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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS


DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

MANUAL DE LABORATORIO DE
BIOQUMICA FUNDAMENTAL

4. EDICIN

MXICO, D.F.

2013
1

PROFESORES DE LA ACADEMIA DE BIOQUMICA


FUNDAMENTAL

DR. CARLOS WONG BAEZA

QFI. ROCO DEL CARMEN GUZMN IBARRA.

M. en C. PEDRO ANTONIO LOYOLA ABITIA.

DRA. DORIS NERI CORTS.

LABORATORIO DE BIOQUMICA FUNDAMENTAL

Nombre:
AGUILERA PALACIOS DIANA NITZHUI
Boleta:
2012500011
Grupo:
4AM1
Carrera: INGENIERA EN SISTEMAS AMBIENTALES
Profesores:

NDICE
REGLAMENTO DEL LABORATORIO

Prctica No. 1
Propiedades de los aminocidos y protenas
Prcticas No. 2, 3, 4, 5, y 6
Cintica enzimtica y curva tipo de azcares
Efecto de la temperatura
Efecto del
pH
Efecto de la concentracin del sustrato
Inhibicin Enzimtica
Prctica No. 7
Reacciones de carbohidratos

19
21
24
27
29

33

Prctica No. 8, 9 y 10
Reacciones enzimticas de xido-reduccin
I)
Deshidrogenasa lctica
II)
Determinacin de la deshidrogenasa succnica
III
Determinacin de citocromo c y citocromo oxidasa

40
43
44
45

Prctica No. 11
Aislamiento del DNA de chcharo/haba y su
caracterizacin espectrofotomtrica

47

APNDICE I:
Medidas generales de seguridad en el laboratorio.

54

APENDICE II:
Caractersticas y cuidados en el manejo de los reactivos
Qumicos txicos empleados en el laboratorio

55

REGLAMENTO DEL LABORATORIO DEL CURSO TERICO


PRCTICO DE BIOQUMICA FUNDAMENTAL
1. En la primera semana del curso, cada alumno deber traer una fotografa para su hoja de control de
asistencia.
2. Los cursos de laboratorio son para que los alumnos adquieran prctica y habilidad para desarrollar trabajo
experimental, por lo tanto, la asistencia es obligatoria.
3. El alumno que falte a una sesin de laboratorio, tendr una calificacin de cero en la sesin
correspondiente.
4. Las prcticas se iniciarn y se pasar lista a la hora indicada en los horarios, con una tolerancia de 10
minutos a la entrada; no habr retardos y se pondr falta a quien no llegue a la hora.
5. Todos los datos e informacin referente a las prcticas que se desarrollarn en el curso estn contenidas en
el instructivo de laboratorio, por lo que el alumno deber traerlo a cada sesin de laboratorio a la que
asista.
6. Para el trabajo de laboratorio es indispensable traer bata, un lienzo de franela, un marcador indeleble,
papel higinico, escobilln para tubos de ensayo, detergente, lpiz, regla y "masking-tape".
7. Durante el desarrollo de la prctica, queda estrictamente prohibida la entrada de personas ajenas al grupo.
8. Los laboratorios son un lugar de trabajo, por lo que se que se deber guardar el comportamiento adecuado.
9. Al finalizar el trabajo experimental el alumno deber apagar y desconectar los aparatos elctricos, entregar
su material limpio, depositar su basura en su lugar y dejar limpia su rea de trabajo.
10. Queda estrictamente prohibido sentarse en las mesas de trabajo.
11. Por razones de seguridad, queda estrictamente prohibido fumar o comer dentro del laboratorio.
12. El material de laboratorio roto, deteriorado o extraviado por los alumnos, deber reponerse, sin excusa
por el responsable directo o por el equipo de personas que efecten la prctica.
13. El informe de las prcticas de laboratorio deber hacerse por equipo en hojas blancas tamao carta
siguiendo las instrucciones del manual.
14. Los informes se entregarn una semana despus de terminada cada prctica o en fecha previamente
establecida por el profesor y al momento de pasar lista. Pasada esta fecha, ya no se recibirn informes.

PRCTICA No. 1
PROPIEDADES DE LOS AMINOCIDOS Y DE LAS PROTENAS
INTRODUCCIN.
Las protenas son polmeros de alto peso molecular, compuestos por aminocidos unidos entre s por
enlaces peptdicos, que en soluciones acuosas se comportan como coloides. Presentan propiedades qumicas y
fsicas que dependen directamente de factores intrnsecos del propio polmero, como son su estructura y
composicin de aminocidos, o bien de factores extrnsecos, como pueden ser el pH, la temperatura, la
presencia de sales, etc.
Existen varios mtodos para la identificacin y cuantificacin de las protenas, pero la mayora tiene
como principio alguna reaccin qumica caracterstica de los grupos R de los diferentes aminocidos.
Puede decirse que las protenas reflejan las propiedades qumicas de los residuos de aminocidos que
contienen, por lo que la mayora de las reacciones coloridas de identificacin dependen de la existencia de un
aminocido especfico en ellas.
OBJETIVOS.
Realizar algunas reacciones coloridas especficas para la identificacin de los aminocidos que
constituyen a una protena.
Comprender la importancia de estas reacciones para distinguir las protenas.
Observar el efecto que producen algunos agentes fisicoqumicos sobre la solubilidad de las protenas.
MATERIAL
Gradilla
Tubos de ensayo
Pipetas de 1, 5 y 10 mL
Vaso de precipitados de 100 mL

Bao mara
Agitador de vidrio
Pinzas para tubo

SOLUCIONES Y REACTIVOS
Hidrxido de sodio al 10%
Acetato de plomo al 5%
Ninhidrina al 1% en etanol al 96%
Insulina
Clara de huevo dil.
cido ntrico concentrado
Oxido rojo de mercurio
cido clorhdrico 0.1 N
Nitrito de sodio
Nitrato de plata al 2%
Cloruro de sodio al 5%
Etanol al 96%

Acido actico glacial


Reactivo de biuret
Gelatina al 5%
Acetato de sodio slido
Albmina al 5%
Tirosina al 1%
Etanol 96
Fenilalanina al 1%
Cistena al 1%
Aspartame al 0.5%
Cloruro mercrico al 5%
Hidrxido de sodio 0.1 N

1. REACCIN DE LA NINHIDRINA.
Es una reaccin caracterstica para grupos amino libres que se lleva a cabo a pH alcalino.
6

PROCEDIMIENTO
a) A 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en la tabla) se adicionan 5 gotas de la
solucin de ninhidrina en etanol. Observar a temperatura ambiente la aparicin de un color azul o violeta
que se debe a la presencia de los grupos amino libres; si es necesario, calentar en bao mara 1 2 minutos
los tubos en los que no aparece el color.
b) Anotar los resultados y observaciones en la tabla.

2. REACCIN DE MILLON.
El reactivo de Millon contiene una mezcla de nitritos y nitratos mercricos en cido ntrico concentrado.
Debido a la presencia del grupo fenlico se produce un compuesto de color rojo. El aminocido tirosina da
positiva esta prueba.
PROCEDIMIENTO
a) Adicionar a 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en la tabla) de 2 a 5 gotas del
reactivo de Millon y calentar en bao mara. La aparicin de un color rojo ser una prueba positiva.
b) Anotar en la tabla los resultados y observaciones.
3. REACCIN DEL PLOMO PARA CISTEINA.
Es una reaccin caracterstica para grupos sulfhidrilos.
PROCEDIMIENTO
a) A 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en la tabla) se adicionan 2 mL de NaOH al
10% y de 3 a 5 gotas de acetato de plomo al 5%, calentar hasta ver la aparicin de un precipitado acero o
negro.
b) Anotar en la tabla los resultados obtenidos.
4. REACCIN DEL BIURET.
Esta es una prueba general para protenas y pptidos de cadena no menor de 3 unidades de
aminocidos. Esta reaccin tiene utilidad en seguir el proceso de una hidrlisis protenica, ya que la reaccin
ser negativa cuando la hidrlisis sea completa.
PROCEDIMIENTO
a) A 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en la tabla) se adicionan 2 mL de NaOH al
10% y de 3 a 5 gotas del reactivo del biuret (solucin de CuSO 4 al 0.5%), mezclar bien. La formacin de
un color violceo o la precipitacin de hidrxido cprico ser una prueba positiva.
Si el color de la reaccin del biuret no se presenta inmediatamente, dejar reposar de 10 a 15 minutos.
b) Anotar en la tabla los resultados y observaciones
7

TABLA DE RESULTADOS

Gelatina
Albmina
Aspartame
Tirosina
Fenilalanina
Cistena
Agua

Reaccin de la
ninhidrina
*
*
*
*
*
*

Reaccin de
Millon
*
*

Reaccin para
grupos -SH
*
*

*
*
*
*

*
*

Reaccin del biuret


*
*
*
*
*
*

5. PRECIPITACIN DE PROTENAS POR EFECTO DEL pH .


La mayora de las protenas presentan un mnimo de solubilidad a un pH conocido como punto isoelctrico
(pI), que es el valor de pH en el cual la carga neta de la protena es cero y no migra en un campo elctrico.
Adems la protena presenta su mxima viscosidad.
Al preparar los tubos mostrados en la siguiente Tabla, mantener un tubo con 4.0 mL de volumen de la
solucin de clara de huevo.

