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PRODUCCIÓN DE FRUCTOSA

Antón Taboada Santos. Bioingeniería. Máster en ingeniería química y bioprocesos. Universidad de Santiago de Compostela. Resumen: el objetivo de este trabajo es el estudio del proceso de fabricación de fructosa haciendo especial hincapié en la producción de jarabes de maíz de alto contenido en fructosa HFCS (high fructose corn syrup). Partiendo de una materia prima rica en almidón, (habitualmente maíz), se obtiene glucosa tras una etapa de hidrólisis y una de sacarificación para finalmente realizar una isomerización enzimática y convertir esta glucosa a fructosa en un porcentaje de 42 o 55%. Se comentarán también los distintos microorganismos encargados de la generación de las enzimas necesarias para llevar a cabo estas reacciones bioquímicas, las condiciones en las cuales se lleva a cabo dicha operación y se tratará brevemente la mutágenesis dirigida sobre estos microorganismos, una técnica que sirve para mejorar su comportamiento en este tipo de procesos.

1. Introducción Después de la D-glucosa, la D-fructosa es el monosacárido más importante. Pese a ello, solo se ha producido en cantidades industriales a lo largo de los últimos 30 años. Fue descrita por primera vez en 1853 cuando fue obtenida como un azúcar no cristalizable a partir de la hidrólisis de la inulina (nombre con el que se designa a una familia de glúcidos complejos compuestos de cadenas moleculares de fructosa), aunque se estructura molecular fue descubierta por E. Fischer en 1891. Es el más dulce de los azúcares naturales (algunos azúcares sintéticos son más dulces). La D-fructosa es una ketohexosa, y según la nomenclatura IUPAC se clasifica como una hexulosa. La fructosa, en su forma cristalina, existe en la forma β-piranosa, aunque la forma βfuranosa es más común en otras estructuras como sacarosa, rafinosa o inulina. Las disoliuciones de

fructosa contienen

también

los

otros

dos

anómeros de esta forma cíclica (α-piranosa y αfuranosa) al mismo tiempo que una pequeña cantidad (1%) de la forma keto de cadena abierta, como se puede observar en la figura 1.1.

Figura 1.1 Distribución tautomérica en agua a 20ºC.

La fructosa se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza, especialmente en frutas como (manzanas, peras) en forma de monosacárido libre, pero también es un constituyente de varios di-, oligo- y polisacáridos como la sacarosa, la rafinosa o la inulina. Es un producto normal del metabolismo humano, se puede encontrar en el esperma o el líquido amniótico. [1] La conversión enzimática de D-glucosa a Dfructosa es un importante proceso industrial, en especial para la producción de jarabes de maíz de alto contenido fructosa HFCS. Su principal uso es como edulcorante en bebidas gaseosas

están

clasificados

como

genotóxicos

y

carcirógenos.[2]

2. Alternativas para la producción de fructosa Industrialmente, la fructosa se puede obtener a partir de sacarosa, inulina y almidón. 2.1. Obtención a partir de inulina Las raíces y los tubérculos de la achicoria, la alcachofa de Jerusalén y las dalias contienen inulina que puede ser hidrolizada a fructosa después de la extracción de la misma. La hidrólisis se lleva a cabo en medio ácido y con alta presión y temperatura. La adición de hidróxido de calcio provoca la precipitación de fructosato de calcio, que es recogido por filtración. La fructosa es obtenida entonces tratando una suspensión acuosa del precipitado con dióxido de carbono. Sin embargo, por motivos económicos este tipo de procesos está en la actualidad obsoleto. Se ha sugerido que las pérdidas debidas a reacciones secundarias pueden ser disminuidas mediante la realización de la etapa de hidrólisis mediante catálisis enzimática utilizando fructozima. 2.2. Obtención a partir de sacarosa La hidrólisis de sacarosa produce una mezcla de glucosa y fructosa que puede ser separada por cromatografía. La hidrólisis puede llevarse a cabo de una manera continua utilizando ya sea la forma protonada de un intercambiador de cationes o la enzima invertasa. El hidrolizado resultante se separa en un proceso discontinuo por lotes, las

