Universidad Autnoma de Ciudad Jurez Instituto de Ciencias Biomdicas Licenciatura en Qumico Farmacutico Bilogo Laboratorio de Enzimologa

Prctica 7. Cintica Enzimtica: efecto del

pH y la temperatura

Antonio de Jess Muoz Escobar 100724 al100724@alumnos.uacj.mx Ciudad Jurez, Chih., 21 de marzo del 2014 Resumen Existen varios factores que modulan la velocidad de una reaccion catalitica, siendo algunos de los principales el valor de pH y la temperatura. En la siguiente prctica se analiz el efecto de estos dos factores sobre la actividad de la enzima invertasa, sometiendo diferentes disoluciones de enzima y sustrato a diferente pH en un experimento y variando el intervalo de temperatura en otro. Empleando el reactivo dinitrosalicilato fue posible cuantificar la concentracin de los productos al leer su absorbancia, obteniendo con ello la velocidad cataltica. Al comparar dicha rapidez con los valores de pH y temperatura, respectivamente se obtuvo el pH ptimo y la temperatura ptima para la enzima invertasa. Se compararon estos valores con los reportados en la literatura y se concluyeron los factores que afectan la cintica enzimtica. Introduccin Las propiedades catalticas de las enzimas que influyen en su actividad estn bajo la influencia de numerosos factores, los cuales son de importancia fundamental para entender el funcionamiento de los sistemas enzimticos. Entre estos factores se encuentran los factores fsicos, como la temperatura y la presin, los factores qumicos, como el valor de pH y el grado de ionizacin, asi como la concentracin de los sustratos, cofactores, inhibidores e incluso de producto de la reaccin1. Al tomar en cuenta que las enzimas son protenas y por ende polielectrolitos, se entiende que estas poseen propiedades bastante sensibles al pH, el cual tiene un efecto importante sobre la velocidad de las reacciones enzimticas2. La mayora de las protenas solo se activan dentro de un estrecho intervalo de pH (generalmente de 59). Al representar grficamente la actividad enzimtica en funcin del

pH se obtiene una curva gaussiana, producida porque los residuos de aminocidos con grupos ionizables en la cadena lateral son esenciales para la catlisis3. El pH ptimo es el pH en el cual la actividad es mxima, dependiendo este valor del medio en donde se realice la catlisis. A pH demasiado cido o alcalino, no slo se compromete el sitio activo, sino que se altera la estructura terciaria de toda la molcula pudiendo llegar incluso a la desnaturalizacin2. La dependencia de la catlisis a la temperatura no es simtrica. Al aumentar se observa una aceleracin inicial debido a que la energa aumenta las colisiones entre sustrato y enzima, llegando a una temperatura ptima donde la velocidad de reaccin es mayor. No obstante a determinada temperatura la enzima se vuelve inestable y pierde su estructura ordenada, es decir se desnaturaliza, disminuyendo la 1 velocidad de reaccin . Objetivos Analizar el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimtica en una reaccin. Discutir el efecto sobre el comportamiento cataltico de una enzima al variar el pH de la mezcla de reaccin.

Discutir los cambios que se presentan en la cintica enzimtica al variar la temperatura de reaccin. Determinar las condiciones ptimas de reaccin en funcin de estos dos factores (pH, temperatura) Mtodos Efecto del pH Se prepararon una serie de tubos de ensaye con los volmenes de reactivos especificados en la tabla 1. Enseguida se verti 1 mL de la enzima invertasa a todos los tubos, y se mezclaron para luego incubarlos a una temperatura de 37 C durante 20 minutos.
Tabla 1. Cantidad de mililitros de reactivo agregada a cada tubo.
TuboEfecto del pH Sacarosa 0.3 M Amortiguador pH = 2.5 Amortiguador pH = 2.5 Amortiguador pH = 3.5 Amortiguador pH = 4.5 Amortiguador pH = 5.5 Amortiguador pH = 6.5 Amortiguador pH = 7.5 Agua 1 1 0. 5 0 0 0 0 0 0 0 2 1 0 0. 5 0 0 0 0 0 0 3 1 0 0 0. 5 0 0 0 0 0 4 1 0 0 0 0. 5 0 0 0 0 5 1 0 0 0 0 0. 5 0 0 0 6 1 0 0 0 0 0 0. 5 0 0 7 1 0 0 0 0 0 0 0. 5 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 1

Terminado este tiempo, se le agrego a cada tubo 1 mL de dinitrosalicilato, mezclando nuevamente. Finalmente se volvieron a calentar en bao de agua a ebullicin durante 5 minutos. Una vez enfriados los tubos, se procedi a leer su absorbancia al espectrofotmetro

a una longitud de onda de 540 nm, ajustando a 0 con el tubo no. 8. Se anotaron los resultados. Efecto de la temperatura Se prepararon siete tubos con las cantidades de reactivo especificadas en la tabla 2. Una vez aadidos los reactivos se mezclaron e incubaron a 5 minutos a la temperatura indicada para cada tubo. Enseguida se agreg 1 mL de dinitrosalicilato a todos los tubos para posteriormente calentarlos en bao de agua a ebullicin durante 5 minutos. Una vez enfriados los tubos, se procedi a leer su absorbancia a 540 nm, ajustando a 0 con el tubo nmero siete.
Tabla 2. Cantidad de volumen aadida a cada tubo, as como la temperatura especfica para su incubacin.
Tubo Sacarosa 0.3 M Amortiguador pH = 4.7 Invertasa Agua Temperatura C 1 1.0 0.5 1.0 0 4 2 1.0 0.5 1.0 0 26 3 1.0 0.5 1.0 0 37 4 1.0 0.5 1.0 0 45 5 1.0 0.5 1.0 0 60 6 1.0 0.5 1.0 0 100 7

el tiempo de incubacin, en este caso 20 minutos.

