de algunos factores sobre la hibridacién ‘Ademés de la composicién de bases de las cadenas, existe una serie de parémetros que afectan a la posibidal {de renaturalizacién de dos hebras sencilla y, por tanto, condicionan experimentalmente la realizacién de un ensayode hibridacién. Estos factores, cuya descripcién detallada corresponde a un tratado especifico de metodologia en Bicyis Molecular, estan esenciaimente retacionados con la concentracién de DNA o RNA diana (no sélo la concentracion de Acido nucleico en la muestra, sino el ndmero de copias de la secuencia diana que contiene esa muestia) ‘concentracién y tamaiio de la sonda, la temperatura y tiempo de hibridacion, y las caracteristicas del medio de reaccin, tales como fuerza iSnica, pH, concentracién de agentes desnaturalizantes, adicién de ciertos polimeres, et. A ‘continuacién se comenta solo un aspecto, de interés general en cualquier ensayo de hibridacion, determinado pa ‘algunos de dichos factores, 13.2.2.1 Rigor de la hibridacién ‘Se define el rigor (en inglés, stringency) como el grado de especificidad en el apareamiento conseguido en ks hibridos: es decir, supone una medida de la capacidad de reconocimiento mutuo de dos secuencias. Al realizar la hibridacion, normaimente se busca un apareemiento completo entre sonda y diana, pero en ocasiones interesa toot un cierto grado de desapareamiento, con el fin de detectar regiones del DNA cuya secuencia no es exactamente igula la diana, pero presenta elevada homologia, Por otro lado, el control del rigor en cada aplicacién y caso concreto es jsencial: ni debe ser tan alto que impida la unién estable do la sonda a su diana, ni tan bajo que permit la hibideca inespectfica de la sonda con secuencias poco relacionadas, dando lugar a una sefial de fondo elevada o 2 falas positives. El rigor depende de diversos factores experimentales: temperatura y tiempo de renturaizacién (0 templdo longitud y concentracion de las cadenas, composicion de bases y ambiente quimico (presencia de cationes, formamita urea, pl, tipo de disolucion, etc.). Cuanio més elevada es la temperatura durante la fase de templado, més espectizn auGan) te de cPMETODOS DE ENSAYOS DE HIBRIDACION 169 debe ser la interaccién entre las hebras para que se mantengan unidas. Los catlones monevalentes (Na) estabilzan el Aiplex, pues apantalin la repulsién electrostética entre los grupos fosfato, faciitando la aproximacién de ambas hebras. Por iio, la formamida y la urea afectan a les enlaces de hidrogeno (pg. 165) y son por ello agentes que esestabizan la doble hélice. En consecuencia, los principales factores que se suelen manejar en la préctica para maximizer at rigor de la Iibiéacion, y permitir s6lo las hibridos que estén apareados completamente, son la elevacién de la temperatura de {umplaco, la disminucién de la concentracién de Na* y el aumento de la de formamida. Viceversa, para reducir el rigor ‘ela hbridacion, es decir, para permitir la formacion de hibridos parcialmente desapareados, se emplean temperaturas (e templado relativamente bajas, concentraciones eltas de Na* y bajas de formamida, mezcla de sonda de DNA sonde de RIVA 0 eat, sate. ats fR Set pe ae we CF Ar = el “\ — = stasenran 99, 42°0) tsp (p35, stacne amis cone de NaCl gn a veigsog de mar lsc. fe Net orn {f slo son eae iis on pei ito con complementroad conned deere yor tse lagen 3 METODOS DE ENSAYOS DE HIBRIDACION ‘Todos los ensayos de hibridacién se basan en la mezcla de hebras sencilas de dicido nucleico muestra o diane, mareado, con una sonda de secuencia conocida, marcada, bajo condiciones experimentales que permitan of mmianto entre bases complementarias. Si la sonda 0 el DNA diana son de doble hebra, han de ser previamente ralzados, generalmente por calor o por tratamiento alcalino, Una vez mezclades, se permite la renaturalizacion le cusl, como ya se ha comentado, se pueden formar hibridos sonda:diana. Se ha de disponer, ademas, de un 0 pera detectar los hibridos formados, que viene determinado por el tipo de arcaje empleado en la sonda. ‘os ensayos de hibridacion se pueden clasificar en tres grupos: ‘Hibridacién cn fase liquida “Dot-blot” y “slot-blot” Hibridacién en soporte s6lido 4 Hibridacién de Southem o “Southern blot” Hibridacién Norther 0 “Norther blot” Hibridacién in sitr }3.1 Hibridacién en fase liquida Este fue el método inicialmente empleado. Utlizendo una muestra de DNA 0 RNA en disolucién, se realiza su on la sonda; al estar ambas disueltas, la cinética es mas rpida. Ademés, todas las moléculas diana son -accesibles, por lo que la técnica es més cuantitativa que la hibridacion en soporte sélido, Sin embargo, es el fo que menos se utliza actualmente, habiendo sido desplazado por otros més convenientes. Se aplica, por ‘enel estudio de la estructura de los mRNAs empleando nucleasa St.470 HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS: FUNDAMENTO Y METODOS DE ENSAYO O~@x Siz A= a Sere fonst ea ‘es mse gts apa 2) retain con voles stoic age siomotedes andes erases 13.3.2 Hibridacién en soporte sdlido Se trata de un tipo de ensayo mas simple, que permite procesar varias muestras simulténeamente y facite el ‘control dela hibridacién. Aunque la cinética de la hibridacién es mas lenta y el proceso menos eficiente, se utiiza mucho mas que la hibridacién en disolucion, por ser mas sencillo de realizar y mas versatl, Estos métodos han adquirido hoy dia un interés particular como herramientas muy validas para el andlisis de ‘cides nuclelcos y el diagnéstico de enfermedades moleculares con base genética. Como antecedentes, pueden citarse la inmoviizacién del DNA en ritrocelulosa, su deteccién por primera vez por hibridacion y el descubrimiento de un ‘método para la lisis in situ de colonias bacterianas en firos de celulosa, El esquema general de este tipo de ensayos se puede ilustrar con el método comtinmente empleado part Identificar, de entre varias colonias bacterianas en placas de cultvo con agar, aquéllas que contienen un gen 0 {fragmento de DNA de interés bajo la forma de plésmido recombinante (tema 16). ‘se prasona al isco de papel sabre Se ocoge cod papal con a paca de agar Alguras dels cus do repica gels coongs dei placa ‘cade coli so pena papel aca Pe con -¢ Side Ee rata con lat para isarias Senter oe clas y deans ef ONA, weap ‘gue quodafdo al papal (6e pues tavoreceris hain con ‘aadiacin WY) ‘Se neta con fa sora y sa, Sie Lasoo fic dea fore ONA an shies Eicon inenonss eroen ccanienel somone “ide (pated de ayes) se revels ta. 13.3.2.1 Hibridacién “dot-blot” y “slot-blot” Es el método mas simple y coman, gracias a su posibilidad de empleo con muestras de acide nucteico sin purer {por ejemplo, sangre, haces o esputes). La muestra se aplica, bien gota a gota (dot-blo!) o en manchas alergadas {Slot-blo!), sobre un “fro” de nylon o nitrocelulosa, cuyas propiedades de adsorcién fijan las moléculas de acido ‘nucleico y proteina.METODOS DE ENSAYOS DE HIBRIDACION 474 ‘Se apican as musing Sends ieee, gecesi mics a nda itt on (einvemtnas)— onan i coenunn sens a9 a oxo Rxagune TF - Coke se “del lito con albumins aise a ye aaron eLONA 13.3.2.2. Hibridacién de Southern Desatroiada por E.M. Southern, al que debe su nombre (Southern blot). Es una técnica simple y facll de realizar ie detecta fragmentos de DNA, separados por tamafio mediante electroforesis en get (pag. 137). Combina la ‘paracién electroforética del DNA con su transferencia a un soporte sélido o “fitro" (nylon 0 nitrocelulosa) para su hibidacién. Tanto ésta como la posterior deteccion se realizan de forma més eficaz en el fitro de lo que se harla en el ‘21 Esta técnica ha contribuido de forma notable a aumontar la potencialidad de la hibridacién como herramianta fzlica, constituyendo hoy dia en bioquimica clinica el método habitual de andlisis del ONA extraido de muestras de fangre, esputos, taido y oblulas (tinfocites, amnioctos...), Metodolégicamente, implica cinco etapas bien diferencladas: separacién electroforética, desnaturalizacién, trerslerencia,hibridacion y deteccion: rune micas ae ae leiioennt a serene gay aca cmmgioemitanan Jake ‘ivocsilon, asf por woe Eaenannan, ste ct Breen a oman sydccle dolce ta bts con prone [s rade mex o eee opuseonse, Siimenmicoieses | zenen! dmnen tae, Geiekahieecice | coitnl okt 3.3.2.3 Hibridacién Northern A diferencia del caso anterior, su nombre (northern bof) no corresponde al de ningin investigador, sino a un Juego de palabras (southem = del sur, northern = del norte). El procedimiento es idéntico, pero el acido nucieico es RNA. Por su menor tamafto, no es necesaria su fragmentacién con endonucleasas, pero debe tenerse special cuidado para evitar la accion de RNasas, tanto endégenas como exégenas (contaminacion muy comdn, incluso las manos del analista, y muy difciles de inactivar). El uso de agentes desnaturalizantes sigue slendo necesario evita apareamientos intracatenarios, que alterarian el patron de separacién por tamario. La técnica de hibridacion Northern se emplea principalmente para obtener informacion sobre el tamafio de RNAS y 1 modelo de expresién de genes especificos. Estos, una vez clonados, pueden ser utiizados como sondas para mmuestras de RNA aisladas de una variedad de tejidos diferentes, y asi conocer los tipos celulares en los que se sa el gen, la abundancia relativa y tamatio de los transcrits, y diversos detalles de su procesamiento posterior.472 HIBRIDAGION DE AGIDOS NUCLEICOS: FUNDAMENTO Y METODOS DE: Tjemplo de inerpretacion ] es ercnct pr ood ee Ay 8 ‘de un experimento de * 5 Southern. Las sefafes obtenidas en fa tnd core co sa efoto auionadiogrfia dependen del xx x ee (Gistrbucién de los puntos de tet de oe agen eins core) y de as sondas empleades. | 7p 5a oe Tow iaworcidy teal — sacrome —— —= sont Tene — _—_— a ® —— resultado de Ia hibridaci6n Southern oe secede saa, 3 sat ‘eles ars ‘mareadores ae 13.3.3 Hibridacién in situ Es un ipo especializado de hibridacion en soporte sélido, en la que la sonda se aplica sobre muestas en ubicacion natural, generalmente aquéllas preparadas para microscopia. Supone, por tanto, el empleo de la hit bajo un abordaje citolégico e histolégico, y metodolégicamente es andloga @ las técnicas Inmunoctogulmicas inmunohistoquimicas. Oe forma muy globe, cabe distinguir entre sus aplicaciones tsular y cromosémica. 13.3.3.1. Hibridaci6n in situ tisular Se realiza sobre cortes de tejido, células intactas, ndcleos aistados... En muchos casos, se lleva a directamente sobre tajidos fiados con formalina,incluidos en parafina, congelades, etc. Es una modalidad de hibridecén. particularmente importante para detectar virus patégenos, para diagnosticar células cancerosas como consequencia dt ‘cambios genéticos o para estudiar cambios en la expresién génica, detectando secuencias en el RNA celular, En ese caso, tras una fjacion suave de la preparacién, se afiaden sondas de DNA complementario (cDNA), de hebra sencil La deteccion se realiza por autorradiografia y examen de la pelicula fotogréfica bajo el microscopio, © por microscope de fluorescencia, si se empled éste marcaje para la sonda (tema 14). 13.3.3.2. Hibridacion in situ cromosémica Se realize sobre preparaciones en porta de cromosomas metafasicos o prometafasicos (pag. 90), tratadas con {adores para preservar ls caractristicas morfoligicas del cromosoma. Para hacer accesible fa Secuencia de ONA,s {tata la muestra con enzimas proteliicas y se desnaturaliza el DNA por calor, dali o formamide para permits hibridacién con la sonda, Inicilmente se emplearon sondas radlactves, pero problemas tecnicos en Is detec de ‘sefial limitan su utilidad, Se ha conseguido aumentar la sensibilidad y resoluci6n con el empleo de sondas marcadas con forescencia. En esta técnica, lamada hibridacién in situ por fluorescencia o FISH (Wuorescorce in st ybridzation), la deteccion se hace bajo microscapio de fuorescencia, bien de forma directa © por un métodoindteda (pag. 185). En cuanto a sus aplicaciones, dada la gran detectabildad de los fuorocromos actusles se puede emplear le FISH on fines muy diversos y se ha converido en una técnica con elevade potencial diagnéstico en cromosomonats, (tema 20), genes tumorles, virlogi,tasplones, etc. Uno de los métodos surgidos de Ia hibridacién in situ cromosémica es et denominado pintado de cromosomas (chromosome painting), donde se use como sonda una mezcla de ffagmentos de ONA procedentes de Un mismo cromosoma, con lo cual se observa fhiorescencia en el eromosoma completo. Se facita asi la Kentiieacion vival de cada cromotoma (0 varios simultaneamonte, si se emplean sondas con distntosfuoroeromas), en lo que so ha lamedo Un “ariotpo molecular” Esto es tl para estudiar grandes reorganizaciones de los cromosomas, que tienen luge pr sjemplo en procesos cancerosos.METODOS DE ENSAYOS DE HIBRIDACION 173 13.3.4 Técnicas relacionadas ‘Se comenta finalmente una técnica de analisis que, aun no estando basada en los principios de hibridacién, posee una simiitud en los planteamientos que hace interesante su exposicién en este lugar. Han surgido también otros umperosos métodos de andlisis de Acidos nucleicos, variantes de los aqui expuestos, que combinan el reconocimiento, it tales como los ensayos de 13.3.4.1 Transferencia Western ‘A pesar de que en este caso no existe hibridacién entre cidos nucieicos, se describe aqul este método por su Simitud técnica y mecanistica con las hiridaciones Southern y Northern. El ensayo Western (western = del oeste) se enplea para detectar las proteinas presentes en una muestra. Para ello, son sometidas a electroforesis en gel de polzcriamida (separdndose en funcién de tamafio y carga, salvo en el caso frecuente de electroforesis en presencia de. 80S, que separa s6lo en funcion de tamafo) y transferidas a una membrana (western blot). La deteccién de las bandas, protecas en la membrana o fro se realiza gracias a la union especifica de un anticuerpo contra la proteina o regién proleica que se quiere estudiar. De forma similar al marcaje y deteccién de sondas de Acido nucleico, se puede marcar ‘irectamente el anticuerpo o detectarlo mediante la unién de una proteina ligante marcada a su vez, tanto empleando ‘sttopas como técnicas no radiactivas. El paralelismo (y las diferencias) entre los 3 métodos se resume en la figura. Southern Northern Western, La electroforesis de écidos iclcos se suele hacer en getes 4 agarosa y en horizontal a de roteinas, en gles de poliarilamida yen vertical Ta transferencia do Scidos auclelcos gate MSE por cepa de proteinas, por corrente eléctiea (leetrotransferencia) “Alo écidos nucleicos, desnaturalizados, 6 lune una sonda complementaria (hibridacion): 8 fas protease une ofta proteina gue tenga afinided, generalmente un antic De forma andloga, también se realizan ensayos “dol-bot”y “slot-blot” para proteinas, con un planteamiento similar slexpuesto para dcidos nucleicos, salvo por el ipo de muestra, y un procedimiento de union y deteccién completamente {andiogo al del westem (en este caso, obviamente, al no realizar electroforesis no es precisa la transferencia)Tema 14 Preparacion y marcaje de sondas para hibridacion 144. Preparacién de sondas genéticas.. 175 14.1.1 Clasificacion de las sondas, en funcion del métoda de preparacion 176 14.12. Sondas convencionales 176 14.1.2.1. Sondas de DNA obtenidas por clonacién celular (tecnologia del DNA recombinante) ... 176 44.1.2.2 Sondas de DNA obtenidas por clonacién acelular (amplficacion por PCR)... 14.1.2.3.Sondas convencionales de RNA (rlbosondas).. 141.3. Sondas sintticas. 414.1.3.1. Sintosis quimica de oligonuciestidos 141.32 Disefo de una sonda sintética 142 Marcaje de las sondas Marcaje directo en ta fe sonda, 14.2.1.1 Marcaje con DNA polimerasa....... 