ACTIVIDAD Y REGULACION DE LAS REACCIONES ENZIMATICAS

ACTIVIDAD ENZIMATICA Adems del efecto de la concentracin del sustrato [ S ] en la rapidez de la reaccin enzimtica hay otros factores que afectan la actividad de las enzimas: (a) La concentracin de la enzima [ E ]: a mayor concentracin de enzima mayor actividad cataltica (mayor velocidad inicial), siempre y cuando haya suficiente sustrato:

(b) El pH: todas la enzimas tienen un pH ptimo, al que habr mayor actividad o eficiencia enzimtica. Por lo general este valor flucta entre un pH de 6 a 8, aunque algunas funcionan mejor a bajo pH (pepsina). Los cambios en pH pueden cambiar las cargas electricas netas en los residuos de aminocidos y alterar la estructura nativa.

(c) La temperatura: hay una temperatura ptima a la que habr una mayor eficiencia enzimtica. Por lo general, entre los 50 a 60C la enzima pierde

efectividad y la rapidez de la reaccin disminuye bruscamente. A alta temperatura la enzima puede desnaturalizarse.

(d) Iones y coenzimas: sin la presencia de stos, no hay actividad enzimtica. UNION DEL SUSTRATO CON LA ENZIMA La enzima se une con una molcula del sustrato para formar un complejo enzima-sustrato (ES), que, a su vez, se disocia en el producto y la enzima, que se recupera:

El sustrato es, casi siempre, ms pequeo que la enzima y se une a sta en un lugar especfico llamado sitio activo o foco activo. Tpicamente, el sitio activo es una pequea abertura o hendidura en la estructura tridimensional de la enzima. Por lo general, la concentracin del sustrato es mayor que la de la enzima, [ S ] > [ E ], por lo que los sitios activos se "llenan" rpidamente: la enzima se satura. En este punto, el producto se forma a cierta velocidad (Vmax), no importa si se aumenta la [ S ]. Caracteristicas particulares del sitio activo: (a) Especificidad: una enzima puede discriminar entre diversas molculas de posibles sustratos. De aqu el axioma "una enzima para cada sustrato". El sitio activo tiene una forma que se asemeja bastante al sustrato, por lo que sustrato correcto se "ajusta perfectamente" en el sitio activo.

Hay dos tipos de especificidad: (1) Optica o absoluta: la enzima acepta slo un tipo de sustrato, por lo que la catlisis es de una sla reaccin con un slo sustrato. (2) Grupal: una enzima en particular slo interacciona con grupos qumicos especficos (grupos funcionales): alcoholes, pptidos, steres, etc. (b) Estructura: el sitio activo es una regin tridimensional relativamente pequea de la enzima. Cuando est totalmente encajado, el sustrato interacciona directamente con no ms de 3 a 5 residuos de aminocidos del sitio activo. (c) Interacciones: los sustratos son retenidos inicialmente en el sitio activo por interacciones no covalente, dbiles y reversibles, como la interacciones hidrofbicas, los puentes de hidrgeno y los puentes salinos, que sostienen al sustrato orientado hacia los residuos de aminocidos para una mayor eficacia enzimtica. La siguiente figura ilustra la reaccin enzimtica (hidrlisis de un enlace pptido por una peptidasa) y la fijacin del sustrato en el sitio activo:

El enlace escindido es el enlace que se va romper por la accin enzimtica. Cuando el sustrato se une al sitio activo se crea una tensin en ese enlace, que se rompe parcialmente en el estado de transicin. La energa necesaria surge de la energa liberada por la unin con el sustrato. El estado de transicin se estabiliza por la interacciones no-covalentes que se forman. MODELOS DE ESPECIFICIDAD A-Modelo de Llave-Cerradura (Lock & Key), propuesto por Emil Fischer en 1890, establece que el sitio activo y el sustrato tienen estructuras complementarias. La forma y la distribucin de cargas del sustrato le permiten "entrar" e interaccionar con el lugar activo de la enzima.

B-Modelo Ajuste Inducido (Induced-fit model), propuesto por Daniel Koshland en 1958. Las interacciones no-covalentes entre sustrato y enzima alteran la estructura tridimensional del sitio activo haciendo que ste se conforme al sustrato.

PROCESOS MECANISTICOS Sustrato-Enzima: se mantienen unidos por interacciones no-covalentes dbiles. En gran medida stos son responsables de la velocidad de reaccin. Una vez anclado al sustrato y estabilizado el estado de transicin entra en juego otros procesos implicados en el mecanismo, como lo son, por ejemplo: (a) Catlisis general cido/base: grupos en las cadenas laterales del sitio activo pueden donar o aceptar H+. Los grupos funcionales del sitio activo de la enzima que se comportan como cidos (-NH3+; -COOH) o como bases (NH2; -COO-) y ayudan en las reacciones de transferencia de protones, facilitan la ruptura de enlaces. Por ejemplo, la hidrlisis cida de un enlace pptido:

(b) Catlisis mediada por iones metlicos: los iones de los metales alcalinos (Na+, K+) y los iones de los metales de transicin (Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Ni2+) ayudan en las reacciones anzimticas de dos modos:

1-formando enlaces covalentes coordinados para fijar el sustrato y quede orientado apropiadamente y se una al sitio activo con una geometra muy especfica:

2-polarizando el enlace que va a ser escindido o restabilizando el intermediario cargado negativamente:

3-participando en reacciones de oxidacin-reduccin mediante transferencia reversible de electrones entre iones metlicos y el sustrato:

Las metaloenzimas requieren del ion metlico para la actvidad enzimtica. (c) Catlisis covalente: grupos funcionales nucleoflicos (ricos en electrones) de una enzima reaccionan con el sustrato formando unh intermediario con enlaces covalentes inestables. El intermediario se degrada y se forma el producto.

Los siguientes aminocidos contienen grupos nucleoflicos (circulados):

REGULACION DE LAS REACCIONES ENZIMATICAS ALOSTERISMO Y COOPERATIVIDAD Las interacciones entre las subunidades de una protena multimrica se ven afectadas por la uniones con ligandos. En la alostera (o alosterismo), el control de la actividad protena funciona por medio de la unin con ligandos: uniendo un ligando a un lugar especfico en la protena promueve un cambio conformacional que altera la afinidad de la protena por otros ligandos. Esto se conoce como transicin alostrica y los ligandos que promueven los cambios conformacionales son llamados efectores o moduladores . El trmino efector puede aplicarse a sustratos, activadores o inhibidores. Los efectos alostricos pueden ser positivos o negativos, dependiendo de si el efector aumenta o disminuye la afinidad protenica por otros ligandos. El cambio conformacional que ocurren en una determinada subunidad como respuesta a la unin de un ligando en un foco alostrico se conoce como efecto alostrico. Con respecto a las enzimas, los efectos alostricos se refieren a aquellos que se manifiestan en la actividad de una parte de la enzima - tal como el foco activo - por la unin de un efector en otra parte distinta de esa enzima. Las enzimas alostricas son usualmente multimricas u oligomricas (consisten de varias subunidades), por lo que contienen mltiples sitios activos. Subunidades idnticas se denominan protmeros, y cada protmero puede consistir de una o varias cadenas polipptidas.

El concepto de cooperatividad se usa para explicar la interaccin entre los lugares de unin con ligandos de estas enzimas; es la influencia que tiene la unin de un ligando a una subunidad sobre la unin de ligandos en otra subunidad de la protena multimrica. La cooperatividad generalmente implica cambios en la conformacin debido al efecto de un ligando en una subunidad que, a su vez, promueve en otra subunidad adyacente un nuevo cambio conformacional, pero con una alterada afinidad por el ligando efector o por un segundo ligando. El cambio conformacional puede ser inducido por un efector alostrico o por el sustrato. Ello implica que la unin entre el efector (la molcula que causa el efecto) y la enzima cambia la estructura de la protena , lo que conlleva una "comunicacin" a las otras subunidades de la protena de que esa unin se ha producido. La cooperatividad requiere de una protena con varios focos activos, usualmente localizados en mltiples subunidades de una protena multimrica. Las enzimas cooperativas son usualmente dmeros, trimeros, tetrameros, etc. Ambos conceptos, alosterismo y cooperatividad, tienen aspectos comunes en lo que se refiere a los cambios estructurales requeridos por ambos. La esencia de los dos efectos est en que los eventos de unin y catlisis que ocurren en un foco activo pueden influenciar los eventos de unin y catlisis en otro foco activo de una protena multimrica. Un efecto alostrico puede ocurrir sin cooperatividad: cambios conformacionales inducidos en un protmero no se transmiten a otros protmeros. Interacciones alostricas homotrpicos son las que ocurren cuando varias molculas idnticas - por ejemplo, varias molculas del sustrato - se unen a la protena. Este efecto se denomina como cooperatividad si el mismo se transmite a los diferentes protmeros de la protena.

Los efectos alostricos heterotrpicos son interacciones alostricas que ocurren cuando diferentes sustancias - por ejemplo, inhibidor y sustrato - se unen a la protena; son el efecto de un ligando en la unin de otro ligando diferente.

Los efectos alostricos homotrpicos o heterotrpicos pueden ser positivos (activacin) o negativos (inhibicin): -Si es positivo, entonces la unin del primer efector (activador) hace que sea ms fcil la subsecuente unin del sustrato. -Si es negativo, el primer efector (inhibidor), hace ms difcil la subsiguiente unin del sustrato. (La cooperatividad homotrpica negativa es muy rara).