PROCEDIMIENTO.
a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla:

TUBO No.

Clara de huevo
8

filtrada, dil. 1:3


(mL)

3.0

3.0

3.0

3.0

HCl 0.1 N (mL)

1.0

NaOH 0.1 N (mL)

1.0

Regulador de
acetatos 0.1M pH
4.7 (mL)

1.0

Agua

1.0

Observaciones

6. PRECIPITACIN
DIELCTRICA.

DE

PROTENAS

POR

MODIFICACIN

DE

LA

CONSTANTE

Existen ciertas sustancias orgnicas como alcoholes, teres y cetonas que reducen la constante dielctrica de
las soluciones acuosas de protenas, disminuyendo as su afinidad por el solvente, haciendo que las protenas
se disuelvan menos.

TUBO No.

Clara de huevo filtrada dil. 1:3


(mL)

2.0

2.0

Etanol (mL)

1.0

Agua

1.0

Observaciones

7. EFECTO DE ADICIN DE METALES.


Las protenas suelen precipitar al aadir a sus soluciones sales de metales pesados (sales de mercurio, plomo,
etc.). Estos precipitados proteicos pueden estar desnaturalizados, pero si la precipitacin tiene lugar en
condiciones rigurosamente controladas, se obtienen protenas nativas en forma de sales de metal pesado; estas
sales han sido muy tiles para el estudio cristalogrfico de las protenas con rayos X.
PROCEDIMIENTO
a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla:

TUBO No.
Clara de huevo filtrada dil.
1:3
(mL)
Cloruro mercrico 5% (mL)

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.125

0.125

0.125

0.125

0.125

Nitrato de plata 2% (mL)

Acetato de plomo 5% (mL)

Cloruro de sodio 5% (mL)

Agua (mL)

Observaciones

10

8. DETERMINACIN
INSULINA

DEL

PUNTO ISOELCTRICO DE LA

El punto isoelctrico (pI) de una protena es el pH en el cual la protena presenta su mnima solubilidad, su
carga neta es cero y no migra en un campo elctrico. Tericamente, es el pH para el cual la carga neta, la
suma de la carga de todos sus grupos disociables (como carboxilo, amino, imidazol, guanidino, etc.) es igual a
cero. La superficie de la protena siempre posee una carga elctrica, que depende del pH, de los electrolitos
presentes y del solvente, pero existe un conjunto de condiciones, basado en las relaciones entre todos estos
factores, para el cual la suma de las cargas positivas es igual a la suma de las cargas negativas y la carga neta
es cero. En estas condiciones las molculas de protenas pueden formar agregados que precipitan. A valores
de pH por arriba y por abajo del pI, todas las molculas poseen una carga neta negativa y positiva,
respectivamente, y se rechazan entre s. Por lo tanto, el pI coincide con solubilidad mnima de las protenas.
PROCEDIMIENTO
a) Preparar una serie de 5 tubos como se indica a continuacin, haciendo las mediciones de insulina con una
jeringa:

TUBO No.

cido actico
0.2 M (mL)

Acetato de sodio
0.2 M (mL)

Insulina
40 U/mL

0.23

0.02

6U
(0.06 mL)

0.15

0.10

6U
(0.06mL)

0.05

0.20

6 U
(0.06mL)

0.01

0.24

6U
(0.06 mL)

0.00

0.25

6 U
(0.06 mL)

pH

Observaciones

Si la solucin de insulina usada es de 80 U/mL medir en la jeringa de aplicacin 6 U (0.06 mL)


b) Anotar sus observaciones a los 5 y 10 minutos.
Calcular el pH a cada tubo e indicar cul es el punto isoelctrico obtenido para la insulina.
INFORME.
1. Introduccin.
11

2. Objetivos.
3. Resultados obtenidos en forma de tabla, para cada experimento.
4. Interpretacin y conclusiones de cada una de las reacciones.
5. Clculos.
6. Discusin.
7. Conclusiones generales.
8. Bibliografa.
9. Preguntas extra.

PREPARACIN DE REACTIVOS
1) Reactivo de Millon.- El reactivo se prepara aadiendo 60 g de xido de mercurio a una mezcla de 45 mL
de HNO3 concentrado y 50 mL de H2O. Cuando el xido de mercurio se ha disuelto, se aaden 50 mL de
una solucin de nitrito de sodio al 30%. El reactivo de Millon contiene nitritos y nitratos mercricos.
2) Nitrito de sodio al 30%.- Pesar 30 g de nitrito de sodio y llevar a 100 mL con agua destilada.
3) Soluciones de aminocidos al 1%.- Pesar 1 g del aminocido a preparar y llevar a 100 mL con agua
destilada. Si no se disuelve fcilmente, adicionar algunas gotas de solucin de NaOH o HCl para mejorar su
solubilidad. Calentar un poco si es necesario.
4) Soluciones de las protenas al 5%. Pesar 5 g de la protena a preparar y llevar a 100 mL con agua
destilada.
5) Ninhidrina al 1% en etanol al 96%. Pesar 1 g de ninhidrina y disolver en 100 mL de etanol al 96%.
6) Reactivo de biuret.- Pesar 0.5 g de sulfato de cobre y llevar a 100 mL con agua destilada.
7) Acetato de plomo al 5%.- Pesar 5 g de acetato de plomo y llevar a 100 mL con agua destilada.
8) NaCl al 5%.- Pesar 5 g de cloruro de sodio y llevar a 100 mL con agua destilada.
9) Nitrato de Plata al 2%.- Pesar 2 g de nitrato de plata y llevar a 100 mL con agua destilada.
10) Cloruro Mercrico al 5%.- Pesar 5 g de cloruro mercrico y llevar a 100 mL con agua destilada.
11) Solucin fresca de clara de huevo.- Separar la clara de un huevo y diluir con el doble de volumen de
agua destilada (dil. 1:3). Filtrar la a travs de gasa o algodn.
12) cido Clorhdrico 0.1 M.- Medir 8.3 mL de HCl concentrado (37%) y llevar a un litro con agua destilada
en un matraz aforado.
13) cido Actico 0.2 M.- Medir 11.55 mL de cido actico glacial y llevar a un litro con agua destilada en
un matraz aforado.
14) Acetato de sodio 0.2 M.- Pesar 16.4 g de acetato de sodio anhidro o 27.2 g de acetato de sodio trihidratado
y llevar a un litro con agua destilada en un matraz aforado.
15) Solucin comercial de Insulina 40U/mL u 80U/mL.- Mantener en refrigeracin.
BIBLIOGRAFA
1. Rendina, G. 1974. Tcnicas de bioqumica aplicada. Ed. Interamaricana. Mxico. Argentina. Espaa. Pp
59- 63.
2. Stryer, L. 1993. Bioqumica. 3a ed. Tomo I. Ed. Revert. Barcelona. Bogot. Buenos Aires. Mxico. pp 1570

12

PRCTICA No. 2
CINTICA ENZIMTICA Y CURVA TIPO DE AZCARES REDUCTORES

INTRODUCCIN
Las enzimas son protenas que catalizan reacciones biolgicas. Al igual que otros catalizadores aumentan la
velocidad a la que se alcanza el equilibrio, pero no afectan el equilibrio final de la reaccin. Facilitan la
reaccin proporcionando una ruta con menor energa libre de activacin para la transformacin de sustrato a
producto que en la reaccin no catalizada.
Las enzimas son altamente especficas y su actividad puede modificarse por diferentes factores tales como
temperatura, pH, concentracin de enzima, concentracin de sustrato, inhibidores, etc.
La cintica enzimtica comprende el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y de las
condiciones que las modifican, as como los mecanismos de reaccin.
Una de las enzimas ms conocidas y ms ampliamente estudiadas es la sacarasa, -fructofuranosidasa o
invertasa, que puede hidrolizar diferentes sustratos, presentando una mxima actividad con la sacarosa.
La velocidad de la reaccin de hidrlisis de la sacarosa puede medirse observando el cambio de rotacin
ptica, o bien, valorando el poder reductor de los productos formados en un tiempo definido.
En la siguiente reaccin se muestra la accin de la invertasa sobre la
sacarosa y se seala el sitio de accin sobre otros carbohidratos.

OBJETIVO GENERAL
Analizar algunos factores que modifican la velocidad de la reaccin catalizada por la invertasa y
caracterizar de esta manera a dicha enzima.