reemplazando a la remolacha o la caña de azúcar. Su principal ventaja es que para el mismo nivel endulzante es entre un 10-20% más barato que la sacarosa, además de ser menos calórica. Otra de sus ventajas es la mejor solubilidad de la glucosa y fructosa frente a la sacarosa, lo cual implica una menor tendencia a cristalizar en una amplia gama de productos. Por estos motivos se utiliza en productos de confitería como mermeladas y cremas, helados, conservas, etc. En vista del hecho de que hay un gran consumo de HFCS en bebidas, muchos investigadores de la rama nutricionista se han centrado en la posible relación entre el consumo de bebidas endulzadas y la obesidad, diabetes u otras enfermedades crónicas relacionadas. Recientemente, se ha informado de que el HFCS en las bebidas carbonatadas compuestos era la principal fuente de

reactivos

a-dicarbonilo

(glioxal,

metilglioxal y 3-deoxyglucosona), compuestos que

fracciones que contienen fructosa y glucosa con una pureza superior al 95% se mantienen; fracciones con menor pureza se reciclan. 2.3 Obtención a partir de almidón La sacarificación de almidón produce glucosa, que puede ser isomerizada con la adición de la enzima glucosa isomerasa E.C. 5.3.1.5. [1] Esta

peso del almidón (seco). La relación de los dos polisacáridos varía según el origen botánico del almidón. Los almidones “cerosos” contienen menos de 15% amilosa, los “normales” de 20 a 35% y los “altos” (amilo-) cantidades

aproximadamente del 40%. El contenido de humedad de almidones oscila entre el 10-12% (cereales) y 14-18% (algunas raíces y tubérculos). La amilosa y la amilopectina, cuyas estructuras moleculares se pueden ver en la figura 2.1, tienen diferentes estructuras y propiedades que han sido discutidas y revisadas por muchos autores. La amilosa es una cadena relativamente larga y lineal de α-glucano conteniendo alrededor de un 99% de enlaces α-(1,4) y α-(1,6) y difiere en su talla y estructura dependiendo del origen botánico. La amilopectina es una cadena mucho más larga que la amilosa, muy ramificada y contiene sobre un 95% de enlaces α-(1,4) y un 5% de enlaces α-(1,6). [4]

isomerización enzimática es realizada a nivel industrial en todo el mundo, pero especialmente en los Estados Unidos. El producto comercial que se obtiene, jarabe de maíz de alto contenido en fructosa, con un contenido típico en fructosa de un 42 o 55% en base seca. La isomerización enzimática de glucosa fue realizada por primera vez a escala industrial en 1967 por Clinton Corn Processing Co. en los Estados Unidos, utilizando su propia tecnología enzimática. [3] El almidón se compone de dos tipos de alfaglucanos, amilosa y amilopectina, que

representan aproximadamente el 98-99% del

Figura 2.1. Estructuras moleculares de la amilosa y la amilopectina

Para la transformación del almidón en glucosa, se debe llevar a cabo un proceso de hidrólisis seguido de un proceso de sacarificación, para lo cual se utilizarán unas enzimas conocidas como endoamilasas y exoamilasas. Las endoamilasas son capaces de romper los enlaces α-(1,4) glucosídicos presentes en la parte interior de la cadena de amilosa o amilopectina. La α-amilasa (E.C. 3.2.1.1) es una endoamilasa muy conocida. Se puede encontrar en una amplia variedad de microorganismos, tanto arqueas como bacterias. Los productos finales tras la acción de la α-amilasa son oligosacáridos de cadena de longitud variable. Las enzimas pertenecientes al segundo grupo, las exoamilasas, rompen exclusivamente enlaces α(1,4) glucosídicos como la β-amilasa (E.C.3.2.1.2) o rompen enlaces α-(1,4) y α-(1,6) glucosídicos como la glucoamilasa (E.C.3.2.1.3) y la glucosidasa (E.C. 3.2.1.3). [5] Por último, es necesario realizar la isomerización de la glucosa a fructosa para lo cual se añade, como se ha dicho anteriormente, glucosa isomerasa. La vía enzimática no es la única a través de la cual puede ser catalizada esta isomerización, sino que también puede

