Agrobiotecnologa.

Curso 2013
Transformacin de cloroplastos
Estructura y gentica del cloroplasto Transparencias 4-16 Las clulas eucariotas probablemente evolucionaron a partir e asociaciones en osimbi!ticas entre i"erentes organismos procari!ticos. La comparaci!n e secuencias e A#$ ribosomal sugiere %ue los pl&sti os vegetales comparten un ancestro com'n con las cianobacterias actuales( tal como el organismo e vi a libre Synechococcus lividus. )n "en!meno actual e en osimbiosis conoci o como *en osimbiosis secun aria+( involucra la a %uisici!n( por ciertos organismos( e pl&sti os a partir e algas eucari!ticas ,transparencia 4-. )n e.emplo concreto es la asociaci!n simbi!tica /alla a entre las babosas marinas ,moluscos- el gnero Elysia 0 los cloroplastos e origen algal. La babosa e mar Elysia chlorotica se alimenta pre"erentemente el alga Vaucheria litorea( %ue posee gran es clulas multinuclea as ,sinciciales- llenas e cloroplastos. Las babosas marinas pun1an la clula el alga 0 succionan los pl&sti os. 2n ve1 e igerir los pl&sti os obteni os( Elysia los enva a travs e su sistema igestivo mu0 especiali1a o( on e los mantiene "uncionales por varios meses. 3ic/os pl&sti os pue en pro ucir 42 e manera lu1- epen iente 0 "i.ar C42( as como tambin sinteti1ar protenas. Contin'a sien o un misterio el /ec/o e %ue stos pl&sti os sean capaces e "otosinteti1ar por meses( 0a %ue para llevar a cabo la "otosntesis se re%uieren protenas con alta tasa e recambio co i"ica as en el genoma nuclear ,es ecir %ue eben sinteti1arse continuamente- 0( /asta a/ora( no se /a etecta o A3$ nuclear el alga en la babosa. Cual%uiera sea el mecanismo involucra o( esta simbiosis es obligatoria5 si no se lleva a cabo( la babosa no pue e esarrollarse en un a ulto viable. La transparencia 6 escribe las protenas con origen en cianobacterias 0 su istribuci!n intracelular en Arabidopsis thaliana. Los cloroplastos con oble membrana como los e Arabidopsis se originaron a partir e un en osimbionte similar a una cianobacteria. 3ebi o a %ue la i enti a 0 el conteni o gnico e ic/o en osimbionte se esconocen( se usaron las tres especies e cianobacterias cu0os genomas est&n escriptos ,Synechocystis sp. 7CC6803( Prochlorococcus marinus 0 Nostoc punctiforme- para reconstruir "ilogenias e protenas. 3e los c&lculos reali1a os se presume %ue 4.300 genes nucleares 0 89 genes plast icos tienen origen en cianobacterias ,lneas ver es-. Las lneas ro.as muestran el estino subcelular e las istintas protenas co i"ica as en el genoma nuclear. Los n'meros negros( entre parntesis( in ican el n'mero total e protenas irigi as a ca a compartimiento 0 los n'meros en ver e( las protenas e origen procariota. Los pl&sti os son organelas /alla as 'nicamente en clulas e plantas 0 algas. Los mismos son responsables e la "otosntesis( el almacenamiento e una amplia varie a e pro uctos( 0 e la sntesis e molculas claves re%ueri as para la ar%uitectura b&sica 0 el "uncionamiento e las clulas %ue los contienen. 2stas organelas varan en tama:o( "orma( conteni o 0 "unci!n 0( como pue e observarse en el es%uema( poseen una gran capaci a e i"erenciaci!n( es i"erenciaci!n 0 rei"erenciaci!n. To os los tipos e pl&sti os menciona os en la transparencia 6 se esarrollan a partir e los pro-pl&sti os( %ue son los precursores presentes en las regiones meristem&ticas e la planta. 2n el es%uema se ilustra el ciclo el esarrollo plast ico 0 la interconversi!n e varios tipos e pl&sti os. Las lneas llenas

representan los pasos normales el esarrollo el cloroplasto; las lneas e puntos in ican las interconversiones %ue ocurren ba.o ciertas con iciones el me io ambiente o el esarrollo. Los cloroplastos son organelas "otosintticas e color ver e( e "orma semies"rica o lenticular presentes en las plantas vasculares( musgos 0 algas. Ca a tipo celular contiene un n'mero i"erente e cloroplastos5 una clula e mes!"ilo en empali1a a contiene entre 30 0 40 cloroplastos( mientras %ue una clula el mes!"ilo espon.oso contiene apro<ima amente 20. Los cloroplastos e las plantas superiores est&n ro ea os e una oble membrana ,e<terna e interna- 0 contienen un comple.o sistema e membranas en su interior( conoci o como membranas tilacoi eas. Algunas membranas tilacoi eas est&n organi1a as en estructuras enomina as grana ,sacos e membranas apila os-; otras ,tilacoi es el estroma- no est&n apila as 0( por en e( %ue an e<puestas al me io "lui o circun ante( conoci o como estroma. Las membranas tilacoi eas est&n interconecta as 0 encierran un espacio interno com'n conoci o como lumen. 7ara po er llevar a cabo el proceso e "otosntesis se re%uieren comple.os proteicos 0 en1imas locali1a as en los compartimentos escriptos. Las protenas cloropl&sticas pue en estar co i"ica as por el A3$ nuclear ,A3$n- o por el A3$ plast ico ,A3$pt-; los respectivos A#$ mensa.eros son tra uci os por ribosomas presentes en el citosol ,80=- o en el estroma e los cloroplastos ,90=-. Las protenas %ue se sinteti1an como precursores en el citoplasma pue en ser irigi as /acia la membrana e<terna o al estroma el cloroplasto si contienen una se:al e locali1aci!n apropia a ,CT7- en su e<tremo amino terminal. )na ve1 en el interior el cloroplasto( las protenas pue en tener tres estinos i"erentes5 a- estroma5 interviene la protena >sp60 0 se invierte energa en el procesos e plega o "inal; b- membrana tilacoi ea5 interviene un comple.o proteico %ue reconoce una secuencia se:al particular en la protena importa a; c- lumen5 poseen una segun a secuencia se:al ,bipartita- %ue las irige al lumen el tilacoi e. 2n la parte superior el es%uema e la transparencia ?( se muestra c!mo las c/aperonas citoplasm&ticas interact'an con protenas cu0os ppti os se:al est&n e<puesto en una con"iguraci!n esplega a. La protena e la i1%uier a s!lo posee un ppti o se:al para el estroma ,ro.o-( mientras %ue la protena e la erec/a tiene un ppti o se:al bipartito ,ro.o-amarillo- con ominios para el estroma 0 para el lumen. A'n no se conoce si ambos ppti os se:al irigen a las protenas %ue los portan a travs e los mismos poros o si /a0 transporta ores espec"icos para ca a uno e ellos. 2l ppti o se:al se une primero a los lpi os 0 protenas e la membrana e<terna el cloroplasto interactuan o luego con el aparato e importaci!n %ue "orma el poro proteico. 2ste comple.o est& compuesto por protenas e la membrana e<terna ,Toc16?( Toc96 0 Toc34- 0 e la membrana interna ,Tic110-. La composici!n el comple.o es in&mica( e<perimentan o cambios urante el proceso e translocaci!n. )na ve1 transloca a( la protena pue e tener tres estinos i"erentes. Las protenas %ue permanecer&n en el estroma( como por e.emplo #)@A=C4( pier en su ppti o se:al 0 son plega as 0 ensambla as en procesos epen ientes e AT7 0 e la presencia e una gran c/aperona contenien o >sp60 ,va 1-. Las protenas cu0o estino "inal es la membrana tilacoi ea interact'an con una protena e reconocimiento e se:al cloropl&stica ,=#7; no se muestra en el gr&"ico- re%uirien o BT7 para su inserci!n en la membrana ,va 2-. 7or 'ltimo( las protenas estina as al lumen interaccionan con uno e os comple.os e importaci!n i"erentes presentes en la membrana tilacoi ea ,uno se muestra en el es%uema-( per ien o el ominio e tr&nsito luminal luego el pasa.e ,va 3-. 3epen ien o e la protena a ser transporta a( ic/o proceso e translocaci!n re%uiere e un gra iente e p> o e un gra iente e p> m&s AT7.

