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QUMICA BIOLGICA. Ao 2011 Trabajo Prctico N 1: CUANTIFICACIN DE PROTENAS.

PROPIEDADES PTICAS DE PROTENAS

Objetivo: Dosar protenas mediante los mtodos propuestos y comparar los resultados obtenidos. Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se lleva a cabo la purificacin de una protena en particular; cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica; para el diagnstico de enfermedades; como as tambin para otros propsitos. Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se basan en la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV o en la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes. Absorcin Ultravioleta de las Protenas Todas las protenas absorben fuertemente debajo de 230 nm. La absorbancia por debajo de 230 nm es debido al enlace peptdico. Sin embargo, a esta longitud de onda tambin absorben otros compuestos que pueden interferir en la utilizacin de esta medida en la determinacin de la concentracin de protena (por ejemplo, altas concentraciones de ciertos buffers). Ninguno de los 20 aminocidos hallados en las protenas absorbe luz en la regin visible del espectro electromagntico; sin embargo, tres de ellos (tirosina, triptofano y fenilalanina) absorben significativamente en la regin del UV cercano. Dado que la mayora de las protenas poseen residuos de aminocidos aromticos, las medidas de absorcin a 280 nm constituyen un mtodo rpido para la determinacin del contenido de protena de una solucin. Mtodo de Gornall (reaccin del Biuret): Fundamento: Cuando se calienta la urea a 180C se descompone transformndose en un compuesto llamado Biuret, el cual en presencia de Cu2+ en solucin alcalina forma un complejo violceo. La unin peptdica tambin reacciona con el Cu2+ en medio alcalino dando coloracin violcea, de ah que a esta tcnica de identificacin de protenas se la llame reaccin del Biuret.

NH NH
2

180 C

C NH C

C NH

O NH

NH

Biuret
Se requieren al menos dos enlaces peptdicos para dar positiva esta reaccin. El mximo de absorcin del complejo protena - Biuret se produce a 545 nm, cuando se lee la absorbancia frente a un blanco constituido por el reactivo del Biuret. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados. Reactivo del Biuret: 1,5 g de CuSO4.5 H2O + 6 g de Tartrato de Na y K .4 H2O. Disolver en 500 ml de agua caliente, agregar 300 ml de NaOH 10 %. Llevar a 1 litro con agua. Tcnica: Agregar distintos volmenes de la muestra, completando a 0,3 ml con H2O, mezclar y adicionar 1 ml de reactivo de Biuret. Respetar el orden del agregado de los reactivos. MEZCLAR y leer absorbancia a 530 nm en un lapso de tiempo de entre 30 minutos y 2 horas. Testigo: BSA 30 mg/ml Sensibilidad: 0,2-1,5 mg de protena en el volumen final de la determinacin. Curva de calibracin sugerida: 0,25; 0,5; 0,8; 1; 1,2 y 1,4 mg del testigo.

Mtodo de Bradford Fundamento: Este mtodo constituye una forma rpida y confiable para la determinacin de protenas. Se basa en la cuantificacin de la unin del colorante Azul Brillante de Coomassie a una protena desconocida y la comparacin de esta unin con la de diferentes cantidades de una protena standard. El complejo colorante - protena presenta un mximo de absorcin a 595 nm. Este mtodo es sensible, simple y rpido. Solucin de Azul brillante de Coomassie: 100 mg de Azul Brillante de Coomassie G-250 + 50 ml de etanol al 95 % + 100 ml de cido fosfrico al 85 %. Llevar a 1 litro con H2O. Filtrar con papel Whatman No 1. Conservar a 4 oC. Tcnica: Agregar distintos volmenes de la muestra, completando a 0,5 ml con H2O, mezclar y adicionar 0,5 ml de Azul Brillante de Coomassie. Respetar el orden

del agregado de los reactivos. MEZCLAR y leer absorbancia a 595 nm en un lapso de tiempo de entre 2 minutos y 1 hora. Testigo: BSA 0,1 g/l Sensibilidad: 1-10 g de protena en el volumen final de la determinacin. Curva de calibracin sugerida: 1; 1,5; 2; 2,5; 3 y 3,5 g del testigo. NOTA: dada la alta sensibilidad del mtodo, verifique antes de comenzar a trabajar que los tubos estn limpios.

Cuantificacin de las muestras incgnitas: Cada grupo deber realizar una curva de calibracin por duplicado por alguno de los mtodos mencionados y determinar la concentracin de 2 muestras incgnitas. Volumen de las muestras incgnitas a utilizar: Mtodo de Gornall: 150 l. Mtodo de Bradford: 150 l.

ATENCIN:
Una vez finalizado el prctico cada grupo deber dejar su lugar de trabajo LIMPIO Y ORDENADO. Los tubos de ensayo debern ser borrados, enjuagados con alcohol, lavados y finalmente enjuagados con H2O destilada; de la misma manera debern lavarse las pipetas.

MATERIAL PROVISTO POR EL ALUMNO: alcohol. papel absorbente. marcador indeleble.

Informe de laboratorio: En el informe de laboratorio deber constar: La curva de calibracin y la determinacin de la concentracin de protena. En el caso que Ud. no pueda cuantificar alguna de las muestras incgnitas explique cmo procedera para realizarlo. La respuesta a las cuestiones planteadas a continuacin: Se determin que los valores de Abs a 280 nm para muestras de gelatina y ovoalbmina de igual concentracin no son iguales. A qu se debe la diferencia en los valores de absorbancia de las muestras? Esquematice el espectro de absorcin de dichas muestras incluyendo adems una muestra de hemoglobina de igual concentracin. Explique las diferencias observadas.

La medida de absorbancia a 280 nm: Es un mtodo confiable para la determinacin de la concentracin de protenas? Se puede aplicar a cualquier protena? Qu se usa como patrn para la construccin de las curvas de calibracin?