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Informe de Laboratorio No.

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Solubilidad de las protenas globulares


lvarez, David; Marn, Freddy; Merizalde, Wendy; Pez, Timothy.
Estudiantes de la asignatura IBT411-2 Bioqumi a 1! "arrera de Ingeniera en Biote nologa! #ni$ersidad de las %m&ri as! 'uito-E uador (ES#)EN Las protenas lo!"lares son las ms n"merosas en los seres vivos y las #"e realizan las $"n%iones !iol& i%as dentro de "n or anismo. 'stas protenas poseen "na estr"%t"ra tridimensional, m"y %omple(a res"ltado de ple amiento de "na o ms %adenas poli peptdi%as. )"ando estas protenas se en%"entran en "n medio #"e $avorez%a la destr"%%i&n de enla%es de a%omple(amiento d*!iles, se $orma "n pre%ipitado, %oa "la%i&n o tam!i*n llamado desnat"raliza%i&n. 'n el presente tra!a(o se est"dia y %ompara la sol"!ilidad de dos protenas lo!"lares presentes en los seres vivos, +ovoal!,mina de la %lara de h"evo, y la %asena de la le%he- ante distintos $a%tores #"mi%os +%idos, !ases, sales, al%oholes- y $si%os +%alor-. .e determin& #"e la sol"!ilidad de am!as protenas en "na sol"%i&n a%"osa %am!ia $ormndose "n pre%ipitado %on etanol a!sol"to; i "almente al dil"ir hidr&/ido de sodio en am!as sol"%iones la sol"!ilidad no %am!io. Por los dems $a%tores est"diados, la sol"!ilidad $inal $"e distinta entre las protenas men%ionadas. *alabras la$e+ )adenas poli peptdi%as, desnat"raliza%i&n, protenas lo!"lares, sol"!ilidad. %BST(%"T The most %ommonly $o"nd proteins in livin or anisms that are involved in a vast amo"nt o$ !iolo i%al $"n%tions in the !ody are lo!"lar proteins. These proteins have a %omple/ tridimensional str"%t"re, %a"sed !y the !ondin !et0een $"n%tional ro"ps in one or more polypeptide %hains. When these proteins are in an environment that promotes the destr"%tion o$ 0ea1 !onds that $orm this str"%t"re, a pre%ipitate is $ormed, also %alled denat"ralization. 2n the $ollo0in st"dy, the sol"!ility o$ t0o di$$erent lo!"lar proteins +al!"min $rom e 0hite, and %asein $rom mil1- is analyzed and %ompared; in response to di$$erent %hemi%al and physi%al $a%tors; $or e/ample a%id, al1aline or saline sol"tions; and heat. 3s a res"lt, it 0as determined that the sol"!ility o$ !oth these lo!"lar proteins %han ed 0hen a!sol"te ethanol 0as added to the sol"tion, $ormin a pre%ipitate. 4oth these proteins didn5t present any %han e in their sol"!ility 0hen sodi"m hydro/ide 0as added. 3part $rom these t0o %hemi%al $a%tors, !oth proteins6 sol"!ility 0as the %omplete opposite, 0hen the other $a%tors mentioned !e$ore 0here added. ,e-.ord+ Polypeptide %hains, denat"ralization, lo!"lar proteins, sol"!ility.

1. INT(/0#""I1N Las protenas son mol*%"las or ni%as #"e se %omponen de lar as %adenas de amino%idos; denominados polip*ptidos. Los amino%idos p"eden ser %onsiderados %omo %idos or ni%os, #"e %ontienen en s" estr"%t"ra "n r"po amino, "nido al tomo de

%ar!ono al$a. Los amino%idos p"eden %lasi$i%arse se ,n s" %ar a o polaridad en7 no polares, polares sin %ar a, aromti%os, polares %on %ar a positiva, y %on %ar a ne ativa. 'sta %ar a o polaridad de %ada amino%ido le !rinda s" sol"!ilidad o no en %omp"estos seme(antes, pero %"ando estn $ormando "na protena, hay varios