2l genoma plast ico est& compuesto e un 'nico cromosoma circular e A3$ oble ca ena ,transparencia 10-. 2n la ma0ora e los casos se pue en i enti"icar cuatro regiones5 a- una regi!n ma0or e genes copia simple; b- una regi!n menor e genes copia simple 0 c- os copias e regiones inverti as ,A#- %ue separan las regiones e copia simple. Los genomas plast icos e i"erentes especies pue en variar consi erablemente en tama:o. 7or e.emplo( en el alga Codium fragile posee 8? Cpb 0 en el alga Acetabularia posee 400 Cpb. =in embargo( la ma0ora e los genomas plast icos tienen entre 120 0 160 Cpb 0 comparten una istribuci!n 0 organi1aci!n gnica similares. Bran parte e la variaci!n encontra a entre genomas plast icos e istintas especies se ebe a cambios en las regiones A#. 2l es%uema e la parte superior e la transparencia 11 muestra( a mo o e e.emplo( la estructura el oper!n psbB. =e observa una organi1aci!n tpica e los genes plast icos en operones( en "orma similar a lo %ue ocurre en los genomas procariotas. Los operones son transcriptos en mensa.eros policistr!nicos %ue "recuentemente co i"ican pro uctos gnicos relaciona os. 2n el caso el oper!n psbB( el gen psbN co i"ica o en la /ebra opuesta sera transcripto como un mensa.ero monocistr!nico %ue co i"ica un solo pro ucto gnico. La transcripci!n e los genes plast icos est& a cargo e os A#$ polimerasas presentes en ic/as organelas. Dunto con otros atos bio%umicos( la e<istencia e genes plast icos para protenas similares a las subuni a es a( b 0 bE e la A#$ polimerasa e Escherichia coli( con"irm! la presencia e una A#$ polimerasa e tipo procariota en el cloroplasto. =e /an i enti"ica o genes %ue co i"ican subuni a es e tipo s en el genoma nuclear e varias plantas( lo %ue in ica %ue ambos genomas( plast ico 0 nuclear( cooperan en la regulaci!n e la transcripci!n en los pl&sti os. La A#$ polimerasa co i"ica a en el cloroplasto reconoce promotores plast icos %ue contienen secuencias consenso *-10+ 0 *-36+ tpicas e procariotas. Los genes plast icos tambin pue en ser transcriptos por una A#$ polimerasa co i"ica a por el genoma nuclear e caractersticas similares a las A#$ polimerasas e los bacteri!"agos T3 0 T9. =i se inter"iere la tra ucci!n en los cloroplastos con in/ibi ores espec"icos( la transcripci!n e algunos genes plast icos contin'a a cargo e la polimerasa nuclear. Luego e la transcripci!n( se generan A#$ mensa.eros ma uros cu0a estructura tpica se es%uemati1a en la parte superior e la transparencia 12. 2stos se aseme.an a los A#$ mensa.eros procariotas 0 no presentan mo i"icaciones en su e<tremo 6F. Beneralmente( presentan una estructura tipo /or%uilla en el e<tremo 3F %ue .uega un rol importante en el procesamiento 0 en la estabili a el transcripto. La tra ucci!n e los A#$ mensa.eros plast icos comien1a en muc/os casos con el reconocimiento el co !n e iniciaci!n por parte e la subuni a ribosomal 30=. 2l mismo resulta e una interacci!n espec"ica entre la secuencia e polipurina en el A#$ mensa.ero ,secuencia =/ine-3algarno o =3-( 0 una secuencia e polipirimi ina cercana al e<tremo 3F el A#$ ribosomal 16= e la subuni a pe%ue:a. 4tra "orma e i enti"icar el co !n e iniciaci!n apropia o se e.empli"ica en la parte in"erior e la transparencia 12( on e se muestra el rol e la estructura secun aria en la especi"icaci!n el sitio e iniciaci!n e la tra ucci!n en Euglena gracilis. 2n los cloroplastos e este organismo( la selecci!n el sitio e iniciaci!n transcurre por os vas istintas e acuer o con la estructura secun aria el A#$ mensa.ero. Guc/os procesos regulatorios act'an en con.unto para controlar la canti a e protenas plast icas presentes en las istintas etapas el esarrollo. Las transparencias 13 0 14 es%uemati1an los istintos niveles involucra os en este proceso. 1- La e<presi!n gnica pue e regularse en la etapa e transcripci!n el A3$. 2- La regulaci!n pue e ocurrir urante la ma uraci!n el pre-A#$ mensa.ero en A#$ mensa.ero ma uro( inclu0en o el procesamiento e los e<tremos 3F 0 6F( remoci!n e los intrones 0 el procesamiento e A#$ mensa.eros policistr!nicos en las regiones

