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PRODUCCIN DE FRUCTOSA

Antn Taboada Santos. Bioingeniera. Mster en ingeniera qumica y bioprocesos. Universidad de Santiago de Compostela. Resumen: el objetivo de este trabajo es el estudio del proceso de fabricacin de fructosa haciendo especial hincapi en la produccin de jarabes de maz de alto contenido en fructosa HFCS (high fructose corn syrup). Partiendo de una materia prima rica en almidn, (habitualmente maz), se obtiene glucosa tras una etapa de hidrlisis y una de sacarificacin para finalmente realizar una isomerizacin enzimtica y convertir esta glucosa a fructosa en un porcentaje de 42 o 55%. Se comentarn tambin los distintos microorganismos encargados de la generacin de las enzimas necesarias para llevar a cabo estas reacciones bioqumicas, las condiciones en las cuales se lleva a cabo dicha operacin y se tratar brevemente la mutgenesis dirigida sobre estos microorganismos, una tcnica que sirve para mejorar su comportamiento en este tipo de procesos.

1. Introduccin Despus de la D-glucosa, la D-fructosa es el monosacrido ms importante. Pese a ello, solo se ha producido en cantidades industriales a lo largo de los ltimos 30 aos. Fue descrita por primera vez en 1853 cuando fue obtenida como un azcar no cristalizable a partir de la hidrlisis de la inulina (nombre con el que se designa a una familia de glcidos complejos compuestos de cadenas moleculares de fructosa), aunque se estructura molecular fue descubierta por E. Fischer en 1891. Es el ms dulce de los azcares naturales (algunos azcares sintticos son ms dulces). La D-fructosa es una ketohexosa, y segn la nomenclatura IUPAC se clasifica como una hexulosa. La fructosa, en su forma cristalina, existe en la forma -piranosa, aunque la forma furanosa es ms comn en otras estructuras como sacarosa, rafinosa o inulina. Las disoliuciones de

fructosa contienen

tambin

los

otros

dos

anmeros de esta forma cclica (-piranosa y furanosa) al mismo tiempo que una pequea cantidad (1%) de la forma keto de cadena abierta, como se puede observar en la figura 1.1.

Figura 1.1 Distribucin tautomrica en agua a 20C.

La fructosa se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza, especialmente en frutas como (manzanas, peras) en forma de monosacrido libre, pero tambin es un constituyente de varios di-, oligo- y polisacridos como la sacarosa, la rafinosa o la inulina. Es un producto normal del metabolismo humano, se puede encontrar en el esperma o el lquido amnitico. [1] La conversin enzimtica de D-glucosa a Dfructosa es un importante proceso industrial, en especial para la produccin de jarabes de maz de alto contenido fructosa HFCS. Su principal uso es como edulcorante en bebidas gaseosas

estn

clasificados

como

genotxicos

carcirgenos.[2]

2. Alternativas para la produccin de fructosa Industrialmente, la fructosa se puede obtener a partir de sacarosa, inulina y almidn. 2.1. Obtencin a partir de inulina Las races y los tubrculos de la achicoria, la alcachofa de Jerusaln y las dalias contienen inulina que puede ser hidrolizada a fructosa despus de la extraccin de la misma. La hidrlisis se lleva a cabo en medio cido y con alta presin y temperatura. La adicin de hidrxido de calcio provoca la precipitacin de fructosato de calcio, que es recogido por filtracin. La fructosa es obtenida entonces tratando una suspensin acuosa del precipitado con dixido de carbono. Sin embargo, por motivos econmicos este tipo de procesos est en la actualidad obsoleto. Se ha sugerido que las prdidas debidas a reacciones secundarias pueden ser disminuidas mediante la realizacin de la etapa de hidrlisis mediante catlisis enzimtica utilizando fructozima. 2.2. Obtencin a partir de sacarosa La hidrlisis de sacarosa produce una mezcla de glucosa y fructosa que puede ser separada por cromatografa. La hidrlisis puede llevarse a cabo de una manera continua utilizando ya sea la forma protonada de un intercambiador de cationes o la enzima invertasa. El hidrolizado resultante se separa en un proceso discontinuo por lotes, las