13

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas de 1, 5 y 10 mL
Gradillas
Espectrofotmetro
Tubos para espectrofotmetro
Bao mara a ebullicin
Vaso de precipitados de 100 mL
Cronmetro
Baos mara a 37, 50 y 75 C
Bao con hielo
SOLUCIONES Y REACTIVOS
Solucin de glucosa 0.005 M- fructosa 0.005 M
Sacarosa 0.20 M
Acetato de sodio 0.05 M
cido actico 0.05 M
Regulador de acetatos 0.05 M, pH 4.7
Hidrxido de sodio 2 N
Tartrato de sodio
Reactivo de cido 3,5-dinitrosaliclico al 1% (3,5 DNS)
Solucin de invertasa 10 g/mL
PROCEDIMIENTO GENERAL
1.-PREPARACIN DE LOS TUBOS PROBLEMA
a) Etiquetar perfectamente los tubos como se indica en cada uno de los experimentos.
b) Preparar la serie de tubos siguiendo las indicaciones del cuadro; adicionar cuidadosamente el sustrato, el
regulador y el agua.
c) Preincubar los tubos 5 minutos a la temperatura indicada en el cuadro.
d) Adicionar la enzima e incubar durante 5 minutos (medidos con cronmetro) sin sacar los tubos del bao
de incubacin. El tiempo de incubacin se inicia al momento de adicionar la enzima.
e) Hacer la adicin de la enzima con exactitud y con intervalos de 30 segundos entre cada tubo. Limpiar la
pipeta exteriormente antes de agregar la solucin enzimtica.
f) Detener la reaccin en el momento justo en que lleguen a trmino los 5 minutos de incubacin, adicionando
1 mL de 3,5-DNS siguiendo el mismo orden en que se adicion la enzima y retirndolos del bao.

14

g) Una vez reunida toda la serie de tubos, desarrollar color colocando los tubos en un bao mara durante 5
minutos contados a partir del momento en que empiece la ebullicin. Transcurrido este tiempo enfriar
rpidamente los tubos, sumergindolos en un bao con hielo.
h) Diluir cada tubo con 4 mL de agua destilada y mantenerlos en bao con hielo.
i) Leer todos los tubos en un espectrofotmetro a 540 nm. Ajustar a cero el aparato con el tubo testigo.
2.-PREPARACIN DEL TUBO TESTIGO
a) Etiquetar perfectamente un tubo como TESTIGO.
b) Adicionar el sustrato, el regulador y el agua, siguiendo las indicaciones del cuadro correspondiente.
c) Preincubar e incubar el mismo tiempo y a la misma temperatura de los problemas.
d) Adicionar al tubo, sin sacar del bao, 1 mL de 3, 5-DNS y acto seguido, adicionar la enzima y mezclar,
evitando as la actividad enzimtica.
e) Reunir el tubo testigo con los tubos problema para desarrollar color como se indica en el paso 1f.
f) Usar este tubo para ajustar a cero el espectrofotmetro, a una longitud de onda de 540 nm.
3.-CALCULO DE LAS UNIDADES DE INVERTASA
Interpolar en la curva tipo los valores de absorbencia obtenidos en cada experimento para conocer la cantidad
correspondiente de micromoles de azcar reductor, y con este dato, calcular la actividad de la enzima en
Unidades de Invertasa o Unidades Internacionales (UI), considerando que: una unidad de invertasa (UI) es la
cantidad de enzima necesaria para hidrolizar un micromol de sacarosa en un minuto.
o = actividad =

[moles sacarosa]
min.

= U. I

Reaccin catalizada por la invertasa

15

OH
O

OH
HO
HO

OH

HO

OH

HO
OH

Invertasa

OH

HO

-D-Glucopiranosa

H2O

OH

OH
O

HO

OH

OH
HO

OH

Sacarosa

HO

-D-Fructofuranosa
-D-Fructofuranosa

Reaccin para identificar la formacin de azcares reductores


CHO
H

COOOH
OH

HO

OH

OH

3, 5 DNS
(Amarillo)

CH2OH

D- Glucosa

COOH

NO2

O2N

92C

COO-

COOOH
OH

HO

OH

OH

OH
CH2OH

D-Gluconato

H 2N

NO2

3-nitro, 5-amino salicilato

NH2

O2 N

3-amino, 5-nitro salicilato

ROJO A mx = 540 nm

CURVA TIPO DE AZCARES REDUCTORES


16

Este experimento tiene por objeto obtener una curva de calibracin, mediante la cual se puedan transformar
las lecturas de absorbencia obtenidas en los experimentos de cintica enzimtica, en micromoles de azcar
reductor, para de esta manera obtener la actividad de la enzima invertasa en unidades Internacionales (UI).
PROCEDIMIENTO
a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla:
CURVA TIPO DE AZCARES REDUCTORES.

TUBO No.

Blanco

Problemas

0.1

0.2

0.4

0.8

1.0

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Regulador de acetatos 0.05 M, pH


4.7 (mL)

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Agua (mL)

1.0

0.9

0.8

0.6

0.2

0.0

3,5 DNS (mL)

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Glucosa 0.005 M
Fructosa 0.005 M (mL)
Sacarosa 0.20 M (mL)

Desarrollo de color
Dilucin

5 minutos a 92 C (en bao mara)


Colocar en bao con hielo y diluir con 2 mL de agua
destilada
Leer en un espectrofotmetro a 540 nm.

Absorbencia
= 540 nm
Azcar reductor
(moles)/ 2.0 mL.

INFORME
1.- Introduccin.
2.- Objetivos.
3.- Resultados en forma de tabla.
17

4.- Clculos.
5.- Curva tipo de azcar reductor. Grfica de absorbencia contra concentracin de azcar reductor, en
moles/2.0 mL.
6.- Escriba la reaccin qumica llevada a cabo, con frmulas.
7.- Discusin.
8.- Conclusiones.
9.- Bibliografa.
10.Preguntas extra.

PRCTICA No. 3
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIN
18

INTRODUCCIN
Como en las reacciones qumicas, la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima aumenta al
incrementarse la temperatura, hasta alcanzar una temperatura crtica (que vara de enzima a enzima),
denominada temperatura ptima; sin embargo, despus de esta temperatura la velocidad de la reaccin
empieza a disminuir y a temperaturas ms altas la enzima se inactiva por completo, generalmente por
desnaturalizacin.
El aumento de actividad enzimtica a temperaturas moderadas est asociado con un aumento en el nmero de
colisiones efectivas entre la enzima y el sustrato, ya que la temperatura proporciona la energa de activacin
suficiente para que el sistema alcance el estado activado.
El parmetro usado ms frecuentemente para describir el aumento de velocidad con la temperatura es el Q 10, el
cual representa el nmero de veces que la actividad enzimtica se incrementa al aumentar 10 C la
temperatura.
OBJETIVO.
1. Demostrar que las reacciones enzimticas son afectadas por la temperatura.
2. Calcular el valor de la energa de activacin de la reaccin catalizada por la invertasa.
PROCEDIMIENTO
NOTA: Para lograr el objetivo de esta prctica las temperaturas de preincubacin e incubacin se
deben mantener constantes durante el experimento. Al agregar el 3,5-DNS, retirar inmediatamente el
tubo de su bao correspondiente y sumergirlo en hielo.
a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla.
Terminado el experimento (una vez desarrollado el color), ajustar a cero el espectrofotmetro con el testigo de
25C. Tomar las lecturas de todos los tubos y restar la lectura del tubo testigo a la del problema
correspondiente.

19

EFECTO DE LA TEMPERATURA.

TUBO

Testigos

Problemas

T1

T2

T3

T4

T5

T6

Sacarosa
0.2 M (mL)
Regulador de acetatos
0.005 M,
pH 4.7 (mL)

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Agua (mL)

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75 0.75

0.75

0.75

Temperatura de
Preincubacin (C)
5 min

25

37

50

75

92

25

75

92

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.25

0.25

0.25

0.25

25

37

50

75

92

25

75

92

Enzima 10 g/mL
(mL)
Temperatura de
Incubacin (C)
5 min
Inactivacin

0.5 mL de 3,5-DNS + 0.25 mL de


enzima

37

0.25 0.25

37

5 minutos a 92C (en bao mara)

Dilucin

Enfriar y diluir con 2 mL de agua en cada tubo


Leer en un espectrofotmetro a 540 nm.

Velocidad
(unidades de
invertasa)

20

50

0.5 mL de 3,5-DNS a cada tubo

Desarrollo de color

Absorbencia
= 540 nm
Azcar reductor
( moles)

50

INFORME
1.-Introduccin.
2.-Objetivos.
3.-Resultados en forma de tabla.
4.-Clculos.
5.-Grfica de velocidad en unidades internacionales contra la temperatura en grados centgrados. Indicar en
la grfica obtenida, la temperatura ptima para la invertasa.
6.-De acuerdo con la ecuacin de Arrhenius
k = Ae-a/RT
Si se construye una grfica colocando en las ordenadas el logaritmo natural de la velocidad de la reaccin y
en las abscisas la inversa de la temperatura, en grados absolutos, es posible calcular la energa de
activacin si se saca la pendiente de la curva. (Para tener un mayor nmero de puntos, interpole en la
grfica de T contra vo la temperatura de 5 en 5 grados hasta la temperatura ptima y obtenga las
velocidades correspondientes.)
7.-Calcular la energa de activacin del sistema invertasa-sacarosa.
8.-Discusin.
9.-Conclusiones.
10.-Bibliografa.
11.-Preguntas extra.

21

PRCTICA No. 4
EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIN

INTRODUCCIN

En trminos generales las enzimas solo son activas en un margen limitado de pH y en muchos casos este es
estrecho y definido

La actividad enzimtica en funcin del pH est determinada por los siguientes factores:
a)

Desnaturalizacin de la enzima a valores extremos de pH.

b) Cambios en el estado de ionizacin en los grupos del sitio activo y/o del sustrato y
c)

Cambios en el estado de ionizacin de sitios alostricos y cofactores.

