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DETECCIN DE MICROORGANISMOS MEDIANTE MTODOS MOLECULARES

R. Rodrguez-Herrera*, C. N. Aguilar-Gonzlez, L. A. Ayala-Labarrios, J.C. Rocha-Revilla, V. Padilla-Garca, y T. C. EspinosaHernndez Laboratorio de Microbiologa y Biologa Molecular. Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad Autnoma de Coahuila . Saltillo Coahuila. Mxico.* Correspondencia rrh961@hotmail.com

RESUMEN Los microorganismos juegan un rol muy importante para el humano dado que son benficos para su salud o economa (vg. Probiticos, fijadores de nitrgeno etc) o bien patgenos para el humano, o bien de los animales y plantas econmicamente importantes. Dado lo anterior se han desarrollado una serie de metodologas para poder diferenciar un microorganismo de otro, y para poderlos identificar. Estas metodologas se ha basado tradicionalmente en la observacin de los sntomas que presentan los hospederos, en la observacin macro o microscpica del microorganismo o bien de las estructuras reproductivas de los microorganismos, del desarrollo del patgeno en un medio de cultivo especifico, de la tincin producida al aplicar algunos colorantes sobre el tejido infectado, o bien sobre el patgeno y la reaccin de un anticuerpo a la presencia de un patgeno. Estas metodologas son buenas en algunos casos pero deficientes en otros casos por lo que en las ltimas tres dcadas se han desarrollado tcnicas moleculares de deteccin e identificacin de microorganismos las cuales se basan en el anlisis de los cidos nucleicos extrados de los microorganismos en forma directa o bien de una muestra conteniendo el microorganismo en cuestin. Dentro de las ventajas de las tcnicas moleculares de deteccin se encuentran: Especificidad (pueden detectar solo la molcula o microorganismo de inters), 2.Sensibilidad (son capaces de detectar la presencia de un solo microorganismo), 3.-Rapidez (se puede identificar un microorganismo en menos de 24 horas) y 4.- Pueden ser automatizadas (permiten tener un diagnstico en un menor tiempo y reducir los costos). El objetivo del presente trabajo es describir las principales tcnicas moleculares en la deteccin e identificacin de microorganismos as como sus ventajas y desventajas.

INTRODUCCIN

Los microorganismos juegan un papel muy importante en la vida del ser humano dado que no solo son patgenos a los animales, plantas o seres humanos sino que muchos de ellos son benficos ya que pueden ser utilizados para controlar otros microorganismos, insectos, animales o plantas dainas para el hombre o su economa. Tambin los microorganismos pueden tambin ayudar a mejor el nivel de vida de los seres humanos como en el caso de los prebiticos y bacterias utilizadas en el yogurt. Por otra parte pueden ser utilizados para la produccin de alimentos para humanos o animales, como el caso de los hongos comestibles (championes, setas, huitlacoche,

etc.) o en la fermentacin de alimentos como el queso, vino, pan etc. Adems pueden ser utilizados para rehabilitacin del medio ambiente (bacterias degradadoras de hidrocarburos, tratamientos de aguas residuales etc.). Los microorganismos pueden ser utilizados para la produccin de metabolitos de importancia econmica (antibiticos, pigmentos, aminocidos, hormonas etc.). En la Agricultura, los microorganismos son utilizados por ayudar en el buen desarrollo de los cultivos (Bacterias fijadoras de nitrgeno, micorrizas, etc).

En epidemiologa es muy importante la identificacin no solo del microorganismo en cuestin sino que muchas veces la identificacin a nivel de cepas o razas ayuda a: 1.- Determinar el causante del brote infeccioso, 2.- Detectar la transmisin cruzada de patgenos, 3.- Determinar la fuente de infeccin, 4.-Reconocer cepas particularmente virulentas de organismos y 5.- Monitorear los programas de vacunacin (Olive y Bean, 1999). En el rea clnica y en la agricultura, la base para un tratamiento efectivo y cura de un paciente, animal o planta es el diagnstico rpido de la enfermedad y su agente causal (Reischl, 1996). Esto es especialmente importante cuando se pretende diagnosticar microorganismos difciles de tratar o con crecimiento muy lento tales como Clamidia, micobacterias, micoplasmas, virus del Herpes y enterovirus (Louie y col. 2000). En investigaciones ecolgicas una identificacin rpida y correcta de los microorganismos ayuda a la cuantificacin de organismos y a la caracterizacin de su actividad en diferentes hbitats (Jan y LeBorgne, 2001). El objetivo del presente escrito es recalcar la importancia de las tcnicas moleculares en la identificacin de microorganismos, describir algunas de las tcnicas moleculares ms utilizadas, as como algunas tcnicas con mayor potencial para aplicarse en el diagnstico molecular de microorganismos a corto plazo y relacionar lo anterior con algunos logros obtenidos en nuestro laboratorio.

MTODOS DE IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS

Dado la gran importancia de los microorganismos para el ser humano, se han desarrollado una serie de metodologas para poder diferenciar un microorganismo de otro. Las cuales se ha basado tradicionalmente en la observacin de los sntomas que presentan los hospederos, en la observacin macro o microscpica del microorganismo o bien de las estructuras reproductivas de los microorganismos, del desarrollo del patgeno en un medio de cultivo especifico, de la tincin producida al aplicar algunos colorantes sobre el tejido infectado, o bien sobre el patgeno y la reaccin de un anticuerpo a la presencia de un patgeno.

