UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE MXICO CAMPUS ATIZAPN

PRCTICA No. 3 PREPARACIN DE FROTIS Y FIJACIN GRUPO: ENF01C MICROBIOLOGA MESA 4

PRCTICA No. 3 PREPARACIN DE FROTIS Y FIJACIN

INTRODUCCIN: El microscopio es el instrumento ms importante para el estudio microbiolgico, pues se usa para aumentar el tamao de la imagen aparente de los objetos, lo cual hace posible ver los detalles estructurales de los microorganismos. El estudio microscpico de los microorganismos proporciona datos fundamentales para su identificacin, como forma, tamao, reaccin a diferentes colorantes y estructuras celulares; adems permite establecer caractersticas como la pureza, presencia de contaminantes, variedad y edad de una poblacin microbiana. El microscopio ptico de campo claro es el ms utilizado para el estudio microbiolgico en general y ser compone por tres sistemas: Sistema mecnico Sistema ptico Sistema de iluminacin

Sistema mecnico:

Pie o soporte: Sirve como base al microscopio y en l se encuentra la fuente de iluminacin. Tornillo de desplazamiento horizontal y vertical: Se usa para mover la muestra que se desea observar de arriba abajo y de un lado a otro. Platina: En la superficie sobre la que se colocan las preparaciones. En su centro se encuentra un orificio que permite el paso de la luz. Tubo: Es un cilindro hueco que forma el cuerpo del microscopio. Constituye el soporte de oculares y objetivos. Revolver: Es la estructura giratoria que contiene los objetivos. Brazo o asa: Une el tubo a la platina. Es el lugar por donde se debe tomar el microscopio para transportarlo. Tornillo macromtrico: Sirve para obtener un primer enfoque, desplaza la platina verticalmente de forma perceptible. Tornillo micromtrico: Sirve para un enfoque preciso de la muestra una vez que se ha realizado el enfoque con el tornillo macromtrico.

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Sistema mecnico del microscopio ptico

Sistema ptico:

Oculares: Son los sistemas de lentes ms cercanos al observador. Pueden ser monoculares o binoculares. Objetivos: Son sistemas de lentes convergentes que se sitan en la parte inferior del tubo, mediante el revlver. Tienen distintos aumentos y se clasifican como objetivos secos (5x, 10x, 15x, 35x, 40x, 60x) y objetivo de inmersin (100x). El objetivo de 100x se llama de inmersin porque cuando se observa con esa lente se debe colocar aceite de cedro sobre la muestra y despus subir la platina hasta que el objetivo quede inmerso en el aceite, el cual sirve para ampliar ms la imagen.

Sistema ptico del microscopio

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Sistema de iluminacin: Condensador: Es un sistema de lentes convergentes que capta la luz y la concentra sobre la preparacin, de manera que proporciona mayor o menor contraste. Se regula con un tornillo. Fuente de iluminacin: Est constituido por una lmpara situada en el pie del microscopio.

Sistema de iluminacin del microscopio ptico

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FIJACIONES Y TINCIONES FIJACIONES La forma de preparar especmenes de microorganismos para su estudio microscpico, depende del tipo de microscopio que se usar, el propsito especfico del estudio y el tipo de microorganismo. Como ya lo habamos mencionado anteriormente el microscopio ptico de campo claro es el ms usado para el estudio microbiolgico general, ya que nos ayuda a observar a los microorganismos en preparaciones de dos tipos: Frescas: Tambin llamadas hmedas, las preparaciones en fresco se emplean para observar la movilidad, el tamao y la forma de agrupacin de los microorganismos en su estado natural. En este tipo de preparaciones la observacin de los microorganismos resulta ser difcil, ya que la diferencia entre los ndices de refraccin del medio y de los microorganismos no permite un buen contraste, adems del movimiento continuo de los microorganismos y las corrientes en el fluido. Las preparaciones en fresco pueden ser de dos tipos: En gota pendiente o suspendida: Este se realiza colocando la muestra en un cubreobjetos para despus invertirla rpidamente sobre un portaobjetos excavado. En portaobjetos normal: Se realiza colocando una asada o gota de la muestra entre el portaobjetos y el cubreobjetos. A este tipo de preparaciones se pueden agregar colorantes muy diluidos como el cristal violeta, rojo neutro o verde Janus, que aumentan el contraste de las clulas sin afectar su viabilidad. Fijas y teidas: Este tipo de preparaciones consisten en una capa de la muestra extendida sobre un portaobjetos libre de grasa. El extendido o frote se puede hacer de varias maneras: Distribuyendo el desarrollo microbiano de una gota sobre un portaobjetos.