OBJETIVO

El alumno determinar el efecto de la variacin del pH sobre la velocidad de reaccin para los procesos
catalizados por enzimas.

22

EFECTO DEL pH

TUBO
T

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

4.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

Agua (mL)
0.75
0.75 0.75 0.75 0.75
Preincubacin a temperatura ambiente durante
5 minutos
0.5 mL DNS
+ 0.5 mL
0.5
0.5
0.5
0.5
Enzima 10 g/mL
Enzima
(mL)

0.75

Sacarosa
0.2 M (mL)
0.5 mL de
Regulador de pH

0.5

Incubacin a temperatura ambiente durante


5 minutos
Inactivacin

Dilucin

0.5 mL de 3,5-DNS a los tubos del 1 al 5


Desarrollo de color 5 minutos a 92 C
Enfriar tubos colocndolos en bao con hielo.
Colocarlos en una gradilla y diluir con 2 mL de
agua destilada
Leer en un espectrofotmetro a 540 nm

Absorbencia
Concentracin de de
azcar reductor
(moles/2 mL)
Velocidad (unidades
de invertasa)
pH
INFORME
1.- Introduccin.
2.- Objetivos.
3.- Resultados en forma de tabla.
4.- Clculos.
5.- Grfica de velocidad inicial en unidades de invertasa contra pH.
6.-Indicar en la grfica anterior el pH ptimo.
7.- Discusin.
8.- Bibliograf
PRCTICA No. 5
EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN
23

INTRODUCCIN

Si se modifica la concentracin de sustrato y todas las dems condiciones permanecen constantes, se observa que
a una concentracin de sustrato baja, la velocidad de la reaccin es proporcional a la concentracin del sustrato y
la reaccin por lo tanto, es de primer orden. Sin embargo, a medida que la concentracin de sustrato aumenta la
velocidad de reaccin tambin aumenta pero deja de ser proporcional a la concentracin de sustrato, en esta zona
el orden de reaccin es mixto. Con un aumento posterior de la concentracin del sustrato, la velocidad de la
reaccin llega a ser independiente de la concentracin de sustrato y se aproxima asintticamente a una velocidad
constante (Vmx). En este intervalo de concentracin de sustrato, la reaccin es de orden cero y se dice que la
enzima se encuentra saturada con su sustrato.

OBJETIVO

Observar el efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de la reaccin enzimtica y determinar la
constante de Michaelis-Menten por los mtodos conocidos, as como su aplicacin.
PROCEDIMIENTO
Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla:

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE


REACCIN

TUBO No.

Testigo

Problemas

24

0.50

0.05

0.10

0.15

0.30

0.50

0.8

Regulador de
acetatos 0.005 M,
pH 4.7 (mL)

0.50

0.50

0.50

0.50

0.50

0.50

0.50

Agua (mL)

0.50

0.90

0.80

0.70

0.60

0.50

0.20

0.5

0.5

Sacarosa
0.2 M (mL)

Preincubacin
Enzima 10 g/mL
(mL)
Incubacin
Inactivacin

5 minutos a temperatura ambiente


0.0

0.5

0.5

0.5

0.5

5 minutos a temperatura ambiente


0.5 mL de 3,5DNS + 0.5 mL de
enzima.

0.5 mL de 3,5-DNS a cada tubo

Desarrollo de color

5 minutos a 92C (en bao mara)

Dilucin

Enfriar tubos colocndolos en bao con hielo. Colocarlos en una


gradilla y diluir con 2 mL de agua destilada
Leer en un espectrofotmetro a 540 nm.

Absorbencia
= 540 nm
Azcar reductor
(moles)/3.5 mL
Velocidad
(unidades de
invertasa)
Concentracin de
sustrato
(moles/L = M)

25

INFORME
1.2.3.4.5.6.7.8.9.-

Introduccin.
Objetivos.
Resultados en forma de tabla.
Grficas de velocidad en unidades de invertasa o internacionales contra concentracin de sustrato en moles/l.
Clculo de la constante de Michaelis-Menten por el procedimiento grfico de Lineweaver-Burk.
Discusin.
Conclusiones.
Bibliografa.
Preguntas extra.

26

PRCTICA No. 6
INHIBICIN ENZIMTICA

INTRODUCCIN
La mayora de las enzimas pueden ser inhibidas por diversas sustancias qumicas. A partir del estudio de los
inhibidores de las enzimas se ha obtenido una informacin valiosa acerca de la especificidad de las enzimas por
sus sustratos, de la naturaleza qumica de los grupos funcionales en el sitio activo y del mecanismo de la
actividad cataltica. Los inhibidores enzimticos han sido tambin tiles para dilucidar las rutas metablicas en la
clula.
Existen dos tipos de inhibidores enzimticos: irreversibles y reversibles. Los inhibidores irreversibles son
aquellos que se combinan covalentemente a un grupo de la enzima. Los inhibidores reversibles son aquellos que
se combinan en forma no covalente en la enzima libre y/o al complejo enzima-sustrato disminuyendo la actividad
cataltica de la enzima.
Los inhibidores reversibles se dividen en: competitivos, no competitivos e incompetitivos (acompetitivos).
Los inhibidores competitivos.- Estos inhibidores tienen una estructura qumica similar a la del sustrato por lo cual
pueden competir con el sustrato por unirse al sitio activo, pero una vez unidos, no pueden ser transformados por
la enzima. Este tipo de inhibicin puede ser revertida simplemente aumentando la concentracin del sustrato.
Inhibidores no competitivos.- Estos inhibidores se unen slo a la enzima o al complejo enzima-sustrato en un
sitio diferente al sitio activo.
Inhibidores incompetitivos (acompetitivos).- Estos inhibidores se unen slo al complejo enzima-sustrato.
OBJETIVO
Determinar el tipo de inhibicin producido por una sustancia (anilina) sobre la actividad de la invertasa.

27

PROCEDIMIENTO
a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla.
La solucin de inhibidor (anilina 1.6 mM) ser proporcionada por
el profesor.
EFECTO DE INHIBIDORES

TUBO No.

Sacarosa
0.2 M (mL)
Inhibidor en
regulador de
acetatos
pH 4.7 (mL)
Agua (mL)

Testigo
1

0.50

0.05

0.10

0.15

0.30

0.50

0.80

0.50

0.50

0.50

0.50

0.50

0.50

0.50

0.50

0.90

0.80

0.70

0.60

0.50

0.20

0.5

0.5

Preincubacin
Enzima 10 g/mL
(mL)
Incubacin
Inactivacin
Desarrollo de color
Dilucin

Problemas

5 minutos a temperatura ambiente


0.0

0.5

0.5

0.5

0.5

5 minutos a temperatura ambiente


0.5 mL de 3,5DNS + 0.5 mL de
0.5 mL de 3,5-DNS a cada tubo
enzima
5 minutos a 92C (en bao mara)
Enfriar tubos colocndolos en bao con hielo. Colocarlos en una
gradilla y diluir con 2 mL de agua destilada
Leer en un espectrofotmetro a 540 nm.

Absorbencia
= 540 nm
Azcar reductor
(moles)
Velocidad
(unidades de
invertasa)
Concentracin de
sustrato
(moles/L = M)

28

INFORME
1.2.3.4.5.-

Introduccin.
Objetivo.
Resultados en forma de tabla.
Clculos.
Grficas de velocidad en unidades de invertasa contra concentracin de sustratos en presencia y ausencia del
inhibidor.
6.- Determinar grficamente el valor de Km y el tipo de inhibicin.
7.- Discusin.
8.- Conclusiones.
9.- Bibliografa.
10.Preguntas extra.

PREPARACIN DE REACTIVOS
1) Sacarosa 0.35 M.-Disolver 119.56 g de sacarosa y llevar a 1000 mL con agua destilada.
2) Regulador de acetatos 0.05 M, pH 4.7.- Mezclar 1 litro de cido actico 0.05 M (2.88 mL de cido actico
glacial en 1000 mL de agua destilada), con 1 litro de acetato de sodio 0.05 M (6.8 g de acetato de sodio en
1000 mL de agua destilada), verificar el pH y ajustar si es necesario.
3) Reactivo de 3,5-dinitrosaliclico.- Disolver en caliente 5 g de cido 3,5-dinitrosaliclico en 100 mL de NaOH
2 N (8 g de NaOH en 100 mL de agua destilada). Adicionar 150 gramos de tartrato de sodio a 250 mL de
agua destilada y calentar hasta disolucin, mezclar las dos soluciones y ajustar el volumen final a 500 mL con
agua destilada.
4) Glucosa 0.005 M- Fructosa 0.005 M.- Pesar 0.9 g de glucosa y 0.9 g de fructosa, mezclarlas y llevar a 1000
mL con agua destilada.
5) Solucin de invertasa 10 g/mL.- Pesar 1 mg de invertasa y disolver en 100 mL de regulador de acetatos 0.05
M, pH 4.7
6) Regulador de fosfatos 0.2 M, pH 7.5.- Pesar 27.8 g NaH2PO4 y llevar a 1000 mL con agua destilada. Pesar
53.6 g de Na2HPO4.7H2O y llevar a 1000 mL con agua destilada; mezclar 16.0 mL de solucin A con 84 mL
de solucin B y ajustar a 200 mL con agua destilada.
NOTA: Como alternativa se puede preparar la siguiente solucin de citrato-fosfato para utilizar la misma
solucin durante todo el experimento:
7) Anilina 0.8 mM.- Pesar 0.744 g de anilina y llevar a 1000 mL con regulador de acetatos (pH 4.7). Agitar
fuertemente para que se disuelva totalmente.