concentración de un 30-35% en peso de almidón a pH 6 se mezcla con α-amilasa y se mantiene la reacción a 95-105 ºC durante 90 minutos. Inicialmente se utilizaba la α-amilasa producida por Bacillus amyloliquefaciens, pero se ha ido substituyendo por la producida por Bacillus stearothermophilus o Bacillus licheniformis. La desventaja de las α-amilasas habituales es que no son activas a pH inferiores a 5,9 a las altas temperaturas utilizadas. Así, el pH debe ser modificado desde 4,5 (el valor natural de la suspensión acuosa de almidón) hasta un pH de 6 mediante la adición de NaOH. También se debe añadir Ca2+ debido a la dependencia de estas enzimas de los iones calcio. Pyrococcus furiosus genera una α-amilasa extracelular que muestra muy buenas características para la industria del almidón. Esta enzima es altamente termoestable en ausencia de iones metálicos, activa incluso a temperaturas cercanas a los 130ºC y muestra una especificidad muy alta tanto para el producto como para el substrato. El siguiente paso es la ruptura de las dextrinas generadas en la hidrólisis en moléculas de glucosa que contengan más de un 95% de glucosa. Esto se lleva a cabo mediante la acción de una exoamilasa que hidrolice los enlaces α-(1,4) de los extremos de la cadena, siendo la más habitual para este uso las glucoamilasas de Aspergillus niger o de alguna especie similar. Esta glucoamilasa tiene un pH óptimo de 4.2 y es estable a 60ºC. Para realizar un proceso de sacarificación eficiente, el pH de la mezcla es ajustado a 4,5 añadiendo ácido clorhídrico. Dependiendo de las especificaciones

desarrollarse en medio básico. Sin embargo, este tipo de catálisis no es demasiado específica, generando D-manosa como subproducto

mayoritario por lo que no es muy importante industrialmente. [3] En la etapa de hidrólisis tiene lugar la ruptura de la cadena del almidón en dextrinas de cadena más corta. Una suspensión acuosa con una

del producto final, este proceso es llevado a cabo durante 12-96 horas a una temperatura de 6062ºC. Un problema importante es que la glucoamilasa se especializa en romper los enlaces α-(1,4) e hidroliza muy lentamente los enlaces α(1,6) presentes en maltodextrinas, lo cual se traduce en la acumulación de isomaltosa. Una solución a este problema es la utilización de una pululanasa que rompe los enlaces α-(1,6)

rendimientos se pueden ver en la tabla 2.1. El pH de la reacción debe ser 7 o mayor para asegurar su correcta actividad y garantizar su estabilidad. En estas condiciones la glucosa y la fructosa son bastante inestables y se descomponen en ácidos orgánicos y productos coloreados.
Tabla 2.1. Concentraciones de equilibrio glucosa-fructosa en función de la temperatura.

Temperatura (ºC)

Ratio fructosa/glucosa en equilibrio

eficientemente. El requisito fundamental es que la pululanasa actúe óptimamente a la misma temperatura y pH que la glucoamilasa. Otro problema es el alto contenido en sólidos que hay debe haber para que el proceso Bajo puede sea estas formar