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Por impronta, presionando el portaobjetos sobre la muestra. Con cinta adhesiva transparente Con un hisopo.

Los extendidos o frotes se dejan secar al aire: para asegurar que las clulas queden adheridas al portaobjetos y no se desprendan durante los lavados que se realizan durante las tinciones. Las preparaciones se pueden fijar de distintas maneras: Al aire libre. Con calor moderado pasando el porta objetos por la flama del mechero moderadas veces Adicionando sustancias deshidratantes y/o precipitantes como el metanol o cloruro de mercurio.

TINCIONES Las tinciones pueden clasificarse de dos diferentes maneras: Positivas: Cuando se colorea directamente a los microorganismos o a las estructuras en estudio. Negativas: Cuando se oscurece el fondo de la preparacin y se observa la silueta incolora de los microorganismos. La aplicacin de diferentes colorantes y la combinacin de colorantes, mordentes y decolorantes, ha permitido desarrollar diversas clases de tinciones, que pueden agruparse como:

1. Tinciones simples:

Consisten en aplicar un solo colorante a la preparacin para observar la morfologa de los microorganismos. En este tipo de tincin se usan principalmente los colorantes ms bsicos como el azul de metileno, cristal violeta y safranina.

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2. Tinciones diferenciales: Consisten en aplicar una combinacin de colorantes, mordentes y decolorantes que permiten poner en manifiesto algunas diferencias en la composicin de los microorganismos. Ejemplos de este tipo de tincin es la de Gram y la de Ziehl-Neelsen ya que permiten clasificar a las bacterias por lo menos en dos categoras (positivas y negativas) con respecto a la tincin empleada.
TINCIN DE GRAM:
Fue desarrollada por el dans Christian Gram en 1884. Esta tcnica consiste en aplicar 4 reactivos a la preparacin de bacterias fija: Cristal Violeta Yodo o Lugol Alcohol-Acetona Safranina

Y nos permite clasificar a las bacterias en dos grupos: Gram + (positivas) que se tien de morado y Gram (negativas) que se tien de rosa. La diferencia de la reaccin se basa en la composicin y estructura de la pared celular de las bacterias, la cual determina que unas retengan el primer colorante, en tanto que otras lo pierdan permitindoles as reaccionar con el colorante de contraste. Las bacterias Gram positivas presentan una pared celular relativamente gruesa (25 a 30 nm), con un mayor contenido de peptidoglicano (80 a 90%). En este grupo bacteriano el decolorante deshidrata y reduce la permeabilidad de la pared, por lo que al ser tratadas con el alcohol acetona no pierden el complejo cristal violeta-yodo.

Peptidoglicano 80 a 90 %

Las bacterias Gram negativas poseen una pared celular ms delgada (10 a 15 nm) y contienen poco peptidoglicano (5 a 10%). Estas bacterias adems presentan una capa externa constituida por lipopolisacridos; en estas bacterias el alcohol-acetona disuelve los abundantes lpidos de la pared, abriendo los poros lo que facilita la salida del complejo cristal violeta-yodo y la decoloracin, por lo que las bacterias se tornan invisibles y reaccionan con la safranina.