reemplazando a la remolacha o la caa de azcar. Su principal ventaja es que para el mismo nivel endulzante es entre un 10-20% ms barato que la sacarosa, adems de ser menos calrica. Otra de sus ventajas es la mejor solubilidad de la glucosa y fructosa frente a la sacarosa, lo cual implica una menor tendencia a cristalizar en una amplia gama de productos. Por estos motivos se utiliza en productos de confitera como mermeladas y cremas, helados, conservas, etc. En vista del hecho de que hay un gran consumo de HFCS en bebidas, muchos investigadores de la rama nutricionista se han centrado en la posible relacin entre el consumo de bebidas endulzadas y la obesidad, diabetes u otras enfermedades crnicas relacionadas. Recientemente, se ha informado de que el HFCS en las bebidas carbonatadas compuestos era la principal fuente de

reactivos

a-dicarbonilo

(glioxal,

metilglioxal y 3-deoxyglucosona), compuestos que

fracciones que contienen fructosa y glucosa con una pureza superior al 95% se mantienen; fracciones con menor pureza se reciclan. 2.3 Obtencin a partir de almidn La sacarificacin de almidn produce glucosa, que puede ser isomerizada con la adicin de la enzima glucosa isomerasa E.C. 5.3.1.5. [1] Esta

peso del almidn (seco). La relacin de los dos polisacridos vara segn el origen botnico del almidn. Los almidones cerosos contienen menos de 15% amilosa, los normales de 20 a 35% y los altos (amilo-) cantidades

aproximadamente del 40%. El contenido de humedad de almidones oscila entre el 10-12% (cereales) y 14-18% (algunas races y tubrculos). La amilosa y la amilopectina, cuyas estructuras moleculares se pueden ver en la figura 2.1, tienen diferentes estructuras y propiedades que han sido discutidas y revisadas por muchos autores. La amilosa es una cadena relativamente larga y lineal de -glucano conteniendo alrededor de un 99% de enlaces -(1,4) y -(1,6) y difiere en su talla y estructura dependiendo del origen botnico. La amilopectina es una cadena mucho ms larga que la amilosa, muy ramificada y contiene sobre un 95% de enlaces -(1,4) y un 5% de enlaces -(1,6). [4]

isomerizacin enzimtica es realizada a nivel industrial en todo el mundo, pero especialmente en los Estados Unidos. El producto comercial que se obtiene, jarabe de maz de alto contenido en fructosa, con un contenido tpico en fructosa de un 42 o 55% en base seca. La isomerizacin enzimtica de glucosa fue realizada por primera vez a escala industrial en 1967 por Clinton Corn Processing Co. en los Estados Unidos, utilizando su propia tecnologa enzimtica. [3] El almidn se compone de dos tipos de alfaglucanos, amilosa y amilopectina, que

representan aproximadamente el 98-99% del

Figura 2.1. Estructuras moleculares de la amilosa y la amilopectina

Para la transformacin del almidn en glucosa, se debe llevar a cabo un proceso de hidrlisis seguido de un proceso de sacarificacin, para lo cual se utilizarn unas enzimas conocidas como endoamilasas y exoamilasas. Las endoamilasas son capaces de romper los enlaces -(1,4) glucosdicos presentes en la parte interior de la cadena de amilosa o amilopectina. La -amilasa (E.C. 3.2.1.1) es una endoamilasa muy conocida. Se puede encontrar en una amplia variedad de microorganismos, tanto arqueas como bacterias. Los productos finales tras la accin de la -amilasa son oligosacridos de cadena de longitud variable. Las enzimas pertenecientes al segundo grupo, las exoamilasas, rompen exclusivamente enlaces (1,4) glucosdicos como la -amilasa (E.C.3.2.1.2) o rompen enlaces -(1,4) y -(1,6) glucosdicos como la glucoamilasa (E.C.3.2.1.3) y la glucosidasa (E.C. 3.2.1.3). [5] Por ltimo, es necesario realizar la isomerizacin de la glucosa a fructosa para lo cual se aade, como se ha dicho anteriormente, glucosa isomerasa. La va enzimtica no es la nica a travs de la cual puede ser catalizada esta isomerizacin, sino que tambin puede