La identificacin de un microorganismo (patgeno) basada en los sintomatologa presenta varias desventajas como por ejemplo, los sntomas son muy variados y numerosos; dependen del hospedero del patgeno, e incluso de los factores del medio ambiente en el que se desarrolla el

proceso patolgico. Debido a lo anterior la identificacin de patgenos basada solo en los sntomas puede dar origen a errores graves en el diagnstico de una enfermedad dado que dos diferentes patgenos pueden producir los mismos sntomas en el mismo hospedero, el mismo patgeno puede producir diferentes sntomas en diferentes hospederos y aun los sntomas pueden variar dependiendo del medio ambiente donde se desarrolla el proceso patolgico.

La deteccin de un microorganismo basada en la observacin macro o microscpica es ms eficiente que la identificacin basada solo en los sntomas. La observacin a nivel macro o microscpico es un procedimiento simple, es una deteccin directa de patgenos y puede diferenciar organismos distintos morfolgicamente. Presenta las siguientes desventajas: 1.- Es un procedimiento lento, 2.- Laborioso y 3.-Tedioso dado que se tiene que aislar el microorganismo (lo cual no en todos los casos es posible) y poner a crecerlo en un medio de cultivo hasta que se alcance un tamao o una etapa de crecimiento adecuada para su identificacin. La identificacin en forma microscpica solo es posible en casos muy especficos. Es de baja sensibilidad. Se requiere contar con equipo muy especializado para la identificacin a nivel microscpico de algunos microorganismos (virus, micoplasmas, viroides, priones). La estructura de un microorganismo puede cambiar debido a la influencia del medio ambiente, y se requiere de una gran experiencia para poder diferenciar una especie de otra a nivel microscpico.

La identificacin de patgenos por medio de tinciones o del desarrollo del patgeno en un medio de cultivo especifico, puede detectar un amplio rango de variantes, no requiere de equipo muy sofisticado, son pruebas fciles de realizar. Sin embargo presenta las desventajas de que el tiempo para identificar un microorganismo puede ser muy largo (en algunos casos hasta de 25 das), adems se requieren un gran nmero de pruebas para estar seguro de la identificacin del patgeno (una sola prueba no es suficiente en la mayora de los casos). Por usarse diferentes pruebas, se utilizan una amplia gama de reactivos, lo cual incrementa el costo de la prueba significativamente. Otros procedimientos como el cultivo in vitro e inoculacin en ratones son tcnicas costosas y los patgenos pueden presentar diferencias en infectividad dependiendo del hospedero.

El uso de anticuerpos para la identificacin de microorganismos se ha empleado por ser una tcnica simple y rpida. Se puede automatizar, y puede ser usada para trabajar con varias muestras al mismo tiempo. Sin embargo la deteccin no puede ser precisa cuando existen cantidades mnimas de microorganismos, en el caso de patgenos no distingue entre infecciones activas y latentes. Adems se carece de anticuerpos y antgenos para muchos microorganismos y en algunos casos la deteccin no es precisa por la nula especificidad de algunos anticuerpos. Otras desventajas son que los anticuerpos tienen un costo muy elevado o bien en algunos casos pueden ofrecer falsos positivos, como por ejemplo en la primera generacin de pruebas para la deteccin

de VIH, las cuales estaban basadas en preparaciones puras del antgeno viral derivadas del cultivo del virus, y se obtenan falsos positivos, debido a la presencia de antgenos celulares residuales los cuales fueron incorporados dentro de partcula viral durante la maduracin (Reischl, 1996).

Las tcnicas moleculares se basan en el anlisis de los cidos nucleicos extrados de los microorganismos en forma directa o bien de una muestra conteniendo el microorganismo en cuestin.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS MTODOS MOLECULARES

En la actualidad las tcnicas moleculares para la identificacin de microorganismos estn teniendo un auge muy importante debido a: 1.- Especificidad (pueden detectar solo la molcula o microorganismo de inters), 2.- Sensibilidad (son capaces de detectar la presencia de un solo microorganismo), 3.-Rapidez (se puede identificar un microorganismo en menos de 24 horas) y 4.Pueden ser automatizadas (permiten tener un diagnstico en un menor tiempo y reducir los costos). El uso de tcnicas moleculares ha permitido identificar nuevos microorganismos, los cuales no haba sido posible su cultivo e identificacin por tcnicas tradicionales (Jan y LeBorgne, 2001). Adems permiten estudiar las poblaciones microbianas sin hacer aislamientos, por lo tanto, se evitan los sesgos que pueden surgir con el cultivo de microorganismos (Chan y col., 2002). As mismo estas tcnicas permiten la deteccin de microorganismos altamente patgenos, los cuales pueden ser identificados muertos evitando as los riesgos de infeccin del analista (Johansson y col., 2000). Las tcnicas moleculares han demostraron ser muy tiles en situaciones clnicas donde los mtodos convencionales son muy insensitivos (v.g. durante la etapa asintomtica de las infecciones del VIH), muy lenta (cultivo micobacterial) o muy complicados para ser usados a gran escala (v.g. aislamiento viral). Otra aplicacin importante es en el monitoreo del surgimiento de mutaciones en el genoma, por ejemplo, la seleccin de variantes resistentes durante la terapia antiviral/antibitica (Reischl, 1996).