2) Método de trasiado de la mela 'b) Método de iniciacion 0 cebado al azar 14.2.1.2 Marcaje terminal 2) Marcaje con polinucieétido quinas 'b) Marcaje terminal por relleno. ‘Marcaje externa ala sonda.. Marcaje indirect Tipos de grupos marcadores e indicadores y su detecci 16.2.4.4 Marcadores radtactiV08 non 14.2.4.2 Marcadores no radiactivos 14.2.4.3 Grupos indicadores..... Como ya se ha indicado, la deteccién de cides nuclelcos mediante ensayos de hibridacion depende de la presencia de la secuencia diana a detectar en la muestra y de la disponibllidad de una sonda u oligonucledtido de secuencia complementaria a la diana, Por tanto, la ullidad de la hibridacién, el punto clave, radica en la sonda: de su natualeza depende que el ensayo sea fructifero. El papel de la sonda equivale al del anticuerpo en un inmunoensayo y, alesiar marcada, es posible localizar y cuantificar cualquier secuencia diana con la cual se pueda hibridar. Gracias al ‘empleo de sondas, la sensibiidad de la hibridacién es muy elevada, hasta un millon de veces superior a la deteccién recta por otros métodos, por ejemplo de tincidn tras electroforesis. La sonda se convierte asi en un elemento esencial para cualquler estudio molecular, en especial para analizar la variabildad 0 polmorfismo del genoma, De ahi la caweniencia de estudiar los métodos de preparacion y marcaje de sondas, como aspectos esenciales para su empleo ‘enensayos de hibridacion, 14.1. PREPARACION DE SONDAS GENETICAS Se utiiza una gran variedad de métodos para obtener sondas, tanto de DNA (en hebra doble y hebra sencilla) ‘ame de RNA. Obviamente, para su empleo en el ensayo de hibridacién la sonda siempre ha de encontrarse en forma ehebra sencilla, para lo cual se acude a la simple desnaturalizacién de las sondas de doble hebra,476 PREPARACION Y MARCAJE DE SONDAS PARA HIBRIDACIO 14.1.1 Clasificacién de las sondas, en funcién del método de preparacién Las sondas se pueden clasiicar segin varios criterios: longitud 0 tamano de la secuencla diana, métoda marcaje y detection, tamario de la sonda, método de preparacién, etc, Este ultimo criterio es el mas distinguiéndase entre sondas preparadas por métodos convencionales (por clonacién celular o acelular, temas 15, f ¥¥ por métodos de sintesis quimica. Tipo de sonda: ‘Convencionales ‘Sinetcas Material de partida:_| DNA de doble hebra RNA DNA de doble hebra_| _Nucledtidos ‘Método de Clonacion | Clonacion | __ PCR con ‘Clonacién celular en |” Sintes's quimica obtencién: celular | acelular | transcriptasa vector especial clasica | (PCR) | inversa (RT-PCR) seguida de transcripcion Naturaleza dela Fragmento de DNA "Ribosonda": Oi sonda formada: (oligodesoxiribonuctostido) fragmento de RNA Caliga’) (oligorribonuclestido) 14.1.2 Sondas convencionales ‘También llamadas sondas genémicas, clonadas o biolégicas, fueron las primeras ullizadas y han cont ‘especialmente al progreso de la Biologia Molecular. 14.1.2.1 Sondas de DNA obtenidas por clonacién celular (tecnologia del DNA recombinante) Son de tamafio (longitud) variable, entre 100 bases y cientos de kb. Aunque los detalles experimentales dla ‘lonacion celular se estudian mas adelante (tema 16), se adelantan aqut brevemente las etapas principales del proceso. fagnenicion oe so it ‘omens Je 4 oO tet O rere tina de ‘ecn PE tognena cc se a DNA de incrés plismido Yostor de BY] pwede pacisa inser") ae (corn ejempl on ea tm ple 3 ‘ies fa 3 Stas Gna DNA i ia Oe EI % (DNA) é eee as ‘colin cttBNA roassincn as racién Sean incon so eeanslors em seca dens, del inserto (por corte con ‘Spam el DNA romasmicg pies dl pls ‘nzinnas de resttiecién) ‘pecins coum reat inl calgon De ot NK (ONA sec) rene uso » i . sue) 14. 2 Sondas de DNA obtenidas por clonacién acelular (amplificacién por PCR) Estas sondas son de menor tamafio que las obtenidas por clonacién celular, entre 0,1 y 20 kb. El métoda de preparacion (PCR, tema 15) también consta de un menor nimero de fases, por lo que las sondas se obtienen de fama ‘mas répida y sencilla. En general, partiendo de DNA de doble hebra se preparan sondas de la misma naturaleza, sao fen la PCR asimétrica, que conduce a DNA de hebra sencilla, y en la RT-PCR, que permite obtener sondas de DNA de doble hebra partiendo de un RNA (pag. 195).PREPARACION DE SONDAS GENETICAS. 4m 4 Se) — sess eres “ES Eas Ud coer as DNA de putida a mati 14.1.2.3 Sondas convencionales de RNA (ribosondas) La donacién celular se puede emplear también para preparar sondas de RNA de unos miles de nucleétides. El proceso, relativamente complejo, se basa en la transcripcién de un DNA previamente clonado. Se usa un plésmido espedial (generalmente el pSP64), que se caracteriza por Incluir el promotor de una RNA polimerasa de fago (promotor ‘$P0). EI fDNA resultante, una vez purificado y linealizado, se utliza como molde para la transcripcién por RNA. oimerasa SP6, que transcribe el inserto especiicamente a partir de la secuencia promotora SPS, sintetizando ‘umerosas copias (de hebra sencilla) de RNA. SI alguno de los NTPs, sustratos de la RNA polimerasa, esté marcado (649, 181), el RNA se puede utilizar directamente como sonda; si no, debers marcarse el RNA posteriormente a su obtencon, 7 ( fragmento de ner side conado DNA de partie (OA Lae ebay Banded hats) vise rae teenie eaemg ‘abr rita Cait. NA polimena SP6 an vate Ops Crp eUTP oi) (almenos ino mata = a = ‘ein aire promaar milliplescopias de RNA eT sone Vaniajes de fas ibosondas Dasventajas dole rbosondas ‘AI n0 poderse formar el homoduplex sondaisonda, se Es necesario usar un vector de clonacion favorece la effcacia de la interaccion de la sonda con la secuencia diana. Les sondas no unidas especiticamente pueden ser Stidat - preparaciin de la unin covalente sonda (por satesis ie Smosiesion) ae Soma area TS SS Nuclestidos eared ey, aoe Ercan en a mr farcaje indirecto: el “marcador” unido a Ta sonda no os detectable directamente; se Te llama indieador, ara la deteccién, el indicador se une a una proteina detectora, que Ileva el marcaje. Dos alternativas, después de la sintesis de la sonda o durante ella: — ‘ROSTER MareRUGH (wnidncovatente) Nucledtides ——— Soiiilal ‘repel ‘nin eovler jorsincas X ‘o modiicacibn) ~ ‘Soiidazindi : Sn es Inidicador a, ome u ecg — > Nuclestido-Indicador Fern de nn owen oolong ees, ‘o modificacién) — 14.2.1 Marcaje directo en la molécula de sonda El grupo marcador se puede unir covalentemente a grupos funcionales especificos 0 formar enlaces covalentes de ‘oma inespecifica, Los acidos nucleicos muestran menos grupos funcionales adecuados para este fin que las proteinas; basicamente, algunos atomos de las bases ritrogenadas (especialmente, aquéllos no Implicados en el apareamiento tanla base complementaria) y los grupos terminales 3-OH y 5“P.182 PREPARACION Y MARCAJE DE SONDAS PARA HIBRIDACION MAR Marcaje covalente de la sonda (por métodos quimicos): bi NTPosonda. + Muororome enfrga_— p= NTRo = CD sear ‘quimicaments activada para reacckén de conjugackin cligo Lae) ae fon cre en Ie oe oe = te cement yy eeeceery, SEES 7 En om categoria do moos punen contrarian atu de uos mardon dri ail de la sonda como el marcaje de la sonda ya terminada. De estos Uitimos métodos, se comentan a@ continuacién los més sreseruton e 14.2.1.1_ Marcaje con DNA polimerasa Se Weta de mods do shtcls enna, ls mis comunes Las cut pos de neti (lamas aton Seam Solntoren Sess asats do srmns ane casera se DK, Eten coe west eae la mella (nick transtation) e iniciacién 0 cebado al azar (random priming). a) Método de traslado de la mella Es un método facil y rapido, considerado el ejemplo clésico de incorporacién enzimatica de un marceje, sit secostn! to senenraasdbh ie tons de ONC Sob, Rogure ea arene dine: une cocotbo {Bhone pantediza 9 ns GNA pointes fNepar ec) El eat al areas oo sesso serans ea los mettRine Sopra ce cod hk be DA pot cosa etceoe raochomere ti ore ee se oP oPe oe Pe A Pe Pe Be Pe OH 3” La DNasa | pancredtica produce cortes intemos aon toe pbs pera Siencas eas ara \clssbauy dn esta ees geen DNs a ‘que existen grupos 3°-OH y 5°-P libres. “ty a a Ta DNA polimerasa I de £. coli fa mis versitil de A = leelal las DNA" polimerasas, poses | tes actividades Strate meal coco a ee ee caer Sis anna ceaeats st em toa ca TE wags 2 te ee acl ed Sma ly onama oy ee | Eee , 14.2.1 11 i completa P01 ) Simulténeamente, Ia actividad polimerasa renueva & vofmon & Om +r, los nucledidos, incorporando otros aucvos sobre al stent, 7 Sn Ose aries aes ai tee ton r fen Ia direecién habitual de la sintesis de DNA cn peane son 3° { (593°). El proceso es idéntico en todas las mellas y, marcar « NG ae ae a aed toma ‘Como resultado, las melas se desplazan alo largo de la cadena, Sigue habiendo DNA dable, pero aperecen en ambas hebras regiones marcades ‘(que servirin como sondas). Su tamafo puede ccontrolarse através de la proporcin de enzimas ela mezela de reaceién. Una vee parada la reacein con calor y EDTA, se scparan las sondas ‘de los nucle6tidos no incorporados, por ejemplo, [por eromatografia de Filtracion en gel Tain sondas Puesto que ol nuclestido marcado se incorpora a la sonda, en lugar del marcaje radiactivo (en la figura) pueden ‘emplearse nucleétides marcados con fluorocromos o con grupos indicadores (pags, 181, 185),| | | en MARCAJE DE LAS SONDAS. 183 b) Método de iniciacién o cebado al azar Esta aterativa, a diferencia de la anterior, requiere la desnaturalizacién inicial del DNA doble, para que hibride un ‘sigonuctestido que actéa como cebador de la replicacién por DNApol-I de E. coll. Ahora bien, en este caso s6lo se requere Ia actividad poimerasa, por lo que se prescinde del fragmento pequefio y se suele ullizar el fragmento de Kenow (pég. 147). Esta técnica ofrece una serie de ventajas de cardcter técnica respecto a la anterior, cuya ‘msideracién escapa a nuestros objetivos de cardcter esencialmento conceptual ‘Una ver desnaturalizado por ealor &l DNA ob, se hibrida lentamente eon une mezcla de ‘oligonucle6iidas sintticas (cominmente hhexanueletidos; en la figura, tetranuclebtids) ‘con todas las seeuencias posibles al azar. Algunos de ellos hibridarn en distinis puntos , Pex S°P-DNA 95 HODNAY ATP marcato con "Pony a 2 etapa: y-P2PLATP+ 5° HODNA—> 5° BP-DNA + ADE frgmoK— a Sinan pe omen a polinucteétido quinasa puede también cotati inlereambio directo del fosfto 5"-terminal del DNA pephempmymymyempty ymca | RETA Serle sepia a Soclatedielodlinlalaelalale 5 Perera neviaTs maa ors ~ ea a Rerpeempnpnean mpmpmyeyhen eer araarines nancies i a a Oe a ae a restriecién (pag. 199) : esntura- = me ee eee ee En este caso sélo pueden utlizarse marcajes radiactivos, pues lo inico que se incorpora a la sonda es el fosteloy del ATP. b) Marcaje terminal por relleno Este método se caracteriza por ser el dnico que utiliza una enzima de restriccién especifica para formar dis ‘extremos cohesivos, que luego son “ellenados" por la DNApo!- State opm mp oon 3 TIDNA diplex se eacinde previamente Gon una ‘endonucleasa de restriccl6n adecusda, para generar dor extremas cohesivaro cecalonados (nig. 20), SP o 10-1 Tos slientes 5 actin como molds para que macro fragmento de Klennw dela DNA poimerasa eed (rma de cebad azar) ada cleus ‘mareados alos extremos 3 ‘ise desean sondas marcadas ny un To ‘extreme, se ta el producto con una ‘endonucleasa de restricion Este método de nuevo permite el uso tanto de nuctedtidos radiactivos (en ta figura) como de aquéllos marcadis ‘con fluorocromos 0 con grupos indlicadores..MARCAJE DE LAS SONDAS: 185 14.2.2 Marcaje externo ala sonda En lugar de marcar sus propios nuclettides, la sonda se puede unir con otra molécula que a su vez lleva el ‘marcador. Una posibiidad es la unién de protelnas mediante reactivos entrecruzantes (crosslinkers: formaldehido, {itarcidehido, etc. También puede unirse el marcador por interaccién electrostatica con el DNA o emplearse agentes Inercalantes, que se insertan entre los pares de bases de la doble hélice (hibrido sonda : DNA) de forma no cavalente. Unindgunsenaina sae con Uninet lasonéa oun ara des nto esa Pert et ‘sonda + cidasa (PO) |Peroxidasa (PO) + polietilenimina hibrido diplex * pela Foon somteDNA ana rvs de cngontn rn de ont : SS nas ane eit say snd ona pine 10 sn oosrain ey ees? sa, sage wwe Sen. cok Snare ee sot 40 (mks na) a = dnp tit siete exes Per os me = os tne 1423 Marcaje indirecto Como se ha indicado (pag. 180), puede convenir que a la sonda se una un grupo no detectable o inalcador, el cual ‘1 una segunda etapa es reconocido por otra molécula, generalmente una proteina, que Incorpora el marcador ‘kteciable. Para la unién del indicador son aplicables las consideraciones ya realizadas respecto a la union del Inarcador en los métodos directos. Se ilustra un ejemplo correspondiente a la modificacion de los NTPs: rtd) einen tae ore ooo ae ee Oem bend PY iti cn one cra a son tae hack 2a etapa: Marcada vexpendiS eS ancora onsen. epee eee Se, see eat ae neon . oa deg o PI detectora, marcada —— 5 ‘onda de DNA de doble hebra, ‘mareada con grupo indicador 42.4.1 Marcadores radiactivos 5) marcaje radiactivo 0 isotépico es el que se ha empleado con més frecuencia, aunque va siendo desplazado yesivamente por los métodos no radiactivos. Aunque no existe consenso acerca del marcaje ideal, en la mayoria de ‘casos se hace con 32P. Puesto que la corta vida media de este isétopo (14,2 dias) crea dificultades en la petacién, comercializaci6n y uso rutinario de los ensayos, se utiizan también otros alternatives (358, 3H, 1251 9 14c), a deteccién y registro de la hibridacion se hace por autorradiografia: el soporte con el material hibridado se pone canicto con una pelicula fologrética (del tipo empleado para las radiografias), la cual queda impresionada con una |que muestra a presencia de la radiactividad (ver, por ejemplo, el método de Southem, pag. 171), La intensidad esol depende de la intensidad de la radiacién emitida por el is6topo y del tiempo de exposicion..186 PREPARACION Y¥ MARCAJE DE SONDAS PARA HIBRIDACION 14.2.4.2. Marcadores no radiactivos En funcién del marcador empleado, la detecci6n se have por Nuorimetria o afiadiondo un sustrato especiion aa transformacién enzimatica por la enzima marcadora pueda detectarse por alguno de los siguientes princpios: + Espectrofotometra: medida de ta absorcién de la luz por los productos de la reaccién, bien solubles o insolutes, en el ultavioleta ool visible (colorimetria) + Fluorimetra: medida de la luz emia por procuctos de la reaccién que posean un fuorSforo(pég, 126) + Quimiotuminiscencia: medida de luz emitida como consecuencia de reacciones con esta caracteristica (pr ejemplo, la transformacién de fs lciernas, cataizada por lucferasa, ola oxidacién del lumina). Debe sofalarse que estos y otros procedimientos no son exclusives del marcoje de sondas, sino que se epian igualmente en la deteccion de proteinas, antigenos, pequetosligandos, etc Resumen de marcadores, indicadores y métodos para su deteccién Sante A o et nas rnin myo iendor | Prin deere Pal ; ‘Giza. ligane) a iota ‘vin, ‘sieeve Fereromo Peroxidesa | Reaccidn Cromogénica ABTS Digoxigenina Assen) ABTS “Geena avnpeaeman, [ronan Dervadoe de nal ‘rea pana cern por agua dc as metodo ‘Reaceién Fluorogénica: Benign = Cuiniouminieenis | Deivados de dosctna ‘mobic natin, edo seal spcin,ce | io de fein Forfnias Allon | Reaskin Comoginiss] NBT*BCIF an ne Reacctn Forogénce]__anophos™ seinen aNPrsPaegTR SESE chat mio (6) Chimislaminscenin: | Dead de neta Barres wimondeh done ee Reseed encinCrmopénice| Xgl ee ne to ck harman fo acer Giese etcemn | omelet | Misma 14.2.4.3. Grupos indicadores Los grupos més cominmente usados son la biotina (vtamina natural) y la digoxigenina (esteroide de la plea Digitais). Ambos son fécimente conjugables a fos nuclestidos y se unen con gran afrided, respectivamente, a ks proteinas avidina o estreptavidina y a anticuerpos ant-digoxigenin. Al igual que para los derivados fhuorescentes, se =. ieado, doble hebra lineal —— an cebadores que hibridan con los extremos 5" de la secuencia conocida, por lo que Ia elongacién se extenderd ‘arededor del circulo, Se generan copias de un DNA tineal delimitado, como en la DNA normal, por la posicién de ambos cebadores. 15.2.5.4 PCR con adaptadores También puede ampiiicarse una regiin de DNA de secuencia desconocida ligando a sus fragmentos de ‘estiecion unos adaptadores, oligonuclestides sintéticos con extremos cohesivos compatibles con los gonterados en la muestra. A continuacién, una vez desnaturalizados, se aftaden cebadores especiticos para las secuencias 3 de los ataptadores, Se ampiica asi el conjunto de adaptadores y secuencia diana, pero debe sefialarse que se amplifican por igual todos fos fragmentos de restriccién presentes, no uno sélo. regién que se quire amplificar, de secuencia desconocida SAGCTT Ax yA TICGA 5° aapador AAGCTTCTTAGTCAC 7° IECAGTG 5" y anccactGcnAGcTT aacorrermacreac 3’ sebudor? MORGTG s° S@MCCAC —cehador | S ERGGRGACGTECGAA 'TTCGAAGAATCAGTG 5+ ET y resto de ciclos de POR S'GECCACTGCAAGCTT. .. 3 CAGGTGACGTICGAA. _mailtiples copias del fra 15.2.5.5 PCR asimétrica En este caso, se trata de generar coplas de hebra sencilla de un DNA. En la variante mas simple, se afiaden ‘antdedes muy diferentes de ambos cebadores, de modo que tras los primeros ciclos de PCR uno de ellos se agota y, sponibles ya suficientes coplas del DNA diana, s6lo una de sus hebras sigue amplificdndose gracias al cebador mas abundante 15.2.5.6 RT-PCR: amplificacién de RNA El nombre, *PCR con transcriptasa inversa” (iniciales de reverse transcriptase), indica que se trata de una anpiicacién de RNA (especialmente mRNA) a través de la sintesis previa de su cDNA (DNA complementario al RNA), que después se amplifica por PCR. Es decir, no se obtienen copias del RNA de partida, sino de DNA, aunque se. ‘anserva obviamente la seouencia de aquél. Es el método con mayor capacidad de deteccién de los disponibles para la medida de la expresién génica in vitro. Se utiliza preferentemente para amplificar mRNAs de céluias asequibles, por ejemplo sanguineas, con una expresién196 CLONAGION ACELULAR: REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) celevada de clertos genes (por ejemplo, globina). También se ha aplicado al anétisis de transcritos de genes expresades, ‘en grado minimo. La mezcla inicial contiene todos los componentes necesarios: muestra de RNA, transcriptasa inversa, DNA polimerasa, cebadores y dNTPs. El proceso comienza (por ejemplo, 45 min a 48 °C) con la sintesis de una hebra de ‘eDNA por la accién de la transcriptasa inversa, una polimerasa de DNA dirgida por RNA (pag. 147), permaneciendo a ‘CDNA unido al made como diplex RNA CDNA. En una segunda etapa (por ejemplo, 2 min a 94 °C) se desnaturalzael doplex y comienza la amplificacion segiin ol mecanismo de una PCR normal: la hebra de cDNA liberada actia como. rmolde para una segunda hebra de cDNA y luego el duplex se amplifica en sucesivos ciclos. FE] RNA, dehobrasecilla es| wr eeeamepocnopccoceamuecsnances ER ONT Trerseipctin verea |_tersros inversa I | _ hibrido RNA:DNA IE” | +: samme TT ls s bra RNA & | _, hebra cDNA + Ba eer. soe ese sMMCAGCRAACGCGaTATAGGCTEACCG. eT 5 8 | eomssesanay ceca ———ps [Toro B | hebra cDNA S*AAGT S |x" Jissess TBPEAGOTAACGCGGEATAGGCTRACES. « a Biongacién NA polmerasa own cet tees ‘Blo mpi como molde el DNA) 5’ ANGECGATEGCGCCATATCCGAATGGC.. 