intercistr!nicas. 3- La estabili a el A#$ mensa.ero es regula a por la acci!n e nucleasas. 4- La tra ucci!n el A#$ mensa.ero es regula a e varias maneras( entre otras a travs e la acci!n e protenas espec"icas e uni!n al A#$. 6- La tasa e sntesis proteica 0 la estabili a el ppti o naciente pue en ser regula as urante la inserci!n co-tra uccional e la ca ena pept ica en las membranas( 0 por la uni!n e co"actores tales como la cloro"ila. 6- La canti a e pro ucto proteico "inal tambin pue e ser regula a por su ma uraci!n ,plegamiento( mo i"icaci!n 0 locali1aci!n-( 0 por secuencias se:al %ue regulan su vi a me ia. )no e los "actores %ue pue e regular el "lu.o gnico en los cloroplastos es la lu1. 2<isten "actores transactiva ores %ue se unen a los e<tremos 6F no tra ucibles ,6 F)T#- e los A#$ mensa.eros cloropl&sticos regulan o su tra ucci!n ,transparencia 16-. Los A#$ mensa.eros %ue co i"ican para protenas relaciona as al proceso e "otosntesis son ob.eto e este tipo e regulaci!n. =u e<presi!n aumenta consi erablemente cuan o las plantas manteni as en la oscuri a pasan a crecer en presencia e lu1 ,greening-. La uni!n al A#$ e protenas regula oras espec"icas pue e estar etermina a por el potencial re o< el entorno( el %ue a su ve1 est& etermina o por las reacciones %umicas %ue ocurran en la organela( principalmente a%uellas relaciona as con la "otosntesis. 2n el es%uema e la transparencia 16 se muestra un mo elo propuesto para e<plicar la acci!n e la lu1 sobre la sntesis e la protena cloropl&stica 31( %ue es co i"ica a por el gen psbA. 2n el alga unicelular Chlamydomonas( la tra ucci!n el A#$m psbA se incrementa ram&ticamente cuan o un comple.o "orma o por al menos cuatro polippti os istintos se une a su e<tremo 6F no tra ucible. 2ntre los polippti os /a0 una protena e uni!n a regiones ricas en a enina el A#$m e cloroplasto ,c7A@7-. Cuan o los resi uos cistena e c7A@7 se encuentran re uci os( la a"ini a e uni!n e c7A@7 por el A#$m es sustancialmente ma0or. 2sta re ucci!n po ra estar me ia a por un segun o polippti o el comple.o( una isul"uro isomerasa ,c73A-. 2l mo elo postula %ue( en oscuri a ( cuan o la concentraci!n e "erre o<ina re uci a ,H <re - es ba.a 0 c73A est& o<i a a( c7A@7 tambin est& en su esta o o<i a o 0 se une bilmente al 6F)T# el A#$m e psbA( isminu0en o su ta1a e tra ucci!n. 2n presencia e lu1( los electrones "lu0en es e el agua /acia la "erre o<ina a travs e los os "otosistemas ,7= A 0 AA-. La "erre o<ina re uci a ona electrones a la "erre o<ina-tiorre o<ina re uctasa ,HT#-( %ue a su ve1 re uce a c73A. =ubsecuentemente( la protena c73A re uci a ona electrones a c7A@7( %ue una ve1 re uci a pue e unirse al A#$m e psbA aumentan o as su tra ucci!n. La concentraci!n e A37 en el cloroplasto e.erce un segun o nivel e control. 2n la oscuri a ( las altas concentraciones e A37 activan una protena %uinasa %ue "os"orila c73A. La "orma "os"orila a e sta protena no pue e promover la acumulaci!n e c7A@7 re uci a; m&s aun( parece promover activamente su o<i aci!n. 3ebi o a %ue la "orma o<i a a e c7A@7 no se une al A#$m e psbA( la tra ucci!n no se pro uce en oscuri a . Ingeniera gentica en cloroplastos Transparencias 19-33 La trans"ormaci!n gentica estable en plantas consiste e tres "ases5 a- intro ucci!n el transgn en el te.i o blanco apropia o; b- selecci!n e las clulas %ue integraron el transgn en su genoma; c- regeneraci!n e pl&ntulas trans"orma as con capaci a para ser propaga as por repro ucci!n ase<ual o se<ual. 2ste proce imiento es /o0 a rutina para generar trans"ormantes nucleares e la ma0or parte e las especies e inters agron!mico. 2n el caso e la trans"ormaci!n e pl&sti os( sus caractersticas

particulares ,estructurales 0 metab!licas- /an genera o nuevos esa"os en ca a una e las etapas previamente escriptas. 7ara %ue el A3$ recombinante ingrese al pl&sti o( ebe atravesar primero la pare celular 0 la membrana plasm&tica 0 luego la oble membrana plast ica. La trans"ormaci!n estable el genoma plast ico se logra tras la recombinaci!n /om!loga entre5 a- regiones con /omologa e secuencia al genoma plast ico inclui as en el pl&smi o e trans"ormaci!n 0 b- las secuencias correspon ientes el genoma en !geno. 2n la transparencia 18 se muestra un vector e trans"ormaci!n %ue permite la integraci!n el transgn entre los genes @ 0 C me ia a por os eventos e recombinaci!n /om!loga ,lneas violetas-; "inalmente se muestra la estructura el genoma plast ico trans"orma o. 2ste proceso pue e involucrar m'ltiples eventos e recombinaci!n 0 no re%uiere por en e largos tractos /om!logos e secuencia ininterrumpi a. 2l ingreso e"iciente e A3$ en los pl&sti os pue e lograrse por varios mto os %ue se escriben en las pr!<imas transparencias( con re"erencia a las istintas venta.as 0 esventa.as %ue ca a uno e ellos esee. 2l ingreso e"ectivo e A3$ recombinante en los pl&sti os "ue posible gracias al esarrollo e las tcnicas e biobalstica( me iante las cuales se pue en acelerar micropartculas e oro o tungsteno recubiertas con el A3$ trans"ormante a alta veloci a para impactar en los te.i os o clulas blanco. Las venta.as e este proceso son su e"iciencia relativamente alta 0 su simplici a tcnica. Las esventa.as inclu0en el potencial a:o mec&nico el A3$ plasm ico e gran tama:o urante la preparaci!n 0 el isparo e las partculas( 0 el ata%ue %umico por el tungsteno ,un metal e transici!n reactivo- %ue pue e promover mo i"icaciones o rupturas en el A3$( o a:os al te.i o vegetal. A em&s( ebi o a %ue la biobalstica es un mto o e"iciente para la trans"ormaci!n nuclear( al encarar la trans"ormaci!n e pl&sti os e<iste el riesgo e integraci!n simult&nea el A3$ en el genoma nuclear. 7ara evitarlo( se re%uieren una selecci!n mu0 estricta 0 la caracteri1aci!n rigurosa e las plantas trans"orma as. )n mto o alternativo para la trans"erencia e A3$ a los pl&sti os es la incorporaci!n el mismo a protoplastos e clulas vegetales trata os con polietilenglicol ,72B-. Las tcnicas para trans"ormaci!n e protoplastos "ueron ise:a as originalmente para la trans"ormaci!n nuclear( pero tambin emostraron ser 'tiles para la trans"ormaci!n plast ica. 3ebi o a %ue en los protoplastos los pl&sti os tien en a ubicarse contra la membrana plasm&tica( la permeabili1aci!n simult&nea e las tres membranas %ue separan el estroma plast ico el me io e cultivo "acilita la trans"ormaci!n. La aplicaci!n e este mto o est& limita a a las pocas especies para las %ue e<isten proce imientos e"icientes e obtenci!n e protoplastos. 2ntre las esventa.as e esta tcnica se cuentan los prolonga os pero os e selecci!n re%ueri os para alcan1ar el esta o /omopl&sti ico 0 el gran porcenta.e e escapes. La trans"ormaci!n e protoplastos es tcnicamente eman ante 0 re%uiere e /abili a es 0 conocimientos amplios sobre cultivo celular. =in embargo( los insumos necesarios son relativamente simples en comparaci!n con los re%ueri os para biobalstica. La optimi1aci!n e este tipo e tcnicas se encuentra en progreso. La transparencia 21 es%uemati1a un nuevo mto o para la trans"ormaci!n e cloroplastos consistente en la microin0ecci!n e A3$ "or&neo. La esencia el mto o es el ise:o e una .eringa especial en la %ue el movimiento el embolo se consigue e manera precisa 0 controla a me iante la e<pansi!n in uci a por calor e un metal l%ui o enomina o galinstano ,una aleaci!n e galio( in io 0 esta:o-. 2l galinstano est& conteni o entro e la .eringa 0 las muestras son in0ecta as a travs e un capilar e 0(1 mm e i&metro. 2l mto o result! e"ectivo para la trans"ormaci!n estable e cloroplastos e la cianobacteria Phormidium laminosum con el gen bla 0 para la trans"ormaci!n con el gen gfp e cloroplastos e /o.as e tabaco. =e re%uerir&n m&s estu ios para comprobar si a partir e esta tcnica pue en

implementarse las etapas trans"ormantes estables.