Algunas de las desventajas asociadas a las tcnicas moleculares son: 1.-No distinguen entre organismos vivos y muertos, aunque algunas veces esto no es precisamente una desventaja en el caso de Staphylococcus aureus la bacteria muere a temperaturas que no degradan la toxina as la deteccin de la bacteria muerta es un indicativo de la presencia de toxinas en la muestra. 2.-Se tiene que contar con conocimientos de secuencias de nucletidos especificas del patgeno diagnosticar, 3.-Se requiere de personal altamente capacitado para el desarrollo de las pruebas de identificacin, 4.-Se requiere equipo mas especifico para el diagnostico, lo cual eleva la inversin inicial, y 5.-Se desarrollan procedimientos con mltiples etapas, lo que incrementa la posibilidad de errores, adems de la posibilidad de obtener falsos positivos y falsos negativos. El alto costo de

las tcnicas moleculares tendera a bajar a medida que se incremente el uso de estas tcnicas. Por otra parte el problema de falsos positivos y falsos negativos se puede solucionar si se incluye en cada anlisis un testigo positivo y un testigo negativo (Ayala y col., 2004).

DETECCIN MOLECULAR DE MICROORGANISMOS

Se han propuesto una gran variedad de tcnicas moleculares para la deteccin de microorganismos. Describir cada una de las tcnicas propuestas escapa de los alcances de este escrito. Por lo que solo se abordaran las ms usadas comercialmente. Una de las tcnicas moleculares ms sencillas para identificar bacterias consiste en determinar el porcentaje de guaninas y citosina presente en su ADN. En este caso se realiza la extraccin del ADN de una colonia pura y por espectrometra se determina el porcentaje de guanina y citosina. En el gnero Pantoea se ha estimado un porcentaje de guanina y citosina que va del 50 al 58% y en bacterias del gnero Pseudomona un porcentaje va del 58 al 70%. Esta tcnica tiene la desventaja de no poder identificar especies, solo se pueden identificar bacterias a nivel de gnero, adems algunos gneros de bacterias presentan porcentajes de guaninas y citosina muy similares, por lo cual, las posibilidades de obtener falsos positivos (identificar a un organismo presente cuando en realidad esta ausente) se incrementan. La mayora de las tcnicas moleculares se basan en la hibridacin de los cidos nucleicos o bien en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).

a).- Tcnicas basadas en hibridacin de ADN

Estas tcnicas se desarrollaron a partir del conocimiento de que dos cadenas sencillas de cido nucleico que tengan secuencias complementarias se pueden unir o hibridar para formar una cadena doble. Las cadenas sencillas pueden ser de ADN o ARN, o bien una de ADN y otra de ARN. Dentro de las tcnicas de hibridacin mas utilizadas esta los fragmentos de restriccin de longitud polimrfica (RFLPs).

RFLPs. Esta tcnica est basada en hibridacin de ADN. Consiste en extraer ADN de un cultivo puro de un microorganismo o bien de una muestra infectada y digerir el ADN con enzimas de restriccin (enzimas que cortan el ADN en sitios especficos), posteriormente estos fragmentos de ADN son separados en un gel de agarosa utilizando electroforesis. El ADN est cargado negativamente, por lo tanto, en un campo elctrico el ADN migrara del polo negativo hacia el polo positivo a travs de la matriz de un gel. La friccin entre el fragmento y la matriz ocasiona que fragmentos pequeos migren ms rpido que fragmentos grandes. En esta tcnica el ADN

separado de la forma antes descrita en la gel, es transferido a un soporte slido (membranas de nylon o nitrocelulosa), acto seguido se hibridiza el ADN de la membrana con una sonda de ADN especifica (fragmento de ADN de cadena sencilla de 150 a 300 nucletidos) del microorganismo que se quiere identificar. La sonda va a unirse en el fragmento del ADN que tenga su complemento. La sonda para la deteccin tiene que ser marcada en forma radioactiva (P32) o no radioactiva (digoxigenina). La sonda puede ser aislada del genoma nuclear, del genoma mitocondrial o bien de ADN que codifica para protenas (ADNc) del microorganismo. Esta metodologa es muy especfica. Sin embargo, no es muy rpida ni muy sensible (se requiere 103 a 106 copias de la molcula o secuencia de inters para dar un resultado confiable), adems de que se requiere utilizar radioactividad (si no es empleada adecuadamente y bajo condiciones especiales de laboratorio, se pueden tener riesgos de salud del analista, contaminaciones de instalaciones o del medio ambiente).

Una variante de RFLP`s se ha diseado para la deteccin de Listeria. Esta consiste en fijar en un microtubo una sonda de ADN complementaria a una regin del RNA ribosomal de la bacteria. El RNA completo de la muestra es extrado y colocado en el microtubo con la sonda, la cual se unir al RNA ribosomal, posteriormente se agrega otra sonda de ADN complementaria a otra regin del RNA ribosomal la cual est marcada con florescencia posteriormente se detecta la presencia del microorganismo por un anticuerpo con anti-florescencia (Giese, 2001).