55 60 65 70 80 90

0,500 0,507 0,515 0,524 0,539 0,556

económicamente condiciones, la

rentable. glucoamilasa

Para limitar la formación de subproductos el tiempo de reacción debe ser minimizado, lo cual solo puede realizarse económicamente rentable manteniendo altas concentraciones de enzima inmovilizada. La isomerización de glucosa a HFCS a nivel industrial se realiza exclusivamente en reactores de lecho fijo, en los cuales la glucosa obtenida de la sacarificación del almidón se pasa a través de un lecho granular que contiene la glucosa isomerasa. Los gránulos deben ser suficientemente rígidos para evitar la

productos como la maltosa o la isomaltosa que reducen el porcentaje de conversión en glucosa. La solución es ajustar la cantidad de enzima, la temperatura y el tiempo de reacción. Un tercer paso en la producción de jarabes de maíz de alto contenido en fructosa es la conversión de la glucosa en fructosa con una concentración de 42 o 55%. Esta conversión es realizada usando la enzima D-xilosa-ketol

isomerasa (EC 5.3.1.5) más conocida como glucosa isomerasa. [5] Esta etapa de isomerización solo puede ser realizada de una forma económicamente rentable mediante la inmbilización de la enzima. Es necesario mantener una temperatura

compactación del lecho durante la reacción. El uso de enzimas inmovilizadas requiere un alto grado de pureza en los substratos para prevenir de una rápida desactivación y la obstrucción del lecho. Las impurezas insolubles de la alimentación son eliminadas por filtración mientras que las solubles son eliminadas poniéndolas en contacto con carbón activo seguido de un intercambio iónico. A nivel industrial se produce la reacción

relativamente alta para obtener una conversión de glucosa en fructosa aceptable. Estos

seleccionando una temperatura que fija la conversión de equilibrio en un 50%, pero al limitar el tiempo de reacción se suelen limitar la conversión a un 42%. La temperatura

concentración de fructosa constante, el caudal de alimentación debe ajustar en función de la actividad de la enzima. Con solo un reactor en operación se producen excesivas fluctuaciones en la concentración del producto, por lo que se opera con un sistema de ocho reactores conteniendo enzimas de diferente edad. [3] En la figura 2.2 se muestra un esquema de un diagrama de flujo típico para este tipo de procesos y las condiciones de pH y temperatura para las etapas más importantes. [6] 3. Enzimas En esta sección se discutirá la producción de αamilasa, glucoamilasa y glucosa isomerasa y se

seleccionada es habitualmente de 55-60ºC ya que así también se minimiza el riesgo de

contaminación microbiana. Temperaturas más altas generan una mayor conversión pero reducen la estabilidad de la enzima y la glucosa. Durante la operación, la enzima inmovilizada pierde

actividad. Cuando la alimentación es purificada muy cuidadosamente, la explicación para esto es la desnaturalización térmica de la enzima. Habitualmente el lecho de estos reactores es reemplazado cuando la actividad cae hasta un 12,5% de la actividad inicial. Para mantener una

Figura 2.2. Esquema de un proceso industrial para la producción de HFCS

hablará

de

una

técnica para

conocida mejorar

como las

(LB) con la siguiente composición (g/L): peptona; 10,0; extracto de levadura; 5,0; NaCl, 5,0. El medio de crecimiento utilizado para la producción de αamilasa suele tener la siguiente composición (g/L) plumas de pollo, 7,5; extracto de levadura, 1; MgSO4, 0,1; K2HPO4, 1,4; KH2PO4, 0,7; NaCl, 0,5; ajustando el pH del medio a un valor de 7,0, el valor de la temperatura debe ser de 37ºC y el nivel de agitación de 200 rpm. La incubación es detenida tras 48 horas. Como paso previo a la inoculación, debe inertizarse el medio en un autoclave a 120 ºC durante 20 minutos mejorar las propiedades de la Para