3 y 1 +s SITEAGCTAACGCGGTATAGGCTTACCG. x » & 8 > . s g 3 Ezy ccs sussaon THED) 8 & | PNNENBNpntNpNPN oo >, nN Y Zpn nN i» pN (S-NMPe) Fosfadieserasa_UL-(de-bazo havino). Es una S'-exonucleasa de tipo “b", por lo que liberal nuclebtido 5-terminal ‘como mononucledsido-3",5™bisfosfato. Sila escisién es repetitiva, aparecen los sucesivos mononucleésidos-3'-P y el rnucledsido -terminal: PNpNpNpNp.....NpNpNpN PNpNpNp...NpNpNpN- — N pNp+E Np+Nn Ne Np pNp (NP + N,+3-NMPS) 43. Reconocimiento de nucleésidos, bien por la pentosa o bien por la base nitrogenada (s6lo en algunas nucteas desoxirribonucleasas 0 DNasas, que actiian sélo sobre DNA; ribonucleasas o RNasas, que hidrolizan RN finalmente, algunas nucleasas distinguen entre nucleésidos purinicos y primidinicos:ENZIMAS DE RESTRICCION 199 _Ejemplos de especficidad por nucleésidos ‘RNasa 1 (de péncreas hovina). Endorribonucleasa de tipo “b” que actia sélo sobre enlaces en los que el ribonueldsido del lado S* es pirimidinico (C,U). Se forman, portant, oligonucledidos con extremo 5'-OH y extrema 3°P pirimidnico (ms, en su ca80, el S~-P-ibonucledsio pitimidnico Sterna y el ribonucledsio 3 Aerminal): yapGpLipGpUpCrGrCPAPUPA ——P pApGpUp + GpUp + Cp + GrCp + AnUp + A ‘Nasa LL (de haze, sima ci.). Endodesoxiribonucleasa de tipo “b que hidroliza preferentemente el enlace entre ruclesidos purnicoy primidinico; con menor frecuencia, ene pirimidinico y puiaico o ene pulnio y purinico. Se forman, pues, olgonuclestidos con extremes S-OH y 3-P : PADGPUPGpUGCPGpChApUph ——P pApGp + UpGp + UsCpGp + Carp + UnA 16.1.2 Enzimas de restriccién 16.1.2.1 Caracteristicas generales Les enzimas de restricion se aman también nucleasas de restriccién, endonucleasas de restriccién y, en ocssiones, enzimas restrictivas 0 restrictasas. Pertenocen a esle grupo une gran diversidad de ‘endodesoxirribonucleasas, descublertas como enzimas propias de dstntas bacterias y caracterizadas en los afios 70. ‘Se dspone hoy comercialmente de un gran niimero de elas con elevada especificidad, establidad y pureza. Se nombran con tres letras tornadas del género y espacie de la bacteria de la que se aislaron originalmente, ‘aguas a veces por una letra més, que identifica el serotipo (variante antigénica dela bacteria), yfinalmente por un rnimero romano que las identifica en el caso de que en una misma varianle se hayan encontrado varias enzimas con Aitinte especiicided: Haelll EcoRI Bam bacteria ae Feo! pa ecrigen: Haemophilus agypiis Escherichia coi, Bacillus anloliquefactonst copa RYI3 cepa La importancia de las enzimas de restriccion radica en su gran especificidad de reconocimionto de una secuencia cotta de DNA duplex y fa consiguiente hidrélisis de un enlace fosfodiéster en cada hebra, justamente en secuencias concretas del DNA llamadas sitios de reconocimiento 0 de restriccién. Los fragmentos dé DNA originados son aitiles para iniclr la clonacién celular o acelular, para el andlis's de DNA, para elaborar mapas fisicas de restriccién (pag. 226), parala deteccién de potimorfismos (pag. 381), etc. Las diversas enzimas de restriccién se agrupan normelmente en tres familias, de acuerdo con sus propiedades: Endonucloasas doresticeion Tipot Tipo tt Tipo mt 7etvided Endonucleasa y metlasa Endonvcloasa Endonuclease y metiasa cenzimatica en.una misma proteina (metilasa en una proteina en una misma proteina (endistintas subunidades) independiente) (en distintas subunidades) Coenzimas 0 ATP, Mg”, SAM (*) Mg? ‘ATP, Mg™, SAM (*) cxsitatos Esiucuraproleica 8 subunidades 7 euburidad, 2 subunidedes: S reconocimiento, aunque acta como [MS reconocimiento y Rrestrccion, homodimero matlacién, Mimetlacion Rrestccion Sitio de No palindrémico, dos partes: Palindrémico (4-8 pb) No palindrémico reconocimiento separadas (ej.: TGA(N)sTGCT) (pag. 57) Puntodecote Cortalas 2hebras en puntos Carfalas 2 hebres en purtos Cota las dos Rebras en etcanos ene si, poco equivalents, muy especticos, puntos distantes entre si 2 espections, aunos 1.000 pb denlrode la secuencia de 63 nt, situados a 24.26 pb el so de reconocimiento reconocimiento del sitio do reconocimionton Ponto demeliadin Dentro de la secuencia de Adenina ocitosina may Adenina dentro de Ia reconocimiento. especiicas dentro dela ‘secuencia de En ambas hebras secuencia de reconocimienlo. __reconacimiento. En ambas hebras Enuna sola hebra wierés on No si No ingrieria genetica 5 EcoK, Boo8 Numerosos (pag. 202) Eo Pi, Eoo PS, inf () SAM = S-adenosiimetionina (pag. 201)200 CLONACION CELULAR: TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE 'Nos concentraremos en el estudio de las enzimas de tipo Il, pues, al cortar en secuencias muy definidas, sons utiizadas como herramientas en ingenieria genética. 16.1.2.2 Papel biolégico del sistema metilacién-restricci6n La existencia natural de las nucleasas de restriccién en muchas bacterias oftece a éstas un mecanismo de defensa contra la entrada de material genético de otro organismo, concretamente de virus bacteriofegos (oy reproduccion depende de la maquinaria genética de la bacteria): se trata de los sistemas de restriccion-modificaciona metilacién-restriccién, Para cada enzima de restricei6n, una metasa reconoce la misma secuencia que constityed sitio de restriccién y une covalentemente grupos mello a determinadas bases del DNA en dicha secuencia. En el cis0 de enzimas de tipo II, la metilasa es una proteina independiente, mientras que las de tipo 1 Ill poseen las actividades nucleasa y melilasa en su molécula cligomérica, como subunidades que actdan coordinadamente (ver tabla anterior). EI mecanismo de defensa es el siguiente: ol ONA propio de la bacteria es metilado de una forma especie, caracteristica de cada especie bacteriana (en las secuencias reconocidas tanto por la restrictasa como por la metas de esa especie). La matilacién de las bases impide la unién de la enzima de restrccién, con to que el DNA propio noes hidrolizado. Por el contrario, al entrar en la célula DNA de otro organismo, no metilado 0 con un patrén de metiati diferente, este DNA puede ser degradado por la enzima de restriccion, ya que carece de tos grupos metilo en ssecuencia diana (por razones puramente aleatorias, en cualquier genoma habré un cierto nlimero de secuencias de 46 UB pb iguales a la reconocida por la enzima, luego habré secuencias diana disponibles). A partir de este mecanismo 6 ‘accion combinada surgié precisamente et nombre de enzimas de restriccion: la accién de la nucleasa rostinge posibiidad de infeccion por virus. DNA no meta DNA mtilad on na adnin espe ds con sitio de resticein para EcoRI restiecin para EcoRI (en ambas hebras) S-CAATTCS a S-G-AAMT -T-C3" 3c 3-CT-T-AMAGS 7 Enzima de ne restticelon in ‘EcoRI (2 motéculas) _—_ 8 Ja restrictasa actia sobre sitios no metilados, y la metilasa actia sobre sitios no cortados, EcoRI corta el DNA reconociendo ambas la misma secuencia. ue seats motate una sla hdr dl DNA, so no 6 cond porn encima do etn, prs 9s mets een afd grape eto sao hob, Eo geo Go me Bor oom ha dea rotons Sa Taitoc fs emeso fora heb me, procter) ercosecvee, mots, oa heb eon ssa Shs Rncarece de grupo malo Ets arrancones segura ue oc) DNA eas coset Ne as Metadolomibs pnb Us mln dt DNA lol pncsinert tsi adie dl sacra cena Ena ren reigns en como donate Gl gue mt compose S-terosmtonns 0.2)ENZIMAS DE RESTRICCION 201 i S-adenosilmetionina wy rn) CRC) Hs | aes ] 0 Smet. uy ] (2-0%0-aine Seti pining) DNA DNA —frretiiasa] ‘ostasion 7 WI? Pr Mamet ea Debe adelantarse que la metilacién del DNA interviene en eucariotas como un mecenismo de regulacién de la eigresion génica, aunque este proceso no tiene nada que ver con el mecanismo de proteccién que desempefian los, sstemas metilasa-restriciasa en procariotas. Esencialmente, en eucariotas los genes tienden a estar desmetilados en los tedos donde se expresan y matilados donde no se expresan, especialmente en las regiones de DNA llamadas. “isotes CpG", por tener esta secuencia dinuclestidica en la que C sufre la metilacion. 16.1.2.3 Accién de las enzimas de restriccién de tipo II Son éstas las restrictasas estructuralmente més simples y las mejor estudiadas por su utilidad en Ingenieria Genética, a modo de “teas” para el corte del DNA. El sitio de restricci6n es a la vez lugar de reconocimiento y de hidbisis. Se hidrolizen de forma muy especifica enlaces fosfoéster del DNA, uno en cada hebra, generdndose dos fragmentos de restriccién. E| enlace hidrolizado es siempro el 3-P (es decir, son endonucleasas del tipo "a", ag. 198), por lo que el fosfato queda unido a 5’, dejando en ambos fragmentos extremos 3'-OH y 5°P. La reacci6n no racesta ATP, lo que la diferencia de la catalizada por las enzimas de tipo ly Il. Tos sitios de resriocion son soevenclas eons ‘v-palndrimicas, generalmente de 4 u' pb bia eee ‘Resultan dos fragmentes de DNA diplex, cuyos ‘extremosna contienen bases desapareadas; se denominan extremos romos (hunt ends) Resultan dos frapmentos de DNA diplex, cuyos ‘extremos tienen bases desapareadas; se denominan extremos cohesivas 0 esealonados (cohesive / “sticky” end) lustracién de los distintos tipos de extremos resultantes de la accién de enzimas de restriccién: cna A ? we ? ¢ —— tn: enzina 8 >. = ——— ae x x ary ay mes Se v ae sahsies p—_ d enzimaC202 CLONAGION CELULAR: TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBI ‘Algunas enzimas de restriccién de tipo Il empleadas en ingenieria genética SecuandiareconacKay NeoeRe | acta do organ puntos dacore(/\)” | TPEC®. | producto rsulantes del ecstn “ReCESI | Aehetboctercaeoecates reas FS ERS ia 6 |saliente §'|-C-C-A-T-Gp_ * S| Alu! [Antrobecerhove roros a Bam = asian PORT ‘Boctus omyciguefeciens H 8 * 7 esivoe TRS Ball | Bacitus giobigt ee * x EcoRI | Esohenchiacol RY esos eee aon Isaliente 5'| q Fae | Haomophis esos romes "cal Hindlil | Haemophilus influenzae |cohesivos: PA-G-C- re saliente 5 | M T [kits preumaniae OK Jahosies, “en |saliente 3} * CoAT ‘bol | Morerotabovis ee Peel | Wott | Nocardia otti-cavierum TEE C-C-O pee reece eee e-6-6-0-6-09 ee} Pat) | Prondonca stati ~CeCN roo-e=c-n ie} Taneete [sation sop Accooet Pout | Preveus wgars = hesivos|-6-C-FT 7a] us =G-C\T-A~G-C~ |saliente 3'|-G-Cp_ TAG Poa | Proteus vars Teele beac Pere ‘e =G-T-C\G-A-C- fomos |-c-7-Cp Gate SauGA | Swahiccocous aureus Ti7e-a-tmc-t=|eobesivos pw Pera oe * jsallente 5'|-N-C-T-A-Gp uw & TH TTA | Thomas trmophive san Jechesvos -o-a-c- TAOS salerto§ -c-t-e-N-np weak] El nombre dela Las secuencias diana mis freaventes tienen TnN1ii es un ejemplo de ‘enzima es una 6 pb, pero también son comunes las de 4 pb ‘enzima con especificidad abreviatura del de la y 8 pb (Not I); se dan algunos casos con otro: parcial de secuencia (acepia bacteria en la que se {amafo, por ejemplo, 9 pb (11, cualquier base en ls tee encuenta, Siempre son secuencias palindrémicas, posiziones N) ‘Extremos compatibles en algunos casos, distintas enzimas de retrcci6n generan extremos cuyo salen tenet misma secuencia, Ejemplo: BamHI, Bgl Il y Mbol (¥). soesquiz6meros nombre que sc aplica a dos o mas enzimas que reconocen la misma secuencia; pucden cortar en elmismo punto o bien se diferencian en que el corte ola metlaién asociada ienen ligar en puns dsintos deo delesasecuencia comin de reconocinienta, Ejemplos: Mbol y Sau'3A1 (i), 4cc631 ¥ Kpn | Ok. Obsérvese que en todos los casos los extremos de os dos fragmentos generados son idéntcos, tienen ‘Secuencia (se puede ver girando 180° uno de ellos). Esto es consecuencia de la simetria del palindrome y dela ‘simétrica de 10s puntos de corte en cada hebra. Todo ello se debe a que la enzima actia en forma de dimero, por reconociendo una misma secuencia y cortando un mismo tipo de enlace en las dos hebras: por ejemplo, Eco Rl cota enlace (1) G—AATTC (3!) en ambas hebras. La formacién de extremos cohesivos es de gran interés aplicado en ingenieria genética (pg.207) fragmentos generados con una misma restrictasa a partir de dos DNAs distintos pueden interaccionar mediante ‘apareamiento de las bases de sus extremos cohesivos (tal interaccién no es posible entre extremos romos). ual se pueden asociar los fragmentos producidos por enzimas distintas que producen extremos compatibles. Debe resaltarse que el producto de la reasociacién de los dos fregmentos en ninguno de los casos es idéntcn DNA de partida, pues estd formado por dos moléculas. La falta de enlace covelente entre los extremos de ks fragmentos reasociados se indice con el nombre de “mella" o “muesca" (ick, pag. 156). Estas se pueden cera "solar por la acci6n de las enzimas ligasas (0 DNA ligasas), dando uma molécula tinea de doble hebra. Como se visto (pag, 156). las ligasas catalizan la formacién en cada hebra del enlace fosfoéster que faltaba, con consumo ‘energia. Pueden, incluso, unir 0 “igar” dos fragmentos de DNA con extremos romos, aunque con mucha menor ues no hay apareamiento entre ellos. La accién do las ligasas es, pues, contraria a la de las nucleasas (ormacién enlace fosfoester frente a su hidrdlisis), pero el mecanismo de la reaccién no es exactamente opuesto, porGLONACION CELULAR DE MOLECULAS DE DNA 203 requerimiento energético de la primera. Dobe resaltarse que la ligasa siempre requiere un grupo 5P para su actuacién, propedod que posee utlidad experimental (p89, 208) DNA DNA HC“C-T-C-G-RRWTAT=CAG-G-A“G=TR-GHOE YA T-A-COA-CHC~T-AG-C-G-C-C-A-A-T-T-C-6-OF PELUPL Atte Ft tit TG-GAG-C-TTAA-GHC-CTCATC-GC AAP-GHT-G-G-AOT-CAG-C-G-C-TT-AA-GHO-C-8 eaaima de mania de restricts ‘eslrceion oR ® Fook G-G-A-G-T-A-G-C-6 TTT & SERRE EGE Fg ACA CCT GHC~E-EHG CMT ee pet roe 6-0-6 EAA Ommmm® @ MTA cg aoe OMMMINe® Omume ce ron IIL: @nnn eee Sac aseeaa Om ® TIEDIUIDTENINNEETIETNTS ee Ser DNA combine 12 DNA rsombinate 162 CLONACION CELULAR DE MOLECULAS DE DNA El objetivo central de esta clonacién es la produccién de un gran numero de copias de una regién de DNA (ragmentas o genes) 0 de cDNA (formado a partir de un mRNA). Se trata, por tanto, de un proceso de clonacibn de tipo ‘lular (pues se consigue gracias al empleo de células, pag. 188) que, por contraposicién a la clonacién acetular por POR, in vitro, se puede considerar que se realiza in vivo (estrictamente hablando, en cultivo). Se basa esta clonacién, al igual que la PCR, en la tealizacion de multiples rondas de replicacién, pero en este caso catalizadas por la DNA poimerasa propia de la célula en la que se lleva a cabo el proceso, célula “anfitriona’. Para ello, el fragmento de DNA o {DNA 2 clonar (llamado inserto, por razones que se comprenderdin después) so une a otro DNA (vector de clonacién), ylamolécula de DNA recombinant formada se incorpora a la célula anfitriona donde tiene lugar la amplificacién por teplcacién, Una vez detectada la presencia del DNA de interés y seleccionados los clones que lo han amplificado, se alsa el gen o fragmento de DNA 0 cDNA, que se emplea con distintos fines, esenclelmente el estudio de caracteristicas Secuenciacién Estudio de la estructura de dcidos nue Estudio de homologia entre especies Identficacién de mutaciones: por ejemplo, asociadas a enfermedad peeiios Estudio del proceso de transcripcién y traduccién Estodio de su regulacin: secuencias de contol (por ejemplo, promotores) Amplificacion Para su identificacion Produccién de la_| Para su estudio (propiedades, funcién ...) proteinao RNA} Para aplicarla (produccién comercial): diagnéstico, {formas normales | terapéutica, nutricién, industria oalteradas) Expresion204 CLONACION CELULAR: TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE fisloas, secuencia, estructura, propiedades funclonales, expresién génica a protesnas, etc. (muchos de estos objets pueden ser aplicables también a la PCR o clonacién acelular). Por razones pedagégicas, a la vez que de enfoque experimental, puede describirse la clonacion en siete tapas: dos de preparacion