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amino%idos distintos; por lo #"e las propiedades son di$erentes. +8elson 9 )o/, :;<;, p.=>?=@3l "nos a"tores han or anizado a las protenas en $i!rosas y lo!"lares. Las protenas lo!"lares son las #"e se en%"entran en mayor propor%i&n en los seres vivos; y son dil"i!les por lo menos en "na de las si "ientes sol"%iones7 a "a, sol"%i&n dil"ida de sal, %idos dil"idos o al%alinos dil"idos. +Mertz, <A=<, p. BCLas protenas lo!"lares poseen "na estr"%t"ra ter%iaria o %"aternaria +dependiendo de los a re ados protei%os-. Des"lta de la estr"%t"ra res"ltante del ple amiento de "na o ms %adenas poli peptdi%as; #"e p"ede estar $ormada por "no o ms dominios estr"%t"rales. +Eerrera, <AA>, p. B@?BA3 s" vez las protenas lo!"lares simples p"eden ser or anizadas en r"pos distintos dependiendo de s" sol"!ilidad en a "a destilada o no. Dentro de las protenas lo!"lares sol"!les en a "a destilada en%ontramos las al!,minas, las se"do lo!"linas, las protaminas, las histonas. 3hora !ien las al!,minas son las protenas de inter*s est"diadas en esta pr%ti%a de la!oratorio. .on protenas m"y sol"!les, ampliamente distri!"idas en la nat"raleza; presentes en la %lara de h"evo, en s"ero san "neo, o en al!,mina del $ri(ol de soya. P"eden pre%ipitarse por "na sat"ra%i&n %on sal %ida, o li eramente %ida %omo por e(emplo el s"l$ato de amonia%o. 3dems se %oa "lan por %alentamiento. 3l perder s" sol"!ilidad o %oa "larse, las protenas se desnat"ralizan. La desnat"raliza%i&n es "na r"t"ra en s"s enla%es #"e mantienen s" estr"%t"ra interna esta!le. De esta $orma se %omportan %omo protenas $i!rosas, y s" sol"!ilidad %am!ia drsti%amente. +Mertz, <A=<, p. B@Ftra protena est"diada se en%"entra en la le%he, es la %asena, de$inida %omo "n %omple(o protei%o $os$orado, #"e pre%ipita a "n pE de GH,B. Desde ha%e tiempo esta protena ha sido %onsiderada %omo "na protena p"ra y homo *nea en s" p"nto isoel*%tri%o. 'n la le%he, esta protena se la en%"entra en $orma de mi%elas, %omo las protenas lo!"lares manteniendo s"s amino%idos no polares en s" interior, o s" n,%leo. +3lais, :;;>, p.<::?<:B2. /B2ETI3/S

2.1 /b4eti$o general

3nalizar el e$e%to de distintos %omp"estos #"mi%os en la sol"!ilidad de protenas lo!"lares, la al!,mina y %asena.

2.2 /b4eti$os espe fi os ? Determinar en #"* medio y a #"* propor%i&n se sol"!iliza me(or la al!,mina de la %lara de h"evo. 3nalizar el e$e%to de "n %ido $"erte, sal ne"tra y "na !ase $"erte en la sol"!ilidad de protenas lo!"lares +al!,mina y %asena-. )omparar res"ltados de sol"!ilidad total y sensi!ilidad entre la al!,mina de h"evo y la %asena de la le%he de va%a; ante posi!les e$e%tos #"mi%os e/ternos. 3nalizar el e$e%to de a re ar al%ohol en la sol"!ilidad de las sol"%iones de al!,mina y %asena. Di$eren%iar el e$e%to del %alor en la sol"!ilidad de las protenas %asena y al!,mina.

5. )%TE(I%LES 6 )7T/0/S

>.< Materiales y rea%tivos Iradilla. T"!os de ensayo. +<B Jaso de pre%ipita%i&n C;; ml. +: Me%hero !"nsen. Plan%ha de %alentamiento %on a itador. 3 itador ma n*ti%o.