mutagénesis

dirigida

propiedades de las mismas. La mutagénesis dirigida es un método de biología molecular que se utiliza para realizar cambios específicos e intencional a la secuencia de ADN de un gen y cualquier productos de los genes.[7] 3.1 Producción de α-amilasa Las amilasas constituyen una clase de enzimas que representan aproximadamente el 30% de la producción enzimática mundial. Además de en la industria del almidón, tiene otras muchas aplicaciones en industrias como la alimentaria, la textil, la farmacéutica o de detergentes. [8] La α-amilasa producida por Bacillus licheniformis, es mucho más termoestable que las producidas por otras especies. Así, a 90ºC y en presencia de iones Ca2+ y pH 6,5, el tiempo de vida media de la α-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens y el de Bacillus stearothermophilus son dos y cincuenta minutos, respectivamente, mientras que el de Bacillus licheniformis es de más de cuatro horas. Estas diferencias son muy integrantes debido al hecho de que sus secuencias de aminoácidos son muy similares, (el 81% de la secuencia de aminoácidos de Bacillus licheniformis coincide con la de Bacillus amyloliquefaciens, 65% de la secuencia de Bacillus licheniformis coincide con la de Bacillus stearothermophilus y el 64% de la secuencia de Bacillus amyloliquefaciens coincide con la de Bacillus stearothermophilus. Para la

α-amilasa

producida por Bacillus licheniformis se recurre a una técnica llamada mutagénesis dirigida, la cual es una técnica de biología molecular utilizada para crear mutaciones puntuales en una cadena de ADN, lo cual provocará que los aminoácidos generados sean distintos y así mejorar las propiedades de las proteínas producidas. Para el caso de Bacillus licheniformis, se ha comprobado que la sustitución de Asp121, Asn126, Asp164, Asn192, Asp200, Asp204 y Ala269 son posiciones intolerantes a cualquier substitución y generan enzimas inestables. Por otra parte, la sustitución de tres asparaginas (Asn172, Asn188, Asn190) pueden ser

substituidos por otros aminoácidos que mejoran significativamente la termoestabilidad de la enzima. La mayor estabilización fue la substitución de la aspargina Asn190 por una fenilalanina, lo que multiplico por seis el tiempo de vida media de la enzima. [9]

producción de la misma, habitualmente se parte de un inóculo crecido en un medio Luria–Bertani

3.2 Producción de glucoamilasa Las glucoamilasas son un tipo de enzimas que pueden ser producidas por Aspergillus niger, Aspergillus awamori o Rhizopus niveus. Para la producción de la enzima, se parte de un inóculo crecido en un medio con la siguiente composición (g/L): glucosa, 15; extracto de levadura, 16; MgSO4·7H2O, 0,5; K2HPO4·3H2O, 1,0; ácido cítrico monohidratado 0,53; y el pH ajustado a un valor de 2,5 gracias a una disolución de HCl 1 M. El inóculo se deja crecer en el medio durante 48 horas con agitación y se lleva a un fermentador donde se producirá la glucoamilasa. La

Las glucoamilasas producidas por las dos especies de Aspergillus son muy similares, y al igual que en el caso de las α-amilasas, se puede mejorar su estabilidad mediante mutagénesis dirigida. Así, una mutación muy habitual es la susbstitución de la asparagina de la posición 182 (Asn182) por una Alanina. Se ha comprobado que la enzima mejora su estabilidad 2,5 veces a 65ºC. [11] 3.3 Producción de glucosa isomerasa La glucosa isomerasa se comenzó a producir por microorganismos como Actinoplanes

missouriensis o Streptomyces rubiginosus, aunque actualmente se producen a partir de

temperatura debe estar en un valor cercano a 32ºC y el nivel de aireación será de 1,3-1,4 VVM. El nivel de agitación no debe ser superior a 1000 rpm. El medio tiene la siguiente composición, en g/L: almidón soluble, 15; extracto de levadura, 16; MgSO4·7H20, 0,5; K2HPO4·3H20, 1,0 y 0,33 mL de una agente antiespumante, además de glucosa, 9,0; NH4Cl, 0,69; ácido cítrico monohidratado 0,34; KH2PO4, 2,98; NaCl, 1,5; K2SO4, 1,0; MgCl2·6H2O, 0,16 y 0,33 mL de un agente antiespumante junto a los siguientes

microorganismos termoestables como Bacillus thermoantarcticus, Thermus caldophilus, Thermus thermophilus o Thermotoga maritima ya que generan una glucosa isomerasa con mayor estabilidad y más duradera. [3] Para la producción de glucosa isomerasa a partir de Bacillus thermoantarcticus, se prepara un inóculo en placas de agar-agar con la siguiente composición (g/L): triptona, 5; peptona, 5; MnSO4·2H2O 0,010 y agar 30. La incubación se debe realizar durante 24 horas a 55ºC e inocular un medio como el que se indica: extracto de levadura, 6,0; peptona 2,5; extracto de carne, 1,5; NaCl, 3,0 y las siguientes sales en mg/L: MgSO4·7H2O, 250; FeSO4·7H2O; 1; ZnSO4·7H2O, 1; MnSO4·H2O 0,075 y CuSO4·5H2O, 0,01.La

componentes, en mg/L: FeCl3·6H2O, 4,8; ZnCl2, 1,0; CaCl2·2H2O, 0,27; 18,6; MnCl2·2H2O, 1,1; 0,22;

CuCl2·2H2O,

Na2MoO4·2H2O,

CoCl2·6H2O, 0,28; H3BO3, 0,40 y KI 0,06. El pH del medio se debe mantener entre 3 y 5 mediante la adición de NaOH o HCl 2 M. El medio se debe esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 60 minutos. [10]

fermentación tiene lugar durante 12 horas con una velocidad de agitación de 200 rpm también a 55ºC. [12]

4. Conclusiones Aunque la fabricación de jarabes de alto contenido en fructosa es un proceso ampliamente extendido a nivel mundial y se lleva a cabo desde hace varias décadas, es posible mejorar el proceso de obtención de los jarabes de maíz de alto contenido en fructosa a partir de materiales ricos en almidón utilizando enzimas que muestren una actividad más prolongada o que puedan actuar a mayores temperaturas. Algunas de estas enzimas pueden obtenerse de forma natural a partir de microorganismos termófilos, pero, como ya se ha comentado, también se puede mejorar este comportamiento mediante técnicas artificiales como las

[7] http://centrodeartigos.com/articulos-noticias-consejos/ article_ 136577.html [8] H. Midet, Bayoudh A., (2008) Purification and biochemical characterization of a novel a-amylase from Bacillus licheniformis NH1. Cloning, nucleotide sequence and expression of amy gene in Escherichia coli 43, 499-510. [9] Declerck N., Machius M., (2000) Probing Structural Determinants Specifying High Thermostability in Bacillus licheniformis α-Amylase 301, 1041-1057. [10] Alabaek T., Reeslev, J., (2002). Acid protease and formation of multiple forms of glucoamylase in batch and continuous cultures of Aspergillus niger 30, 410-415. [11] MacKenzie D.A., Jeenes D.J., (2000) Molecular basis of glucoamylase overproduction by a mutagenised industrial strain of Aspergillus niger, 26 193-200. [12] Çalic P., Angardi V. (2009), Glucose isomerase production on a xylan-based medium by Bacillus thermoantarcticus 43, 8-15.

mutaciones dirigidas, lo cual supone un avance importantísimo tanto para el rendimiento como para el coste de un proceso y es un campo que todavía permite un amplio margen de explotación y que será de enorme importancia en las próximas décadas. 5. Referencias
[1] Gerhartz W., Ullman`s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1989), Volume A 12, 47-50. [2] Tükel S., Alagöz D. (2008), Catalytic efficiency of immobilized glucose isomerase in isomerization of glucose to fructose 111, 658-662. [3] Gerhartz W., Ullman`s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1989), Volume A 9, 405-408. [4] Tester F. R., Karkalas J. (2004), Starch composition, fine structure and architecture 39, 151-165. [5] Van der Maarel, M.J., van der Veen B., Uitdehaag J.C. (2002),Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family 94, 137-155. [6] Gerhartz W., Ullman`s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1989), Volume A 9, 400.