e selecci!n 0 regeneraci!n( necesarias para obtener

La transparencia 22 es%uemati1a los pasos a seguir para obtener lneas celulares transplast!micas /omopl&sti icas ,es ecir( en las %ue to os los pl&sti os porten copia el A3$ intro uci o-. 2l evento e trans"ormaci!n plast ico inicial involucra la integraci!n el A3$ trans"ormante a una o unas pocas e los varios miles e copias el genoma plast ico presentes en una clula. 3urante las ivisiones subsecuentes e clulas 0 organelas( la presencia e altas concentraciones el agente selector "avorece la multiplicaci!n e los cloroplastos cu0o genoma /a si o trans"orma o( mientras %ue los cloroplastos con genomas no trans"orma os son elimina os. =in embargo( algunos cloroplastos pue en contener a'n una me1cla e genomas trans"orma os 0 no trans"orma os ,/eteroplasta intra-organelar-. 2n ron as sucesivas e regeneraci!n vegetal en me io selectivo se seleccionan negativamente las copias no trans"orma as obtenin ose as una poblaci!n e genomas plast icos /omogneamente trans"orma os. 2ste esta o es enomina o */omoplasta+. La transparencia 24 muestra istintas etapas el proceso escrito en el es%uema anterior. 2n las "otos el panel superior se muestra el proce imiento e obtenci!n e los primeros trans"ormantes ,/eteropl&sti os-. 2n el panel in"erior se muestra el resulta o e la segun a ron a e regeneraci!n( reali1a a a partir e te.i o "oliar e las primeras trans"ormantes. 7ue e observarse la aparici!n e ma0or n'mero e nuevos regenerantes en la segun a ron a e regeneraci!n. La "oto in"erior( a la erec/a( muestra una planta transplast!mica enrai1a a en me io selectivo. La tabla e la transparencia 26 presenta un resumen e las especies vegetales %ue "ueron e<itosamente trans"orma as a nivel plast ico( etallan o los mto os e trans"ormaci!n emplea os 0 el tipo e trans"ormaci!n obteni a ,estable o transitoria-. 2s importante remarcar %ue s!lo se consigui! trans"ormaci!n estable 0 /ere able en tabaco( papa 0 tomate. 2n la transparencia 26 se se:alan los elementos %ue ebe tener un vector e trans"ormaci!n e cloroplastos. 2ntre ellos se encuentran5 a- regiones e recombinaci!n i1%uier a 0 erec/a5 regiones con i enti a nucleot ica a secuencias el genoma plast ico para promover la integraci!n el gen e inters por recombinaci!n /om!loga; b- promotor5 promotor e e<presi!n plast ica( por e.emplo el promotor el gen rrn ,constitutivo 0 "uerte-; c- selector5 gen %ue con"iere resistencia a antibi!ticos( /erbici as( etc. ,por e.emplo( el gen aadA %ue otorga resistencia a espectinomicina-; - #@=5 sitio e uni!n a ribosoma ,ribosome binding site- re%ueri o para iniciar la tra ucci!n. #o aba.o e este sitio se encuentra un sitio e clona o 'nico para el gen e inters ,gen I-; e- termina or5 termina or e la transcripci!n e cloroplastos ,por e.emplo( el termina or el gen rps1 -. La construcci!n escripta est& conteni a en un vector plasm ico procariota e tipo p)C o similar. Como se muestra en la parte in"erior se pue e e<presar mono o policistrones. La tabla e la transparencia 29 contiene un resumen e los genes selectores emplea os /asta el momento para la trans"ormaci!n e pl&sti os. 7ara la ma0ora e ellos se incorporan atos e e"iciencia asocia os a su empleo. =i se pu iera mo i"icar el genoma plast ico sin intro ucir genes %ue otorguen resistencia a antibi!ticos se eliminara un riesgo potencial e trans"erencia e estos genes( a microorganismos presentes en el me io ambiente( como a a%uellos presentes en la "lora intestinal animal. Los resulta os %ue se muestran en la transparencia 28 correspon en a un traba.o en el %ue se propone como gen selector alternativo un gen e espinaca %ue co i"ica la en1ima betana al e/ o

es/i rogenasa ,@A3>-. 2l proceso e selecci!n involucra la conversi!n el compuesto t!<ico al e/ o e betana ,@A- en el compuesto inocuo glicina betana ,%ue a em&s sirve como osmoprotector-. Con este proce imiento se report! una e"iciencia 26 veces superior a la obteni a con el gen aadA. =in embargo( /asta la "ec/a e<iste un 'nico traba.o publica o con este gen selector. 2n el panel superior e la transparencia 28 se observa una comparaci!n entre los proce imientos e selecci!n con @A 0 con espectinomicina5 a- e<plantos control e Nicotiana tabacum var. 7etit >avana en me io #G47 suplementa o con espectinomicina luego e 46 as. biscos e /o.as trans"orma os a los 46 as e selecci!n en #G47 suplementa o con espectinomicina. c- clones resistentes a espectinomicina en la segun a ron a e selecci!n para obtener /omoplasta. - plantas control en me io #G47 suplementa o con @A tras 12 as e cultivo. e- iscos e /o.as transgnicos selecciona os en #G47 suplementa o con @A luego e 12 as e cultivo ,la "lec/a in ica un isco no trans"orma o usa o como control-. $!tese %ue se /an esarrolla o 23 brotes en el isco selecciona o con @A contra 1-2 brotes en el isco selecciona o con espectinomicina. "- clones resistentes a @A en la segun a ron a e selecci!n para obtener /omoplasta. 2l gr&"ico e barras muestra la e<presi!n e la en1ima @A3> en /o.as e plantas transgnicas e tabaco e i"erentes e a es. =e e<tra.eron protenas e 1-2 g e /o.as 0 se evaluaron 60 mg e protena por ensa0o. =e anali1! la activi a e @A3> me iante la "ormaci!n e $A3> ,la en1ima es $A3J epen iente-. 2n el traba.o %ue se presenta en la transparencia 2?( se emple! como selector al gen e la aminogluc!si o "os"otrans"erasa ,aphA! - e Acinetobacter baumannii. =e intro u.eron vectores portan o ic/o gen por biobalstica o me iante trans"ormaci!n e protoplastos en plantas e tabaco 0 se seleccionaron trans"ormantes por resistencia a Kanamicina. =e observaron i"erencias en la resistencia al antibi!tico en las istintas lneas obteni as( epen ien o e los elementos regulatorios 3F 0 6F asocia os a la regi!n co i"icante e aphA! . 2n las ilustraciones se muestra la selecci!n 0 el an&lisis e trans"ormantes resistentes a Kanamicina. 2l panel superior i1%uier o muestra el crecimiento e colonias e clulas eriva as e protoplastos en respuesta a concentraciones crecientes ,0( 10( 26( 60( 96 0 100 mgLL- e Kanamicina tras 4 semanas e cultivo. 2l panel superior el centro muestra el e"ecto e una selecci!n no rigurosa ,6 semanas e cultivo en 26 mgLL e Kanamicina-. $!tese el alto n'mero e brotes ver es en el &rea central. 2l panel superior e la erec/a muestra el e"ecto e una selecci!n rigurosa ,6 semanas e cultivo en 60 mgLL e Kanamicina-. $!tese el escaso n'mero e brotes ver es. 2l panel in"erior i1%uier o muestra la respuesta e los e<plantos tras 4 semanas e cultivo en 0( 26 0 200 mgLL e Kanamicina. =e muestran el control no trans"orma o ,lnea superior- 0 trans"ormaciones con os construcciones %ue irigen la inserci!n a istintas 1onas el genoma plast ico. 2l panel in"erior erec/o muestra la progenie H1 crecien o en 0 0 200 mgLL e Kanamicina. =e muestran nuevamente el control no trans"orma o ,lnea superior- 0 trans"ormaciones con os construcciones %ue irigen la inserci!n a istintas 1onas el genoma plast ico. La escala representa 1 cm. 7ara la trans"ormaci!n e cloroplastos se utili1an rutinariamente genes e resistencia a antibi!ticos como aadA( npt"" 0 aphA! . A "in e me.orar el sistema 0 combinar ic/os selectores con un sistema e selecci!n visual %ue permita la etecci!n temprana 0 conclu0ente e los "enotipos trans"ormantes( se utili1aron 3 mutantes plast icas e"icientes en el proceso e "otosntesis , #petA( #ycf$ 0 #rpoA-. 2l vector e trans"ormaci!n contiene secuencias %ue permiten complementar esas mutaciones 0 el gen selector aphA! . La restituci!n e los genes eleciona os en los regenerantes trans"orma os result! en brotes con un "enotipo visualmente i"erente al e las plantas salva.es. 2ste sistema e trans"ormaci!nLselecci!n supera algunos problemas comunes asocia os a la trans"ormaci!n e cloroplastos( como por e.emplo( la recuperaci!n e mutantes espont&neos 0 e inserciones nucleares. A em&s e la