concentracin de un 30-35% en peso de almidn a pH 6 se mezcla con -amilasa y se mantiene la reaccin a 95-105 C durante 90 minutos. Inicialmente se utilizaba la -amilasa producida por Bacillus amyloliquefaciens, pero se ha ido substituyendo por la producida por Bacillus stearothermophilus o Bacillus licheniformis. La desventaja de las -amilasas habituales es que no son activas a pH inferiores a 5,9 a las altas temperaturas utilizadas. As, el pH debe ser modificado desde 4,5 (el valor natural de la suspensin acuosa de almidn) hasta un pH de 6 mediante la adicin de NaOH. Tambin se debe aadir Ca2+ debido a la dependencia de estas enzimas de los iones calcio. Pyrococcus furiosus genera una -amilasa extracelular que muestra muy buenas caractersticas para la industria del almidn. Esta enzima es altamente termoestable en ausencia de iones metlicos, activa incluso a temperaturas cercanas a los 130C y muestra una especificidad muy alta tanto para el producto como para el substrato. El siguiente paso es la ruptura de las dextrinas generadas en la hidrlisis en molculas de glucosa que contengan ms de un 95% de glucosa. Esto se lleva a cabo mediante la accin de una exoamilasa que hidrolice los enlaces -(1,4) de los extremos de la cadena, siendo la ms habitual para este uso las glucoamilasas de Aspergillus niger o de alguna especie similar. Esta glucoamilasa tiene un pH ptimo de 4.2 y es estable a 60C. Para realizar un proceso de sacarificacin eficiente, el pH de la mezcla es ajustado a 4,5 aadiendo cido clorhdrico. Dependiendo de las especificaciones

desarrollarse en medio bsico. Sin embargo, este tipo de catlisis no es demasiado especfica, generando D-manosa como subproducto

mayoritario por lo que no es muy importante industrialmente. [3] En la etapa de hidrlisis tiene lugar la ruptura de la cadena del almidn en dextrinas de cadena ms corta. Una suspensin acuosa con una

del producto final, este proceso es llevado a cabo durante 12-96 horas a una temperatura de 6062C. Un problema importante es que la glucoamilasa se especializa en romper los enlaces -(1,4) e hidroliza muy lentamente los enlaces (1,6) presentes en maltodextrinas, lo cual se traduce en la acumulacin de isomaltosa. Una solucin a este problema es la utilizacin de una pululanasa que rompe los enlaces -(1,6)

rendimientos se pueden ver en la tabla 2.1. El pH de la reaccin debe ser 7 o mayor para asegurar su correcta actividad y garantizar su estabilidad. En estas condiciones la glucosa y la fructosa son bastante inestables y se descomponen en cidos orgnicos y productos coloreados.
Tabla 2.1. Concentraciones de equilibrio glucosa-fructosa en funcin de la temperatura.

Temperatura (C)

Ratio fructosa/glucosa en equilibrio

eficientemente. El requisito fundamental es que la pululanasa acte ptimamente a la misma temperatura y pH que la glucoamilasa. Otro problema es el alto contenido en slidos que hay debe haber para que el proceso Bajo puede sea estas formar