29

BIBLIOGRAFA
1. Alexander, R., Griffiths, J., Wilkinson, M. 1985. Basic biochemical methods. Wiley & Sons. pp 29- 34, 41- 43,
56- 69.
2. Clark, J. m. 1966. Bioqumica experimental. Edo Acriba, pp 106- 115, 131- 138.
3. Horton, R., Moran, L., Ochs, R., Rawn, D. y Scrimgeour, G. 1995. Bioqumica. Prentice Hall
Hispanoamericana. pp 5.1- 5.12.
4. Rendina, G. 1974. Tcnicas de bioqumica aplicada. Ed. Interamericana. pp 161- 177.
5. Stryer, L. 1993. Bioqumica. Ed. Revert. Vol I. pp 183- 206.

30

PRCTICA No. 7
REACCIONES DE CARBOHIDRATOS
INTRODUCCIN
Los carbohidratos se definen como polihidroxialdehdos, polihidroxicetonas o aquellos compuestos que
por hidrlisis los producen. Los carbohidratos se clasifican con base en su estructura qumica, por el nmero de
unidades en: monosacridos, oligosacridos y polisacridos.
En los monosacridos, la unidad de carbohidrato, puede ser una aldosa (polihidroxialdehdo) o cetosa
(polihidroxicetona) y stas a su vez se clasifican con base al nmero de carbonos, en triosas y triulosas, tetrosas y
tetrulosas, pentosas y pentulosas, hexosas y hexulosas, heptosas y heptulosas, etc. para finalmente reclasificarse
cada una de ellas por el nmero de sus centros quirales.
Los oligosacridos estn constituidos de 2-10 monosacridos unidos a travs del enlace glicosdico que
puede ser hidrolizado por enzimas o por cidos en ciertas condiciones.
Los polisacridos son carbohidratos que contienen un gran nmero de monosacridos unidos por enlaces
glicosdicos; son hidrocoloides, no forman verdaderas soluciones, no tienen color ni sabor y su peso molecular
puede llegar hasta varios millones. Los polisacridos son polmeros lineales o ramificados constituidos por un
solo tipo de monosacridos (homopolisacridos) o por diferentes monosacridos (heteropolisacridos).

OBJETIVO
Analizar las propiedades caractersticas de los carbohidratos, derivadas de su estructura, realizando
algunas reacciones generales de identificacin.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas de 1, 5 y 10 mL
Gradillas
Bao mara a ebullicin

Vaso de precipitados de 100 mL


Cerillos
Marcador
Masking tape

SOLUCIONES Y REACTIVOS
Glucosa slida y al 2%
Arabinosa al 2%
Maltosa al 2%
Sacarosa slida y al 2%
Fructosa al 2%
Glucgeno slido y al 0.2%
Almidn slido y al 2%
Dextrina slida y al 2%
Amilosa al 0.2%
-naftol

Etanol al 96%
cido sulfrico concentrado
Floroglucinol
HCl concentrado y diluido 1:3
Resorcinol
Sulfato de cobre
Hidrxido de potasio
Tartrato de sodio
Yodo elemental
Yoduro de potasio
31

1. ACCIN DE LOS
CARBOHIDRATOS.

CIDOS

REACCIONES

DE

CARACTERIZACIN

DE

Los cidos fuertes inorgnicos calientes deshidratan a las hexosas formando derivados furnicos como el
hidroximetil-furfural, que puede posteriormente descomponerse y formar otros compuestos como el cido
levulnico y el cido frmico. Por otra parte, a las pentosas las deshidratan produciendo furfural. Estas reacciones
son la base de las pruebas de Molish, Seliwanoff, Tollens y Bial para caracterizar carbohidratos, ya que el
producto deshidratado del carbohidrato se condensa con el reactivo correspondiente (alcohol aromtico)
produciendo compuestos coloridos caractersticos.

a) REACCIN DE MOLISH-UDRANSKY
FUNDAMENTO
La prueba de Molish est basada en la formacin de furfural o derivados de ste a partir de los
carbohidratos, que se condensan con el alfa-naftol, dando un producto violeta.
Es una reaccin muy sensible puesto que soluciones de glucosa al 0.001% y sacarosa al 0.0001% dan
positiva la prueba. Esta prueba tambin es positiva para aldehdos, cetonas y algunos cidos como el frmico,
oxlico, lctico y ctrico.

PROCEDIMIENTO
a) Colocar en el tubo de ensayo
correspondiente 1 mL de las soluciones a
probar marcadas con asterisco en la tabla
correspondiente.
b) Agregar 2 gotas del reactivo de Molish y
mezclar.

c) Dejar resbalar por la pared del tubo 1 mL de


H2SO4 concentrado, despus de lo cual ya no
agite el tubo.
d) Una prueba positiva es la formacin de un anillo
color violeta en la interfase.

b) REACCIN DE TOLLENS
FUNDAMENTO
La prueba de Tollens es una reaccin caracterstica para pentosas y est basada en la formacin de
furfural a partir de pentosas y su posterior condensacin con el floroglucinol, dando un color rojo cereza.

PROCEDIMIENTO

32

a) Colocar en el tubo de ensayo


correspondiente 0.5 mL de las soluciones a
probar marcadas con asterisco en la tabla.
b) Agregar 1 mL del reactivo de Tollens y
mezclar.

c) Calentar en bao mara a ebullicin por 3-4


minutos.
d) Una prueba positiva es un color rojo cereza.
Anote los colores obtenidos.

c) REACCIN DE SELIWANOFF
FUNDAMENTO
La reaccin de Seliwanoff es una reaccin para diferenciar cetosas de aldosas; aunque ambas dan la
reaccin, las cetosas la dan rpido y las aldosas lentamente.
Esta reaccin se basa en la formacin de furfural o en un derivado de ste y su posterior condensacin
con el resorcinol dando un color rojo fuego para cetosas y rosa para aldosas.

PROCEDIMIENTO
a) Colocar
en
el
tubo
de
ensayo
correspondiente, 1 mL de las soluciones a
probar marcadas con asterisco en la tabla.
b) Agregar 0.5 mL del reactivo de Seliwanoff y
mezclar.
c) Calentar en bao mara a ebullicin.
d) Tomar lecturas de la coloracin a intervalos
de 1 minuto durante los primeros 5 minutos.

e) Despus de los primeros 5 minutos saque los


tubos que ya tengan color rojo y deje los dems
en el bao mara a ebullicin por alrededor de
25 minutos adicionales.
f) Un color rojo fuego es una prueba positiva para
cetosas y un color rosa es una prueba positiva
para aldosas.

2. ACCIN DE LOS LCALIS Y PODER REDUCTOR DE LOS CARBOHIDRATOS


Los lcalis pueden inducir varias reacciones qumicas en los monosacridos que dependen de la
intensidad del tratamiento y de la concentracin del lcali utilizado. A bajas concentraciones (0.05 N) se favorece
la isomerizacin y el equilibrio ceto-enlico (aldosas-cetosas).
En condiciones ms severas (0.5 N), la isomerizacin se produce fuertemente y los enoles intermediarios
se rompen produciendo compuestos como: formaldehdo, aldehdo gliclico, gliceraldehdo, acetona, cidos
lctico, propinico, pirvico etc. En condiciones fuertemente alcalinas se generan cidos sacricos. Una reaccin
caracterstica de los carbohidratos se basa en el poder reductor que le confiere su grupo aldehdo o cetona.
a) REACCIN DE FEHLING
FUNDAMENTO
La reaccin de Fehling est basada en la accin reductora que tienen los azcares sobre los iones
cpricos en medio alcalino, como se representa a continuacin:
Carbohidrato reducido + Cu2+ Carbohidrato oxidado + Cu+
33

El reactivo de Fehling est constituido por dos soluciones que se mezclan al momento de usarse
(Solucin A de sulfato de cobre y solucin B de tartrato de sodio-potasio en medio alcalino) con lo que se obtiene
el tartrato de cobre, que es el que se reduce.
El poder reductor de los oligo y polisacridos depende del nmero de carbonilos potencialmente libres
que no estn involucrados en enlaces glicosdicos.
PROCEDIMIENTO
PREPARACION DEL TESTIGO
a)
b)
c)
d)

Colocar en un tubo de ensayo 2 mL de agua destilada.