de muestras, cuatro sucesivas de clonacién propiamente dicha y, segin los casos, una de expresién. En ocasiones, se afiade la amplficacion por PCR del DNA clonado (en este caso, el proceso comprendeit dos clonaciones sucesivas, celular la primera y acelular la segunda). Hoy dia, todas las etapas se realizan de fom rutinaria, a veces incluso automatizada, al disponerse de forma comercial de las enzimas, sustratos, vectores, ele, & strumentos adecuados para su realizacion. ‘Esquema general del procedimiento de clonacién: wey _ BE “cca ‘gen 0 fragmento Lerten gene can, juiere clonar: ‘pldsmido vinus ‘cualquier otra a Erie geste | fragmeato de DNA con una egién de contol de “Suess Tataprsiongenica sero asia) iter208 CLONACION CELULAR: TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE En la préctica, pueden ccurrir diversos tipos de asociacién entre fragmentos de restricién con extremat compatibles, todas ellas cetelizedas por la ligasa. En primer lugar, siempre puede darse la asociacién intramolecular, es decir, entre los dos extremos de una misma molécula (vector o inserto); sise trata de un vector circular, da lugarasu s ‘recircularizacion, Esta interaccion esté fevorecida cuando la concentracién de DNA es baja (pues la probabilidad de que ! dos moléculas se encuentren es menor). En segundo lugar, puede tener lugar una asociacion intermolecular, tanto ‘que conduce al rDNA (vectortinserto) como otras que conducen a productos no deseados: vector+vect, insertotinserto, unién de mas de dos moléculas, etc; todas ellas pueden ser circulares o lineales. Estas interacciones son mds probables para concentraciones elevadas de DNA. incerta _— (DNA deimertsquese quer om) VF a asociaciones del inserto asociaciones Inserto-vector asociaciones del vector intra. intermoleculares (intermoleculares) intra. intermoteculares "LN OOOOW ‘concatenacién del vector coneaencion el insoto ’ apyq —agodacones_rexruaniado buseado | § | productos secundatos no deseados iM Para evita I formacién de estos productos secundarios, que disminuye el rendimiento de la clonacién, se acudes estrategias experimentales, previas a la mezcla de vector e inserto, tales como la escisién con dos enzimas de restriccion diferentes (pig. 207), que evita la recircularizacion del vector 0, como se describe a continuacién, desfosforilacién del vector con fostatasa alcalina. Be Tos 4 puntos de posible wibn, incor gift i ee aN (Gaseram) vector sbieto . (Gaseram) in Sten) por la(s) POH sr ‘enzimas(s) de Nn esi 9 /Facana maa pen i Poa ¥ Seca Fon - a Toshio. Estas mela 5" s.on [eletina cs serén cenrades mis are 5°-fasfato impide la por los mecanismos de Se ireularizacion por la ligasa stpaacin de DNA dela ee eclul anions 16.2.4 Tipos de vectores Los vectores empleados para la clonacién de insertos de DNA son muy variados. Pueden clasificarse segin vate ctiterios, tales como: ‘= Su procodencia procaridtica o eucariti + Eltipo de molécula a partir de la que se preparan: ‘+ Plasmidos: bactorianos, de levadura o de plant ‘+ Virus: que infectan bacterias (bacteriéfagos 0 plemente fagos), plantas, invertobrados o vertebrados. ‘+ Cromosomas artificialos: derivados de elementos cromosémicos de fagos (PACS), de bacterias (BACs) od levaduras (YACs). + Quimeras, es decir, moléculas formadas combinando partes de otras cuyo origen es dir Normalmente, quimeras de plasmido y fago: césmidos, fagémidos, fésmidos. + Eltipo de célula anfitriona en le que el DNA recombinante resultante se puede luego incorporar (etapa 4). * Elgen de resistencia que contiene el vector para su posterior deteccién o seleccién (etapa 6). ‘ Eltamatio det DNA que admiten como inserto.CLONACION CELULAR DE MOLECULAS DE DNA 209 Tipo de vector Tamato det ‘Método de propagacion inserto que adimite Plasmidos normales ‘O40kb ___Replicacion aulénoma natural del plasmido ‘Bacteridfagos, por insercion (fag02) ‘O-10 kb Replicacion propia del ago Bacteridfagos, por sustitucién (fag0 4) 8-23 Kb Replicacion propia del fago (Gésmidos 30-44 Kb Replicacién a modo de plésmido Bacteriofago Pt 70-100 kb PAGS (cromosomas arificiales de P1) 130-1505 BACs (cromosomas artificales de bacteria) Hasta 300 Kb YAGs (cromosomas erificiales de levadura (02-1 Mb Debe, ademés, sefialarse que continuamente surgen nuevos tipos de vectores como consecuencia del avance en les técnicas de ingenieria genética y las necesidades impuestas por el desarrollo acelerado de los Proyectos Genoma, 16.2.4.1 Plasmidos ‘Son moléculas de DNA de doble hebra, de pequefio tamafo (2-5 kb) y forma circular, presentes en forma libre en 4 ctosol de muchas bacterias (de 1 2 3.000 plasmidos/célula) y de algunos eucariotas unicelulares (por ejemplo, el plésmido pt de levaduras 0 “circulo de 2um"). Son féciles de puriicar a partir del cultivo bacteriano. Permiten la incorporacién de insertos de DNA de un tamario maximo de unas 10 kb. Los plasmidos neturales contienen pocos genes propios, ninguno esencial para la viablided de la célula, por lo que pueden ser modificados sin afectarla, Para su replicacién auténoma (independiente de ta del cromosoma bacteriano, aunque utlizando las mismas enzimas), se requiere una secuencia origen de replicacién. En cada division celular, el cromosoma origina una sola copia por oélula hija, mientras que el plésmido (en su caso, el rDNA formado a partir de &l, etapa 3) sufre replicaciones miitiples y origina varias copias por célula (de 20 a 50). Los plasmidos son asi replicones (unidades de replicacién, pag, 150) que setransmiten y mantienen de manera estable como circulos extracromosémicos. El empleo de un plésmido como vector de clonacion se favorece cuando incluye genes marcadores, cuya presencia pueda ser detectada 0 cuya expresién confiera a la célula anfitriona portadora del rDNA una serle de propiedades especiales (pg. 214). Por ello, se utlizan cominmente plésmidos artificiales o sintéticos, obtenidos a su vez portécnicas de DNA recombinante y disponibles comercialmente. Baste como ejemplo el plésmido pUC19, GAATIGpAGcTosaTACGEGGgGATCGTCTAGABTEGAGCTECAGECATEGARGCTY FORT Spey RMT Spy aA apy ST aa Se a Xmat - Ei polisonectrcontene danas Unies para [3 encima reset Su poscion dentro dl gen lacZ permite uti indcansmo de nacivacioh Inseretonl para a selecién ae 219) ue ~\ Sige ann shen {as diana del intror dl genanp fermion ‘umeross dianas par ezinas tambien de restecin permiten cota el uiizar ‘smi por dsintos puntos inctvacion Sein ls netesidades de tacrlén ‘msercional {fe muesran slo le de eninas ue cortan en un tnieo pun )210 CLONACION CELULAR: TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE 16.2.4.2 Bacteriéfagos Los vitus en general se replcan mediante la inoduccton de suv genome en eBlles procaiotas © eucoras (ifoccibn). Esta propiedad resulta dtl para conseguir una alta eficiencia de lonacién, empleando como voctores Wis tmodiicados. Cada tipo de virus infec a céluias especifica y, dependiondo del tamafo del genema virio, aie insertos mis 0 menos grandes, pero en general mayores que los que se pueden insertar en plésmidos. Asi. pare dot fon bacioras ee usan bacteriéfagos, baculovirus para células de inseco, y vius SV0 o retrovirus para cds ée ‘mamifer. La prlferacion de los virus recombinantes se consigue en un cuivo de las células anivionasrespoctvas, fas que ol vius se reproduce. El uso de virus es especialmente adecuado para la clonacion en céiulas de marnife,kt sv dlovada oftcacia de Introduccion del rDNA, pero dada su complejdad y por razones de extension no se tat eh ste toma Les virus mas cominmente empleados como vectores son los pardsitos bacterianos fags M13 y A. (lambda). £l tamafo él vector recombinente seve limitado por la necesidad de st empaquelamiento dent de la c&psida, Erste fe puede inroduct de la misma forma que para les vectors plasmic, es deck, cotandoinsrtoy ONA dal agoct Tas mismas enzimas de resticcion y ligando para obtener un rDNA; esto se denomina técnica de insercén,y xin veclores espocices para ell. Cuando el tamano del DNA de interés qua so quiere clonar es mayor, S© pale incorpotarelminando proviarente Ia pate del genoma virco que no se require paral infeccon y repicaclén; se hate tntonces de técnica de susticén o reemplazamiento, ‘Vectores de clonacién basados en el fago lambda DNA de interés (“Las vectors de NA de interes snaratnacmiton “Sloman ae imrcseel a eet, ps no post asuperienca “arc con ‘capsidas viricas tonic iter ‘Al eliinarse legion 06 ‘esencal fos vectores de susttucidn‘admiten inserts de mayor tm sin superar el Hite ‘ara que puedan empaquetarse Tentesson 6 16.2.4.3 Césmidos ‘Son vectores sintéticos, quimeras que combinan caracteristicas de plasmidos y fagos para combinar las ventas ‘de ambos tipas de vactores. El fragmento plasmidico proporciona las caracteristicas de tamafio pequetio (6-7 kt), circularidad, un origen de replicacion, un numero de sitios de restticcion donde se va a insertar el DNA, uno o mis marcadores soleccionables y la propagacién en bacterias como si fuesen plasmidos. Del fago 2 se toman la secuencias cos" (del inglés cohesive sites), que proporcionan al cosmido la capacidad, propia del DNA del fago, de et ‘empaquetado en capsidas viricas in vitro, ‘Los césmides son utiles para clonar inserios de gran tamatio (hasta 45 kb), especialmente en la preparacién de \brerias genémicas de organismos superiores, ya que disminuyen en gran medida el ndmero de clones necesarios pate que tado el genoma esté representado en la genoteca (pag. 216). Los métodos de introduccién del rDNA cosmicen {etapa 4) dependen del tamafio del inserto. Si éste es pequeto, se puede introducir por transformacién (las células se hacen competontes para incorporario en forma de plésmido recombinante, pag. 211). Si el tamafo es reletivemente grande, la ransformacion se complica y debe acudirse al empaquetamiento previo en forma de fagos, aprovechando kt cempaquetamiento det ius, dependiente de as socuencion eas ‘secuencias cos.Beate” — ntajas 7 kb), > mas: an las do ser ion do 3s para igico vas Se smente ndo as CLONAGION CELULAR DE MOLECULAS DE DNA 2m 16.2.4.4 Cromosomas artificiales Este tipo de vectores se han disefiado en especial para adaptarse al gran tamafio de insertos requeridos en el c2sa del genoma humano y de otras mamiferos, y para la clonacién en células eucariotas. a) Cromosomas artificiales bacterianos ‘Se les llama cominmente BACs (bacterial artificial chromosomes). Se trata de vectores sintéticos derivados de! plésmido F 0 el fago P1. Se caracterizan, en primer lugar, por aceptar grandes insertos de DNA, entre 100 y 300 kb. En ‘comparacion con otras tipos de vectores, los BACs contienen genes que reducen su capacidad de copia, es decir, de raplcacién en la célula anfiriona del rDNA formado (etapa 4). Como resullado, se consigue mayor estabilidad de los ingertos de DNA de origen eucaritico, que en césmidos sufren con frecuencia reordenamientos internos. Gracias 2 ‘esias dos caracteristicas, los BACs son vectores adecuados para la elaboracion de genotecas eucaridticas (pag. 215). ») Cromosomas artificiales de levadura Los VACs (yeast artificial chromosomes) son vectores sintéticos que contienen las tres regiones relacionadas con la uncionalidad de un cromosoma (pag. 92): secuencias constituyentes de un centrémero, de dos telémeros y de un «rigen de replicacién, Ademés, incorporan en general genes marcadores seleccionables (etapa 6) y un sitio de clonado milipl (etapa 2) en el que admiten un inserto de gran tamafio, que puede alcanzar 1 Mb, lo que constituye una carecteristica fundamental. En ocasiones, este tipo de vectores se denominan ARS/CENITEL, por los 3 tipos de seauencias que contienen. La secuencia centromérica permite la segregacién correcta de lasa copias hijas del cromasoma durante la division de la célula (pag. 92), mientras que los telOmeros establizan, como ya se ha estudiado, los cromosomas 2 lo largo de sucesivas divisiones (pag. 157). El origen de replicacion o secuencia de replicacién auiénoma (ARS, autonomously replicating sequence) permite Ia formacién de copias del cromosoma artificial de forma Independiente a la del gonoma propio de Ia célula anfitriona. Los YACs se utlizan en particular para preparar genotecas ée genomas muy grandes, o para mantener un gen completo en un tinico clon, 16.2.5 Incorporacién del DNA recombinante a la célula anfitriona La replicacion de las moléculas de DNA (clonacién) requlere que éstas se introduzcan en una célula anfitriona (receptora u hospedadora, incorrectamente llamada oélula huésped). Para que esta incorporacién, que en general tiene lugar por mecanismos poco conocidos, sea eficaz es preciso emplear oéivlas especializadas (con un genotipo seleccionado), adecuadas al vector de clonacién utiizado y con capacidad de division, 16.2.5.1 Tipos de célula anfitriona Con frecuencia, las células anfitionas son procariéticas. principalmente cepas de E. coli, por ser faciles de cbtener, manipular, multiplicar, y conocerse su genética. Al proceso de introduccién del fDNA plasmidico se le denomina transformacién (pag. 212). La(s) mokécula(s) de rDNA plasmidico incorporades se replican luego varias veces dentro ela célula, de acuerdo con las propiedades de los plésmidos. El inserto de DNA puede permanecer unido al plésmido {ois frecuente) 0 recombinarse con el DNA del cromosoma. Si se integra en el vector més de un tipo de DNA, por ‘empio, dos genes o un gen y un regulador de le transcripcion, el proceso de incorporacion a la céula anfiviona del IDNA se lama cotransformacin. Las células anfitrionas eucariéticas son més cificiles de obtener y mantener, por lo que s6lo se uilizan con fines ‘speciices, fundamentalmente para el andlisis de la regulacion génica, la expresion de una proteina eucarética, etc. De nie elias, las més manejables en cultvo son las levaduras que, aunque mantienen algunas caractersticas similares a Frocerotas (células individueles, crecimiento répldo y econémico, manipulables, et.) tienen una organizacion celular Fropia de eucariotas y son de interés biotecnolégico por su capacitad de expresion y maduracion de proteinas, Entre las células animales que pueden establecerse en cultvo, se pueden citar las células HeLa de carcinoma «ridérmico humano, los fbrobastes NIH de ratén y BHK de rion de hamster, los ovoclios de ratén, ete. En general, uoden dividitse multitud de veces conservendo los mismos caracteres, por lo que su rendimiento de clonacion es dtevado, 16.2.5.2 Métodos de introduccién del rDNA Puesto que normalmente a membrana plasmatica muestra una permeabilidad selectiva y no admite grandes fregnenios de rDNA, se acude a diversos métodos para faciltar su captacién por alteracién transitoria de la permesbilidad celular (métodos pasves) o introducir el rDNA directamente (métodos activos). En muchos casos, los mecanismos son poco conacidas y los métodos resultan mas o menos eficaces dependiendo del tipo de vector y de télula, El proceso suele denominarse transformacisn © transfeccién, aunque estriciamente el primer término caresponde a la introduccion en bacterias anfirionas y el segundo al empleo de virus como vectores. Los métodos uilizados pueden dividirse también en fisicas y quimicos. + El tratamiento més frecuente es de tipo fisico-quimico y se dice que la célula se hace competente. Se comienza ‘con una incubacién en presencia de CaClz a 0°C, seguida de un cambio brusco 2 37-43°C, que induce a las212 CLONACION CELULAI : TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE bacterias a aceptar moléculas de DNA. Se dispone de cepas establecidas especialmente susceptibies 2 ese proceso. + La inoorporacién pasiva de DNA se favorece cuando sus moléculas se han agregado 0 copreciptad pa interaccion con cationes, tipicamente fosfato célcico © DEAE-dextrano (dietilaminoati-dextrano, un pollme ppolicationico). ‘+ Otros agentes quimicos, en especial l poliatilengiicol (PEG), aumentan la permeabilidad de le membrana celle, ‘con fo que se incorpora mas fécilmente el rDNA, también de forma pasiva, ‘+ EIDNA se puede incorporar en liposomas, que luego con facidad se fusionan con la membrana colulary lbern ‘su contenido al interior (incluyendo el DNA que, en realidad, parece asociarse a la superficie exterior hiroflica el liposoma). + Un método con gran eficacia es el empleo de vectores de tipo virico, que por su via natural de infeccién inroducen cen Ia célula anfiiona su DNA, en este caso recombinante. Para este tipo de incorporacion se ha acutiado ‘ermino transfeccién. Detalles del procedimiento de clonado: incorporacién del rDNA (etapa 4) ®OO® DNAS esonnants foes ‘tassel ONA (ods vrs) af afore : incorparr © ‘ "aes See } feo ote j voiamcleats ist fon GebNA eo miss cua) conta, ieee dns. : Os ie, acteriaoclula fragmenta de ot © DNA recombinante oan Sasori nes incorporacim en liposomes (Pj por sonieacion de una ‘mevela del DNA con Tsfolipidos) oS HS * ee DNA en aes anaes” 2s bacteria wansformads ‘eélula transfectada v “Sinn ‘+ Aplicando descargas eléctricas en forma de pulsos breves de alto voltale se consigue la apertura de poms transitorios en la membrana, por los que puede pasar el rDNA. Este método de electroporacion es baste habitual para células eucaridticas, aunque de resultados muy variables. + Un métode curioso y de aplicacién creciente, la “biolistics", consiste en el bombardeo de las células anfivionas ‘con microesferas (de tungsteno u oro) recublertas con el ‘DNA. Se emplean dispositivos adecuados (‘pistols de ‘genes") que impulsan esos microproyectiles mediante un gas a presién, pudiendo aplicarse sobre suspensionesCLONAGION CELULAR DE MOLECULAS DE DNA 213 Celulares, células en cultivo 0 incluso in vivo (sobre la piel, hojas.... Algunos de los proyectlas Impactan y Penetran en las células, cuya membrana se resella répidamente, quedando el DNA incorporado en su interior. + En casos donde la eficiencia de suministro del rDNA debe ser maxima se acude la Inyeccién directa del DNA en la célula 0 en su nucleo, empleando micromanipuladores y agujas de vidrio (microjeringas o micropipetas, de punta extremadamente fina), bajo observacion al microscopio. Obviamente, el inconveniente es el escaso niimero de células que se pueden tratar por este método manual, por lo que generalmente se uliiza sdlo sobre oocitos y cigotos. Dado su cardcter directo, se puede incluso prescindir del vector y suministrar el fragmento de DNA deseado sin modifica. ‘Agente promotor de la incorporacién Nombre especifico del métode Cardcter Ca (generaimente como fosfaio) _transformacin, células competentos _quimico __paslvo_ DEAE-dextrano ‘quimico paso PEG (polietilenglicol) ico __pasivo. liposomas Tipofeccion fisioo _pasivo vectores virales: iransfecci6n fisico activo descargas eléctricas electroporacién fisico activo ‘microproyectiles biclistica fisico yeccién directa con micropipetas microinyeccion fisico 16.2.6 Propagacién en cultivo La divisi6n de las células anfiionas en cultivo producirs, junto con la replicacion de su propio genoma, la fomacion de copias del rDNA que haya podido incorporar y, por tanto, la clonacién propiamente dicha. En la practica, s@ suele hacer una primera siembra celular sobre una placa de agar para que crezcan las colonias (cada colonia proviene de una célula, son clones) y una resiembra posterior de las colonias en medio liquide, que forma poblaciones ‘an mOtiples copias de cada célula original (clones celulares). Dependiendo de las propiedades del vector, ol ‘DNA puede replicarse de forma répida e independiente del genoma de a célula anftiona. Detalles del procedimiento de clonado: propagacién celular (etapa 5) cutive: les bias protean s0 dvcony, cada una do = © © SS — SS Simuiténeamente con esta etapa de propagacién suele tener lugar la seleccién de clones recombinantes y la epresién opcional del gen clonado. 16.2.7 Deteccion y seleccién de los clones recombinantes Dade el gran némero de células empleadas en la clonacién, y fa diversidad de productos que pueden originarse en proceso de creacién del DNA recombinant, es esencial poder diferenciar qué células (0 colonias a las que han dado lugar en cutivo) han incorporado realmente el DNA recombinante deseado. Esta deteccién se puede combinar con una saleccién, es decir, conseguir que solo las células adecuadas sobrevivan en el cultivo. Esto faciita mucho la tarea de pronegecién celular, reduciendo ol numero de clones que se deen seguir cultivando. Dependiando del método ulleado, es posible distinguir células que han incorporado el vector (recombinante o no), que han incorporado rDNA 0 incluso que han incorporado el DNA con el inserto dispuesto correctamente. ‘Se pueden considerar tres tipos de métodos de deteccién: + Métodos de hibridacién: deteccién de una secuencia del DNA clonado, o de! mRNA transetito a parti de él, por hibidacién con una sonda marcada, + Métodos inmunoquimicos: deteccién de la proteina codificada por el gen clonado, mediante un anticuerpo ‘especifcn,214 CLONACION CELULAR: TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE ‘+ Métodos genéticos o de seleccién fenotipica: en clerlos casos, la expresién del propio inserto produce cambios apreciables en la célula anfitriona, que sirven para reflejar su clonacion con éxito. Sin embargo, la estrategia mis ‘comiin es la deteccién y seleccion basadas en la presencia de genes marcadores en el vector '* Genes que codifican una proteina detectable, cominmente una enzima para la que se dispone de un ensayo. Por ejemplo, la B-galactosidasa (gen lacZ de E. col) transforma el sustrato sintético X-gal (bron: 4-cloro-3-indoli-#-0-galaclopiranésido) en un producto de color azul. '¢ Genes de resistencia a un antiblético, que codifican una proteina que permite el crecimiento de la céhla anfona en presencia de un determinado antibiético. Por ejemplo, el gen amp codifica una f-actamast capaz de degradar la ampicilina, una penicilina semisintética. El gen de resistencia a tetracicina (24) ‘codifica una proteina de membrana que acta como una bomba, extrayendo este antibidtico de la célla. ‘+ Genes que complementan defectos nutricionales. En este caso, se emplean cepas mutantes de ta cél ~anfitiona, que no pueden erecer en ausencia de un nutriente. Por ejemplo, clonando en levaduras con ut defecto metabélico en la ruta de biosintesis de triptofano, se emplea un vector que contiene el gen TRPI ‘correcto, con lo que sélo las células transformadas orecen sin Trp en el medio. Los planteamientos experimentales son muy diversos y generaimente combinan varios de estos marcadores. Px razones didacticas, se recogen unos ejemplos que ilustran el uso de varios genes marcadores, aunque no se ajustona la prdctica del laboratorio, Un concepto importante a este respecto es el de inactivacién insercionat. {a inclusion den policonector o sitio de clonado multiple (pags. 207, 208) en el interior de un gen marcador hace que la accion de éstese ‘9jerza solo en las células que han incorporado vector sin inserto. Detalles del procedimiento de clonacién: deteccién y seleccién de clones recombinantes (ctapa 6) Ejemplo de un vector para clonacién: rm faze de DNA con el ‘contiene el inserto de DNA (gen de "For gen ics re lar interés), una regin de control y un gen auxiliar (gen marcador o gen de - ore f resistencia a antibidticos) (promotores de transcripcién) ke ee « aneree —_\ S salir) Ia regién de control favorece Testrccién y ligamiento _y permite regular la expresion isi gecomnoes Deteccidn de clones: Scleoisn de clones Detecin de clones nor el gen A seria un gen ‘(lambign sieve como deiccciée) —_inactivaci6n insercional: el gen A marador, coca una eligen A seriaungen de sera un gen mareador, codifia ura proteina que se puede detectar resistencia a antibidtico proteina que se puede detectar. teen mone ad eres Ce. > een Ea (eda cone Aincabacon eta ot ‘strato Xp) stato Xa) fanedllas solacias no 1 econ colores tas celts quchan colonia 2 ofr clooes earl chansque —@MEODHEM, inerprado el veetor colores: clones ge ‘ocnohen Ranincorpondocl — @ESNPOAMO GL sohyeviveny seimakilican oan fcerpondo cl incorporado el vector "Yector estormeren “MCT oclonss very eee go un icoeprad DNA, recommenGENOTECAS. 215 16.2.8 Expresién génica En algunos casos se pretende no sel la amplificacion del DNA clonado, sino su expresién, bien para estudiar este proceso o para investigar el producto (RNA o proteina). Logicamente, el DNA clonado seré en estos casos un gen, y por flo con frecuencia se trataré de un cDNA. Para conseguir esta expresién se emplean vectores de expresién, especializados, distintos de los vectores de clonacién por presentar caracteristicas que favorecen la transcripcién del ‘gen una vez incorporado a la célula anfitiona. Tipicamente, un vector de expresi6n incluye (o se dabe insertar en él ala vez que el gen, pag. 205) un promotor, region reguladora de la transcripcion (pag. 24). Es frecuente emplear promotares inducibles, ajenos al organismo del que procede el gen clonado pero que se activan bajo condiciones ‘xperimentales controlables, como la adicién de un nutriente u otro tipo de compuesto, disparando entonces la ‘tansctipcion del gen clonado. 163 GENOTECAS Se lama genéricamente genoteca o biblioteca de DNA a una coleccién de clones formados a partir de todos los. ‘tegmentos de DNA obtenidos previamente por escisién del genoma de una especie o de un tejido. En el caso de la donacion celular, cada uno de estos fragmentos se presenta inlogrado, bajo la forma de rDNA, en un vector incorporado ‘en uno de los clones celulares que componen la genoteca. En la cionacién acelular se presentan como fragmentos individuales indepencientes, Dependiendo de si las muestras de partida para la clonacién son fragmentos del DNA genémico 0 moléculas de ‘MRNA (pig. 205), se distingue entre genotecas genémicas y genotecas de cDNA. Es importante indicar que la informacion proporcionada por ambas genotecas no es Idéntica, pues s6lo las primeras incluyen tanto las regiones ndificantes como las no codificantes; ademas, las genotecas de cDNA son diferentes segtin el teido particular del que s& han preparado, pues sélo contienen las regiones codificantes que se exprasan en 880 tejido, tipo celular, etapa del éesarrallo 0 diferenciacién, entorno bioquimico... De acuerdo con ello, se utiizan alternativamente distintas genotecas camo punto de partida para la clonacion, secuenciacién, etc. del DNA. (GENOTECAS GENOMICAS, GENOTECAS DE cDNA —————r —e En humanos: 3.3 - 10° pb los genes que estan siendo expresados) ee nani. SEE em 20 kpb cada uno por término medio) OOOO0CO OCOQO00O0 Tcorporacibn in endo anfirionss cen edule anfitionas prenancion propagaciéa, Una vez preparada una genoteca, ésta se convierte en ol punto de partida para la busqueda de cualquier region 4e1DNA 0 de genes y su estudio mediante clonacién adicional (que recibe el nombre de subclonacién), secuenciacién, ‘expresion, ete. Con respecto al uso de las genotecas como fuente para otros estudios, el problema genérico que s° Hiantea es la localizacién en la genoteca del clon que contlene el DNA buscado. Para ello se acude a los distintos métodos de deteccisn y seleccién, previamente comentados al describrla clonacién de un solo fragmento (pag. 213).216 CLONAGION CELULAR: TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE 16.3.1 Genotecas genémicas El concepto cldsico de genoteca corresponde en realidad estictamente al de genoteca genomica, representaa del genoma completo. El namero de clones componentes debe ser, en la practica, suficiente para abarcar todo el ‘genoma, incluyendo tanto el DNA codificante como el no cedificante. La preparacién del DNA de partida se realza pa fscision del genoma con enzimas de restrccién bajo condiciones de rotura parcial, es decir, que no permit a ‘2ctuaciin exhaustiva de le enzima sobre todos los sitios de resricién presentes en el ONA. La rotura se produce et ada moléculaaleatoriamente sobre el conjunto de sitios de resticcién, de forma que aparecen un numero menorde {ragmentas,yéstos son de mayor amato,respecto ao tedricamente posible, diferentes de una a otra molécua, ‘Genoma completo sachas dianas de eestrceiba Moticuasde X X XX K XX ‘Ajustando las condiciones se DNA idéntiegs bt! 2 consigue que de los sitios de (camo gjempio| restiecion disponibles enel DNA, ‘simplified, solo seescinda una minora cua eon diana) (el 5 cae pb ba ‘Como cosecuencia dela Aetoieda en fos patos “ve resltan conados se secan der raion ‘Mod as rotons dt seroma a lonactin decade Tag (como DNA recombinants) €@eeeees colecciin de fragmentos en forma de clones: biblioteca genémiea A partir del tamafo del genoma completo y el tamafio medio de los insertos se puede calcular el minima nner de clones necesario para que la genoteca represente al genoma completo, Sin embargo, el cardicter aleatotio dels proparacion de fragmentos y del proceso de clonacién hacen que, para tener certeza de que una genoteca content ‘cualquier region del genoma, se requiera en la préctica un nimero de clones muy superior al teérico, Este nimero de postildad ‘Fposiiiga_[ Posblidndes dec = = ears ‘nels fos Testo de ta _melosis | y toda Ta meiosis TT — ‘maxima conden —— es A pimeton ___ A panisios o—> > oa CMT: oa CO senaipo: AB, CA By Cy ABC) LBL G ABC ALB Co oan eo eames oc oo semtpe: Ar Ba Cp Aa By Gy ABC A2BG A2Br Gp AaB Cy eae [La mitad de tos gametos (6) conservan un eromosoma original, no recombinant (genotipo igual al de uo de los aires}, mientras que ls oitos 6 Tlevan un eromoxoma recombinant (genotipo nuevo) AB se haw segregado; Ay Bse han coheredado; A yB se han coheredado; By C se han coheredado; By Cse han segregado; By C se han segregado; ‘Ay Cse han sepregado Ay Cse han segregado AYC se han segregado220 GENOMICA. OBTENCION DE LOS MAPAS GENETICO Y FISICO DEL GENO} Conclusiones de interés, relacionadas con la construccién de mapas genéticos: 8) Si dos loci estin muy proximos en cl cromosoma (por ¢)..A y B): Es dificil que se produzce recombinacién en una posicién intermedia entre ambos; por tanto, hay baja frecuencia de recombinacién (2 de wn total de 12 gametos = 16,7%). Con alta probabilidad, los dos alelos quedan en un tismo cromosoma y cromatida: se coheredan, Los aleios que se coheredan con frecuencia maxima (es decir, que casi nunca se segregan) se dice que estén ligados. Logicamente, los loci de cromosomas diferentes nunca estén ligados,o tienen un ligamiento génico nulo. ‘Al conjunto de alelos localizados en una regién pequetia del cromosoma se le denomina haptotipo. Se cearacteriza porque sus alelos se transmiten conjuntamente (son alelos ligados). ') A mayor scparacién entre os foci en el cromosoma (por e., B y C 0, mis ain, A y C): Exist mayor probabiidd de ecombinacin en posiciones intermedia po ato, hay ‘mayor frecuencia de recombinacion. (para B y C: 4 de 12 = 33,4%; para A y C: 6 de 12 = 50%). Al suftir la recombinacién, los dos alelos quedan en distinto cromosoma, por io que hay ‘menor probabilidad de que se hereden juntos. ‘Nota: la terminologia es aiin ms variada de Ia que se ha empleado aqut; por ejemplo, una alta frecuencia ‘de rocombinacién es sinénimo de herencia conjunta infrecuente, coherencia infrecuente, seareyacién de alelos frecuente y cosegregacién infrecuente. Esto puede dificultar, a veces, la comprensin del significado de “frecuencia de recombinacién”. 17.2.2 Obtencién del mapa genético Una vez conccidas las posiciones relativas de un nimero elevado de marcadores genétcos, se puede este {tecuencia de recombinacién con respecio a ellos de cualquier nuevo gen o secuencia y ast situar su locus en el defnido por aquélos. De esa forma, se dice que se ha ‘mepeado” su posicion en el cromosoma, Una ver localiza nuevo gen o secuerca pasa a engrosar el conjunto de marcadores que forman el mapa. Laescala en las mapas genéticos se mide en unidades centimorgan (cM). 1 eM corresponde, por defen a sistancia que separa dos loci que experimentan recombinacién en ol 1% de las melosis. Empricamente, en el ge humano esta distancia corresponde aproximadamente a 10° pb {1 Mb). A partir de la frecuencia de recombinaciin dedcen las distancia relaivas entre varios loci y se puede establecer su ordenacién en el cromosoma, comenza asi un mapa genético: (Como ejemplo muy simple, al estudiar tres loci cualesquiera, X,Y y Z> Frecuencia de recombinacin observada Distancia entre los loci: para cada parcjo de loci x Y Zz x ¥ Zz x [oa 20% 10% x 1. 