55 60 65 70 80 90

0,500 0,507 0,515 0,524 0,539 0,556

econmicamente condiciones, la

rentable. glucoamilasa

Para limitar la formacin de subproductos el tiempo de reaccin debe ser minimizado, lo cual solo puede realizarse econmicamente rentable manteniendo altas concentraciones de enzima inmovilizada. La isomerizacin de glucosa a HFCS a nivel industrial se realiza exclusivamente en reactores de lecho fijo, en los cuales la glucosa obtenida de la sacarificacin del almidn se pasa a travs de un lecho granular que contiene la glucosa isomerasa. Los grnulos deben ser suficientemente rgidos para evitar la

productos como la maltosa o la isomaltosa que reducen el porcentaje de conversin en glucosa. La solucin es ajustar la cantidad de enzima, la temperatura y el tiempo de reaccin. Un tercer paso en la produccin de jarabes de maz de alto contenido en fructosa es la conversin de la glucosa en fructosa con una concentracin de 42 o 55%. Esta conversin es realizada usando la enzima D-xilosa-ketol

isomerasa (EC 5.3.1.5) ms conocida como glucosa isomerasa. [5] Esta etapa de isomerizacin solo puede ser realizada de una forma econmicamente rentable mediante la inmbilizacin de la enzima. Es necesario mantener una temperatura

compactacin del lecho durante la reaccin. El uso de enzimas inmovilizadas requiere un alto grado de pureza en los substratos para prevenir de una rpida desactivacin y la obstruccin del lecho. Las impurezas insolubles de la alimentacin son eliminadas por filtracin mientras que las solubles son eliminadas ponindolas en contacto con carbn activo seguido de un intercambio inico. A nivel industrial se produce la reaccin

relativamente alta para obtener una conversin de glucosa en fructosa aceptable. Estos

seleccionando una temperatura que fija la conversin de equilibrio en un 50%, pero al limitar el tiempo de reaccin se suelen limitar la conversin a un 42%. La temperatura

concentracin de fructosa constante, el caudal de alimentacin debe ajustar en funcin de la actividad de la enzima. Con solo un reactor en operacin se producen excesivas fluctuaciones en la concentracin del producto, por lo que se opera con un sistema de ocho reactores conteniendo enzimas de diferente edad. [3] En la figura 2.2 se muestra un esquema de un diagrama de flujo tpico para este tipo de procesos y las condiciones de pH y temperatura para las etapas ms importantes. [6] 3. Enzimas En esta seccin se discutir la produccin de amilasa, glucoamilasa y glucosa isomerasa y se

seleccionada es habitualmente de 55-60C ya que as tambin se minimiza el riesgo de

contaminacin microbiana. Temperaturas ms altas generan una mayor conversin pero reducen la estabilidad de la enzima y la glucosa. Durante la operacin, la enzima inmovilizada pierde

actividad. Cuando la alimentacin es purificada muy cuidadosamente, la explicacin para esto es la desnaturalizacin trmica de la enzima. Habitualmente el lecho de estos reactores es reemplazado cuando la actividad cae hasta un 12,5% de la actividad inicial. Para mantener una

Figura 2.2. Esquema de un proceso industrial para la produccin de HFCS

hablar

de

una

tcnica para

conocida mejorar

como las

(LB) con la siguiente composicin (g/L): peptona; 10,0; extracto de levadura; 5,0; NaCl, 5,0. El medio de crecimiento utilizado para la produccin de amilasa suele tener la siguiente composicin (g/L) plumas de pollo, 7,5; extracto de levadura, 1; MgSO4, 0,1; K2HPO4, 1,4; KH2PO4, 0,7; NaCl, 0,5; ajustando el pH del medio a un valor de 7,0, el valor de la temperatura debe ser de 37C y el nivel de agitacin de 200 rpm. La incubacin es detenida tras 48 horas. Como paso previo a la inoculacin, debe inertizarse el medio en un autoclave a 120 C durante 20 minutos mejorar las propiedades de la Para