selecci!n "enotpica( la restauraci!n e la "otosntesis es un motor %ue acelera la obtenci!n e /omoplasta. 2n la transparencia 30 se muestran istintas etapas el proceso e selecci!n. 2n la "otogra"a superior i1%uier a se observa la planta mutante utili1a a para la trans"ormaci!n; en la "otogra"a in"erior se observa una planta trans"orma a "otosintticamente activa. La e<presi!n e altos niveles el marca or e selecci!n es in ispensable para asegurar la ampli"icaci!n selectiva 0 la /omoplasta urante la trans"ormaci!n. Cuan o el gen e selecci!n est& presente en ca a copia el genoma plast ico( su pro ucto proteico pue e alcan1ar una e<presi!n e /asta el 10M e la protena total soluble( lo %ue representara una carga metab!lica signi"icativa para la planta. A em&s( a causa e los riesgos potenciales %ue intro uce la utili1aci!n e genes e resistencia a antibi!ticos( sera eseable la remoci!n e estos( una ve1 cumpli o su prop!sito. 2n las transparencias 31 0 32 se es%uemati1an os estrategias para la eliminaci!n e los genes selectores. La "igura e la transparencia 31 muestra un es%uema para lograr la eliminaci!n el gen selector por escisi!n me iante una recombinaci!n irigi a por pe%ue:as secuencias repeti as. =e muestran5 a- mapa el genoma plast ico trans"orma o con un gen reportero ,uidA-( un gen selector ,aadA- 0 un gen e resistencia a /erbici a ,bar-. Los "ragmentos el promotor 71 , e 194 pb- 0 los el termina or %spbA e 418 pb ,T1- son pe%ue:as repeticiones irectas. Los cortes en las barras negras( naran.as 0 a1ules representan eleciones etecta as; b- m'ltiples eventos e recombinaci!n alternativa 0 segregaci!n el genoma plast ico con ucen a la obtenci!n e plantas resistentes al /erbici a libres e marca or. $!tese %ue la selecci!n para resistencia a espectinomicina ,=1- po ra continuarse con la selecci!n para resistencia al /erbici a ,=2-( la %ue elimina los eriva os eleciona os no resistentes al /erbici a. $5 n'cleo. 4tra estrategia para eliminar los genes e selecci!n se basa en el sistema e recombinaci!n espec"ica cre-lo<. La recombinasa Cre actuan o sobre los sitios lo&P permite resolver concatmeros %ue se pro ucen en la replicaci!n el "ago 71 , erec/a e la transparencia 32-. 2n el e.emplo( %ue se muestra a la i1%uier a( el transplastoma contiene al gen selector aadA "lan%uea o por sitios lo& ,"lec/as-. 2l gen e inters ,goi- se muestra en a1ul. La intro ucci!n el gen cre a nivel nuclear( por trans"ormaci!n con Agrobacterium tumefaciens ,a- o por cru1amiento ,b-( resulta en la e<presi!n e la recombinasa espec"ica Cre. La protena Cre es irigi a al pl&sti o me iante un ppti o se:al 0 escin ir& al gen marca or e to as las copias e genoma plast ico. La presencia e cre 0 el gen e resistencia a Kanamicina ,npt ""- en el genoma nuclear est&n in ica os con c 0 n respectivamente; su ausencia con *J+. T0 se re"iere a las plantas transgnicas regenera as por cultivo e te.i os. La tabla e la transparencia 33 presenta una comparaci!n sobre las principales caractersticas e la trans"ormaci!n plast ica 0 nuclear. >an e notarse en particular las i"erencias en los niveles e e<presi!n 0 la ausencia e silenciamiento gnico postranscripcional en el caso e la trans"ormaci!n plast ica. 2s oportuno recor ar %ue el cloroplasto no es capa1 e pro ucir glicosilaciones en las protenas por l sinteti1a as 0 %ue a nivel nuclear esto es posible( aun%ue pue en e<istir i"erencias con la glicosilaci!n pro uci a en otros organismos. Aplicaciones / Genes expresados Transparencias 34-69 La trans"ormaci!n e pl&sti os /a si o emplea a en la investigaci!n b&sica 0 en numerosas aplicaciones biotecnol!gicas. =u uso /a compren i o m'ltiples ob.etivos(