Lipopolisacrido Peptidoglicano 5 a 10 %

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3. Tinciones selectivas: Son aquellas que permiten observar un organelo celular determinado, porque el colorante se combina selectivamente con l; en algunos casos, se requieren mordentes, agentes acidificantes o precipitantes para lograr la combinacin especfica colorante-organelo; tambin suelen usarse colorantes de contrate, para distinguir el resto de la clula. Algunos tipos de tinciones selectivas son: Tincin de endosporas Tincin de flagelos Tincin de genoma

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OBJETIVOS:

Comprender la importancia que tiene el anlisis microscpico de los microorganismos en el laboratorio. Aplicar habilidades para lograr un buen enfoque con el microscopio, as como conocer las partes y sistemas del mismo. Aprender a fijar preparaciones correctamente con la flama del mechero. Ejecutar con los pasos adecuados una tincin simple y una diferencial. Comprender la funcin que desempea cada reactivo de la tincin de Gram y la diferencia que hay entre una bacteria Gram positiva y una Gram negativa.

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MATERIALES: Solucin de Benzal desinfectante 1 Esponja 1 Microscopio ptico 2 Laminillas con preparaciones fijas 1 Mechero de Bunsen Torundas con alcohol del 95% Papel absorbente 2 Portaobjetos 2 Placas de Agar con crecimiento bacteriano 1 asa bacteriolgica 1 Puente de tincin 1 Vaso de precipitados de 100 ml 1 Piceta con agua destilada Contenedor con solucin desinfectante

Reactivos para la tincin simple: Azul de metileno

Reactivos para la tincin de Gram: Gotero con colorante Cristal Violeta Gotero con colorante Safranina Gotero con Lugol Gotero con Alcohol-Acetona Aceite de inmersin

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DESARROLLO: Enfoque con el microscopio 1. Desinfecte la zona de trabajo limpiando en crculos la mesa con la solucin de Benzal desinfectante y la esponja. 2. Coloque el microscopio sobre la mesa de trabajo y encindalo. 3. Tome una de las laminillas con preparaciones fijas y colquela sobre la platina del microscopio. 4. Con ayuda del revlver, coloque el objetivo de 10x para observar la preparacin. 5. Con el tornillo macromtrico suba la platina del microscopio al mximo. 6. Ahora observe la preparacin y con el tornillo micromtrico de un enfoque ms fino a la misma, si es necesario modere la intensidad de la luz. 7. Aada los esquemas de los resultados que obtuvo. 8. Repita la operacin usando ahora el objetivo de 40x. Aada los esquemas de los resultados obtenidos.

Preparacin de muestra fija 1. Encienda el mechero de Bunsen y coloque las placas con cultivos dentro del radio de asepsia del mismo. 2. Tome los dos portaobjetos y lvelos con agua y jabn vigorosamente. 3. Con una torunda alcoholada limpie varias veces los portaobjetos que lav, pngalos a secar y flamelos 2 3 veces. Repita la operacin hasta que el cristal del portaobjetos quede desengrasado. 4. Dentro de la zona de asepsia, con la ayuda de la piceta coloque una gota de agua destilada sobre uno de los portaobjetos. 5. Tome el asa bacteriolgica y esterilcela en la flama hasta que sta est al rojo vivo, retrela del mismo y espere a que se enfri un poco. 6. Cuidando no salir del rea de asepsia, tome la placa con crecimiento bacteriano con la mano izquierda, brala y con el asa bacteriolgica recoja una pequea muestra colonial. 7. Cierre la placa cuidadosamente. Disuelva la muestra que tomo del cultivo bacteriano en la gota que coloco sobre el portaobjetos y extindala sobre el mismo. 8. Esterilice el asa bacteriolgica.

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9. Deje secar el frote y fjelo pasndolo sobre la flama del mechero 4 5 veces, cuidando que no se sobre caliente y altere la muestra. Para verificar lo anterior coloque el portaobjetos sobre el dorso de su mano, este no debe de quemar su piel, slo debe sentir el calor del mismo.

10. Repita la operacin en otro portaobjetos; usando esta vez la otra placa con crecimiento bacteriano.

Tincin simple 1. Tome una de las preparaciones fijas que realizo. 2. Suspenda el puente de tincin en la tarja, coloque el portaobjetos sobre el puente de tincin. 3. Con ayuda del gotero, agregue de 1 a 3 gotas de colorante azul de metileno, hasta que se cubra la muestra. 4. Deje actuar el colorante por 1 o 2 minutos. 5. Llene el vaso de precipitados con agua. 6. Una vez que haya transcurrido el tiempo, elimine el exceso de colorante con el agua del vaso de precipitados. 7. Deje secar la preparacin dejndola inclinada sobre un trozo de papel absorbente. 8. Coloque en la platina del microscopio la preparacin una vez que se haya secado. 9. Enfoque con el objetivo de 10x y despus observe con el de 40x. 10. Aada los esquemas de los resultados obtenidos.