Agregar 0.5 mL del reactivo de Fehling A y 0.5 mL del reactivo de Fehling B y mezclar.
Calentar en bao mara durante 5 minutos.
No debe producirse un precipitado rojo ladrillo, sino mantenerse el color azul caracterstico.
PREPARACIN DE LOS PROBLEMAS

a)
b)
c)
d)

Colocar en el tubo correspondiente 1 mL de las soluciones a probar marcadas con asterisco en la tabla.
Agregar 0.5 mL del reactivo de Fehling A y 0.5 mL del reactivo de Fehling B y mezclar.
Calentar en bao mara a ebullicin durante 5 minutos.
Una prueba positiva es un precipitado rojo ladrillo.
3. REACCIN DEL YODO
FUNDAMENTO

El yodo es atrapado por los polisacridos formando clatratos, y dependiendo de la estructura del
polisacrido, da una coloracin caracterstica; si el polisacrido es lineal se obtendr una coloracin azul pero si
es ramificado la coloracin obtenida va del prpura al rojo.
PROCEDIMIENTO
a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente
1 mL de las soluciones a probar (marcadas con
asterisco en la tabla).
b) Agregar una gota de lugol y mezclar.
c) Anotar el color producido en fro.

Blanco (agua)
Glucosa
Arabinosa
Maltosa
Sacarosa
Fructosa
Glucgeno
Almidn

Molish
*
*

Tollens
*
*
*

*
*

d) Calentar en bao mara.


e) Anotar la observacin despus de aplicar calor.
f) Introduzca los tubos calientes
en hielo y observar qu sucede.

Seliwanoff
*
*

*
*
*
34

Fehling
*
*

Solubilidad
*

*
*

Yodo
*
*
*

*
*

Dextrina

INFORME
1.2.3.4.5.6.7.8.-

Introduccin.
Objetivo.
Fundamento de las reacciones con frmulas.
Resultados en forma de tabla.
Interpretacin de cada una de las reacciones.
Conclusiones.
Bibliografa.
Preguntas extra.

35

PREPARACIN DE REACTIVOS
1)
2)
3)
4)
5)
6)

Glucosa al 2%.- Pesar 2 g de glucosa y disolver en 100 mL de agua destilada, refrigerar.


Arabinosa al 2%.- Pesar 2 g de arabinosa y disolver en 100 mL de agua destilada, refrigerar.
Maltosa al 2%.- Pesar 2 g de maltosa y disolver en 100 mL de agua destilada, refrigerar.
Sacarosa al 2%.- Pesar 2 g de sacarosa en 100 mL de agua destilada. Refrigerar.
Fructosa al 2%.- Pesar 2 g de fructosa en 100 mL de agua destilada, refrigerar.
Solucin de glucgeno al 0.2%.- Pesar 200 mg de glucgeno y disolver en 100 mL de agua caliente.
Refrigerar.
7) Solucin de almidn al 2%.- Pesar 2 g de almidn comercial y disolver en 100 mL de agua caliente, al
agua caliente agregar poco a poco el almidn. Refrigerar.
8) Dextrina al 2%.- Pesar 2 g de dextrina y llevar a 100 mL con agua destilada (para disolver, alcalinizar en
caliente y neutralizar posteriormente), refrigerar.
9) Amilosa al 2%.- Pesar 2 g de amilosa y disolver en 100 mL de agua destilada caliente. Refrigerar.
10)Reactivo de Molish.- Pesar 5 g de alfa-naftol y disolver en 100 mL de alcohol a 96.
11)Floroglucinol al 2%.- Pesar 2 g de floroglucinol y disolver en 100 mL de agua caliente.
12)Reactivo de Tollens.- Mezclar 10 mL de HCl concentrado con 2 mL de floroglucinol al 2% y llevar con
agua destilada hasta 18 mL.
13)Reactivo de Fehling:
Solucin A.- Pesar 34.65 g de sulfato de cobre y disolver 300 mL de agua destilada, llevar a 500 mL
con agua y conservar en frasco con tapn de hule.
Solucin B.- Pesar 125 g de KOH y 173 g de tartrato de sodio y potasio, y llevar con agua destilada a
500 mL, conservar en frasco revestido de parafina y con tapn de hule.
14)Reactivo de Seliwanoff.- Pesar 0.05 g de resorcinol y disolver en 100 mL de HCl diluido 1:3.
15)Lugol.- Pesar 1 g de yodo elemental, 2.0 g de KI (dos partes de KI por una de yodo), mezclar en un
mortero y agregar agua destilada poco a poco hasta la disolucin total. Llevar a 300 mL con agua destilada
y conservar en un frasco mbar.
BIBLIOGRAFA
1. Bohinski, R. C. 1991. Bioquimica. Addison- Wesleym Iberoamericana. pp 381- 415.
2. Clark, J. M. 1966. Experimental Biochemistry. W.H. Freeman & Co. California pp. 40- 42.
3. Daniels, L. J. y Neal A. L. 1967. Laboratory Experiments in Biochemistry. Academic Press. N. Y. pp 5758.
4. Litwack, G. 1967. Experimental Biochemistry. John Wiley & Sons. N. Y. pp 19- 25.
5. Minch, M. J. 1989. Experiments in biochemistry. Projects and procedures. Prentice Hall. Inc. pp 283- 296.
6. Plumer, D. T. 1981. Introduccin a la Bioqumica Prctica. Mc Graw Hill Latinoamericana, S. A. pp. 166167.
7. Rendina, G. 1974. Tcnicas de bioqumica aplicada. Interamericana. pp. 110- 121.
8. Robyt, J. F., White, B. J. 1987. Biochemical Techniques. Theory and Practice. Waveland Press. Inc. pp.
213- 227.

PRCTICAS No. 8, 9 y 10
REACCIONES ENZIMTICAS DE XIDO-REDUCCIN
INTRODUCCIN
Todas las manifestaciones vitales requieren energa, la cual se obtiene de la oxidacin gradual de los
alimentos a travs de reacciones de xido-reduccin, es decir, reacciones en las cuales se transfieren
electrones o hidrgenos desde un compuesto, el donador de electrones o agente reductor, a un aceptor de
electrones o agente oxidante.
Las grandes cantidades de energa que liberan las reacciones biolgicas de xido reduccin
constituyen de hecho la principal fuente de energa disponible para el trabajo de la clula.
El ATP es el portador intermediario de energa entre las oxidaciones biolgicas que la liberan y los
diversos sistemas que la utilizan.
Las reacciones de xido-reduccin llevadas a cabo por la clula son catalizadas por enzimas que
actan como intermediarios hasta llegar al aceptor final de electrones que es el oxgeno.

OBJETIVOS.
El alumno realizar una serie de experimentos en los que pondr de manifiesto la actividad de algunas
enzimas que participan en reacciones de xido reduccin, la importancia de los cofactores y el efecto de
algunos inhibidores.
MATERIAL
Tubos de ensaye
Pipetas de 1, 5 y 10 Ml
Bureta de 25 Ml
Vasos de precipitados
Mortero y pistilo
Equipo de diseccin
Matraz erlenmeyer de 125 Ml
Bao mara

Gradillas
Arena lavada
Tubos de centrfuga
Centrfuga
Recipientes para hielo
Balanza granataria

SOLUCIONES Y REACTIVOS
NaCl al 0.9%
Na2HPO4 0.06 M, pH 7
KCN 0.5%
Lactato de sodio al 1%,pH 7.0
Azul de metileno 0.002 M
-naftol al 0.15%

Aceite vegetal
Succinato de sodio 0.1 M, pH 7
Malonato de sodio 0.1 M, pH 7
p-feniln diamina al 1 %
N,Ndimetil-p-feniln-diamina
al 0.5%

Nota:

TRABAJAR LA SOLUCIN DE CIANURO DE POTASIO (KCN) CON MUCHA PRECAUCIN, YA QUE


ES UNA SUSTANCIA ALTAMENTE TXICA. NO UTILIZAR
PIPETA. MANIPULAR DICHA SUSTANCIA CON BURETA Y LAVARSE LAS MANOS.

PROCEDIMIENTO
1. OBTENCIN DEL SISTEMA DESHIDROGENASA LCTICA (LDH)-NAD+
A. Obtencin de la coenzima NAD+
a) Obtener 6 g de msculo de una pierna de pollo. Se puede utilizar msculo previamente congelado.
b) Cortar el msculo en fragmentos pequeos.
c) Colocarlos en un matraz erlenmeyer con 24 mL de agua.
d) Hervir durante 5 minutos y ajustar con agua destilada al volumen original.
e) Pasar la preparacin a un mortero con aproximadamente 1 g de arena y triturar el msculo hasta
homogeneizar.
f) Centrifugar a 2,500 rpm durante 15 minutos.
g) Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como "Coenzima NAD+".
h) Desechar el precipitado en una bolsa de plstico proporcionada por el profesor.

B. OBTENCIN DE LA DESHIDROGENASA LCTICA (LDH)


a) Obtener 6 g de msculo de una pierna de pollo . Se puede utilizar msculo previamente congelado.
b) Cortar el msculo en fragmentos pequeos y colocarlos en un mortero previamente sumergido en hielo.
c) Adicionar 24 mL de NaCl 0.9 % y aproximadamente 1 g de arena

d) Triturar el msculo en fro.


e) Centrifugar a 2,500 rpm durante 15 minutos.
f) Desechar el precipitado en una bolsa de plstico proporcionada por el profesor.
g) Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como "LDH".