200M 10eM vf ame ame {fy | aoa os aoe 7 Z| 10M 30cM te Vv Z| 10% Se concluye que el locus 'X debe estar entre los loci ¥ y Z, 0 10 que es lo ‘isto, los loci estin en clordenZ-X-Y (0 viceversa, Y= X-Z) Experimentalmente, los mapas ganéticos requieren estudios familiares con arboles genealégicos, en los ue examina, para alguno de los marcadores, la combinacién de alelos que va slendo heredada. Estos se analizan en distinos inividuos a lo largo de varias generaciones; en humanos normalmente se parte de muestras de cil sanguineas nucleadas. La presencia de una u otra forma alélica se detecta por los procedimientos, variados, permitan dstinguiras: bien através de su influencia sobre el fenatipo (caracteres observables, aparicion de e etc) 0 bien mediante técnicas moleculares de deteccién de secuencias (hibridacién in situ por fuorescencie, mio Southern o amplicacién por PCR). A partir de la informacion de la herencia de alelos se calculan las frecuencasse _ 28 ue i, do de MAPAS FisICoS 221 recombinacién entre ésios. Con este planteamiento se han podido determinar, entre otros, los mapas genéticos de plantas, levadura, Drosophila y ratén, En humanos es dificil determinar mediante estudios familiares las frecuenclas de recombinacién de loci génicos. Esio se debe, por un lado, a Ia escasez de casos en los que se transmiten simulténeamente dos alelos representativos, por ejemplo aquéllos causantes de dos enfermedades. Por otra parte, la baja tasa de reproduccién del ser humano Gficuta el calculo fiable de dicha frecuencia. Para superar esta limitacién, en la practica se acude a marcadores polimérficos, es decir, aquéllos que presentan en la poblacién un elevado numero de alelos (formas alternativas), con lo cual son muy frecuentes los individuos heterocigéticos y la recombinacion se podré detectar en un ato porcentaje de la descendencia (tecuérdese que Ia recombinacion de loci homocigéticos no se puede apreciar). Los marcadores polimérficos son en general no génicos, no relacionados con enfermedades o con genes, sino simplemente secuencias de DNA detectables en una posicién lla del cromosoma. Entre ellos destacan los basades en el DNA mini- y Iicrosatelite que presentan polimortismo en el nimero de repeticiones (VNTR, pag. 383). E| ndmero de marcadores palimérficos, especialmente los microsatélites, ha crecido de forma exponencial a lo largo de los afios, de modo que ‘adualmente se dispone de un mapa pera cada cromosoma con la ubicacién de un elevado ndmero de marcadores, La utlidad del mapa genético se ilustra, por elemplo, con la posibilidad de localizer el gen responsable de una enfermedad hereditaria, aun sin conocer la identidad de dicho gen ni fa base molecular de la enfermedad. Para ello, se busca, entre todos les que componen el mapa, un alelo de un marcador que esté presente en los individuos afectados et0 no en los sanes, lo que indica que el locus de tal marcador esta ligado al del gen buscado. Por consiguiente, el gen {debe estar muy préximo a la posicién conocida del marcador en el mapa. Esta posiblidad de ubicacion de genes se potencia si se elabora el mapa con marcadores dispuestos a lo largo de todo el genoma: se asegura asi, por puro azar, {ue siempre exista algin marcador suficientemente proximo al gen como para que ambos estén ligados, De esta forma ‘2 ha podido encontrar, por ejemplo, la localizacién cromosémica de los genes responsables de la fibrosis quislica, la anemia falcorme, a enfermedad de Tay-Sachs, el sindrome X-fégily a distrofia mioténica, varios marcadores nico (psisin conoid nel map gnc) cromesons $$} 1 ‘gen buscado, causante (uficientemente proximos como para de la patologia ‘que estén figados, experimenten (posicién desconocida) ‘frecuencia de recombinacién ula. o muy pequefia 17.3 MAPAS FISICOS Como se ha indicado, estos mapas miden directamente distancias fisicas (es decir, en pares de bases) entre ‘genes u otras regiones del DNA en el genoma. Las estrategias metodolégicas son muy diversas y conducen a distintas vafantes de mapas y niveles de resolucién. Dependiondo de la escale 0 nivel de resolucién, conocida como “unidad cartogréfica 0 de mapa’, se distinguen tres estrategias: baja resolucién (varias Mb), alta resolucién (hasta 10° bases) y mméxima resolucién (secuencia nudleotidica). En este capitulo se describen nicamente las dos primeros niveles, ‘ejando la secuenciacién del DNA para el tema siguiente. 17.3.1 Obtencién de mapas fisicos a baja resolucién Este nivel de mapeo corresponde a la asignacion de cada marcador a un cromosoma o regién cromosémica. Se utlzan cistintos planteamientos que ademas implican muestras diferentes, segiin se describe a continuacién. En ‘general, el marcador se detecta empleando sondas 0 cebadores de PCR, ambos especificos para su secuencia: en el ‘as0.de un marcador génico, puede acudirse también a le deteccién de su producto funcional (proteina o RNA). 17.3.1.1 Métodos basados en empleo de lineas celulares somaticas hibridas Consisten en Ja bisqueda del marcador (génico 0 no) en lineas celulares hibridas, preparades de tal forma que catienen material genético de dos arigenes diferentes: el genoma completo de un roedor (aunque con una mutacién tH, expicada mas adelante) y una parte del genoma humano, que puede ser varios cromosomas, uno solo o un fragmento de cromosoma. Disponiendo de una coleccién (0 panel) de tales clones celulares hibrides, cada uno con pates distintas del genoma humano, se puede ensayar la presencia en todos ellos del marcador y asi ubicar en qué ‘gamesama 0 parte del mismo se encuentra. Repitindo el proceso para distintos marcadres se llega @ construir un mapa fisic.222 GENOMICA. OBTENCION DE LOS MAPAS GENETICO Y FISICO DEL GENOMA TECNICA DE MAPEO MEDIANTE HIBRIDOS DE CELULAS SOMATICAS. politilengicl {nes posiilidades de fusion: a6 (EG) 2nd 48D 9 Tinfobsticos,lincasccllares fetal, ete.) (Cétas de roedor (normalmente, raton hamster) en cultivo Fusign de cbtas de 20 ia misma especie ‘aon i Ghomocariontes) Tas edlulas se euhivan repatidas en pocillos y © D)sityen pegesivamente ata que cata pio ‘quede un minimo ndmero de ellas, De este modo, caltivo en un medio que solo ‘el ereeimiento do Ins elulas bids al final se consigue que cada pocilio contenga una (ps), medio HAT, inca coe one etibatipnenn ichsi face ema Gy En la primera mitosis las dos membranas rnuclares se disgregany en coda céula @o ‘omesomas se apap ya enum nice mica ‘in embargo, las Glues hibrdas son iostabes yen BS ‘sueesivas mitosis van petiendo la mayorta de los ‘eromogomas hurancs, con lo que el clon presente en cada Docilloretiene alealariamente uno solo © unos pocos 4 shone procedentes ada uno deta cla Ws din ends uno sonscrvscromoworas Sits) COVE) Se dctermine dl carotpo para averiguar qué cromosomas humanos esti presenesen cada ‘lon (se dstinguen de los dl roedor por su tamaoy patron de bandeado). “También pueden foalizars los cromasomas humanos mediante agin mareado, por _jemplo una sonds pars la secuencia Al, que se distribuye uniformemente por todo “genoa humane pero ests ausente en el de rato, ‘Coeccién o pane? de clones decéuas bids qe ban retenido solo nos pocos reosmes aos A pai de ada tno ae pusden extablecsrposteriormente Tincas cellars estab en cultio 2) nel caso de algunos gens, por andisis de Ta funei6n de sus proiutos proteicos (pe. ‘aetvidad envimstica). >) En gonera, mediante técnica de hibidacibn (in stu Southers) con sondas especifcas {stse canoce le secuencia del marcador) 0 con el propio marcador come sonda (si nose onoce su Secuencia), o por PCR con cebadores esecificos para el marcador. esl 00 “paride los resultados (positives y negatives) de cada clon on la detocion y Tos datos portados por la determinaciGn dal earotpo, se deduce en Gué eromosoma human 8© encuentra el marcador (gen oregibn de DNA de ites).MAPAS FISICOS: Tempe iene aac aa eal po so jnesisensromasomss | | aetemiacén| somone? | a0 tee vous Per etter | acento = a capes ee | | eel eer ta cee qectincens | aauet aes 5 an Jos cromosomas 1-5 enodecromosoms] no momo. ‘resultado de la deteecién sobre cada clon (actividad = of + - enzimatica, hibridacién, etc.) (Cana la megién de DNA que se esté detectando (gen 0 DNA de interés) debe estar en el cromosoma 4 Seleccién de las eélulas hibridas Un aspecto sumamente importante para el mapeo mediante células somaticas hibridas (que también se emplea en la preparacién de anticuerpos monoclonales) es la capacidad de seleccionar los hibridos, es decir, que en cultivo sélo sobrevivan estas células. El sistema de seleccién mas utilizado hace uso del ‘medio HAT, asi \lamado por contener Hipoxantina (una base nitrogenada, 6-oxopurina), Aminopterina (un agente antifélico) y Timidina (un nucleésido), Fundamento metabélico del uso de medio HAT. Su misién es bloquear Ia principal ruta de sintesis de muclestidas, la denominada via de novo, al tiempo que favorece la ruta alternativa, via de recuperacién, VIAS DE SINTESIS DE NOVO DE NUCLEOTIDOS S-fosforibosl-|-profesfato (PRPP) ‘El medio HAT aporta aminopterina, anilogo del FH, que bloguca su reactivacin y asl indirectamente, la sintesis de 20vo (etapas sefiladas i) “También se utiliza en su lugar smnctopterina (metotrexato), ambos se Haman agentes antfilices. S-fosforibosi-1-amina ribonuclestido de formlicinamidina (GAM) oe (sep) a x0 otal e Bun (CMP) <$—<—' naeee adenilato (AMP) (0(@TMP) ats vn tholen eo oe Li) pet 3 guanine ipoxantina adenina Elna BAT Reed 7 Perr Comatitretotany 4S porta timidina, to create [gue refer late OTIS |e recuperacon de midis (eaccién >) Bl medio HAT apo hipoxan E ruta de recuperacion de purinas (feacciones >) VIAS DE RECUPERACION DE BASES PARA OBTENER NUCLEOTIDOS °Y REACCIONES DE DEGRADACION DE LOS NUCLEOTIDOS, QUE APOYAN LAS VIAS DE RECUPERACION Enzimas clave en las vias de recuperacién HGPRT = bipoxantina/guenina fosforibosiicansfersa APT ~ adenina fosforribositransferasa 223224 GENOMICA. OBTENGION DE LOS MAPAS GENETICO Y FISICO DEL GENOMA ‘Consecuencias del cultivo de las eélulas en medio HAT. Para que el medio HAT sea cficaz se requiere Ia fusién de células humanas se realice con lineas de roedor mutantes, deficientes en la actividad enzimitiea HGPRT, esencial para la via de recuperacion. Las células de roedor dependen, pues, dc la via de nove, que no es usada habitualmente por las células rnormales. De esta forma, en el hibrido se complementa la capacidad de proliferacién propia de la célula de roedor con la capacidad de crecimiento en medio HAT aportada por la presencia de material genético Ihumano (que sf posee el gen de la enzima HGPRT normal). ‘Dilizacian dela rates metaboleas y, como consecuencia, crecimiento en cai Tipo de lula ‘en medio normal ‘en medio HAT ‘Célula bumanaode | Vie de novo—> f no, bloqueada por A reedornormeles | Via de recuperacién -] si si, favorecida por Hy T @ no no (caracterstica del tipo celular) || (caracterstca del tipo cella) [No prolifera bien en culkivo, Posce actividad HGPRT. Lines cellar de edor | Vin do novo > a to, nude pore ‘especial para fusion | Via de recuperaciin >| no, por falta de HGPRT ‘no, por falta de HGPRT © “ - carci Bl po cha «faa decks Prolifera ficilmente en ‘ “re a a eskv. Matane HOPRT- RR hae enact “seins ‘la ria estane | Vin nwo > a vo: Bogue por scutes ‘Via de rocuperacién >} si sf, favorecida por Hy. Sagi ern © © ‘de rocdor y Ia actividad envimatica HGPRT dela ‘humana Conch E] medio normal no icias al medio HAT: aclaeaes permite la seleecién _-seleccionan las células hibrd La praparacién de hibridos a partir de células somaticas humanas sélo permite identificar el cromosoma en el a festa situado el ONA de interés, Se puede alcanzar mayor resolucién de mapeo empleando hibridos similares reparedos con una porcién menor del genoma humano: hibridos monocromosémicos, conteniendo un sl ‘cromosoma, @ hibridos subcromosémicos, con un fragmento de cromosoma. Con estos timos se construye lo ques denomina "mapa de asignacion regional", es decir, la localizacion de cada marcador en una regién delerminada de u cromosoma. 17.3.1.2 Obtencién de mapas mediante ensayos de hibridacién con sondas fluorescentes La ubicacién de marcadores para formar un mapa fisico de baja resolucién puede también conseguirse realzens ‘ensayos de hibridacién con sondas que contengan la propia secuencia del marcador. Esla técnica ha adquiido gan aplicabilidad en el mapeo gracias a las sondas fluorescentes (hibridacién in situ por fluorescencia o FISH, 9g. 172. La sonda se marca con un fluorocromo, bien de forma directa o a través de un grupo “indicador” (reporter, por ejempi, biotina 0 digoxigenina, pag. 185). Para identiicar el cromosoma o la regién del mismo donde hibrida la sonda se pueie ‘acudir a la observacion bajo ol microscopio de fluorescencia o a la citometria de flujo. a) Mapas por hibridacion in situ (FISH) cromosémica La hibridacién se raaliza sobre preparaciones para el microscopio de cromosomas metafésicos, previamenle ‘desnaturalizados. La identidad de los cromosomas se revela por las técnicas habituales de establecimiento del cavolgn (forma, tamafio y bandas bajo tincién). EI DNA diana (marcador) se manifiesta bajo el microscopio de fluorescends ‘como puntos luminosos dobles, debido a la hibridacién de la sonda con las dos crométidas. Se alcanza con esta tériza tn nivel de resolucion cromosomico 0 subcromosémico, y es posible localizar o mapear simultaneamente vatts ‘marcadores empleando varias sondas con fluorocromos distintos.MAPAS FisICOS 225 ‘Cromosoma metaiisien Gran empaquetamicnto(plegamsento) del DNA. se esac wna incl poe et tsa chin rande en la endena de DNA = pucdendistinguirmarcadores ave ‘xan pardos mid uss pas Mb ‘ues que Ts adsna de DNA ‘ecame el eromosoma ‘oxdenadamente de unex hr, el orden dc ls scales fhuorescents de wanassondas coineige con orden em genoa “elas socuoncns de ince Ta inerpetaion ex ieta ) Mapas por citometria de flujo La identiicacién del cromosoma en el que se encuentra cada marcador puede también realizarse sila sonda se tibida con muestras que contienen cada una un solo tipo de cromosoma. Estas pueden conseguirse aplicando la dsifcecion de células activada por Muorescencia (FACS, pag. 126), adaptada al mapeo del modo siguiente: Los romesomas se tralan con luorocromos que se intercalan entre las bases nitrogenadas aplladas del DNA; los de mayor longitud pueden incorporar mayor cantidad de ese agente intercalante, por lo que adquieren més fuorescencia. Esto permite diferenciar los cromosomas en la etapa de andlisis 0 caracterizacién, proporcionando lo que se ha llamado un cariograma de flujo, asi como separarios en la etapa de clasificacion y obtener muestres, cada una con un solo tipo de cromosoma. Finalmente, estos cromosomas separados pueden emplearse, por ejemplo, en hiridacién dot-biot con la sonda especitica para el marcador buscado. 17.3.2 Mapas fisicos de alta resolucién Estos métados, complementarios a los anteriores, permiten alcanzar una resolucién inferior a 1 Mb, incluso hasta llegar a unos pocos nucledtidos, lo que ya supone el nivel molecular de resolucién; de ahi que sean los métodos de ape fisico més importantes. Sirven de enlace entre los mapas fisicos anteriores y los de secuenciacion o mapas de Fesolucion total a escala de un nucleétido (tema 18). Se plantean principalmente dos tipos de abordaje: hibridacion y ‘enaimas de restriccion, 17.3.2. Mapa fisico por hibridacién in situ (FISH) de alta resolucion La baja resolucién asequible sobre cromosomas metafasicos se puede aumentar mediante la hibridaci omosomas menos compactados. ‘Cramaxoma infersico! Menor empaguetamiento Debio al plegamicno at sa de laeadena de DNA, et ‘onlen de ns stales| Auorescents de vate sondas puede no cutie ‘com el orden ene genoma de Tas secuancas de in Ja intrpetaién precisa in nds estaseo dolor resultados oben con ‘muchos eleos Tesolin avennedi una dstanols ‘equi enr nestles coresponde "tua sparacion media en l eadena ‘de DNA: so se pueden distingur smareadores qu estén separados mis ‘deuntsdecenas de kb, “Ate resolucn: una distancia pequcha ene Tas shales correspond ‘una separacton peguefa eae cadena de DNA; se pueden isting mareadores que exten ‘algunas Kb. “Alexa o cadena de DNA poco condensada y extend, Chorden dels stale rellja a posicign real de os smarcadores en el genom226 GENOMICA. OBTENCION DE LOS MAPAS GENETICO Y FISICO DEL GENOMA 17.3.2.2 Mapa fisico con enzimas de restriccién Antes de que se descubrieran las endonucleasas de restriccién y se extendiera su uso en el laboratorio de investigacién, se ullizaron otras nucleasas para secuenciar RNAs, siguiendo el mismo enfoque ultlizado proviamente para secuenciar polipéptidos, es decir, la fragmentacion de la molécula por puntos de caracteristicas conocidas y la reconstruccién del conjunto mediante solapamiento de los fragmentos. Este método no dio los resultados esperados ca DNAs, debido @ su mayor longitud y, sobre todo, a la menor especficidad de las DNasas, por lo que sdlo se consiguié ‘secuenciar algunos oligodesoxiribonucledtidos. Fragmento de RNA o DNA problema _ aan Ww ‘Separacién de ls fragmentos por eromatograifay secuenciacion de cada uno con exonucleasa iii a La ventaja de estos planteamientos iniciales es que sirvieron de pauta para la confeccién de los actuales mapas {isicos del genoma a partr de fragmentos de DNA criginados por enzimas de restriccién. Un mapa de restnccion para ‘una regién determinada del genoma esté constituide por una relacién ordenada de sitios que pueden ser cortadas por cenzimas de restriccién concretas, con inicacién de las distancies entre ellos (en pb). A diferencia de los mapes ‘genéticos, para su elaboracién no afecta la funcionalidad de la regién de DNA (su cardcter génico) ni la presencia en fla de mutaciones (salvo que éstas alteren precisamente el sitio de resticcién). Por el contaro, s importan algunas alteraciones que puede suffr el ONA, como translocaciones, deleciones o inserciones. La resolucion o escala de los mapas de restriccién depende de la separacién entre los sitios de corte 0, icho de ‘otro modo, de la frecuencia con que la secuencla diana reconocida por la enzima aparece en el genoma (frecuencia de reconocimiento del genoma por la enzima). Por ejemplo, asumiendo que en un DNA de gran longitu las cuatro beses ueden distbuides aleatoriamente, cuanto mas corta sea la secuencia del sitio de restriccion, mas probabilidad habré {de encontrarla, por puro azar, e8 deci, mayor sera le frecuencia de