Transferencia por aplastado (squash blot). En esta tcnica la muestra a analizar se aplasta contra un soporte slido originando una huella, la muestra se fija utilizando alcohol o exponindola a UV. Se hibridiza con la sonda especfica para el microorganismo en cuestin. Tiene la ventaja de ser una tcnica rpida, que puede ser utilizada en campo o fuera de laboratorio. Sin embargo es una tcnica sucia, lo cual a veces no permite distinguir una hibridacin de cidos nucleicos, con lo cual las probabilidades de obtener falsos negativos (diagnosticar el microorganismo como ausente cuando en realidad est presente) se incrementan. Otra de las tcnicas son: Transferencia de punto (dot blot) similar a squash blot y Northern blot similar a RFLPs sin embargo lo que se separa es ARN y se hibridiza con sondas de ADN presenta ventajas y desventajas similares a RFLPs.

ARN de cadena doble. Esta tcnica se utiliza principalmente para detectar clulas infectadas con un virus que tenga como material gentico ARN (retrovirus). Dado que el ARN en una clula se encuentra como cadena sencilla, la presencia de ARN de cadena doble implica la replicacin del virus dentro de la clula. Esta es una tcnica relativamente sencilla, dado que incluye pocas etapas (extraccin y purificacin del ARN de cadena doble y su separacin en geles de poliacrilamida). Sin embargo, presenta la desventaja de identificar solo clulas infectadas con retrovirus, sin poderse especificar la taxonoma del virus, por lo tanto es una tcnica muy limitada.

b).- Tcnicas basadas en PCR

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) o la amplificacin enzimtica in vitro de un segmento de ADN especfico del microorganismo blanco. Esta es la tcnica ms utilizada para la deteccin de microorganismos, se basa principalmente en realizar millones de copias de un segmento de ADN especfico de un microorganismo. En esta tcnica la cadena doble de ADN es separada en dos cadenas sencillas sometindola a temperaturas mayores a 92 grados centgrados despus se hibridiza o alineen dos pequeos segmento de ADN complementarios uno a una cadena y el otro a la otra. Estos pequeos segmentos son llamados iniciadores, los cuales deben de ser diseados de tal manera que solo hibridisen con el ADN del microorganismo que se desee y su tamao generalmente va de 18 a 25 bases. Una vez que los iniciadores estn unidos a las cadenas complementarias se adiciona a la reaccin una ADN polimerasa la cual va a formar la nueva cadena tomando como bases la cadena sencilla y uno de los extremos del iniciador (3). Despus de este primer ciclo, si se parti de una sola cadena doble de ADN se tendran dos cadenas dobles. Esta amplificacin se incrementa en forma geomtrica a medida que se repite el numero de ciclos, as despus de dos ciclos tendramos cuatro cadenas dobles de ADN, y despus de tres, ocho y as sucesivamente, despus de treinta ciclos tendramos una gran cantidad de ADN amplificado para ser visualizado a simple vista. Las ventajas de PCR sobre otras tcnicas de deteccin se han reportado en varias ocasiones. La deteccin de C. trachomatis por PCR resulto ser mas precisa, con sensibilidad de 90-100% y especificidad mayor al 97% que la deteccin por ELISA (Louie y col., 2000). As mismo la PCR ha ayudado a identificar microorganismos infecciosos relacionados a enfermedades previamente identificadas como de origen no infeccioso.

La tcnica de PCR se ha utilizado para la identificacin de virus, bacterias hongos, fitoplasmas nematodos etc. Un ejemplo es el mtodo desarrollado por Ayala y colaboradores 2004, para la identificacin de la bacteria Clavibacter michiganensis subs. nebraskensis, la cual es causante de la enfermedad conocida como marchites bacteriana del maz, en este caso se disearon iniciadores especficos a un segmento entre los genes de rRNA 16 S y 23S. Dichos iniciadores se compararon con las secuencias de ADN reportadas en los bancos de genes para comprobar que solo se alinearan a la secuencia de Clavibacter michiganensis subsp nebraskensis. La precisin y reproducibilidad de los ensayos de PCR depende de la experiencia tcnica y experiencia de analista. La especificidad de la prueba puede ser afectada por la contaminacin de la muestra durante su procesamiento. Si los iniciadores no son especficos o si las condiciones de la PCR no son optimas, se pueden amplificar productos no especficos (Louie y col., 2000). Lo anterior puede guiar a la deteccin de falsos negativos, de la misma manera la contaminacin de la muestra con inhibidores (cidos hmicos, polifenoles, carbohidratos, etanol, etc) de la enzima polimerasa puede ocasionar tambin falsos negativos. Sin embargo esto se puede solucionar incorporando siempre controles positivos. La contaminacin de la muestra con otro ADN o RNA, puede conducir

a la deteccin de falsos positivos, esto se soluciona agregando siempre un control negativo (Ayala y col., 2004). La identificacin de microorganismos directamente de alimentos utilizando PCR presenta algunas retos como es la baja sensibilidad provocada por la inhibicin debida a la matriz del alimento, esto puede ser parcialmente restablecida con una etapa de enriquecimiento pero se alarga el tiempo para el diagnostico (Grant y col., 1993). Aun con estas desventajas, la flexibilidad, automatizacin, rapidez y confiabilidad de las tcnicas moleculares basadas en PCR son las tcnicas moleculares con ms aceptacin en la actualidad para la deteccin de microorganismos en general.

