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Caracterizacin de Taninos

Katherina Fernndez E.
Universidad de Concepcin Octubre 2007

Qu son los Taninos?


Son compuestos fenlicos solubles en agua, con pesos moleculares entre 500-3000, que a demas de dar las reacciones fenolicas usuales, poseen la habilidad de reaccionar y precipitar con alcaloides, gelatinas y otras protenas
Bate-Smith and Swain, 1962

Taninos
Hidrolizables
(Polmeros de cidos fenlicos)

No Hidrolizables (Condensados)
(Polmeros de flava-3-oles)

Florotaninos
(Grupo minoritario y recientemente descubierto)

Difieren en su estructura qumica como en su origen biosinttico

Taninos Hidrolizables
Son esteres de cidos fenlicos (cido glico y elgico), con una azcar (glucosa) o un polialcohol

cido Glico

Galotaninos

cido Elgico

Elagitaninos

Desde 1989 gracias a Haslam, Okuda y Yokida ms de 750 nuevas estructuras se han elucidado

Galotanino

Taninos Condensados
Unidad bsica: flavan-3-ol Catequinas

Proantocianidas: Polmeros de flavan-3-oles


Son unidades de flavan-3-ol unidas entre si por enlaces C-C en la posicin 48 y 46

Florotaninos
Son aislados desde varias especies de algas pardas Sus estructuras estn constituidas de unidades de floroglucinol unidas por C-C o C-O

Aislado desde Eisenia Arbrea

Diversos Alimentos y Vegetales Poseen Taninos

Mtodos para analizar taninos


Separacin
(Cromatografa)

Identificacin
(Espectroscopa/Espectrometra)

Cromatografa
Un poco de historia
Primera aplicacin por Tswett 1906 Adsorcin cromatogrfica de pigmentos de hoja en una columna de carbonato de calcio Cromatografa de particin liquido-liquido (Martin and Synge, 1941) Cromatografa gaseosa (James and Martin, 1952) Cromatografia en papel (Bate Smith 1964) High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) (1966) y la incorporacin DAD (1982) y el desarrollo de materiales para nuevas columnas mejor el la caracterizacin fenoles

Cromatografa
Mejores resultados y actividades son obtenidos si los taninos son previamente purificados y/o concentrados
Extracts dissolved in 20mL buffer phosphate (pH 7.0)

Skin

100 berries

Seed

DSC18 y DSC 18Lt

Extraction

Wash Monmeros Oligomeros Proantocianidinas

Cromatografa
Monmeros y oligmeros:
Fase Reversa (RP-HPLC) Separar componentes por polaridad
gradientes solvente acuoso a un solvente orgnico

Columnas
Reversed-phase silica (C-18) Polystyrene divinylbenzene (PSDVB)
Extrado de Lazarus et al., 1999

Fase Normal (NP-HPLC)

Cromatografa
Proantocianidinas

Extrado desde Jerez et al., 2006

Cromatografa
Proantocianidinas:
Caracterizacin Estructural
Catlisis cida en la presencia de un agente nucleofilico (Phloroglucinol, Tiol, Benzil mercaptano) seguido de deteccin en HPLC Cromatografia de permeacin en gel (GPC)
Win es
Sugar, Acids and LMW phenolics were discarded

Proanthocyanidins (freeze-dried)

Phloroglucinolysis

Toyopearl HW-50F (Kennedy and Jones, 2001)

HPLC

Concentration, mDP, %Yield

Cromatografa
Proantocianidinas: Caracterizacin estructural por Phloroglucinlisis
Cromatograma HPLC
90 80 70 Ascorbic Acid Phloroglucinol

(280 nm)
Extension units: 1, epigallocatechinphloroglucinol (EGC); 2, catechinphloroglucinol (C); 3 epicatechinphloroglucinol (EC) and 5, epicatechin gallateploroglucinol (ECG).
5

Absorbance (mAU)

60 50 40 30 20

2
10 0 0 1 2 3 4 5 6

Terminal units: 4, catechin (C) and 6, epicatechin (EC).