Tabla 3. Resultados de absorbancia de cada una de las disoluciones empleadas. tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 absorbancia 0.362 0.391 0.573 0.300 0.670 0.329 0.090 blanco Velocidad (abs/min) 0.0181 0.01955 0.02865 0.015 0.0335 0.01645 0.0045 pH 2.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 -

Una vez calculada la velocidad se procedi a graficar en funcin del pH, con el objetivo de conocer el pH donde la actividad enzimtica fue mxima.
Grafica 1. Cintica de reaccin en funcin del pH

Velocidad en funcin de pH
1.0 0.5 0 1.0 25

Velocidad (abs/min)

0.04 0.03 0.02 0.01 0 0 2 4 pH 6 8

Resultados Se obtuvo la absorbancia para cada uno de los tubos sometidos a diferente pH. Para poder graficar la cintica de reaccin en funcin del valor del potencial de hidrgeno, se dividi la absorbancia registrada entre

En el caso del experimento a diferentes temperaturas, tambin se obtuvo la velocidad de reaccin al dividir la absorbancia obtenida en cada tubo por el tiempo de

incubacin, el cual en este caso fue de slo 5 minutos.

Tabla 4. Resultados de absorbancia de cada una de los tubos a diferente temperatura.
tubo 1 2 3 4 5 6 7 absorbancia 0.815 0.795 0.883 0.916 0.909 0.844 blanco Velocidad (abs/min) 0.163 0.159 0.1766 0.1832 0.1818 0.1688 Temperatura (C) 4 26 37 45 60 100 25

a (-) fructosa, de acuerdo con la siguiente reaccin: C12H22O11 + H2OC6H12O6 + C6H12O6 [Sacarosa] + H2O [D(+)Glucosa] + [D(-)Fructosa] Para poder cuantificar la cantidad de sustrato en el medio, se tom en cuenta la capacidad reductora de los azcares resultantes. Por ello se emple el reactivo 3,5-dinitrosalicilato (DNS). En presencia de azucares reductores, el DNS es reducido a 3,5diaminosalicilato, el cual presenta un mximo de absorcin a 540 nm. Es por ello que al aadir este reactivo, la concentracin de glucosa y fructosa en el medio es proporcional al valor de absorbancia registrada.

Para visualizar la temperatura de mayor reaccin cataltica, se grafic la velocidad en funcin de la temperatura en grados Celcius de cada tubo.
Grafica 2. Cintica de reaccin en funcin de la temperatura

Velocidad en funcin de Temperatura

Velocidad (abs/min) 0.185 0.18 0.175 0.17 0.165 0.16 0.155 0 50 100 150 Temperatura (C)

Figura 1. Reduccin del DNS a DAS

Discusin La enzima invertasa [3.2.1.10] es una hidrolasa que acta sobre el disacrido sacarosa (razn por lo cual tambin se le conoce como sacarasa), para dar lugar de la ruptura de la molcula a (+) glucosa y

En la grfica 1 se puede observar que la actividad mxima cataltica tiene dos valores de pH idneos, en 3.5, luego sigue una cada en 4.5 y vuelve a subir la velocidad en 5.5. El comportamiento poco comn de esta grfica nos indica que posiblemente el valor de absorbancia de 4.5 no fue bien registrado, lo que supondra entonces un comportamiento creciente hasta 5.5 donde la hubo una mayor cantidad de sustrato.

Al comparar este valor con el pH ptimo terico de la enzima vemos que realmente es 4.5 5.0, por lo que nuevamente se supone un error al registrar el valor en el espectrofotmetro. La temperatura ptima de la enzima invertasa se debera encontrar entre 50 y 60 C, por lo que el valor registrado en nuestro experimento es idneo al presentarse la mayor actividad cataltica en una temperatura de 45 C. El incremento progresivo de la temperatura, proporciona mayor energa cintica entre los reactivos, lo que produce que aumente la probabilidad de colisin entre la sacarosa y la invertasa, incrementando as la velocidad de reaccin. La estructura ordenada de la enzima, depende en gran parte de puentes de hidrogeno, los cuales tienen una distancia promedio de 1.97 A. Cuando se aumenta la energa, estos enlaces se rompen, por lo cual se ve comprometida la funcin de la enzima, al no tener el plegamiento adecuado. Lo mismo sucede con el valor de pH. Tanto los aminocidos de unin al sustrato, como los que permiten la estructura terciaria de la enzima necesitan cierta grado de ionizacin. Ms importante an, es la protonacin de los aminocidos del sitio activo, los cuales al comprometerse su ionizacin, impide su accin con el sustrato. Es por ello

que la accin del pH muestra comportamiento en forma campana, siendo los extremos idneos para la actividad de enzima. Conclusin

un de no la

El dogma central de la protemica nos dice que la estructura de una protena es equivalente a su funcin, por lo que los factores que puedan modificar tal plegamiento ordenado repercutirn en la cintica enzimtica. En esta prctica se comprob el efecto de dos de estos factores, el pH y la temperatura, logrando obtener un valor ptimo de accin de ambos parmetros donde la actividad enzimtica es idnea para llevar a cabo la catlisis. Referencias bibliogrficas 1. Koolman, J., Rohm, K-H. Bioqumica: texto y atlas. Editorial Mdica Panamericana. Madrid, 2004, pg. 94. 2. Pena, A. Bioqumica. Editorial Limusa. Mxico, 1988, pp. 200201. 3. Voet, D., Voet, J.G. Bioqumica. Editorial Mdica Panamericana, Argentina, 2006, pp. 494-495.