RT-PCR (amplificacin de un segmento de ADN previamente formado a partir de ARN). Esta es una de las tcnicas ms utilizadas para identificar microorganismos cuyo material gentico es ARN (retrovirus y viroides). En este caso se extrae primeramente ARN del microorganismo en cuestin o bien de una muestra presuntamente infectada por uno de estos microorganismos, acto seguido el ARN se somete a una temperatura generalmente de 80 0C para linearizar el ARN dado que es por lo general una cadena sencilla y tiende a formar estructuras secundarias y terciarias. Posteriormente se le aade un iniciador complementario y se coloca a una temperatura entre 37 y 40 oC para que se alinee el iniciador con la cadena complementaria, posteriormente se coloca la reaccin a 4oC con lo cual se detiene esta. Despus se coloca una enzima denominada reverso transcriptasa la cual se va a encargar de formar ADN tomando como molde el ARN de cadena simple y un extremo ( 3) del iniciador cuando el ADN ya ha sido formado se procede a realizar la reaccin del PCR, esta tcnica puede ser realizada en un solo paso si se aaden todos los reactivos en un mismo tubo y se programan las temperaturas especificas y para cada etapa. Un ejemplo de un microorganismo que puede ser fcilmente identificado utilizando esta tcnica es el virus de la tristeza de los ctricos. Otra de las ventajas de esta tcnica en la deteccin de microorganismos es que permite identificar infecciones activas (Louie y col., 2000).

PCR anidada (amplificacin enzimtica de un segmento de ADN interno de un segmento de ADN previamente amplificado). La PCR anidada es una tcnica que se utiliza principalmente cuando un microorganismo se encuentra en muy bajas cantidades o bien cuando se quiere identificar si en una muestra existen microorganismos de un determinado grupo y despus determinar que especies de microorganismos de ese grupo estn presentes. Esta tcnica consiste en amplificar un segmento grande de ADN (700-2000 pb) por la tcnica de PCR con un par de iniciadores y posteriormente amplificar con otro par de iniciadores un segmento interno del primer fragmento amplificado es decir esta tcnicas es una PCR doble y por lo tanto se estima que es mil veces ms eficiente que una PCR simple. La PCR anidada se ha utilizado con xito para la identificacin de muestras presuntamente infectadas con fitoplasmas, y si la muestra es positiva a la presencia de fitoplasmas. Se amplifica por segunda ocasin para determinar el tipo especfico de fitoplasmas presente en dicha muestra. Un ejemplo del uso de esta tcnica es la deteccin del fitoplasma del amarillamiento letal del cocotero.

RAPDs o polimorfismo del ADN amplificado al azar en este caso se realiza una reaccin de PCR con un solo iniciador el cual tiene un tamao de 8 a 12 bases con secuencia arbitraria. En la etapa de alineamiento del iniciador se emplean temperaturas bajas 37 a 40 oC para asegurar que el iniciador se una a diferentes regiones del genoma del microorganismo que se desee identificar. En este caso la identificacin se realiza solo de cultivos puros del microorganismo y con una sola reaccin del PCR se amplifican varios segmentos a la vez (Figura 1). Tiene la ventaja de que no se requiere conocimientos previos del microorganismo para poderlo identificar, esta tcnica como mtodo de identificacin a nivel comercial no es muy utilizada debido a los problemas de reproducibilidad, sin embargo es muy til cuando se requiere determinar diferencias entre 2 microorganismos altamente emparentados pudindose detectar estas diferencias aun a nivel de cepa. Padilla en el 2003 utilizando RAPDs logro identificar diferencias a nivel de ADN entre 3 cepas del Aspergillus niger degradadoras de taninos. Otra ventaja de los RAPDs es en el caso donde se logra identificar un fragmento de ADN amplificado que se encuentre en una cepa en particular, este se puede secuenciar y se pueden disear a partir de esa secuencia iniciadores especficos para esa cepa. Lo mismo aplica para el diseo de iniciadores especficos a nivel de especie o de gnero esta tcnica es conocida como SCAR (secuencia caracterizada de regin amplificada) (Figura 2). Adems de la desventaja de poca reproducibilidad, la presencia de una banda RAPD, no permite distinguir entre los estados homocigoto y heterocigoto (Babalola, 2003). Una tcnica similar a RAPD`s es la conocida como amplificacin de huellas genmicas del ADN (DAF), en esta tcnica se utilizan iniciadores de 5-10 bases para amplificar ADN genmico al azar, las bandas amplificadas se separan en geles de poliacrilamida. Esta tcnica se ha utilizado para el estudio de cepas de Salmonella enterica (Babalola, 2003) Inmuno-PCR (unin de un microorganismo a un soporte slido utilizando un anticuerpo y una posterior amplificacin de ADN por PCR). Es una tcnica que combina las ventajas de las tcnicas inmunolgicas (ELISA) y de las tcnicas moleculares (PCR) para que las ventajas combinadas, disminuyan o eliminen las desventajas de ambas tcnicas. Rocha en el 2003, menciona que ELISA es ineficiente en la deteccin cuando se presentan niveles muy bajos de la molcula o microorganismo de inters en la muestra a analizar, mientras que la PCR se ve inhibida por algunos componentes de la muestra (compuestos fenlicos, polisacridos etc.). Estas caractersticas se combinan cuando se desea detectar microorganismos cuarentenados directamente de rganos vegetales (semillas, tubrculos etc). Rocha (2003) adapto la tcnica de inmuno PCR para la deteccin de Pantoea stewartii, directamente de la semilla de maz. En este caso fijo un anticuerpo primario a un microtubo, se lavo el exceso de anticuerpo y se coloco la muestra molida de la semilla, la cual se conoca que estaba infectada por Pantoea stewartii, posteriormente se dejo incubando por una hora para la unin antgeno-anticuerpo, se lavo para eliminar la muestra y en el tubo con el antgeno y el anticuerpo se realizo la PCR.