Papel absorbente

Muestra secando

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Tincin Diferencial: Gram 1. Tome la otra preparacin fija que realizo y colquela sobre el puente de tincin. 2. Con ayuda de un gotero, agregue unas gotas hasta que cubra la preparacin fija con colorante Cristal violeta, deje actuar durante 1 minuto. 3. Escurra el exceso de colorante lavando con agua la preparacin y djela secar. 4. Una vez que se sec la muestra, cubra la preparacin con Lugol y djelo actuar durante 1 minuto. 5. Enjuague para eliminar el exceso de reactivo y deje secar la muestra. 6. Con el gotero, decolore la muestra con Alcohol-acetona mientras la sostiene ligeramente inclinada para que el decolorante resbale lentamente por ella. Tan pronto como las gotas de esta solucin ya no arrastren colorante, lave con agua y deje secar. 7. Cubra la preparacin con safranina y djela actuar por 1 minuto. Escurra el exceso de colorante enjuagando con agua y deje secar al aire. 8. Observe la preparacin primero con los objetivos de 10x, 40x y con el objetivo de inmersin (100x). Para usar el objetivo de inmersin, es necesario colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin y sumergir el objetivo de 100x dentro del aceite. 9. Aada los esquemas de los resultados y anote las observaciones realizadas

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RESULTADOS: Enfoque con el microscopio: Preparaciones fijas para practicar el enfoque en el microscopio.

Preparacin del tejido de una planta, observada con objetivo de 40x

Preparacin del msculo cardiaco, observada un objetivo de 10.

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Preparacin de muestra fija y tincin simple:

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Tincin diferencial: Gram Muestra sobre el portaobjetos fija y teida:

Observacin al microscopio ptico:

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ANALISIS DE LOS RESULTADOS: Logramos observar la microscopa microbiana tiendo de manera indicada las preparaciones que fijamos, provenientes de los cultivos que ya habamos realizado con anterioridad en la prctica pasada. No tuvimos la oportunidad de observar de manera correcta con el objetivo de inmersin la preparacin de la tincin diferencial debido a que termino la clase, probablemente esto sucedi porque dedicamos un gran periodo de tiempo en la observacin de las otras preparaciones; lo mejor ser hacer ms gil la visualizacin al microscopio en las siguientes prcticas. Al no hacer las observaciones adecuadamente con el objetivo de inmersin pudimos haber daado el lente de este objetivo, pero afortunadamente no sucedi lo antes mencionado. Otro problema que se presento fue que en la tincin simple, en lugar de usar el colorante azul de metileno usamos safranina, ya que no prestamos atencin en la etiqueta de los goteros. Es importante revisar las etiquetas de los reactivos, pues este tipo de descuidos puede provocar un accidente en el laboratorio.

CONCLUSIN: Logramos los objetivos de la prctica ya que comprendimos la importancia y los cuidados que se deben de tener al realizar una fijacin de microorganismos en un portaobjetos, y de igual manera entendimos que el estudio de microorganismos en el laboratorio es de suma importancia ya que nos ayuda a obtener un diagnstico ms certero, confiable y nos ayuda tambin a saber qu tratamiento podemos llevar a cabo.

BIBLIOGRAFA: R. M. Ramrez Gama, L. Hernndez e I. Mggenburg Rodrguez. Manual de prcticas de Microbiologa General. (2011), Mxico. Pginas: 4- 41. Q.F.B Porfirio. Microbitos Blog. Pruebas bioqumicas primarias. (2011). Disponible en: http://microbitos.wordpress.com/2011/09/27/pruebasbioquimicas-primarias/

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La batalla de los microorganismos. Tincin de Gram. (2012) Venezuela. Disponible en: http://microbiologiaujap2012.blogspot.mx/2012/03/la-tincionde-gram-normal-0-21-false.html