mutagnesis

dirigida

propiedades de las mismas. La mutagnesis dirigida es un mtodo de biologa molecular que se utiliza para realizar cambios especficos e intencional a la secuencia de ADN de un gen y cualquier productos de los genes.[7] 3.1 Produccin de -amilasa Las amilasas constituyen una clase de enzimas que representan aproximadamente el 30% de la produccin enzimtica mundial. Adems de en la industria del almidn, tiene otras muchas aplicaciones en industrias como la alimentaria, la textil, la farmacutica o de detergentes. [8] La -amilasa producida por Bacillus licheniformis, es mucho ms termoestable que las producidas por otras especies. As, a 90C y en presencia de iones Ca2+ y pH 6,5, el tiempo de vida media de la -amilasa de Bacillus amyloliquefaciens y el de Bacillus stearothermophilus son dos y cincuenta minutos, respectivamente, mientras que el de Bacillus licheniformis es de ms de cuatro horas. Estas diferencias son muy integrantes debido al hecho de que sus secuencias de aminocidos son muy similares, (el 81% de la secuencia de aminocidos de Bacillus licheniformis coincide con la de Bacillus amyloliquefaciens, 65% de la secuencia de Bacillus licheniformis coincide con la de Bacillus stearothermophilus y el 64% de la secuencia de Bacillus amyloliquefaciens coincide con la de Bacillus stearothermophilus. Para la

-amilasa

producida por Bacillus licheniformis se recurre a una tcnica llamada mutagnesis dirigida, la cual es una tcnica de biologa molecular utilizada para crear mutaciones puntuales en una cadena de ADN, lo cual provocar que los aminocidos generados sean distintos y as mejorar las propiedades de las protenas producidas. Para el caso de Bacillus licheniformis, se ha comprobado que la sustitucin de Asp121, Asn126, Asp164, Asn192, Asp200, Asp204 y Ala269 son posiciones intolerantes a cualquier substitucin y generan enzimas inestables. Por otra parte, la sustitucin de tres asparaginas (Asn172, Asn188, Asn190) pueden ser

substituidos por otros aminocidos que mejoran significativamente la termoestabilidad de la enzima. La mayor estabilizacin fue la substitucin de la aspargina Asn190 por una fenilalanina, lo que multiplico por seis el tiempo de vida media de la enzima. [9]

produccin de la misma, habitualmente se parte de un inculo crecido en un medio LuriaBertani

3.2 Produccin de glucoamilasa Las glucoamilasas son un tipo de enzimas que pueden ser producidas por Aspergillus niger, Aspergillus awamori o Rhizopus niveus. Para la produccin de la enzima, se parte de un inculo crecido en un medio con la siguiente composicin (g/L): glucosa, 15; extracto de levadura, 16; MgSO47H2O, 0,5; K2HPO43H2O, 1,0; cido ctrico monohidratado 0,53; y el pH ajustado a un valor de 2,5 gracias a una disolucin de HCl 1 M. El inculo se deja crecer en el medio durante 48 horas con agitacin y se lleva a un fermentador donde se producir la glucoamilasa. La

Las glucoamilasas producidas por las dos especies de Aspergillus son muy similares, y al igual que en el caso de las -amilasas, se puede mejorar su estabilidad mediante mutagnesis dirigida. As, una mutacin muy habitual es la susbstitucin de la asparagina de la posicin 182 (Asn182) por una Alanina. Se ha comprobado que la enzima mejora su estabilidad 2,5 veces a 65C. [11] 3.3 Produccin de glucosa isomerasa La glucosa isomerasa se comenz a producir por microorganismos como Actinoplanes

missouriensis o Streptomyces rubiginosus, aunque actualmente se producen a partir de

temperatura debe estar en un valor cercano a 32C y el nivel de aireacin ser de 1,3-1,4 VVM. El nivel de agitacin no debe ser superior a 1000 rpm. El medio tiene la siguiente composicin, en g/L: almidn soluble, 15; extracto de levadura, 16; MgSO47H20, 0,5; K2HPO43H20, 1,0 y 0,33 mL de una agente antiespumante, adems de glucosa, 9,0; NH4Cl, 0,69; cido ctrico monohidratado 0,34; KH2PO4, 2,98; NaCl, 1,5; K2SO4, 1,0; MgCl26H2O, 0,16 y 0,33 mL de un agente antiespumante junto a los siguientes