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Fvoal!,mina. +< h"evoLe%he re%i*n ordeKada de va%a +<;; ml3 "a destilada. Tamp&n $os$ato. +:; mlFos$ato di %ido de sodio ;,C Molar. +:; mlEidr&/ido de sodio. +< Molar%ido %lorhdri%o. +< Molar)lor"ro de sodio. ."l$ato de amono. Deter ente. 'tanol a!sol"to. 'n el anlisis %"alitativo de la sol"!ilidad de la ovoal!,mina en distintos solventes se o!t"vo los si "ientes res"ltados presentados en la Tabla 1 donde se esta!le%e el vol"men a re ado a dos mililitros de ovoal!,mina. Los res"ltados se p"eden o!servar vis"almente en la Figura 1 presentada en 3ne/os. Tabla 1: Volumen agregado de distintos solventes, hasta obtener la mejor solubilidad de 2 ml de ovoalbmina. .olvente7 Jol"men a re ado7 8aE:PFH @ ml. E:F <: ml. Tamp&n $os$ato <: ml.

>.: Pro%edimiento e/perimental .e a!ri& y separ& la %lara del h"evo, %olo%ndose en "n vaso de pre%ipita%i&n. 'nton%es se analiz& y es%o i& la me(or sol"!ilidad de la %lara en "n medio %on a "a destilada, en tamp&n $os$ato, y en $os$ato di %ido de sodio ;,C Molar; tomando en %"enta la propor%i&n del solvente %olo%ada y $ase homo *nea. La sol"%i&n #"e me(or sol"!iliz& se reparti& en = t"!os de ensayo apro/imadamente : mililitros en %ada "no. La %asena de la le%he se en%"entra ya en sol"%i&n, por lo #"e solo se %olo%& apro/imadamente : mililitros de le%he re%i*n ordeKada de va%a en = t"!os de ensayo aparte; o!teni*ndose as <H t"!os de ensayo += %on sol"%i&n de ovoal!,mina y = %on sol"%i&n de %asena-. 3 %ada t"!o de ensayo de ovoal!,mina se le %olo%&7 Eidr&/ido de sodio < Molar, %ido %lorhdri%o < Molar, %lor"ro de sodio, s"l$ato de amonio, deter ente, etanol a!sol"to, y al ,ltimo t"!o se le %olo%& dire%tamente a la llama del me%hero. Lo mismo se realiz& %on los = t"!os de ensayo de la sol"%i&n de %asena +le%he-. .e o!serv& si e/isti& "n %am!io de sol"!ilidad, y de ser as si el pre%ipitado $"e notorio, o %omo $ormando "n %oloide. 4. (ES#LT%0/S

.e "tiliz& la sol"%i&n de ovoal!,mina %on $os$ato di %ido de sodio en rela%i&n H a <; por ser el ms id&neo.

La sol"!ilidad de la sol"%i&n de ovoal!,mina %on $os$ato di %ido de sodio al someterla a distintos $a%tores #"mi%os y $si%os se presentan en la Tabla 2, ("nto %on o!serva%iones para %ada %aso. Las Figuras 2, 3, 4 y 5 estn presentadas en 3ne/os. Tabla 2: Cambio de solubilidad de solucin de ovoalbmina al someterla a los distintos factores qu micos ! f sicos establecidos. 8a tor. Eidr&/ido de .odio. %ido %lorhdri%o. )lor"ro de .odio. ."l$ato de amonio. Deter ente. 'tanol *re ipitado. 8o. 8o. .. .. 8o. .. /bser$a i9n. 8in "na. 8in "na. Figura 2. Figura 3. 8in "na. Figura 4.