inclu0en o la e<presi!n e protenas e inters in ustrial 0Lo "armacol!gico( la resistencia a pat!genos( 0 el me.oramiento e caractersticas e inters agron!mico. 2n este es%uema se mencionan varias e stas aplicaciones; los e.emplos concretos se presentar&n en las pr!<imas transparencias. La alb'mina srica /umana ,>=A- es una protena e uso intravenoso prescripta en canti a es el or en e los miligramos para reempla1ar el volumen sanguneo en situaciones e trauma. =u pro ucci!n en istintos sistemas /eter!logos( tales como istintos sistemas microbianos ,E.coli' B. subtilis' S. cerevisiae' (luyveromyces 0 P. pastori- 0 plantas transgnicas ,e<presi!n nuclear- io como resulta o ba.os niveles e acumulaci!n. 3ebi o a las caractersticas e la protena se busc! aumentar el nivel e e<presi!n e >=A trans"orman o cloroplastos e Nicotiana tabacum. 2l es%uema e la transparencia 36 muestra las construcciones emplea as en el traba.o %ue se escribe a continuaci!n. La transparencia 39 muestra resulta os e una investigaci!n en %ue se e<pres! el gen e la seroalb'mina /umana ,>=A- en cloroplastos e plantas e Nicotiana tabacum. La ilustraci!n superior i1%uier a muestra un an&lisis por Northern blot de los patrones e e<presi!n e A#$m en las plantas transgnicas. Como son a se emple! el e<tremo 3F el gen psbA. 2n las calles el gel se muestran5 1- planta no trans"orma a; 2- planta trans"orma a con pL3As >=A; 3- planta trans"orma a con pL3ApsbA>=A luego e ser ilumina a 0 4- planta trans"orma a con pL3ApsbA>=A en oscuri a . =e us! como control e carga el gel te:i o con bromuro e eti io. =e in ican los transcriptos i enti"ica os. 2l es%uema in"erior i1%uier o muestra el patr!n e transcripci!n espera o para las i"erentes construcciones integra as al genoma plast ico. Las "lec/as presentes sobre los genes in ican los transcriptos( 0 las "lec/as entro e las construcciones la orientaci!n e los genes entro el genoma. $o se muestran los transcriptos origina os por trans-lectura ,read!through). r#$A5 A#$ ribosomal. 2n los gr&"icos e barras e la erec/a se muestra un an&lisis e la acumulaci!n e >=A en las plantas transgnicas. 2l gr&"ico superior muestra los niveles e >=A en /o.as e i"erentes esta ios el esarrollo e plantas transgnicas etermina os por 2LA=A. Las muestras se recolectaron e plantas control o trans"orma as con las construcciones pL3As >=A o pL3ApsbA>=A. Los niveles e e<presi!n se in ican como porcenta.e el total e protenas solubles. 2l gr&"ico in"erior muestra un estu io reali1a o luego e someter a las plantas a i"erentes pero os e iluminaci!n. Las muestras e /o.as trans"orma as con pL3ApsbA>=A "ueron colecta as tras 8 / e oscuri a o luego e los pero os e iluminaci!n in ica os. =e pue e concluir %ue las plantas transplast!micas presentan altos niveles e e<presi!n 0 %ue la misma vara con la lu1( esto 'ltimo se ebe a %ue en la construcci!n se utili1! la regi!n 6F)T# 0 el promotor el gen psbA %ue muestra regulaci!n por lu1. La transparencia 38 muestra un an&lisis e la acumulaci!n e >=A en cuerpos e inclusi!n en las plantas transplast!micas escriptas anteriormente. $!tese la presencia e cuerpos e inclusi!n en las microgra"as @( C 0 3. Gagni"icaci!n5 A<10.000; @- <6.000; C- <6.300 0 3- <12.600. La "otogra"a superior erec/a muestra los "enotipos e las plantas transgnicas 0 controles. 2n la "igura in"erior erec/a se anali1a la e<tracci!n e >=A a partir e los cuerpos e inclusi!n. A la i1%uier a( se observa una electro"oresis en gel e poliacrilami a con =3= ,=3=-7AB2- te:i a con plata mostran o( e i1%uier a a erec/a5 a- 600 ng e >=A pura; b- marca or e peso molecular; c- "racci!n soluble obteni a luego e la centri"ugaci!n e e<tractos e plantas no trans"orma as; - "racci!n soluble obteni a luego e la centri"ugaci!n e e<tractos e plantas trans"orma as con pL3ApsbA>=A; e- >=A luego e la solubili1aci!n el precipita o; "- protenas e plantas no trans"orma as %ue "ueron someti as al proce imiento anterior. A la i1%uier a( se muestra un an&lisis por *estern e los e<tractos proteicos. 3e i1%uier a a erec/a se sembraron5 a- 40 ng e

>=A pura; b- >=A puri"ica a e plantas trans"orma as con pL3ApsbA>=A mostran o las "ormas mono( i 0 trimricas; c- e<tracto e plantas no trans"orma as %ue "ueron someti as al proce imiento anterior; - e<tracto contenien o >=A pero en un esta io m&s avan1a o e la solubili1aci!n; e- >=A completamente monomeri1a a al "inali1ar el tratamiento e solubili1aci!n. Como resulta o e este traba.o( se obtuvo un sistema e e<presi!n m&s e"iciente me iante el cual se lograron altos niveles e e<presi!n 0 alta estabili a e la >=A. La transparencia 3? 0 la siguiente muestran los resulta os obteni os al e<presar la /ormona e crecimiento /umana ,/B>-( una protena e gran inters teraputico( en cloroplastos e Nicotiana tabacum. A la erec/a se es%uemati1an las construcciones emplea as para la trans"ormaci!n. 2n la tabla se muestran los niveles e e<presi!n e /B> en "unci!n e las istintas construcciones emplea as. $!tese %ue la ma0or e<presi!n se logra con la construcci!n pG4$389?4 %ue lleva el promotor el gen rrn 0 la secuencia e /B> "usiona a a la secuencia el gen e ubi%uitina. a La e<presi!n proteica( en os lneas transgnicas nucleares ,Nrg4949 0 Nrg4996- 0 en las plantas transplast!micas Nrg4838 "ue anali1a a por 2LA=A. Los mismos resulta os se obtuvieron por an&lisis e *estern. $35 no etermina o. b 2<presi!n proteica en lneas e "usi!n a ubi%uitina cuanti"ica a por an&lisis e *estern ,inclu0en o especies e /B> procesa as 0 no procesa as-. pts5 protenas totales solubles e /o.a. La transparencia 40 muestra e<perimentos e cru1amiento %ue emuestran la /erencia materna el gen e /B> intro uci o en el genoma plast ico. =e sembraron semillas eriva as e cru1amientos recprocos e la lnea transplast!mica $t-4838 0 e Nicotiana tabacum no trans"orma a ,$T- en me io contenien o 600 mgLL e espectinomicina. La progenie est& se:ala a con el receptor "emenino ,O- cru1a o con el a or e polen ,P-. Las pl&ntulas resistentes son uni"ormemente ver es mientras %ue las sensibles se ven clor!ticas ,blancas-. Las "otogra"as "ueron toma as 10 as espus e la germinaci!n e las semillas. 2s sabi o %ue la acci!n e los ppti os antimicrobianos es epen iente e la concentraci!n. 7or lo tanto( si el ob.etivo es obtener plantas transgnicas resistentes al ata%ue por /ongos 0 bacterias "itopat!genas( es necesario alcan1ar altos niveles e e<presi!n e ic/os ppti os. La trans"ormaci!n e cloroplastos permitira alcan1ar esos niveles. 2n el traba.o %ue se escribe en la transparencia 41 0 siguientes( se trans"ormaron cloroplastos e Nicotiana tabacum con una construcci!n %ue co i"ica un an&logo e la magainina ,G=A-??-( un ppti o pro uci o por +enopus laevis. Los ppti os antimicrobianos act'an e manera espec"ica sobre las membranas e procariotas 0 no sobre las e eucariotas. 2sta caracterstica "un amental po ra representar un impe imento para la e<presi!n en una organela e origen evolutivo procariota. =in embargo( a o %ue la membrana e los cloroplastos posee lpi os neutros( se i"erencia e las membranas e los microorganismos reconoci os por stos ppti os( por lo cual su integri a no se encuentra a"ecta a. 2n la transparencia 42 se muestran ensa0os e activi a antimicrobiana para las plantas transplast!micas obteni as. A la i1%uier a se muestran los resulta os e un ensa0o in vitro e activi a antimicrobiana reali1a o con e<tractos e plantas trans"orma as. =e ilu0! un cultivo e Pseudomonas syringae /asta A600 Q 0(1 a 0(3 0 se preincubaron 6 L e la iluci!n con 100 g e protenas totales e /o.as e plantas transgnicas 0 control urante 2 / a 26RC. 7osteriormente( se registr! el crecimiento bacteriano. A em&s el e<tracto e plantas no trans"orma as ,controltambin se utili1! buffer como control negativo. Stoc, se re"iere al cultivo sin agrega os. 2l panel erec/o e la transparencia 42 muestra un ensa0o e in"ecci!n reali1a o sobre las plantas. =e inocularon /o.as e Nicotiana tabacum var. 7etit >avana con 10 L e cultivos bacterianos contenien o el n'mero e clulas in ica o