9 10

Retention time (min)

Espectrometra/Espectroscopa
UV-Visible Espectrometra
Espectro flavan-3-oles

Max: 270-290 nm A ring

Comn a todos los flavonoides

No tiene utilidad para identificacin DE TANINOS

Se necesita incorporar otros indicadores que den solo cuenta de los taninos MEDICIONES INDIRECTAS

Espectrometra/Espectroscopa
Ensayos Colorimtricos para Taninos
Tanino + qumico = complejo o aducto coloreado

Desventajas: Falta de selectividad hacia los taninos Funcionan bien solo con muestras de taninos purificadas

Espectrometra/Espectroscopa
Ensayos colorimtricos para taninos
Butanol-HCl (Butanlisis) (Porter at al, 1986) Depolimerizacin cida, oxidacin y deteccin. Es selectivo para taninos condensados, interferencias por agua y metales en la muestra Prussian Blue o Folin Ciocalteu (reacciones de oxidoreduccin). Los fenoles se oxidan no selectivamente Vainillina. Influenciada por T, [ ], tiempo, entre otros (Sun et al., 1998) DMACA (4-dimetilaminocinamaldehido) (Treutter, 1989) Detectan el producto coloreado de la reaccin tanino- aldehdo

Espectrometra/Espectroscopa
Mtodos de Precipitacin con Protenas
Aprovechan la habilidad de los taninos para reaccionar con los protenas
Esta habilidad va a depender de: Peso molecular de los taninos El nmero de sitios disponibles pH T Fuerza inica Punto isoelectrico

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Mtodos de Precipitacin con Protenas


La eficiencia y el mecanismo de precipitacin de protenas es diferente para los diferentes clases de taninos (hidrolizables y condensados)

Protenas empleadas: Haemoglobin (Bate-Smith, 1973) Bovine Serum Albumine (BSA), (Hagerman and Butler, 1978; Harbertson et
al., 2003)

Gelatina (Glories, 1984) Ovoalbumina, (Llaudy et al., 2004) Saliva humana (-amilasa) (Baxter, 1997)

Mtodos de Precipitacin con Protenas


Deteccin de Taninos en forma Indirecta Ejemplo de Aplicacin de BSA Precipitacin Complejacin con FeCl3 Deteccin colorimtrica a 510 nm
Cuantificacin en equivalentes de catequina (mg EC/L)

Otros Mtodos de Deteccin de indirecta de taninos


(modulacin o inhibicin de la actividad enzimtica) Medicin de la fosfatasa alcalina (Ittah, 1991) Inhibicin de -galactosidasa (Dick and Berne, 1998) Accin degradativa de trypsin en las protenas (Mcnabb et al., 1998)

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Espectrometra/Espectroscopa
Mtodos de Precipitacin con Otros Reactivos Polietilenglicol (PEG) (Jones, 1965; Makkar et al.,1995) Polivinilpirrolidona (PVP) y Polivinilpoliprirrolidona (PVPP) (Makkar et al., 1993; Clifford, 1974) Acetato de Cobre (Yebra et al, 1995) Formaldehdo (Singleton, 1974) Ion metlico Iterbio (Yb+3) (Reed et al., 1985) Metilcelulosa (MCP) (Sarneckis et al., 2006)

Espectrometra/Espectroscopa
Espectrometra de masa (MS)
MS unida a LC para determinar la masa exacta de taninos

Un poco de historia.
El primer espectrmetro de masa fue construido en 1940 Time of flight (TOF) MS (1946) Ion cyclotron MS (1948) Quadrapole filters and ion-trap detectors (1953) Gas chromatography-TOF MS (1956)
Nueva era para la identificacin estructural

Liquid secondary ion mass spectrometry (LSI-MS) (1978) Fast atom bombardment mass spectrometry (FAB-MS) (1981)

