Laboratorio de Anlisis Instrumental / Otoo 2000/ Prof.

Jorge Castillo
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Figura 1
Figura 2
Aplicacin del Mtodo de Estndar Interno a la Cromatografa de Gases

Prof. Jorge Castillo R, 18/ Agosto / 2003

Introduccin:

El mtodo del estndar interno debe su nombre a la forma como
se preparan las muestras a ser analizadas. El estndar interno es
una sustancia que se aade a todas las muestras y estndares en
cantidad conocida y a la vez en cantidad suficiente para poder ser
determinado sin problemas, Su adicin no debe de causar ningn
tipo de interferencia en el anlisis, y debe de proporcionar una seal
analtica similar al analito en el anlisis pero distinguible del mismo.
Adems el estndar interno No debe estar presente en la matriz en
estudio.

Los mtodos basados en la adicin de un estndar interno
generalmente se utilizan cuando el analista esta interesado en la
concentracin de uno o algunos de los componentes y el mtodo de
anlisis es susceptible a errores tanto sistemticos como al azar.

El mtodo esta basado en que cuando las seales del analito y
del estndar interno responden proporcionalmente a las fluctuaciones
del mtodo y del instrumental empleado, entonces la razn de estas
seales es independiente de tales fluctuaciones; De esta forma el
mtodo compensa por errores provenientes de la manipulacin de la
muestra por analizar.

Un ejemplo del mtodo lo encontramos en la determinacin
espectroscpica de sodio y potasio en suero sanguneo por emisin
atmica. El estndar interno es generalmente litio el cual tiene una
seal de emisin comparable al analito pero no se encuentra
naturalmente en la sangre; La emisin de litio ocurre a diferente
longitud de onda que el sodio y potasio por lo que se puede analizar
sin problemas de interferencias espectrales; adems su adicin en la
cantidad requerida no afecta la matriz en estudio (sangre) y no
interfiere qumicamente con el analito. Al llevar a cabo el anlisis de
la muestra se determina simultneamente la lectura de emisin de
sodio, potasio y litio, si en algn momento existe un error (fluctuacin)
en el anlisis, podemos esperar que el mismo afecte de manera
similar las lecturas del analito y del estndar interno y podamos
compensar el anlisis.

Factores de Respuesta:

Para aplicar el mtodo del estndar interno a la cromatografa
de gases debemos primeramente emplear correctamente los factores
de respuesta, por lo que se dar a continuacin una pequea
introduccin a la utilizacin y determinacin de los factores de
respuesta del detector al analito.

Tanto en cromatografa como en la gran mayora de las tcnicas
instrumentales de anlisis, es poco frecuente que todos los
componentes de una muestra tengan una misma respuesta en el
detector, es por esta razn que debemos emplear la misma sustancia
a analizar (analito) en forma pura para preparar los estndares en
una curva de calibracin, adems de tratar de mantener las mismas
condiciones del mtodo y del instrumental que sern empleados en el
anlisis para todas las muestras (estndar y desconocido)

Bsicamente los factores de respuesta se obtienen de la
siguiente relacin:
Ci = FiAi

As el factor de respuesta del detector (F) a una sustancia es
una constante que correlaciona el rea (A) con la concentracin (C).

Supongamos dos soluciones cada una de concentracin
0.1%v/v de los compuestos A y B las cuales se inyectan en igual
cantidad y empleando las mismas condiciones a un cromatgrafo del
cual se obtienen las siguientes reas:





AA = 500 y AB =1000 ( Fig. 1).

Al calcular los factores se obtiene:

FB = CB/AB = 0.1/1000 = 0.0001
FA = CA/AA = 0.1/500 = 0.0002

Como podr observar existe una
relacin directa entre estos factores de
respuesta y el rea del pico
cromatografico; Entre mas pequeo
sea el factor mas grande ser el rea y
mayor la sensitividad del detector para
ese analito. De lo anterior podemos
observar que FB es la mitad de FA y que el detector producir una
seal (rea) para el compuesto B que ser el doble de la esperada
para el compuesto A (empleando mismas condiciones y
concentraciones de A y B).

Supongamos ahora que
queremos calcular la cantidad del
compuesto A y B en una solucin
desconocida, la cual se inyecta en
igual cantidad y bajo las mismas
condiciones que los estndares (ver
fig. 2). En esta mezcla se encontr que
el rea de A es igual al rea de B. Si
nos dejamos llevar simplemente por las reas de los compuestos
podemos suponer que habr igual cantidad (concentracin) del
compuesto A y del compuesto B en la mezcla lo cual seria un grave
error (de 50%, en este caso) ya que supondramos factores de
respuesta idnticos para ambos compuestos; lo cual es poco comn
pero... algunas veces ocurre como por ejemplo para algunos
compuestos con isomera espacial (enanteomeros).

Calculemos las concentraciones de cada componente en la
mezcla empleando los factores de respuesta previamente calculados:

CA = AA/FA = (500)/(5000) = 0.10%
CB = AB/FB = (500)/(10000) = 0.05%

Mtodo del Estndar Interno

En el mtodo de estndar interno se emplea normalmente una
curva de calibracin (fig. 3) empleando una serie de soluciones que
contienen igual cantidad del estndar interno e incrementos en la
cantidad del analito. Se
inyectan las soluciones y del
cromatgrama obtenemos el
rea del analito y el rea del
estndar intern, se calcula la
relacion entre las reas
(Aanalito/AEst. Int.) y se grfica
contra la concentracin de
analito en cada solucin.
Finalmente se interpola en la
grfica obtenida el valor de la
razn de reas de una
muestra desconocida, la cual
debe contener la misma
cantidad de estndar interno
que los patrones.
Fig. 3 Curva de Calibracin (Estndar Interno)

Por desgracia en el experimento de laboratorio (GC2) no
tenemos el tiempo para realizar el anlisis de las soluciones patrn
requeridas por lo que solo empleamos un solo estndar (patrn) y
supondremos una relacin lineal entre la razn de reas y la

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concentracin de analito. El anlisis se efecta de la siguiente
manera:

Se prepara una solucin patrn de concentracin conocida tanto
del estndar interno como del analito, con lo que se establecer una
relacin entre sus concentraciones, en nuestro caso:

CA = CEi AA FA = AEi FEi FA = AEi FEi /AA

Ahora asignaremos al estndar interno un factor de respuesta
igual a la unidad (1.0) esto nos permitir calcular el factor FA en
funcin del estndar interno, de tal forma que el factor obtenido ser
un factor de respuesta relativo.

Una ves encontrado el valor del factor de respuesta relativo del
compuesto procederemos a analizar los datos del desconocido, el
cual debe contener una concentracin conocida del estndar interno
(CEiD). Emplearemos para ello las reas del analito (AAD) y del
estndar interno (AEID) en la muestra del desconocido, para obtener la
concentracin del analito en el desconocido, se procedera de la
siguiente forma:

CAD = FAAAD y CEiD = FEiAEiD CAD/CEiD = FAAAD/FEIAEiD

CAD = FA AAD CEiD / FEi AEID

De esta forma se obtiene el valor de la concertacin del analito
en el desconocido (CAD).

Recuerde que en el experimento GC2 se calculan los factores
para cada inyeccin del patrn y luego estos se promedian; De igual
forma, la concentracin del analito se determina en cada inyeccin
del desconocido y luego se promedian.