en las "otogra"as. A los 6 as( se evaluaron los sntomas( los %ue variaron entre una ligera ecoloraci!n ,/o.as trans"orma as- a necrosis ,/o.as e los controles no trans"orma os-. La transparencia 43 muestra bioensa0os e activi a anti"'ngica para las plantas transplast!micas escriptas anteriormente. Los gr&"icos e la i1%uier a muestran los resulta os e un ensa0o in vitro en el %ue se incubaron coni ios en germinaci!n e istintos /ongos "itopat!genos ,Aspergillus flavus' -usarium moniliforme y Verticillium dahliae) con e<tractos e plantas controles 0 transplast!micas. Los resulta os se e<presan como el n'mero e colonias "'ngicas esarrolla as. 2n los tres gr&"icos se observa una re ucci!n signi"icativa en la germinaci!n e coni ios por e<posici!n a e<tractos e plantas transplast!micas en comparaci!n con los e<tractos e las plantas no trans"orma as. 2l panel e la erec/a muestra un ensa0o e in"ecci!n in planta. =e inocularon /o.as transplast!micas 0 control con el /ongo Colletotrichum destructivum 0 se evaluaron los sntomas a los 9 as. 2n la /o.a control se observan sntomas e necrosis( mientras %ue en la /o.a e la planta transplast!mica se observa s!lo una leve clorosis en la 1ona e inoculaci!n. La e<presi!n e G=A-?? no result! t!<ica para la planta. Las protenas Cr0 e Bacillus thuringiensis poseen "uerte activi a t!<ica contra istintos !r enes e insectos. 2stas protenas son sinteti1a as como proto<inas 0 procesa as en "orma espec"ica a "ragmentos t!<icos activos en el intestino e los insectos. Las plantas transgnicas %ue e<presan genes cry vegetali1a os a nivel nuclear poseen muc/as venta.es en comparaci!n con el empleo e los insectici as convencionales. =in embargo( en cultivos %ue son ataca os por varias especies e insectos con i"erentes gra os e susceptibili a a las to<inas Cr0( la e<posici!n a niveles sub-!ptimos e la to<ina po ra generar resistencia. La secuencia e los genes cry tiene una composici!n rica en ALT( por lo %ue ebi! ser *vegetali1a a+ ,un proce imiento prolonga o 0 costoso- para su e<presi!n nuclear. 3a a la naturale1a procariota e la ma%uinaria transcripcional 0 tra uccional e los pl&sti os sera "actible obtener altos niveles e e<presi!n e estos genes en las organelas sin la necesi a e vegetali1arlos. La transparencia 44 muestra los resulta os e un traba.o en %ue se tras"ormaron cloroplastos e tabaco con un gen cry. La construcci!n utili1a a se muestra en el es%uema superior erec/o. 2n el panel in"erior erec/o se observa un bioensa0o reali1a o en /o.as e plantas e tabaco transplast!micas 0 controles. Las /o.as se in"ectaron con .elicoverpa /ea 0 Spodoptora e&igua; el progreso e la in"estaci!n se evalu! a los 4 as e ensa0o. =in intro ucir mo i"icaciones en la secuencia el gen( se obtuvieron altos niveles e e<presi!n e la protena Cr0 %ue controlaron e"ica1mente a los insectos ensa0a os. =e sabe %ue los niveles e las protenas Cr0 ecaen urante cambios estacionales 0 en con iciones e estrs( con el riesgo apare.a o e %ue la e<presi!n sub-!ptima e la protena "avore1ca la aparici!n e resistencia ,ver iapositiva anterior-. 2n Bacillus thuringiensis el gen cry est& inclui o en un oper!n %ue tambin co i"ica una c/aperona espec"ica %ue incrementa su estabili a promovien o su correcto plegamiento. 2n el traba.o %ue se escribe en la transparencia 46 se intro u.o en cloroplastos e Nicotiana tabacum el oper!n completo cry0Aa0 con el ob.eto e aumentar la estabili a 0 los niveles e e<presi!n e la protena Cr0. La construcci!n gentica utili1a a se muestra en el es%uema e la parte in"erior i1%uier a. 2l gr&"ico e barras muestra la cuanti"icaci!n por 2LA=A e los niveles e protena Cr0 en /o.as .!venes( ma uras 0 vie.as( e plantas transplast!micas obteni as con la construcci!n simple ,gen cry) ! con el oper!n cry0Aa0 completo ,gen cry m&s 4#H1 0 4#H2-. 2n la "otogra"a e la erec/a se observa la "ormaci!n e cristales e la protena Cr0 en los cloroplastos ebi o a los altos niveles e e<presi!n logra os. La e<presi!n el oper!n cry0Aa0 en cloroplastos provee un mo elo para la e<presi!n e altos niveles e