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Espectrometra/Espectroscopa
Espectrometra de masa (MS)
No se necesita una gran preparacin de la muestra y la manipulacin no es excesiva Suave ionizacin iones moleculares abundantes con minima fragmentacin Se necesitan muestras relativamente puras
Matrix-assited laser desorption ionization (MALDI) MS (1987) MALDI-TOF-MS (2003) es una poderosa herramienta de mapping Electrospray Ionization (ESI-MS) (2002) HPLC-ESI-MS (1993) acoplar es una ventaja para el anlisis

Tandem mass spectrometry (MS-MS) (2004)

Espectrometra/Espectroscopa
Resonancia Magntica Nuclear (NMR)
El primer equipo fue introducido en 1953 y se convirti en una herramienta analtica con el Varian A-60 en 1961 Con la introduccin de la transformada de Fourier (FT-MNR) en 1966 se mejoro el desempeo y su aplicacin a fenoles LC-NMR poderosa herramienta para separar y caracterizar compuestos (Wolfender et al., 2003) Electron paramagneric resonance (EPR) tambin ha sido empleada para analizar fenoles (Hageman et al., 2003)

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Espectrometra/Espectroscopa
Espectrometra Infraroja (IR)
Descubierta F. Wilheim Herschel in 1800 Regin de inters del espectro IR :
Near Infrared (NIR): 14000-4000 cm-1 (700 to 2500 nm) Mid-Infrared (MIR): 4000 to 400 cm-1 (2500 to 2.5*104 nm)

Espectrometra/Espectroscopa
Espectrometra Infraroja (IR)
Ventajas No destructiva, de anlisis rpido, multicomponente Mnima preparacin de la muestras

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C=C-C aromatic ring 1450-1510 cm-1

C-O strectching 1230-1320 cm-1

Fingerprint zone (800-1800 cm-1)


1,0

Normalized Absorbance

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0 800

C-H aromatic out plane 670-900 cm-1

1000

1200

1400
-1

1600

C=C-C aromatic ring 1580-1615 cm-1

Combination of bands 1660-2000 cm-1

C-H aromatic 950-1225 cm-1

Taninos de Vino

1800

Wavenumbers (cm )

IR + Anlisis Multivariado

Predecir

Modelamiento: Application of Multivariate Techniques to Spectroscopy Partial Least Square (PLS)


1 column=1 1 file=1 spectrum
Modeling that maximizes the covariance between X and Y

Spectral data matrix

Reference Analysis

Y=X*b + e
b. Regresion Coefficient; e. residuals

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Quantitative Analysis of Red Wine Tannins Using Fourier Transform Mid-Infrared Spectrometry
MODELING
Concentration and mDP

86 varietal wines

modeling
FT- MIR

Proanthocyanidins Monomers and oligomers discarded

Catalysis Phloroglucinol

HPLC

Fraccionation C-18 column

m od eli ng

Concentration by
Protein Precipitation Assay

Best Model to Tannin Quantification


(Calibration with Phloroglucinolysis)

550 500

Tannins by FT-MIR (mg/L)

450 400 350 300 250 200 150 100 100

Calibration Validation Line of perfect correlation

RMSEC=2.6% RMSEP=9.4% Rc=0.995

150

200

250

300

350

400

450

500

550

Tannins by Phloroglucinolysis (mg/L)

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Best Model for mDP determination


(data obtained from Phloroglucinolysis)

6,5

Calibration Validation Line of perfect correlation

5,5

mDp by FT-MIR

4,5

3,5

RMSEC=6.7% RMSEP=10.3%

2,5

R=0.958

1,5 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5

mDP by Phloroglucinolysis

Conclusin
Un vasto nmero de tcnicas pueden ser empleadas para el anlisis de taninos Es un extenso campo que an esta en desarrolloy en la caracterizacin de taninos queda mucho an por hacer

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