Inmunomagnetic PCR (similar a la anterior, en este caso el soporte es una esfera magntica, la cual es removida de la muestra con un magneto y posteriormente se realiza la PCR) . En esta tcnica un anticuerpo primario se encuentra unido a perlas metlicas las cuales se colocan dentro de la muestra a analizar, se deja incubar para la unin antgeno-anticuerpo, posteriormente se extraen estas perlas metlicas con un magneto, se lavan y se colocan en un tubo en el cual se realiza la PCR. Esta tcnica se ha utilizado para la deteccin de Listeria monocytogenes en alimentos.

PCR-mltiple. Uno de los problemas de las tcnicas de PCR discutidas anteriormente es que solo permiten la identificacin de un solo patgeno a la vez. Con la finalidad de solucionar este problema se ha diseado la tcnica conocida como PCR-mltiple la cual permite la deteccin de diferentes molculas o microorganismo de inters en una sola reaccin. En esta tcnica se incorporan a la reaccin un par de iniciadores por cada uno de las molculas o microorganismos a detectar, lo cual permite un ahorro en tiempo y costo para la deteccin de diferentes microorganismos simultneamente. Esta tcnica presenta retos como el de disear todos los iniciadores que se deseen agregar a la reaccin con similar temperatura de alineamiento, no deben de presentar homologa entre ellos, adems de amplificar fragmentos de diferentes longitudes. La sensibilidad de una PCR mltiple es del orden de 102 clulas o de 2.9 pg de ADN de inters. Sin embargo esta sensibilidad puede ser afectada por el diseo ineficiente de los iniciadores (Rodrigues y col., 2003). Esta tcnica se ha utilizado para la deteccin de diferentes especies de Listeria en una misma muestra, as como para detectar diferentes microorganismos a la vez como es el caso de Salmonella, Campylobacter, Shigella y E. coli (Babalola, 2003). La PCR mltiple tambin ha sido usada para detectar diferentes genes de un mismo organismo en una muestra. Clulas infectadas no retienen todos los genes del virus del papiloma humano por lo tanto usando PCR mltiple se identific la presencia de varios genes vrales a la vez, lo cual confirm el agente causal (Karlsen y col., 1996). Esta tcnica tambin es usada para identificar cuales genes de resistencia a antibiticos poseen una determinada cepa bacteriana (Prez-Roth y col., 2001). IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS ALTAMENTE EMPARENTADOS

En algunas ocasiones uno se encuentra en una situacin en la cual tiene que identificar una cepa especial de un microorganismo ya que esta presenta caractersticas sobresalientes de produccin de alguna enzima o bien de adaptacin a una determinada condicin, o bien cuando se requiere preservar la identidad de una cepas en particular, lo cual ayudara a determinar si se contamin, as mismo cuando se quieren establecer relaciones de parentesco gentico (filogentica) entre diferentes cepas de una especie, diferentes especies de un gnero, diferentes gneros de una misma familia o bien entre diferentes familias de microorganismos. Todos estos casos se presentan cuando se identifica una cepa con una caracterstica no reportada previamente, por lo

tanto las tcnicas moleculares permiten tener un control sobre la produccin y diseminacin de esta cepa. Algunas de las tcnicas moleculares que ayudan para la identificacin de microorganismos altamente emparentados adems de las discutidas previamente son: RepPCR, PCR-RFLP, AFLPs entre otros.

Rep-PCR esta tcnica est basada en la amplificacin simultnea de diferentes regiones con secuencias repetidas, se ha utilizado preferentemente en bacterias amplificando las regiones BOX, ERIC, y Rep. En este caso se obtienen varios fragmentos de diferentes tamaos los cuales son amplificados simultneamente lo cual permite distinguir dos microorganismos altamente emparentados al comparar los patrones de amplificacin de estos microorganismos. Se ha propuesto que la tcnica REP-PCR puede ser usada para elucidar las bases genticas de la variabilidad fenotpica entre diferentes especies, dado que se producen patrones de bandeado reproducibles, de complejidad similar, y permiten la diferenciacin de cepas al nivel de subespecie (Johansson y col.. 2000). Esta tcnica se ha utilizado para la identificacin de diferentes especies de Xanthomonas y de Francisella.