reconocimiento: tamafio de la tamafio tedrico_n® tedrico de dianas- secuercia dana eoatintcements, aparecetia Sige,” nel gerama, de esinccon fragmentoe___numano haploe ‘4p F = 256 pb 256 pb 13-10° 6pb #& = 4096 pb 14.096 pb 8: 10° 8 pb. 4° = 65.536 pb 65.535 pb 5- 10% La frecuencia suele ser inferior a Jo todricamonto calculado, debido a varias causas. Por un lado, la distribucion de bases en el genoma no es totalmente aleatoria, lo que conduce a fragmentos de longitud muy variable (frente a ls cifras promedio indicadas), Como ejemplo, los fragmentos de DNA humano generados por distintas enzimes de restricién varian entre los 300 pb en promedio oblenides con Alu (diana de 4 pb) y las 9,7 Mb para Not | (diana de 8 pb). Oira causa que reduce el ntimero de sitios de corte en el genoma es la presencia de reglones ricas en secuencas CpG, que al estar normalmente metiladas no son sensibles a las enzimas de restriccién. La construccién de un mapa de restrccién se simpitica si el niimero de sitios de restriccién es reducido. Esto os especialmente necesario para mapear moléculas grandes de DNA, en las que las secuencias especifices para as lenzimas de restricion habituales se hacen muy numerosas. Para estos fragmentos grandes el mapeo sélo se puode border empleando enzimas “oortadoras infrecuentes" y elactroforesis en campo pulsante. En cualquiera de los cass, el revelado de los geles y Ia hibridacién Souther con diversas sondas permiten deducir la distribucién de los stios de restriccién, 0 “cartografia" det mapa. Para faciltar la comprensién del método de obtencién de mapas fisicos de restriccién, se proponen a continuacén unos ejemplos practices. En ol primer caso, se emplean dos enzimas (A y B), actuando aistadamente 0 on forma conjunta (experimento de doble digestion). En el segundo ejemplo, las dos enzimas actian de forma sucesiva, En al tercero, la digestion enzimatica es idéntica al primero, pero se emplea la hibridacién para enriquecer la informacén obtenida.MAPAS FiSICOS 227 oO ‘Ejemplo de aplicacion de las enzimas de restriccion para investigar la posicién de determinadas sccuencias de DNA (mapeo fisico), dentro de un fragmento de genoma de interés (por ejemplo, por la presencia de un gen) fragmento de DNA de partida (23 kb) liqu e quire obene ape Del total de fragmentos Teri con wou | [aor 3310] — fo gio] — [ane si] [a Se") Sf oe a or ois ska 8 3 sho] a [as sib] AS ARS A AB nN re +e =o — el agent AA fora parte dl B2; Aly ABI forman pare de BI Gig sin resolver dob ohio) Finalmente, debe resaltarse que, puesto que un mapa de restriccién no identifica la posicién de genes, su ulidad ‘8 tanto mayor cuando més pueda ser relacionado con un mapa genético, Para establecer esta relacién es necesaio ‘encontrar mutaciones que afecten a los sitios de restriocion y determinar su ligamiento con alteraciones que afectan a ‘genes, tales como las que producen enfermedades u otras cambios fenatipicos. Ello permite situar ese gen dentro de. mapa de restriccién (y otros que puedan haberse localizado respecto a aquél en un mapa genético); éste es un elenplo {de cémo se complementan las diversos abordajes de mapeo para ir construyendo el mapa completo del genoma, 17.3.2.3 Mapas fisicos de STS y EST Cada vez con mayor frecuencia, para la construccién de mapas fisicos se utllzan marcadores no gérioes (pig, 218). Dos de los tipos de marcador més extendidas lo constituyen los llamados "secuencias de referencia’, “sis arcades tnicos, “sitios de secuencia marcada” 0 STS (sequence-tagged sites) y las “eliquetas 0 marcas de secuencias expresadas” 0 EST (expressed sequence tags). En ambos casos, se trata de regiones cortas del genoa (60-500 pb) que se han podido secuenciar y para las que se han desarrollado cebadores de POR (tema 15), lo qu permite su amplifcacion y consiguiente deteccién, Se llama STSs a los marcadores encontradas en el DNA genémin, mientras que los ESTs se identifican en moléculas de cDNA, resultantes de la transcripcion inversa de mRNAS. Es consecuencia, los STSs son marcadores que sirven para elaborar mapas fisioos de todo el genoma, y los ESTs si para mapas de la parte del genoma de mayor interés aplicado, los genes responsables de la sintesis de proteinas. Ente ‘otras cosas, estos iltimos se han empleado para estimar el numero de genes del genoma humano (pag. 240). A pesar de que la posicién de estos marcadores en el genoma se desconoce inicialmente, se puede usar ura Coleccion de ellos para caracterizar fos clones componentes de una genoteca (pag. 216) ~genomica en ef caso de bs 'STSs, de cDNA con los ESTs-, mediante la deduccién de! solapamiento de clones, © construccion de mapas dé céntigas.MAPAS FISICOS. 229 17.3.2.4 Mapas de céntigos Se denomina asi a los mapas que se obtienen mediante el solapamiento de fragmentos de DNA. Estos fregmentos proceden generalmente de la digestién parcial con enzimas de restriccién de otros fragmentos mayores, ‘ada uno de los cuales se ha obtenido a su vez por fragmentacién de los 24 tipos diferentes de cromosomas (en humanos) de la muestra. El planteamiento del mapeo es idéntico en ambos niveles, y similar al descrto para las rnudeasas. Para la deduccion del orden 0 solapamiento de los diferentes fragmentos se acude a la comparacién de los. | marcadores presentes en cada uno, que constituyen generalmente mapas de restriccién o mapas de STSs 0 ESTs, Un eromosoma completo, o una parte de él ‘muchas dianas de resriccion moléeulasde OX X XX x XX pe eee ‘Sopind ‘consigue que, de fs sitios de restricién disponibles en cl DNA, sole se eseinda una minoria| Sli (cj: cor) eos puts cond ama gestion paral Son Iwbido8) lana encima de restrict] (Gertadrs inffecuente) Como consesuencia dea aleatoedad ens puntos ‘que estan coreades, te se dvonae gio, “que slapan paciaiente 7 — sian aca ‘comma a eonjnro ee es, Se ite lies oat de cata Rage py] separa en cules antiones Geomo DNA recombinant) colessin de cntgos en forma de clones: biblioteca de eéntgos ‘apeo de cada fragmento por separado cris: supone corse acer electoforesis ensayos Souther y rozonstair ‘mapa, comm sh indica en guray anteriores aaa Van Del mismo modo se puede hacer paride det mapa det snapa de marcadores ST de cada fragmento (cada sgmento ecusdro coloreado sea una secucnc STS), de EST en el caso de pat de un cDNA. mapa det fiagmento S: mapa del fragmento 7: ‘mapa conjunto: conjnio debe complementarse ‘Brrenyassosentasse ‘cn los mapas slapan parcial ‘enticos: ubieatiin de genes y de marcadores de diversos tiposTema 18 Secuenciacion del genoma y Proyectos Genoma 18.4 Introducci6n 182 Método quimico de secuenciacién del DNA 18.2.1 Marcaje de una hebra del DNA 48.22 Modiicacién de las bases y fragmentacién del DNA. 18.2.3 Separacién de los fragmentos y andlisis. 183. Método enzimatico de secuenciacién del DNA .. 184 188 186 Otros proyectos de secuenciacién del gonoma humano. 18.7 Genémica comparativ: 18.1 INTRODUCCION Los esfuerzos iniciales para secuenclar acidos nucleicos dieron pocos resultados. Hasta los afios 70 era dificl y costoso secuenciar incluso fragmentos de solo § a 10 nucleétidos. Fueron los métodos quimico de Maxam y Gilbert (1977) y enalmatico de Sanger (1980) os que abrieron el camino a dicho gran objetivo. Se consiguieron moléculas. mayores de DNA y se definieron algunas secuencias concretas como las del fago $X174 (5,4 kb), mitocondria humana (16.5 kb), fago lambda (48,5 kb) y virus animal de Epstein-Barr (170 kb). Estos dos métodos ploneros de la secuenciacion tienen en comin algunos aspectos, como la ullizacién de ‘ragmentos del DNA original escindidos con enzimas de restriccién, el marcaje del DNA de forma radiactiva © quimica (comouestos fluorescentes), e! empleo de métodes electroforéticos para separar los fragmentos generados, etc. La ‘muestra de DNA de pariida para la secuenciacion procede generalmente de clonacién calular, de amplificacién por PCR 0. Ia digestion controlada con una enzima de restriccién de un genoma, un cromosoma w otro fragmento de DNA. Con frecuencia, las muestras se amplifican por PCR para disponer de suficiente cantidad. Igualmente, es conveniente la putficacion para eliminar ONA contaminante en la muestra (por ej. DNA bacteriano) y reactivos procedentes de la putiicacién 0 de otros procesos previos (como cebadores y nucleétidos restantes de la PCR), Se puede acudir también ‘recuperar del gel el DNA contenido en una banda de electroforesis. 18.2, METODO QUIMICO DE SECUENCIACION DEL DNA Este procedimiento, uno de los mas usados pero actualmente desplazado por el método enzimatico, se basa en la hidrdlisis quimica y en un disefo original aplicable @ secuencias de DNA de menos de 250 nucleétides. Se conoce habitualmente como métode de Maxam y Gilbert. Puede describirse en tres etapas: marcaje del DNA, hidrblisis quimica selectiva del DNA y andlisis de los productos.232 SECUENCIACION DEL GENOMA ¥ PROYECTOS GENOMA 18.2.1. Marcaje de una hebra del DNA Normalmente se parte de un DNA de doble hebra, genoralmente obtenido por restriccion de uno mayor, aunque dl rmétodo puede aplicarse igualmente a un DNA de hebra sencilla. Esta primera etapa consiste en el marcaje de uno de los extremos de cada hebra. Lo habitual es emplear polinuclestido quinasa y ATP radiactvo para marcar el extemo 5; ‘aunque pueden también emplearse fluorocromos © marcar el extrem 3. En el marcaje radiactvo es comiin el uso de P, pero por su elevada energia produce sefiales clspersas y,hace afc! cistinguir bandes edyacentes on i electroforesis. Otros isétopos de menor energia, tales como *%P o 995 (éste sustituyendo a un oxigeno), dan bandas ‘mas nitidas, aunque precisan mayor tiempo de exposicin. 7 DNA de dobe heb a 2 ————" Sn a APPPA CHEPLATR, PPLATP @ [YSSHOATP) ri a sae ra (ADF) © ‘Al ser el DNA de doble heb, resulta ‘mareados os dos extremos. Deben separarse ambos, dc lo eontraro se secuenciarian aribas hebras ala vez y oh ‘fesultado no sera interpretable, ‘Una forma de separar ambos exiremos es ‘por desnaturalizacin y aslamicnto de cada hebra. Otra forma, comin, es cortare! DNA y continuar con uno de los ‘fragmentos, que ya s6lo liene un extreme marcado, —_ Separacién de ambos fragments (por electroforesis) Y secuenciacion por separado. Siel DNA te pia fese Ue stra sencil, habia bastado con marearlo y no se precisa separacién alguna, 18.2.2 Modificacién de las bases y fragmentacién del DNA Esta es la etapa caracteristica del método quimico de secuenciacién. El proposito ©s conseguir fragmentos de DNA de hebra sencila, marcados, de longitud variable y que terminen en un nucle6tido conocido. De esta forma, Jongitud de cada fragmento Indicaré la posicion de ese nucledtido. Ello se consigue con tratamientos. quimits independientes que producen esos fragmentos. ® “Rangue oT DNA sign sendo de doble here, slo ua ott Jamuesua de DNA { arcaday esl ica que sc detectard Por elo pair de ce ee ‘gut sesonessnia sola hebra mareada, por simplicidad ‘Secucnea ejemplo: 1 cada una resibe * *pATCGATICTCGGAGTCACACG 3° un tatamiento aie 5 O08 Se, SSS SSE oo OTS ca a ae ete aneae tA ® SSS Sameer sie nei satel a oo id bbbhbb. spasinmane Goes hace perme (09 Ay pirimidinicas (C y'T). En todos los €ass, se rompe el enlace N| an Blicosiico, dejando un sit abésica (apurnicao apirimiaiio) iio para Sma ¥ mantenicndo el exqueleo osfto-desoxieribosa-osTato, iminar cada base | Eliminacién de guanina (en alicuota T1): ‘La guanina se tifa con dimetfsulfao 1% y formiao ambnico 50 mM. La metiguanina resultant se piesde rata con piperiding en medio bisico i 2 ina (en alievotaT2) Se reali una despurinacion en medio sido, coneretament rico al 80% inact de citosina (en sicuota 3): ‘Con hidroxilamin 4 M a pH=6, 0 con hidracina y alta jeoncenitacin slo. (cn ticuota T4) ‘Con permanganato potdsico 0,1 M, o con hidrazina sin sales, emf 7 Abb heb TL, A cio sfc cig ga moet Nx |x cites fee 4 umbels aly ae ae Eins nen polnctorcs (lo to & (correspondiente al nuctedsido ei) > ie eociciboee pine ch nyMETODO QUIMICO DE SECUENCIACION DEL DNA. 233 Es importante resaltar que los cuatro tratamientos de eliminacién de bases se deben realizar restringiendo e! tiempo de reaccién y las concentraciones de reactives, para evitar que se escindan todas las bases de un tipo delerminado presentes, Sdlo debe perderse, aleatoriamente, una de las bases en cada molécula de DNA (del tipo ‘correspondiente al tratamiento aplicado). De esa forma, el resultado es una mezcla de moléculas de DNA modificadas en dstntos puntos. ‘Resultados de fos 4 watamientos para la secuencia ejemplo: $° *pATCGATECTCGGAGTCACACG 3° Tszela de moléeulas de DNA resultante dele reaccion en condiciones limitantes (representa, ibosa en el nucletide abisico}. ‘de nucleotides cen cada fragmento a desoxi marca: sparconrreres SBAICGATICTCCGARTCACACG = spaTeGarTenccGaGTeAcAce + SPMICGATICTCGGAD + PICACACG + SPATCGATECTCGp G+ spaTCoarrcter cs spAICCATICTOA 6 SPATCGRTTEDGp + peAGTEACAce +E 10 “BAECRATTC! ay) ‘patcp + paticrcecacteacnca + © 3 pe sparcaarreroscactencace ‘parccarrercscagrcacace + F “PATCGATTCTCGGAGTCRCEES SPAICGATTCTCGEAGTCACD + PCG + © “PRICGATICTCOGAGTCREACG SBAICGATTCTCGGAGTCP + pCACG + “pATCOATTCTE 6 “BARCEATTCTCGEAP + PICRCACG + © jminacioa™, *paTeCA SREACE spARCGATTCTCGG + pETCACACG + © GeGyA_> *PAICCATICTCGEAGTCACACG SBRICGATICTCSp. + pAGICACACG + © a O77 PRICE \GTCACACS SBAICGATICTCp + pEAGTEACACG + © SBAICGRTTCTECGNSTCACACG 1» SPAIGGp. 1 PITCTCEGAGICACACG + = SBAICEATTCTCGGAGTCACACG “GHA” “pntcp + pAITCTCEGAGTCRCACG + = *PEICOATICTCGGASTCACACG “p+ PICGATICTCGGAGTCACACG +E spAncaaTTcreacacTcacag ‘paTecarreressasrcacap + pots 19 “BAICGATICTCGCAGTCAEROS SPAICGATECTCGGAGFCRD | pACG + © IT “EARCGATTCTOGCAGTERCACG spatcanrrereccnerp + pacace + © 1S “patceal PTEACACS SPAICGATICTS + PGGAGTCRGRCG + £9 “SEATCOATD ITERCACE *EARCGATIp * BTEGGAGTCACACG + © 7 “PATE SGTCAERCE SDE + PCAFICTCGGAGTCACACG + F 2 spaTCGATTCTCGGAGTCACAEE ‘spATCGATTCTeGGAGTCACAP + pG +x 19 SPAICGATECTCGGAGTCARNCG ‘Barccattcresanstcap * pace + © 17 sPAICGATICTCGGAGTERCACG ‘PATCGATTeTCcGnGrp + pacacs + = 1S *BATCGATTCTCGGAGECACACG TEATCGRTTCTEGGAGp + pEACACG + E14 raliinacion SBMICGAPTCTp + pEGAGICACACG + © 9 deCyT hidrotsis SPATCGATTCp + peGGAGICACACG + FR ¥ “patcenrip + picegnsteacace + © 7 a Ta *PATCGATp + peTOCEAGTCACAGG + x & Gar” *PATCGAp + prcroscaGTeacnos +f S “BATEGATTCTOGGAGTCACACS “BAEp + pGARTCTCGGAGTCACACG + FZ SPAECGATECTCGGAGICACACE “BAP 1 POGATICICGGAGTCACACG + = 1234 'SECUENCIACION DEL GENOMA Y PROYECTOS GENOMA J METO 18.2.3 Separacién de los fragmentos y anélisis 18.3 Para analizar las 4 mezclas de fragmentos obtenidas, se separan todos ellos de acuerdo con su tama, fempleando electroforesis. El tamafio de cada fragmento marcado indica directamente la posicién en la secuencia del E rnucledtide correspondiente al corte. gran ¢ contro! DNA pe ‘Anilisis del patrin de bandas: iF Si la banda aparece en las calles G0 C a variant interpretacién es obvia. Si lo hace en las calles (pag. 1 ae’ ta GA OCHT, hay que tener on cuenta i tambia de “se apes ei ra apatece banda en la G 0 , respestivamente: lime Gucumesken | OfSmewemeas rn separ por clcroforesis, mene ee eel a = enzima sive Roca ornpdie = ere inrodocido inlatnen > Ff = ' nuctest puesto ‘Aniline par de bandas rece | La posicion de cada bande bos frag conesponde along dl métoda Iragmento marca (calbraciéa dot ge, Esa coineie (ver ign atetio) eon le posicon dst auclesto anterior 3 fabs 18.3.1 nade, puesto que cl extreme De tna prin | ea iE nun gel de poinestamiao (Geatre 6 y 89) se pueden observa las diferencias de Tongiud de wn sole suelo. Con urea 68 M y manteniendo el gel a 40030" (condiciones ematurazanen) se iid ‘ue ls ragmentosformen oentcs de haropeno enue 'Elevelede (gar *p, atoradiogratis) musta sols Traginentos Iareodos, (Los tapers de Tata wo marca ine “dtp oad pd owes cet) apeo “a0 (cl tipo de tratamiento) En conclusion, los fragments, ‘ordenados de menor a mayor (Ge abajo arriba), corresponden ‘la secuenca,lelda de $° a3" DAOGpHHOHODOPONOROPOO > 20 OmAANAAOOD, de abajo arriba se puede lee Ia sccuencinMETODO ENZIMATICO DE SECUENCIAGION DEL DNA 235 18.3 METODO ENZIMATICO DE SECUENCIACION DEL DNA El metodo enzimético o de Sanger es la base de las variantes més utiizadas actualmente para la secuenciacién a gran escala del DNA. En &l no se degrada el DNA como en el método quimico, sino que se acude a la interupciin Controlada de la sintesis de una hebra complementaria durante una repicacién in vlro. Esta sintesis, cataizada por una DNA polimerasa, define elcardcter enzimaico del método. Puesto que fa actividad 6'-exonucloasa de las DNA polimerasas naturales no es conveniente aqui, se suelen usar variantes, tales como el denominado “fragmento de Klenow" o fragmento grande de la DNA-polimerasa T de E. coli (pag. 147), 0 formas alteradas artificialmente de la DNA polimerasa del fago T7 (algunas comercializadas con el nombre: de “secuenasa’, Sequenase®). También se emplean en ocasiones transcrptasas inversas o la DNA polimerasa Taq (Polimerasa termoestable dela arqueabacteria Thermus aquaticus, conocida por su aplcacién en PCR, pag. 180). Estas atemativas intentan, ademas de evitar la actividad S-exonucleasa, conseguir mayores procesividad, actividad ‘ezimétca y eicacia sobre regiones homopolimércas y regiones con tendencia @ adoptar estructura secundaria, Todo allo conduce a la posibildad de secuenciar cada vez fragmentos mas largos y con menor margen de error. Igualmente, han ido surgiendo distintas Variantes del método inicial en lo rlatvo al tipo y lugar de marca de los nucledtidos, especialmente al aparecer los fluorocromos como altemativa a los isétopos radiactivos, Para simplificar, y puesto que el fundamento no varia, se expone a continuacién una de ellas, que emplea cuatro fuorocromos distntos y ffece la posiblidad de automatzacién. EI método puede describrse en tres secciones: sintesis enzimatioa,andls's de tos fragmentos y aulomatizacién. Al final se indicaran los matices que supone el empleo de variantes altenativas del mmétodo. 