La accin enzimtica alostrica se puede explicar por dos modelos que describen los cambios conformacionales en las subunidades individuales de una enzima multimrica. Estos son: modelo concertado y modelo secuencial. Modelo concertado: propuesto por Jacques Monod, Jeffries Wyman, y Jean-Pierre Changeux en 1965 para describir la cooperatividad: La protena (enzima) tiene dos conformaciones: la conformacin T (tensa o taut) y la conformacin R (relajada). En cualquier molcula enzimtica, todas las subunidades estn en la mismo estado conformacional (T o R). Sustratos y activadores se unen ms facilmente a la conformacin R ; los inhibidores son ms afines a la T. En ausencia de sustrato la enzima est ms en el estado T que en el R. En el estado R todos los focos activos tienen una mayor afinidad para el sustrato que en el estado T. Una vez una subunidad cambia al estado R, todas las dems subunidades cambian simultaneamente al mismo estado.

Modelo secuencial:

propuesto por Koshland, Nemethy y Filmer, propone que la unin de un efector causa un cambio conformacional en una subunidad que, a su vez, promueve un cambio conformacional en las dems subunidades de forma secuencial.

Este modelo explica el cooperativismo negativo en el que en algunas enzimas la unin del primer efector reduce la afinidad de la enzima por ligandos similares.

REGULACION A-Regulacin Alostrica: Las enzimas alostricas llamadas enzimas reguladoras (o marcadoras del paso, "pacemaker"), determinan la rapidez de un proceso; estas enzimas catalizan el primer paso del proceso, o el primer paso de una ruta ramificada que lleva a la formacin de un producto alterno. Son modificadas por la unin reversible no-covalente de una molcula seal; por ejemplo, para la secuencia:

La primera enzima (enz1) es la principal enzima de control y est influenciada por la concentracin de A, o la de P, o ambas. As a alta [ A ] y baja [ P ] se fomenta la secuencia hacia P; en ese caso, A sera un efector positivo. La enzima reguladora responde a una cintica que no obedece a la ecuacin de Michaelis-Menten porque no generan una hiperbola en la grfica de velocidad inicial vs concentracin de sustrato [S]. En su lugar, se obtiene una curva sigmoidal.

Este tipo de curva sugiere una relacin de segundo orden (o mayor) entre la rapidez (velocidad) y [S], es decir v es proporcional a [S]n, donde n > 1. A ciertos niveles de [ P ] el compuesto P puede actuar como inhibidor (efector negativo), proceso que se conoce comoinhibicin por retroalimentacin negativa por ser un ejemplo de un efecto alostrico negativo en una enzima reguladora. Esta inhibicin se observa cuando el producto final de una cadena inhibe la enzima del primer paso (u otro paso clave) de esa secuencia:

En este esquema, el producto "P" inhibe a la primera enzima (enz1) del proceso. Esto ocurre cuando se sintetiza suficiente cantidad de ese producto final. El compuesto "P" no tiene semejanza estructural con "A", el sustrato de la enz1, la enzima reguladora. De aqui que "P" debe unirse a la enz1 en lugar distinto del foco activo. Esto ilustra un efecto alostrico heterotrpico negativo ya que el producto "P" acta como un efector negativo o inhibidor alostrico. Complementando ambos procesos de regulacin alostrica (efecto positivo y negativo) se producir una cantidad adecuada de P sin que se agote por completo A.

B-Modificacin Covalente: Es la regulacin de ciertas enzimas por la interconversin reversible entre su forma activa y desactiva. Esto ocurre primordialmente por la fosforilacin y desfosforilacin en residuos especficos de las cadenas laterales. Este es un proceso enzimtico: una enzima causa la modificacin covalente de otra enzima (que acta como sustrato). En algunos casos, la modificacin transforma la enzima activa en la inactiva; en otros, es lo contrario. Por ejemplo:

C-Ruptura Proteoltica: Proenzimas o cimgenos, son precursores enzimticos inactivos. Estos pueden producirse y almacenarse y luego convertirse- irreversiblemente - en la enzima activa. El proceso implica la ruptura de uno o ms enlaces pptidos (pptido bloqueador):

D-Regulacin por Isoenzimas: Algunos procesos metablicos estn regulados por isoenzimas (o isozimas), que son diferentes formas moleculares de una misma enzima. Estas tienen secuencias de aminocidos similarers, pero no identicas. Todas catalizan la misma reaccin bioqumica y tienen: -distintas propiedades cinticas : diferentes Km y Vmax -diferentes propiedades reguladoras (diferentes efectores) -diferentes preferencias por coenzimas -diferente distribucin celular La ms conocida es la lactato deshidrogenasa (LDH) que cataliza la conversin reversible de piruvato a lactato:

LDH es un tetrmero con dos posibles tipos de subunidades: M (muscular) y H (cardiaco). Hay 5 tipos diferentes isoenzimas: LDH1 (H4); LDH2 (H3M), que se encuentran slo en el corazn y en los glbulos rojos LDH5 (M4), que se encuentra en el hgado y msculo esqueletal LDH3 (M3H); LDH4 (M2H2), que se encuentran en otros rganos.

La isoenzima M4 tiene mayor afinidad por piruvato y la H4 por lactato. Es de esperarse que las varias formas estan diseadas para servir a diferentes funciones regulatorias. Este tipo de regulacin permite que diferentes patrones metablicos funcionen en distintos rganos.