PCR-RFLP esta tcnica consiste en amplificar por PCR un segmento especfico de un microorganismo y posteriormente digerir el ADN amplificado con enzimas de restriccin, esto permite poder determinar diferencias entre los patrones de bandas amplificadas y/o entre los patrones de los fragmentos resultantes de la digestin del ADN. Existen diferentes variantes de esta tcnica dependiendo del fragmento especfico amplificado y digerido. Entre los segmentos ms comnmente amplificados y posteriormente digeridos se encuentran los genes ribosomales (16s en el caso de procariotes y 18s en el caso de eucariotes), los espacios entre el conjunto de genes ribosomales (espacios intergnicos IGS) (Figura 4) y los espacios internos transcritos (ITS) (Figura 5) del conjunto de genes ribosomales. El gen ribosomal 16S est altamente conservado pero con la variabilidad suficiente para hacer distinciones entre gneros y especies (Jan y LeBorgne 2001). Se han desarrollado iniciadores a partir de la secuencia del gen ribosomal 16S dentro de un rango muy amplio (universales), desde el nivel de dominio (bacterias, archaea o eucariotes), grupos (bacterias metanognicas, bacterias sulfatoreductoras, bacterias lcticas, etc) hasta gneros individuales (Escherichia) (Jan y LeBorgne 2001). Sin embargo cuando la resolucin del anlisis basado en el gen 16S rRNA es muy pequea para hacer inferencias sobre el parentesco de microorganismos altamente relacionados se ha propuesto la utilizacin del gen gyrB el cual codifica para la subunidad B del polipptido de la ADN girasa. Se ha estimado que este gen evoluciona ms rpido que el gen 16S rRNA mientras que aun mantiene una alta correlacin con la homologa del genoma total analizada por hibridacin total ADN-ADN y microarreglos (Rodrguez y col.., 2003). Se han establecido metodologas para la identificacin rpida basada en PCR-RFLP de cuatro especies altamente emparentadas de Carnobacterium las cuales son importantes en la industria alimentaria (Babalola, 2003). La amplificacin de los segmentos IGS y su posterior digestin con la enzima Hind III permiti identificar diferentes cepas de Penicillum purpurogenum

(Espinoza, 2004) La amplificacin de los segmentos ITS y su posterior digestin con la enzima Xho I permiti la identificacin de diferentes cepas altamente emparentadas de Aspergillus niger (Padilla, 2003). AFLP`s. Amplificacin de fragmentos de longitud polimrfica. Esta tcnica se basa en la amplificacin de un subgrupo de fragmentos de ADN generados por la digestin con enzimas de restriccin. El ADN de los microorganismos es aislado, purificado y sometido a digestin con las enzimas de restriccin Eco RI y MseI. Los fragmentos de restriccin son despus ligados a adaptadores los cuales contienen sitios de restriccin a cada uno de los extremos del fragmento y una secuencia homologa al sitio de apareamiento del iniciador. Los iniciadores usados para la amplificacin contienen secuencias de ADN homologas a los adaptadores y contienen una a dos bases selectivas a las terminaciones 3 de los fragmentos. As los nucletidos selectivos, permiten la amplificacin de solo un subgrupo de los fragmentos cortados. Los AFLP`s han demostrado ser reproducibles, y una buena forma de diferenciar cepas de microorganismos altamente emparentadas. La deteccin a nivel comercial se ve restringida por el alto costo del secuenciador que se utiliza para visualizar los fragmentos amplificados (Olive y Bean, 1999). Restrepo y col.., en 1999 evaluaron la eficiencia de la tcnica de AFLP`s para detectar la variacin gentica entre diferentes cepas de Xanthomonas axonopodis.

DGGE. Electroforesis en geles con gradiente desnaturalizante. Esta tcnica es capaz de separar secuencias altamente relacionadas por su diferente movilidad en gradientes desnaturalizantes (Kowalchuk y col.., 1997). En esta tcnica comnmente se amplifica alguno de los genes que codifican para el RNA ribosomal (16S rDNA, 18S rDNA etc). El ambiente desnaturalizante se crea manteniendo una temperatura uniforme (50-60 oC) y un gradiente lineal con urea y formamida. El incremento de una concentracin desnaturalizante separa las cadenas dobles de ADN en dominios distintos. Cuando un dominio alcanza su temperatura de desnaturalizacin en una posicin particular del gel ocurre una transicin del hlice doble a parcialmente desnaturalizado, y la migracin de la molcula prcticamente se detiene. Las variaciones en la secuencia de los dominios causa que sus temperaturas de desnaturalizacin sean diferentes; por lo tanto, migran a posiciones diferentes dentro del gradiente desnaturalizante, logrndose la separacin de los dominios de manera efectiva (Jan y LeBorgne, 2001). Kowalchuk y col. en 1997 amplificaron el gen 18S rRNA de 20 especies fngicas y sometieron los productos amplificados a DGGE, adems secuenciaron las bandas separadas con DGGE, con esto se pudo identificar algunas cepas fngicas.