18.3.1 Sintesis de un DNA complementario de longitud variable Dado que se emplea una DNA polimerasa para sintotizar hebras complementarias a la que se quiere secuenciar, una primera caracterstica del método es la necesidad de un cebador, un oligonucledtido diseriado para que se hibride can el extrem 3' de la regién que se quiere secuenciar. La segunda, y principal, caractoristica de este método de secuenciacién es el uso de didesoxinuclestidos, andlogos estructurales de los desoxinucledtidos que provocan la detencién de la reaccién de sintesis de DNA. Por ello, ‘se conoce también como secuenciacién didesoxi o de terminacién de cadena. Ejemplo de Ejemplo de Bjemplo de idesoxiribonucledtido (8ANTP): ‘elongcion por ua longi variable cebador min (©) sng ten cata ie deseo or zals Sera evs de Toned a ec comenanconel hogar n 59 emianen con un miso mesa ‘NTP nl cn eas ens. Rela, porate patos dl meta omplamenara ena sscteai dea ha de DNA de uri NF de nuclides oh eda fragmento mareador ‘BATCOATTETOSeACrEACACEARCCEAG patcoartcrecaacrencacgarceaas RERGRGCEAGSERGp 747 RSG ar sTCCATTCTOGEAGTEACACCARCCEAG scaTTCTGCAGr: WBCCCRG st FPRARCES ise a GARRERSStnSoStep #7 PATCGATECTCGGAGTCACACEATCCERG patconrrercogagtencnccatecans “SEACCEREAGHGRCOTAGGGRCp 1547 Rosen wae7 TI” | pxrccaTnenocgncTcAcAcoATCCEAG 13", parcoarncregencrencnccazecenc (asarp P7OONERERCESRERGRSREC HACER 1647 (ddeTP) GEREAGIONGCEAGEERCD U1+7 PATOGRTTERCGGAGTCHCRCEATCOAG PLS 007 PAC Gn Gea oRGRGLTASSET ee PATCGATTCTCGGAGTCACACGATCEENG patcenrrerecenctcAcaccazecens ‘SERS, FOES, 7 PATCEATTCTOSCAGHCRERCSRTERAS a _PATCGATICTeGcAGTeAGACEATCCGAG q ‘GREGRNGEERG a7 1 oaxaTercosnanpaenceatcesns rcaxtrorcecngpeacacsancesne Px TAMERS, oy SEREARERESSENG, or a2) paoonrnengcononencncennecine 12) parcopgrencconsrcncaccarccons caicre) SRARIMGREERIES DS aoy a trp) P*CCREESTERERETERERCEARSSNS yy sICGATTETCGGAGTCACACGATCCEAG PACA SSeReASTSRC RCC 7 panggagy erenencenncee Deere es a weMETODO ENZIMATICO DE SECUENCIAGION DEL DNA 18.3.2 Separacién de los fragmentos y analisis ‘Se sigue un procedimiento completamente andlogo al andlisis del método quimico: “nado reacions (Gadhia cx un era de foment ee anu mileb) se separ otofresisen ely se asec ‘orn mito can areie edo inicamert en elem, Tors) Copageagin = aa ee secteattct, |» Seat Spoaadene came ee pase de Margene cnr Sees seeietGhoren Scikeemens steers Soa sip de et pee ea me det ‘arrears \ 1 Boe (aaaTP) (aaG TP) (BACT) (4EFTP) = : alti amiioral a4 Sls es = _|$9 2 as i rps i aS ae —i|:# ican oF aun S$ 18.3.3 Automatizacién ‘secnenca dela hea depart 237 "1 fragmento, mareado, cuyo nuclestido SYterminal eb el didesoxi ‘usado on esa muestra. (calle o ear del ge), rages (calibracign dl ge, «© Puesto que fod tienen “in exten 3° cond aden) a ongiad inci on Ta postion det nucldid erminador (aN) En couelusin, os fragmento, (de abo aria, (comesponden a scevencn de a hebra sera, iidade S03 La Secuencia del DNA de ‘para sed la corplementte La posibiidad de usar un fluorocromo distinto en cada una de las 4 reacciones de sintesis permite automatizar el rmétado, de forma que se “lean” simulténeamente las hebras marcadas componentas de las 4 mezclas. Ademés, esta lectura de la luorescencia se puede hacer en continuo, con fo que la electroforesis sigue transcurriendo, las moléculas de menor tamafio, ya detectadas, se salen por el extremo inferior del gel, y se sigue consiguiendo la separacién de mmoléculas mayores en el gel, de modo que se amplia el nimero de nucledtides que se pueden secuenciar en un solo experimento, Gracia al empleo de “4 fuoroeromes. diferentes, se puede combinar el resultado de las 4 eoacciones ¥ aplicar la mezela aun ‘misme posillo del gel 1 color de cada banda nd al didesoxinucledtide 3? terminal de ese fragmenta, mo \ rey (ante) (acre) (dCTP) (aATTP) No silo se pueden detectar as 4 colores tras acabar la separacién electroforética, ‘Se genera un registeo informatizado de los 4 Perfies de color, que ‘combinados se =|za interpretan como una =|: ES ]ia | tor pucde media SS] AS | presencia de las bandas que SCF | vanpasando por et haz ser eae ¥y sucolor, =a) © | x | 3 =I: J—l¢ 5 eestor fa: Law at)238 SECUENCIACION DEL GENOMA ¥ PROYECTOS GENOMA A titulo ilustrativo, de los numerosos fluorocromos disponibles, se indican los 4 usados mas comuinmente para secuenciacién en la actualidad (todos como N-hidroxisuccinimidilésteres, forma activa que permite su unién a un grupo ‘amino del nucledtido). Nombre ‘propiedades de fuorescencia ‘comin nombre completo Jexlam) —Rem(nm) color emitide FAM — (566)-carboxitluoresceina 494 518 rojo anaranjado JOE (5 8}catboxi-'5'dicloro-2',7-dimetoxifuoresceina $22, 850 rojo-pérpura TAMRA (6 6 6}-carboxitetrametirrodamina 555 580 orpura ROX __ (5 66)-carboxi-X-rodamina 580. 805___azul verdoso 18.3.4 Variantes del método ‘Ademas de mediante el método llustrado, al marcaje de la hebra da nueva sintesis se puede conseguir de okas ‘maneras, aplicandose a otros componentes de la reaccién en la que se sintolizan dichas hebras: ‘Método de marcaje dela hebra nueva En el dldesoxinuclestio En los desoxinucisiidos (extreme 3) (alo largo de la hobra) Tae aaa uorescenda aa Teaes | tuorescenciarciaciwdaa sn marcar Sepmarar tne, co ee ae yiecra ves torninar etcroforeis ont cate " penaaa se stroman) Tofatmente comparable al Gemple itvarado, salvo que la division de fa muestra en 4 debe hacerse antes de afadir el eebador "Nota t: Empleando nvclestidos marcados durante su sintesis quimica 6 bien por modificacién enzimitica del ecbedor ‘ompleto, mediante fos métodos ee marcaje terminal (véase el mareaje de sondas). ‘Nota 2: Basta con uno de los NTPs marcado con isStoporadiactivo (a"P, aP, "S) 0 con fluoracromo, que se ‘neomporacien varios puntos ala hebra en crecimiento. Notese que, a diferencia del metodo quimico de secuenciaci, en este caso el isdtopo debe estar en el fosfto a (no en el ), que es el tnioo que se conserva incomporado en ef DNA. So han desarrollado ademas de estas modificaciones, otras que afectan al planteamiento y alcance del métado ‘quimico y, especialmente, del enzimatico, y que estan siendo aplicadas en los distintos proyectos genoma baja estudio ‘en ef momenio actual. Sin embargo, creemos que su descripcién excede las posiblidades de este texto. Baste ctr ‘entre ellas la secuenciacién ciclica, la secuenciacién miiliple, la quimioluminiscente y la secuenciacién en fase sélida, 18.4 SECUENCIACION DEL RNA La secuenciacién del RNA es, en general, més dificil que la del DNA, entre otras causas por su menor estabildad Es posible deducita a partir de la secuencia del DNA del que se transcribe, o también sintetizar un cDNA a part del RNA de interés y secuenciar aquél. Sin embargo, a veces es necesario secuenciar directamente el RNA, sobre todo ‘cuando se desea determinar las posiciones de nucledsidos modificados, caracteristicos de los tRNAs y fRNAS. ParaPROYECTO GENOMA HUMANO (PGH): CARACTERISTICAS ESENCIALES 239 ‘lo, se ha desarrollado un procedimiento que emplea distintas RNasas que cortan en el lado 3' de ruclestidos ‘spectficos, con lo que se puede obtener una serie de fragmentos que reflejan las posiciones de cada base. Siguiendo tun planteamiento andlogo al de la secuenciacién quimica del DNA se puede entonces deducir la secuencia del RNA. --PNpNpApNENpN. Nasa U2 s...pNpNPAD + NpNpN...3° x BOUe AE RNA nacinte (10 n0) {pareado ala heb olde Sl DN) ZO-o>-o-z— ‘Sotetizado en dcceiba 3°93") ATP, UTP. CTP GTP254 TRANSCRIPCION 19.4.1.3 Formacién de los primeros enlaces fosfodiéster El enlace fosfodiéster inical se forma entre dos ribonuclestidos, @ partir de sus NTPs en forma libre. Uno de eles, ‘generaimente con base putinica (coneretamente ATP), se aparea con el nuclestido +1 en ta hebra molde de DNA. ‘otro se encuentra igualmente apareado con el nucleétida +2 de la misma hebra. pppA a pppN_ ———® pppApN— + 1pycledtide (ATP), _Ribonucledsido- RNA de dos actiia como cebador. _trifostato (NTP) nucledtidos, Se apareaconTen+i _complementario al con tr-P en su delahebra molde del nuclestido de la extremo 5°, unido DNA posicién +2 de la ‘Ja hebra molde hebra molde Este primer enlace corresponde, por tanto, al extremo 5'-P del RNA naciente, La reaccion se repite sobre é ‘extromo 3° del dinucladtido resultante, y asi sucesivamente hasta formar un oligorribonucle6tido de unas 10 bases, qe permanece temporalmente unido a la hebra molde de DNA como hibrido RNA-DNA. En este momento, ta RNApoHilse separa de los TFS unidos a los promotores (iberacién del promotor) y comienza a desplazarse por el DNA (en sentido, 3°95" de la hebra molde), Este momento se considera el final de la etapa de iniciacién y ol comienzo de la de elongacién. 19.4.1.4 Liberacién del promotor: transicién de iniciacién a elongacién En procariotas, esta transicién se desencadena por la disociacién de la subunidad « de la holoenzima RNAPOL ‘quedando aquella disponible para su interaccién con una nueva RNApol nucleo e iniciar la transcripcién en un ave ‘promotor. El resto de la polimerasa (RNApol “nicleo", desprovista de la subunidad a) continéa actuando en le ‘etongacion. dad dela RNA polimerese En eucariotas, la transicién entre las fases de iniciacién y elongacién viene marcada por la fosforiacién dominio CTD de la RNApol-Il (en la fase de Inickacion participé la forma no fosforilada). Esta fosforlacién la Neva aca cl factor de transcripeién TFIIH, 19.4.2 Elongacién o alargamiento del RNA La RNA polimerasa continda alargando la cadena de RNA mientras avanza por el DNA, desplazando junta elle la burbuja de transcripcién. El complejo de elongacién ya esta s6lo formado por el DNA abierto, Ja RNApol y e naciente, Durante este avance continuo ocurre lo sigulente: ‘+ Por delante de la polimerasa se separan las dos hebras de! DNA por ruptura de los puentes de hidrogeno (ava de la burbuja). La tension creada por el efecto de superenrollamiento debe ser compensada por topolsomersi (pags. 86 y 151). ‘+ La polimerasa aiarga e! RNA afladiondo nucledtidos al extremo 3° del RNA naciente. E! itimo tramo pet dentro de la burbuja, apareado transitoriamente como hibrido RNA-DNA. ++ Por detris de la polimerasa, la cadena de RNA miuevo se va separando de la hebra molde de DNA, seliendo de burbuja y quedendo como RNA de hebra sencilla. En el DNA se vwelven a aparear las dos hebras y se produce re-enrollamiento o rebobinado de la doble hélice, de nuevo asistido por topoisomerases.ETAPAS EN EL PROCESO DE TRANSCRIPCION 255 ‘Tras haber incorporado unos 10 nuelestides, ta RNA polimerssa se separa de los TF y comienza a despazanse, atiadiendo mis meledtios al exremo 3" dela cadena de RNA. La burbula do anserpeionavanza Topo. ameraas—) _[avance de la barba) a > [cccalamen) 37 ee, = Zo-o>ozorm Pera que la elongacién sea eficiente se requiere, ademés, la ayuda de los llamados factores de transcripcion {2nerales de la elongacién (PTE). Se desconoce su mecanismo exacto de actuacién. Son proteinas que se agrupan en varios pos: PTEFD y SII evitan la terminacién prematura de le elongacién, mientras que FF, Sill (0 elonguina) y £1L aumentan la velocidad de la elongacion al suprimir es pausas transitorias. 194.3. Terminaci6n El complejo de transcripotén responde a seviales especificas para finalizar el proceso, separéndose ol RNA ‘Al leanzar las seevencias de terminacia, la RNA polimeras iatrumpe Ia satess de RNA y se separa del DNA. DIVIVIUIUIU on 3 Saperei e an eee eoieserers er ve RN Apo! protsina p_RNApO La proteina p se une a (e088) secuencias especificas del RNA, ren favoreciendo su separacién del DNA (praia : "santa ‘y,en consecuencia, el fin de la ‘Ate’ RNA ‘ranseripcién. aol NX 19.4.3.2 Terminacién en eucariotas A alcanzar determinadas secuencias del DNA eucariético, ain poco caracterizadas, se produce la terminacin, ‘como consecuencia de la combinacion de dos factores o mecanismos: ladetencién o pausa de la RNA polimerasa ylt desestabilizacién del hibrido RNA/DNA. El resultado final es la separacién de los componentes del complejo de transcripelén y, en e} caso de la RNApo'-ll, su desfosforlacién para que pueda ensamblarse a un nuevo complejo de iniciacion y comenzar otro cilo de transcripcién. La influencia de los dos mecanismos mencionades es diferente para cada una de las tres polimerasas eucaridticas. A diferencia de procariatas, parece ser un hecho comiin la ausencia de regiones palindrémicas del RNA ‘que participen en la terminacion deta transcripcion. Las caracteristicas para cada RNApol son: Termi Len eucariotas: RN ApoE a ‘mecanismo similar a la terminacién intrinseca de procariotas. — * Una “proteina de pausa” 0 “proteina terminadora” se unea > a secuencias especificas del DNA y detiene el avance de la * RNApol. + Una vez detenida la polimerase, la presencia de una regién rica en Ten la hebra no-molde facilta la separacién del RNA. + No hay regin palindrémice. a Rebip en evadura, ‘TTF- en catén, similar en humansTRANSCRIPCION DEL GENOMA MITOCONDRIAL, 257 Terminacion de RNApal-ll en euceriotas: mecanismo similar al dependiente de p en procariotas. RNApobtl + En miltiples sitios dentro de una amplia “region de D terminacién” la RNApol se detiene, lo que puede deberse a secuencias especificas en el DNA oa “proteinas de pausa” ‘que se unen al DNA. - * Una proteina, similar a p (de hecho, la propia p bacteriana posible produce el misme efecto in vito), se une al RNA induciendo Brown Suseparacion simi terminadora + Nohay eegién palindrémi See Terminaci6n de RNApOLIM en eucariots: ae ‘mecanismo similar a la terminacién intrinseca de procariotas. + La RNApol se detiene en sccueneias especificas del DNA (no sehhan encontrado proteinas terminadoras). + Una vez detenida la polimerasa, la presencia de una regi rica en T en la hebra no-molde faciita la separacion del RNA. + No hay regin palindrér ¥ 3 Finalmente, e independientemente de estos mecanismos, es importante adelentar que el extremo 3' del RNA funcional no corresponde al punio donde termina la transcripcién, debido @ que durante la maduracién postrnscripcional se corta la molécula de RNA recién transcrita (pag. 279). Por esta razén es menos importante precisa la terminacién en eucariotas que en procariotas, y también se explica Ia dificultad del estudio de las secuencias Yymecarismos de terminacién eucariétices (pues es difclalsar los transcritos primarios, de corta vida). 195 TRANSCRIPCION DEL GENOMA MITOCONDRIAL Como ya se ha indicado, ol cromosoma crcular mitocondrial humano, y de mamiferos en general, es transcito por 1a sola RNApol que esté formada por un solo poipéptido y que, pare la iniciacion, requere la presencia de un factor de ‘anscripcion mtTFA. E1 mtDNA se transcribe a partir de 3 lugares de iniciacion, dos para a hebra pesada (Hy H2) y tno para la ligera (L), produciéndose asi tres transcrtes primarios diferentes (dos de ellos complementarios correspondientes a toda la longtud del cromosoma, 16,5 kb). Los 3 promotores se encuentran situados en la regién no codiicante de control 0 bucte © (pags. 160 y 378). Ain se desconoce si el inicio en Hit y H2 depende de un mismo promotor ode dos independientes (principal y “secundario"), uno de ellos todavia desconocido, ‘A partir del primer lugar de iniciacién de ta hebra pesada (H1) se transcribe el DNA que codifica los tRNA™, IRNA 125, 1RNA™ y rRNA 16S; la transcrpcion se detiene tras este timo, mediante la pertcipacién de un factor dé teinacién (mTERF), Cuando la transcripcién comienza en el segundo punto de inicio H2,localizado inmediatamente tas el RNAM™, el transeito primario (L2) continéa més alé del punto de terminacion anterior, completando ol resto del RORY rier aa waaseeen) Cones ‘mee WS mitocondrial ee BNA mitosonarl aa nett cage (ara siphifear, somite a sparacion de as heb de DNA tlaburbjadetanseripcion ye reprennia a sdena de BNA “ino ala de DNA aungue yao estin apes) (ebra pesa L (hebra tigers) completado, cenelongscion cliranzerto i