protenas "or&neas en una con"ormaci!n a ecua a( lo %ue pue e intro ucir aumentos sustanciales en estabili a 0 "acilitar la puri"icaci!n posterior. )n "ruto comestible como el tomate es un blanco apropia o para la pro ucci!n e vacunas orales. 2n el traba.o %ue se presenta en la transparencia 46( se trans"ormaron pl&sti os e 1ycopersicum esculentum con un gen selector 0 se logr! regenerar plantas transplast!micas "rtiles. 2n la "igura in"erior i1%uier a( se anali1a la acumulaci!n e aminoglic!si o 3E a eniltrans"erasa ,aa A- en /o.as( "rutos inma uros 0 ma uros e plantas e tomate transplast!micas me iante un ensa0o e *estern. =e inclu0! una muestra e una planta transplast!mica e tabaco portan o el gen aadA ,$t-l0c?- como control positivo. Las "otogra"as e la erec/a muestran el proceso e obtenci!n e plantas transplast!micas e tomate5 a- se muestra una placa con e<plantos e /o.as a los 3 meses e la trans"ormaci!n en me io selectivo; los callos resistentes a espectinomicina ,"lec/a- aparecen como montculos amarillentos o ver e claros en un "on o ecolora o ,te.i o sensible a espectinomicina-; b- propagaci!n e las lneas e callos resistentes en me io con antibi!tico selector; el crecimiento en este me io ocurre en "orma e un callo in i"erencia o( por lo %ue se toman muestras peri! icas para evaluar la /omoplasta; c- regeneraci!n e plantas a partir e los callos trans"orma os; se observa la aparici!n e brotes a las 4 semanas e cultivo en un me io e in ucci!n apropia o; - enrai1amiento e los brotes regenera os. 2ste traba.o emostr! %ue la e<presi!n e un transgn en cromoplastos e tomate es "actible 0 %ue los niveles e e<presi!n en el "ruto son e apro<ima amente 60M respecto a la obteni a en los cloroplastos "oliares. Las transparencias 49 a 63 muestran los traba.os reali1a os en nuestro grupo e investigaci!n con el "in e e<presar el "actor e crecimiento epi rmico /umano ,/2BH- en cloroplastos e plantas e tabaco. La transparencia 48 muestra el genoma plast ico e tabaco 0 el sitio elegi o on e se insertar& el transgn por precombinaci!n /omologa. La transparencia 4? muestra los vectores esarrolla os en nuestro laboratorio( a o el origen procariota e los elementos regulatorios presentes en ellos es posible veri"icar su "uncionali a en 2 coli. Arriba a la erec/a se observa una tinci!n utili1an o un sustrato para la en1ima b-glucuroni asa en placas contenien o bacterias trans"orma as con ca a uno e los vectores 0 control sin trans"ormar. Aba.o ensa0os /isto%umico ,i1%.- 0 "luoromtrico , er- e activi a gus reali1a o sobre /o.as e plantas transplast!micas provenientes e istintas ron as e regeneraci!n 0 controles. La transparencia 60 muestra un an&lisis e =3=-7AB2 on e es posible observar %ue los niveles e e<presi!n alcan1a os por la en1ima bglucuroni asa en las plantas transplast!micas es igual o superior a la subuni a ma0or e rubisco( la %ue en plantas alcan1a valores el 20 al 30M e las protenas solubles e las /o.as. Otras aplicaciones de la transformacin de cloroplastos Transparencias 68-62 2n la iapositiva 6? se muestra una estrategia actualmente en esarrollo para el control e la e<presi!n e genes en el genoma plast ico. Como se muestra en el es%uema( se intro u.o una construcci!n gentica en el genoma nuclear e Nicotiana tabacum' %ue contiene la secuencia e la polimerasa el "ago T9 "usiona a al ppti o e importaci!n a cloroplastos e la subuni a pe%ue:a e #)@A=C4. La construcci!n se coloc! ba.o el control e una secuencia regula ora el promotor el gen P2!1 e tabaco( in ucible por un an&logo e &ci o saliclico el =- ben1ometilster ,1(2(3tia ia1o-9-&ci o carbotioico ,@T>-. Las plantas transgnicas /omocigotas se cru1an luego con lneas trans"orma as /omopl&sti icas obteni as con una construcci!n

gentica %ue inclu0e el promotor el gen 13 el "ago T9( el gen reportero uidA 0 el termina or el gen 13 el "ago T9. Como resulta o' la protena b-glucuroni asa se e<presar& en presencia el in uctor %umico %ue inicie la transcripci!n nuclear e la polimerasa T9. Las intenas son secuencias proteicas %ue se auto-escin en e la protena precursora on e est&n presentes por un proceso auto-cataltico. 2sta escisi!n e.a uni as a las secuencias "lan%ueantes 0 a lugar a la protena ma ura , e manera similar al splicing e A#$-. Como e.emplo( en la "igura e la i1%uier a se es%uemati1a el proceso e trans!splicing %ue origina la protena 3na2 e Synechocystis sp. 7CC6803. $ 0 C son las e<tenas e 3na2 ,los "ragmentos proteicos %ue estar&n presentes en la protena ma ura-; A$ e AC son los "ragmentos $-terminal 0 C-terminal e las intenas respectivamente. A la erec/a e la transparencia 60 se muestra un e.emplo e aplicaci!n el mecanismo e trans!splicing. =e e"ectuaron os construcciones genticas en las %ue se "usionaron intenas , e Ssp 3na2- a os "ragmentos el gen e la en1ima 6-enol-piruvils/iKimato-3-"os"ato sintetasa ,27=7=- e petunia( resistente al /erbici a gli"osato 2stas construcciones se integraron separa amente en el genoma nuclear 0 plast ico o .untas en el genoma plast ico. 2l proceso e trans!splicing "ue correcto tanto si se e<presaban ambos "ragmentos e 27=7=-intenas en el cloroplasto o separa os en cloroplasto 0 n'cleo ,ver es%uema superior erec/o ela transparencia 60-. Las plantas transgnicas obteni as "ueron resistentes al /erbici a gli"osato( como se observa en la "otogra"a in"erior erec/a e la transparencia 60( emostran o %ue el ensambla o a origen a una protena "uncional. =e muestran tambin os *estern blots en los %ue se anali1a el correcto ensambla.e e la protena 27=7= en plantas transgnicas trans"orma as seg'n el es%uema e la iapositiva ,$ 0 C representan e<presi!n nuclear 0 plast ica respectivamente-. )na posible aplicaci!n e sta meto ologa po ra ser la "ragmentaci!n e los genes selectores entre el n'cleo 0 el cloroplasto para( una ve1 obteni a la planta transplast!mica( poner una barrera m&s a la trans"erencia /ori1ontal e genes e resistencia a otras especies.
$T5 plantas no transgnicas 9 ,$JC-5 plantas transgnicas

La trans"ormaci!n e cloroplastos es una tecnologa %ue /a si o esarrolla a en los 'ltimos a:os. 2ntre los genes intro uci os e<itosamente en ic/o genoma( a%uellos %ue con"ieren valor agron!mico ,resistencia a estreses abi!ticos 0 bi!ticos por e.emplo- "ueron los m&s recientes. La tabla e la transparencia 61 presenta un resumen e los genes intro uci os al genoma plast ico. La tabla %ue se presenta en la transparencia 62 muestra una lista e las protenas e<presa as en cloroplastos( el nombre el pl&smi o utili1a o 0 istintos elementos conteni os en el vector e trans"ormaci!n( a saber5 promotor( regi!n 6E )T#( regi!n co i"icante 0 termina or o regi!n 3E )T#. Como pue e observarse( las istintas combinaciones tienen e"ectos iversos sobre los niveles e e<presi!n e la protena /eter!loga. 2stos niveles son generalmente superiores a los alcan1a os en las trans"ormaciones nucleares 0 varan ampliamente seg'n la construcci!n emplea a. )n caso e<cepcional es el e los niveles e protena alcan1a os cuan o se trans"orm! el genoma plast ico con el oper!n %ue contiene al gen e la to<ina Cr02Aa2 m&s os genes %ue co i"ican para c/aperonas propias e la misma ,46(3M-.