TGGE. Electroforesis en geles con gradiente de temperatura. Similar al DGGE, sin embargo en este caso el gradiente se crea incrementando gradualmente la temperatura durante la electroforesis. El ambiente desnaturalizante se forma por una concentracin constante de urea en el gel, combinado con el gradiente de temperatura temporal (Jan y LeBorgne, 2001). Esta tcnica puede utilizarse para estudiar la diversidad de especies en una comunidad de microorganismos y comparar as la diversidad de especies entre comunidades. Esta comparacin se basa en que el

nmero, la posicin precisa y la intensidad de las bandas reflejan el nmero y abundancia de los tipos dominantes de rDNA en una muestra y as se puede comparar dos comunidades de microorganismos (Eichner y col., 1999).

FUTURO DE LA DETECCIN DE MICROORGANISMOS

Actualmente existen tcnicas muy prometedoras que en los prximos aos jugarn sin duda un papel importante en la deteccin y cuantificacin de un microorganismo en una muestra dada, las consideradas con ms futuro se enuncian a continuacin.

PCR en tiempo real. En esta tcnica adems de los componentes tradicionales de una PCR normal se agrega un sonda de ADN la cual en un extremo tiene un quincher y en el otro extremo un beacon esta sonda es complementaria al ADN que se desea amplificar por lo tanto se alineara con todas las cadenas de ADN en donde est su complemento cuando la ADN polimerasa amplifica los fragmentos libera esta sonda del ADN la cual est unida, al liberarse se emite una fluorescencia la cual puede ser detectada, as entre mas ADN se amplifique ms luz se emitir por lo tanto se puede estimar el nmero de fragmentos de ADN amplificado. Con esto podemos cuantificar el nmero de molculas del ADN del microorganismo presente en la muestra en cuestin. Esta tcnica ha sido usada para medir cuantitativamente la carga viral con el objetivo de monitorear la respuesta a la terapia por pacientes con infecciones de VIH, citomegalovirus, o virus de la Hepatitis C (Louie y col. 2000). La cuantificacin de un determinado microorganismo en una muestra es de importancia prognstica, ayuda a predecir el progreso de una enfermedad, y es usada para asistir en la decisin del tratamiento mdico. Adems, la tcnica de PCR en tiempo real se adapta para la evaluacin de un nmero grande de muestras al mismo tiempo, permitiendo un diagnstico de laboratorio, rpido, confiable, eficiente y barato (Klotz y col.., 2003)

Microarreglos o microchips. Esta tcnica utiliza la complementariedad de las bases nitrogenadas del ADN y consiste de un arreglo ordenado de cientos o miles de secuencias de ADN (oligonucleotidos, cDNA, etc) depositados sobre una superficie slida (1.2 x 1.2 cm.). Los soportes slidos son piezas de silicio o de vidrio. Para la deteccin de microorganismos se puede construir un arreglo (chip) con ADN de diferentes microorganismos, posteriormente una muestra conteniendo ADN de uno o varios microorganismos puede ser depositada e hibridada sobre el arreglo y cualquier ADN no hibridado puede ser eliminado por lavados. El arreglo es despus analizado y escaneado para poder determinar con que ADN especfico se hibrido el ADN de la muestra e identificar el o los microorganismos presentes en la muestra. Actualmente esta tcnica es muy costosa tanto por los reactivos empleados como por el digitalizador de imgenes utilizado para escanear los microarreglos (Rapley, 2000).

Secuenciacin. La determinacin del orden o secuencia de bases a travs de un segmento de ADN es una de las tcnicas centrales de la biologa molecular. Se cuenta con dos tcnicas para secuenciar una basada en un mtodo enzimtico y la otra en un mtodo qumico. Los requisitos que debe tener una secuencia para poder utilizarse en la identificacin de microorganismos son 1.La secuencia debe de ser conservada entre un nmero de organismos relativamente grande. 2.- Su proporcin de cambio debe ser constante sobre largos periodos y entre diversos organismos y deber permitir inferencia de la distancia evolutiva entre un amplio rango de formas de vida; la secuencia no debe ser sujeta a grados amplios discrepantes de la presin de evolucin. Tercero, La secuencia deber no haber sido compartida entre diferentes organismos por transmisin horizontal. Finalmente, la secuencia deber ser factible de ser amplificada y detectada de variadas formas (Relman, 1998). Secuencias que cumplen con los anteriores requisitos son las regiones que codifican para las pequeas unidades ribosomales 16S en procariotes y 18 S en eucariotes (Vinayagamoorthy y col. 2002) reportan un mtodo basado en la secuencia de nucletidos que puede simultneamente generar secuencias cortas conocidas de nucletidos de un nmero de segmentos del mismo genoma o de diferentes genomas. La secuenciacin es uno de los mtodos con ms futuro dado que se puede solo amplificar por PCR el gen ribosomal 16S o 18S, separar las bandas amplificadas, secuenciar o mandar secuenciar las bandas encontradas, posteriormente comparar esas secuencias con las secuencias depositadas en los bancos de genes y poder llegar a identificar el o los microorganismos presentes en una muestra.

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