2. OBTENCIN DE LA DESHIDROGENASA SUCCINICA "SDH" Y CITOCROMO OXIDASA.


a) Obtener un corazn de pollo. Se pueden usar corazones previamente congelados
b) Partir el corazn a la mitad, lavarlo con agua fra hasta que quede libre de cogulos y despus cortarlo en
fragmentos pequeos.
c) Colocar los fragmentos en un mortero previamente sumergido en hielo, y adicionar 25 mL de Na 2HPO4
0.06 M pH 7.0, y aproximadamente 1 g de arena.
d) Triturar el corazn en fro.
e) Centrifugar a 2,500 rpm durante 15 minutos.
f) Recuperar el sobrenadante, completar al volumen necesario con solucin de fosfatos, y etiquetarlo como
"SDH-Cit".
g) Desechar el precipitado en una bolsa de plstico proporcionada por el profesor.

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA


I) DESHIDROGENASA LCTICA
a) Preparar una serie de 5 tubos segn se indica en la tabla. Hacer observaciones a los tiempos indicados
anotando en el cuadro el grado de decoloracin con cruces.
TUBO No.

Lactato 1% (mL)

1.00

1.00

0.00

1.00

Azul de metileno 0.002


M (mL)
Agua (mL)

0.30

0.30

0.30

0.30

0.00

1.00

1.00

1.00

Coenzima NAD+
(mL)
LDH (mL)

1.00

0.00

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

0.00

Mezclar y mantener en hielo hasta agregar:


Aceite vegetal

0.5

0.5
No agitar los tubos

Incubar a bao mara a 37 C.


Observacin inicial:
2 min
5 min
7 min
10 min
15 min
30 min

0.5

0.5

Nota: Iniciar las lecturas en los tiempos indicados cuando se observe decoloracin en el tubo nm.
1.

II)

DESHIDROGENASA SUCCNICA

a) Preparar una serie de 7 tubos de acuerdo a lo indicado en la tabla siguiente. Hacer observaciones
a los tiempos indicados anotando en el cuadro el grado de decoloracin con cruces.

TUBO No.

Succinato de sodio
0.1 M (mL)

0.50

0.50

0.00

0.50

0.50

0.50

1.00

Azul de metileno
0.002 M (mL)

0.30

0.30

0.30

0.30

0.30

0.30

0.30

Malonato de sodio
0.01 M (mL)

0.00

0.00

0.00

1.00

0.50

0.25

0.25

Agua (mL)

1.00

3.00

1.50

0.00

0.50

0.75

0.25

SDH-CIT (mL)

2.00

0.00

2.00

2.00

2.00

2.00

2.00

0.5

0.5

0.5

Mezclar y mantener en hielo hasta agregar:


Aceite vegetal (mL)

0.5

0.5

0.5

No agitar los tubos


Incubar a bao mara a 37 C
Observacin 0 min:
2 min
4 min
6 min
8 min
10 min
15 min
20 min

0.5

III)

CITOCROMOS Y CITOCROMO OXIDASA

a) Preparar una serie de 8 tubos de acuerdo a la tabla siguiente. Hacer observaciones a los tiempos
indicados anotando en el cuadro los cambios de color de las soluciones.
NOTA: Puede utilizarse solucin recin preparada de N, N dimetil p-feniln diamina al 0.5%.

TUBO No.

KCN 0.5% (mL)

0.0

0.0

1.0

0.0

0.0

0.0

1.0

1.0

- naftol 0.15% (mL)

0.0

0.0

0.0

0.0

0.1

0.1

0.1

0.1

Agua (mL)

1.1

2.1

0.1

2.1

1.0

2.0

0.0

1.0

SDH-CIT (mL)

1.0

0.0

1.0

1.0

1.0

0.0

1.0

0.0

1.0

1.0

1.0

Mezclar
Leer color en cada tubo antes de iniciar la reaccin
p-feniln diamina 1% (recin
preparada) (mL)

1.0

1.0

1.0

0.0

Incubar a bao mara a 37C


Observacin 0 min:
Color que se tiene iniciar la
reaccin
1 min
2 min
4 min
5 min

1.0

INFORME
1.2.3.4.5.6.7.-

Introduccin.
Objetivos.
Resultados en forma de tabla.
Escriba con frmulas las reacciones que se efectuaron en esta prctica.
Interpretacin de cada tubo y global de cada serie.
Conclusiones.
Bibliografa.

PREPARACIN DE REACTIVOS
1) NaCl 0.9%.- Pesar 0.9 g de NaCl y llevar a 100 mL con agua destilada.
2) KCN 0.75%.- Pesar 0.75 g de KCN y llevar a 100 mL con agua destilada (dosis txica 4.3 mg/Kg de
peso).
3) Lactato de sodio 1%.- Pesar 1 g de lactato de sodio y llevar a 100 mL con agua destilada. Debe tener pH
7.0. En ausencia de lactato de sodio ste se puede preparar a partir de cido lctico y neutralizando la
solucin con bicarbonato de sodio slido, hasta pH 7.0.
4) Azul de Metileno 0.002 M.- Pesar 0.747 g de azul de metileno y llevar a 1000 mL con agua destilada.
5) Na2HPO412H2O 0.06 M.- Pesar 21.36 g de fosfato disdico y llevar a 1000 mL con agua destilada.
Ajustar a pH 7.0.
6) Succinato de sodio 0.1 M.- Pesar 11.8 g de cido succnico y llevar a 1000 mL con agua destilada.
Neutralizar la solucin con bicarbonato de sodio slido hasta pH 7.0.
7) Malonato de sodio 0.01 M.- Pesar 1.04 g de cido malnico y llevar a 1000 mL con agua destilada.
Neutralizar la solucin con bicarbonato de sodio slido hasta pH 7.0.
8) p-Feniln-diamina (base) al 1%.- Pesar 0.4 g de p-feniln-diamina y llevar a 40 mL con agua destilada
(DEBE PREPARARSE AL MOMENTO DE USARSE Y ESTAR A pH NEUTRO).
9) -naftol 0.15%.- Pesar 0.15 g de alfa-naftol y llevar a 100 mL con alcohol etlico 95%.
BIBLIOGRAFA
1. Conn, E. E. y P. K. Stump., Qutlines of Biochemistry., John Wiley and Sons, Inc., Fourth edition, pp.
287-288, 362-363, 375-392, (1976).
2. De Pierre, J. W. y L. Ernster. "Enzyme topology of intracellular membranes". Ann. Rev. Biochem.,
46:209-229. (1977).
3. Hinkle, E. R. McCarty. "Como fabrican ATP las clulas. Investigacin y Ciencia, 20:58-75. (1978).
4. Karp, G., Biologa Molecular, Mc Graw-Hill, Inc., USA (1987).
5. Lehninger, A. L., Principles of Biochemistry, 2a. Ed. Worth Publishers, Inc., pp. 415-417, 452-462,
542-567, (1993).
6. Martin, D. W., V. W. Rodwell, P. A. Mayes, D. K. Granner., Bioqumica de Harper., El Manual
Moderno. 10a. edicin (1986).
7. Rendina, G. Tcnicas de Bioqumica Aplicada. Ed. Interamericana. pp. 235-249. (1974).
8. Thorpe, W. V., H. G. Bray y P . S. James. Bioqumica. Ed. Continental, S.A. Mxico. pp. 195-208.
(1974).
PRCTICA No. 10

AISLAMIENTO DEL DNA DE CHCHARO, GUAYABA O HABA Y SU CARACTERIZACIN


ESPECTROFOTMETRICA

INTRODUCCIN
El cido desoxirribonucleico (DNA) es una molcula muy larga que contiene muchos miles de
desoxirribonucletidos de cuatro clases distintas, unidos en una secuencia que es caracterstica para cada
organismo y que consta, generalmente de dos cadenas. El genforo de las clulas procarinticas es una gran
molcula de DNA, dispuesta de modo compacto en una zona nuclear o nucleoide. Las clulas eucarinticas
contienen muchas molculas de DNA, combinadas con protenas y se hallan organizadas en la fibra de
cromatina en el interior del ncleo.

Las funciones del DNA consisten en almacenar la informacin gentica completa, necesaria para especificar
la estructura de todas las protenas y en cada una de las clases de RNA del organismo, en programar, tanto en
el tiempo como en el espacio, la biosntesis ordenada de los componentes de las clulas y de los tejidos, en
determinar la actividad de un organismo a lo largo de su ciclo vital y finalmente, en definir la individualidad
de un organismo dado.

En el aislamiento de los cidos nucleicos debe tenerse en cuenta lo siguiente:


1.- Debe romperse eficientemente la pared y membrana celular para facilitar la extraccin del cido nucleico
deseado.
2.- Se debe trabajar en condiciones que inhiban las nucleasas (enzimas degradativas) liberadas durante el
proceso de lisis celular.

El mtodo utilizado en esta prctica involucra el rompimiento de la membrana celular, inhibicin de


nucleasas, precipitacin de DNA impuro, disociacin de protenas del DNA y reprecipitacin del DNA ya
purificado.