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3!sol"to. )alor. .. Figura 5. 'n la Tabla 2. L!i%ada en los res"ltados se p"ede o!servar #"e la sol"%i&n de ovoal!,mina pre%ipit& %on7 %lor"ro de sodio, s"l$ato de amonio, etanol a!sol"to y %alentamiento. 'sto se prod"(o por#"e la ovoal!,mina es "na protena lo!"lar sensi!le a pre%ipitar %on sales y #"e se desnat"raliza de!ido al a"mento de temperat"ra. +Mertz, <A=<- Mientras #"e el %am!io de sol"!ilidad de esta protena %on etanol a!sol"to se prod"%e por#"e la ovoal!,mina es insol"!le en al%oholes, el mismo #"e provo%a s" desnat"raliza%i&n y por ende s" pre%ipita%i&n. La ovoal!,mina no pre%ipit& %on7 hidr&/ido de sodio, %ido %lorhdri%o y deter ente. 'sto se de!e a #"e la ovoal!,mina no se ve a$e%tada tanto %on %idos y !ases. La desnat"raliza%i&n de la ovoal!,mina $"e m/ima %on el $a%tor de alta temperat"ra. 'n la Tabla 3 se o!serva el %omportamiento de la %asena %on respe%to a a entes e/ternos #"e pre%ipitan o no %on la misma. .e o!serva pre%ipita %on %ido %lorhdri%o por#"e la %asena se desnat"raliza %on %omp"estos #"e poseen "n pE menor a H.B %ondi%i&n presentada %on este %omp"esto. Tam!i*n e/iste "n %am!io de sol"!ilidad de la %asena %on etanol a!sol"to, por#"e no es sol"!le en al%oholes. De i "al manera en la Tabla 3 se o!serva #"e la %asena no pre%ipita %on7 hidr&/ido de sodio, %lor"ro de sodio, s"l$ato de amonio, y deter ente. 'sto se de!e a #"e los %omp"estos antes men%ionados son sales ne"tras o %omp"estos al%alinos, #"e poseen "n pE mayor o i "al a =, los %"ales no son valores %on los #"e pre%ipita la %asena. .e demostr& tam!i*n #"e el %alor no es "n $a%tor #"e determine %am!ios en la estr"%t"ra lo!"lar de la %asena. +3lais, :;;>.i se %omparan la Tabla 2 y la Tabla 3 "!i%adas en los res"ltados del presente in$orme se divisa #"e %ada protena posee "n %omportamiento espe%$i%o para %ada rea%tivo de!ido a s"s propiedades individ"ales. Por e(emplo la ovoal!,mina pre%ipita al %alor mientras la %asena no lo

La sol"!ilidad de la sol"%i&n de %asena de la le%he al someterla a distintos $a%tores #"mi%os y $si%os se presenta en la Tabla 3, %on los mismos parmetros de la ta!la anterior. Las Figuras 6 y 7 estn presentadas en 3ne/os. Tabla ": Cambio en la solubilidad de la leche #solucin con case na$ al someterla a distintos factores qu micos ! f sicos. 8a tor. Eidr&/ido de .odio. %ido %lorhdri%o. )lor"ro de .odio. ."l$ato de amono. Deter ente. 'tanol 3!sol"to. )alor. *re ipitado. 8o. .. 8o. 8o. 8o. .. 8o. /bser$a i9n. 8in "na. Figura 6. 8in "na. 8in "na. 8in "na. Figura 7. 8in "na.

:. 0IS"#SI1N

)omo se p"ede o!servar en la Tabla 1 la rela%i&n vol"m*tri%a ideal sol"to solvente para %onse "ir "na sol"%i&n homo *nea de ovoal!,mina se o!t"vo a partir de la adi%i&n de la ovoal!,mina %on $os$ato di %ido de sodio, en rela%i&n H a < de vol"men. 'ste res"ltado se de!e a #"e los otros solventes se %omportaron de $orma m"y d*!il al momento de homo eneizar la ovoal!,mina, sin %onse "ir a la $inal la homo eniza%i&n esperada.