microorganismos termoestables como Bacillus thermoantarcticus, Thermus caldophilus, Thermus thermophilus o Thermotoga maritima ya que generan una glucosa isomerasa con mayor estabilidad y ms duradera. [3] Para la produccin de glucosa isomerasa a partir de Bacillus thermoantarcticus, se prepara un inculo en placas de agar-agar con la siguiente composicin (g/L): triptona, 5; peptona, 5; MnSO42H2O 0,010 y agar 30. La incubacin se debe realizar durante 24 horas a 55C e inocular un medio como el que se indica: extracto de levadura, 6,0; peptona 2,5; extracto de carne, 1,5; NaCl, 3,0 y las siguientes sales en mg/L: MgSO47H2O, 250; FeSO47H2O; 1; ZnSO47H2O, 1; MnSO4H2O 0,075 y CuSO45H2O, 0,01.La

componentes, en mg/L: FeCl36H2O, 4,8; ZnCl2, 1,0; CaCl22H2O, 0,27; 18,6; MnCl22H2O, 1,1; 0,22;

CuCl22H2O,

Na2MoO42H2O,

CoCl26H2O, 0,28; H3BO3, 0,40 y KI 0,06. El pH del medio se debe mantener entre 3 y 5 mediante la adicin de NaOH o HCl 2 M. El medio se debe esterilizar en autoclave a 121 C durante 60 minutos. [10]

fermentacin tiene lugar durante 12 horas con una velocidad de agitacin de 200 rpm tambin a 55C. [12]

4. Conclusiones Aunque la fabricacin de jarabes de alto contenido en fructosa es un proceso ampliamente extendido a nivel mundial y se lleva a cabo desde hace varias dcadas, es posible mejorar el proceso de obtencin de los jarabes de maz de alto contenido en fructosa a partir de materiales ricos en almidn utilizando enzimas que muestren una actividad ms prolongada o que puedan actuar a mayores temperaturas. Algunas de estas enzimas pueden obtenerse de forma natural a partir de microorganismos termfilos, pero, como ya se ha comentado, tambin se puede mejorar este comportamiento mediante tcnicas artificiales como las

[7] http://centrodeartigos.com/articulos-noticias-consejos/ article_ 136577.html [8] H. Midet, Bayoudh A., (2008) Purification and biochemical characterization of a novel a-amylase from Bacillus licheniformis NH1. Cloning, nucleotide sequence and expression of amy gene in Escherichia coli 43, 499-510. [9] Declerck N., Machius M., (2000) Probing Structural Determinants Specifying High Thermostability in Bacillus licheniformis -Amylase 301, 1041-1057. [10] Alabaek T., Reeslev, J., (2002). Acid protease and formation of multiple forms of glucoamylase in batch and continuous cultures of Aspergillus niger 30, 410-415. [11] MacKenzie D.A., Jeenes D.J., (2000) Molecular basis of glucoamylase overproduction by a mutagenised industrial strain of Aspergillus niger, 26 193-200. [12] alic P., Angardi V. (2009), Glucose isomerase production on a xylan-based medium by Bacillus thermoantarcticus 43, 8-15.

mutaciones dirigidas, lo cual supone un avance importantsimo tanto para el rendimiento como para el coste de un proceso y es un campo que todava permite un amplio margen de explotacin y que ser de enorme importancia en las prximas dcadas. 5. Referencias
[1] Gerhartz W., Ullman`s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1989), Volume A 12, 47-50. [2] Tkel S., Alagz D. (2008), Catalytic efficiency of immobilized glucose isomerase in isomerization of glucose to fructose 111, 658-662. [3] Gerhartz W., Ullman`s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1989), Volume A 9, 405-408. [4] Tester F. R., Karkalas J. (2004), Starch composition, fine structure and architecture 39, 151-165. [5] Van der Maarel, M.J., van der Veen B., Uitdehaag J.C. (2002),Properties and applications of starch-converting enzymes of the -amylase family 94, 137-155. [6] Gerhartz W., Ullman`s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1989), Volume A 9, 400.