OBJETIVOS
El alumno conocer y realizar un procedimiento de purificacin del DNA de una fuente vegetal.
El alumno obtendr el espectro de absorcin caracterstico del DNA.
MATERIAL
Mortero con pistilo
Vasos de precipitados de 250 Ml
Pipetas de 1, 5 y 10 Ml
Pipetas Pasteur
Tubos de centrfuga de 50 mL de
Polipropileno

Gasa (manta de cielo)


Cuchara de plstico
Matraz de 250 mL
Agitador de vidrio

SOLUCIONES Y REACTIVOS
Tris-EDTA-NaCl
Amilasa
Dodecil sulfato de sdio
(SDS) al 10 %
Chiocharo, Guayaba o Haba

NaCl slido
Solucin concentrada de citrato salina
(SSC)
SSC diluida 1:1000
Cloroformo: alcohol isoamlico (24:1)
Etanol absoluto

PROCEDIMIENTO
A.- Obtencin de DNA a partir de Chcharo, Guayaba o Haba.
a) Antes de empezar, colocar en el congelador el frasco de etanol absoluto.
b) Pesar 15g de Chcharo, Guayaba o Haba.
c) Pasarlo a un mortero y adicionar 5mL de la solucin de tris- EDTA-NaCl (50mM:20mM:5mM) .
d) Triturar de 3 a 5 minutos

e) Adicionar 0.3 mL de amilasa (100mg/mL). Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente. Agitar
ocacionalmente.
f) Agregar 10 mL de una solucin saturada de NaCl y 5 mL de SDS al 10%.
g) Seguir triturando durante 5 minutos.
h)

Filtrar el homogeneizado a travs de tela sinttica (magitel) en un embudo y recuperar el filtrado


(aproximadamente 10 mL) en un tubo falcon de 50 mL.

i) No exprimir con las manos


j) Aadir 15 mL de la mezcla de cloroformo: alcohol isoamlico (24:1) Ta el tubo y agitar vigorosamente
durante 30 segundos.
k) Centrifugar por 10 minutos a 4000 rpm. En este paso se obtienen 3 fases: en la superior se encuentra el
DNA, en la media la protena coagulada y en la inferior la mezcla cloroformo-alcohol isoamlico.
l) Separar con una pipeta Pasteur la capa superior y verterla lentamente a un vaso de precipitados
conteniendo 30 mL de etanol fro. En este paso el DNA libre de protena, asciende.
m) Dejar precipitar completamente el DNA.
B.- Caracterizacin espectrofotomtrica del DNA:
a) Separar el DNA con ayuda de un agitador eliminando el exceso de etanol presionando la muestra contra
las paredes del vaso de precipitados.
b) Disolver el DNA en 2 mL de solucin diluida de citrato salina diluida.
c) Preparar una dilucin 1:10 de esta solucin de DNA con citrato salina diluida.
d) Determinar la absorbencia de esta muestra diluida, a 260 nm contra un blanco del mismo diluyente.
e) Si la absorbencia a 260 nm (A 260) es mayor que 1.0, preparar una dilucin tal que la A 260 sea 1.0 o
ligeramente menor.
f) Usando esta solucin con A260 1.0, determinar los valores de absorbencia, de 210 a 300 nm, de 5 en 5
nm, para crear el espectro de absorcin del DNA.
g) Con estos datos, construir una grfica de absorbencia contra longitud de onda, en nanmetros.
h) Calcular la concentracin del DNA obtenido en g/mL mediante la siguiente relacin:
C = As260/22500 X FACTOR DE DILUCION
i) Determinar, con ayuda del nomograma anexo, la concentracin de su muestra de DNA. Este es otro
mtodo utilizado para determinar la concentracin del DNA si se conocen las absorbencias a 260 y 280
nanmetros.

INFORME
1.2.3.4.5.6.7.8.9.-

Objetivo.
Diagrama de flujo del procedimiento de obtencin del DNA.
Interpretacin de cada paso efectuado en la obtencin del DNA.
Espectro de absorcin del DNA.
Clculo de la concentracin del DNA obtenido, en g/mL tomando en cuenta el coeficiente de absorcin.
Determinacin de la concentracin del DNA obtenido, en mg/mL, con ayuda del nomograma.
Conclusiones
Pregunta extra.
Bibliografa.

PREPARACIN DE REACTIVOS
1) Solucin de tris-sacarosa-cloruro de magnesio.- Tris 0.01 M (PM 121.14); sacarosa 0.3 M (PM 342.30);
MgCl2 (PM 203.30). Pesar 1.21 g de tris, 102.66 g de sacarosa y 1.016 g de MgCl 2 y disolver en 1000 mL
de agua destilada en un matraz aforado.
2) Solucin de tris 0.4 M, pH 8.5.- Pesar 24.22 g de tris y disolverlo en aproximadamente 450 mL de agua
destilada en un matraz aforado, ajustar a pH de 8.5 y aforar.
3) Dodecil sulfato de sodio al 4%.- Pesar 20 g de dodecil sulfato de sodio (SDS) y llevar a 500 mL/cm de
agua destilada.
4) Solucin de EDTA salina, pH 8.0.- EDTA 0.1 M (PM 292.25); cloruro de sodio 0.15 M (PM 58). Pesar
2.922 g de EDTA y 0.87 g de NaCl y disolver en 80 mL con agua destilada. Ajustar el pH a 8.0 y llevar a
100 mL con agua destilada en un matraz aforado.
NOTA: Disolver el EDTA aadiendo NaOH concentrado y ajustar a pH de 8.0.
5) Solucin concentrada de citrato-salina.- Citrato de sodio 0.15 M (PM 294.10); cloruro de sodio 1.5 M
(PM 58). Pesar 11.028 g de citrato de sodio y 21.75 g de cloruro de sodio y disolver en 250 mL de agua
destilada en un matraz aforado.
6) Solucin diluida de citrato salina.- Preparar una dilucin 1:1000 de la solucin anterior. Mezclar 1 mL de
la solucin salina citrato concentrada con 999 mL de agua destilada.
7) Mezcla de cloroformo: alcohol isoamlico (24:1).- Mezclar 24 mL de cloroformo con 1 mL de alcohol
isoamlico.
NOTA: Esta solucin se prepara en el momento de usarse.

BIBLIOGRAFA
1. Clara, J., Jr. & Switzer, R. L. "Experimental Biochemistry" 2a. Ed. W.H. Freeman & Co. N. Y. San
Francisco. pp. 207-229 (1977).

2. Rendina, G. "Tcnicas de Bioqumica Aplicada". Ed. Interamericana. Mxico. Argentina. pp. 89-93
(1974).
3. Alemany. M., Font, D. "Prcticas de Bioqumica". Ed. Alhambra. Madrid. pp. 285-289 (1983).
4. Rawn, J. D. "Bioqumica". Vol. II. Mc Graw Hill. Interamericana. Madrid. pp 665-700 (1989).
5. Bohinski, R. C. "Bioqumica". 5a. Ed. Addison-Wesley Iberoamericana. Argentina. Brasil. pp. 227-242
(1991).

APNDICE I
MEDIDAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO.

De manera general puede considerarse que los riesgos que existen por el trabajo en el laboratorio pueden
evitarse con el uso de una buena tcnica de trabajo. De cualquier manera las muestras, los reactivos y
sustancias, el material y los aparatos que se utilicen deben ser manipulados de manera correcta pues los
accidentes leves que no se tratan correctamente pueden resultar de consecuencias graves.
En el laboratorio pueden presentarse accidentes tales como incendios o explosiones por el uso de solventes
flamables, por ello, este tipo de productos deben guardarse y usarse en lugares frescos y bien ventilados y a
prueba de fuego. No deben manejarse cerca de flamas y en lugares cerrados, donde los vapores puedan
acumularse y formar en el aire mezclas explosivas.
Los vapores de algunos reactivos usados en este curso de laboratorio son sumamente txicos, ya que pueden
penetrar a travs de la piel y causar erupcin y/o irritacin, tanto de sta como de los ojos, nariz y garganta,
por lo que deben medirse con propipeta, bulbos de hule o despachadores especiales para agregar reactivos
peligrosos y utilizarse en lugares bien ventilados.
En el manejo de los reactivos venenosos, corrosivos y custicos, aunque la mayora no tiene efecto de
absorcin en la piel, se debe tener cuidado ya que su ingestin es sumamente peligrosa, tal es el caso de los
cianuros, alcohol metlico, arsnicos, mercurio, etc. Por ello, debe insistirse en la importancia de rotular
correctamente los envases que los contengan y no beber ningn tipo de sustancia en el laboratorio.
En caso de ingerir cidos como el clorhdrico, ntrico, sulfrico, fosfrico y actico o hidrxidos como el de
sodio o de potasio, el tratamiento que se recomienda es el uso rpido de demulcentes como la leche o la clara
de huevo. El lavado gstrico y los hemticos estn contraindicados. La neutralizacin qumica (uso de lcalis
o cidos diluidos segn el caso), genera una reaccin exotrmica que empeora las lesiones existentes.
Se debe llamar al mdico o acudir a l en casos de ingestin, en el menor tiempo posible.