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ha%e, de!ido a s"s distintos p"ntos isoel*%tri%os. Por tanto no se p"ede estandarizar el %omportamiento de las protenas por#"e %ada "na presentar %ara%tersti%as ,ni%as se ,n s"s enla%es peptdi%os. .in em!ar o tam!i*n se p"ede divisar #"e las dos protenas pierden s" sol"!ilidad en presen%ia de etanol a!sol"to, por#"e el mismo %a"sa desnat"raliza%i&n en am!as; a pesar de #"e e/ista esta seme(anza, s"s propiedades si "en siendo ,ni%as a raz&n de la individ"alidad de los enla%es peptdi%os de %ada protena por#"e s" %omportamiento, a pesar de e/istir esta seme(anza, no es id*nti%o. ;. "/N"L#SI/NES ? 'l me(or medio en el %"al sol"!iliz& la ovoal!,mina $"e en el $os$ato di %ido de sodio ;,C Molar, %on "na rela%i&n de H a < vol"men?vol"men. 'n el %aso de la ovoal!,mina pre%ipit& en presen%ia de sales, etanol a!sol"to y de %alor; mientras en el %aso de la %asena pre%ipit& en presen%ia de %idos $"ertes y del etanol a!sol"to. .e o!serva #"e tanto la %asena %omo la ovoal!,mina rea%%ionan de $orma distinta %on respe%to a a entes e/ternos, esto se de!e a s"s p"ntos isoel*%tri%os y las propiedades espe%$i%as de s"s %adenas peptdi%as. .e %on%l"ye #"e las protenas lo!"lares est"diadas no son sol"!les en presen%ia de etanol a!sol"to, y en eneral de al%oholes. La ovoal!,mina pre%ipita en presen%ia de %alor, por#"e esta protena lo!"lar se desnat"raliza en estas %ondi%iones de $orma irreversi!le, mientras #"e la %asena no se ve a$e%tada por la presen%ia de %alor por#"e s" enla%es peptdi%os no son sensi!les al mismo. ? 8o e/isten re%omenda%iones, la pr%ti%a se realiz& e/itosamente y en el tiempo esta!le%ido.

BIBLI/=(%8>%

Alais, C. (2003). Ciencia de la leche: Principios de tcnica lechera. Barcelona, Espaa: Revert. Herrera, E. (1993). Elementos de Bioqumica. !ico ".#, !ico: c$ra%&Hill. ert', E. (19(1). Bioqumica. !ico ".#, !ico: Centro re)ional *e a+,*a tcnica. -elson, "., . Co!, . (2010). Lehninger. Principles oh Biochemistry (/,inta e*.). -e% 0or1, Esta*os 2ni*os: #ree3an an* Co3pan+.
%NE?/S La si "iente Fi "ra representa vis"almente los res"ltados o!tenidos y mostrados en la Tabla 1, so!re la sol"!ilidad de la ovoal!,mina en tres distintos solventes.

<. (E"/)EN0%"I/NES

&igura 1: 'e(resentacin gr)fica de la solubilidad de la ovoalbmina en los tres solventes se*alados: &osfato di )cido de sodio, agua destilada, ! tam(n fosfato+ junto con la relacin establecida (ara cada solucin.

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3 %ontin"a%i&n se presentan las im enes de %&mo pre%ipit& la ovoal!,mina se ,n distintos %omp"estos, presentada tam!i*n en la Tabla 2. 'n todas las im enes se presentan a la iz#"ierda la sol"%i&n ini%ial de ovoal!,mina %on $os$ato di %ido de sodio, y a la dere%ha el t"!o de ensayo #"e ha s"$rido la pre%ipita%i&n7 &igura ,: -esnaturali.acin total de la ovoalbmina al estar e/(uesta a calor. Fvoal!,mina %on %lor"ro de sodio Figura 2.

&igura 2: Cambio de solubilidad leve de la ovoalbmina con cloruro de sodio #tubo de la derecha$. Fvoal!,mina %on s"l$ato de amonio Figura 3:

3hora se presentan las im enes del %am!io de la sol"!ilidad de la protena %asena de la le%he. 2 "almente %omo en las Figuras 2-5, a el t"!o de ensayo de la iz#"ierda %ontiene la sol"%i&n ini%ial de %asena sin s"$rir a"n de al ,n %am!io #"mi%o o $si%o; y el t"!o de ensayo de la dere%ha es el #"e ha s"$rido la pre%ipita%i&n7 )asena %on %ido %lorhdri%o Figura 6.

&igura 0: -esnaturali.acin mu! norotia ! (1rdida total de solubilidad de la case na con )cido clorh drico 1 2olar. &igura ": Cambio de la solubilidad leve de la solucin de ovoalbmina con sulfato de amonio. Fvoal!,mina %on etanol a!sol"to Figura 4: )asena %on etanol a!sol"to Figura 7.

&igura 3: 41rdida (arcial de la solubilidad de la case na de la leche con etanol absoluto. &igura %: Cambio en la solubilidad notoria de la solucin de ovoalbmina notorio con etanol. Fvoal!,mina e/p"esta al %alor Figura 5: