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MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

MANUAL DE LA ASIGNATURA
SECRETARA DE EDUCACIN PBLICA SUBSECRETARA DE EDUCACIN SUPERIOR E INVESTIGACIN CIENTFICA SUBSISTEMA DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS COORDINACIN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS
ELABOR: GRUPO DE DIRECTORES DE LA CARRERA DE INFORMATICA REVIS: FECHA DE ENTRADA EN VIGOR: COMISIN ACADMICA NACIONAL

APROB:

COORDINACIN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS

Revisin no. 0.

Fecha de revisin: MARZO, 2004.

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F-CADI-SA-MA-38-GP-A

PRESENTACIN DEL CURSO

Una de las principales funciones de los tecnlogos de alimentos es asegurar la calidad microbiolgica de los alimentos. Las infecciones y toxiinfecciones debidas a la ingesta de alimentos contaminados por alimentos, son una de las principales causas de muertes prevenibles en el mundo. Para los Tcnicos Superiores Universitarios en Tecnologa de Alimentos, resulta indispensable conocer las tcnicas de trabajo asptico en un laboratorio de Anlisis Microbiolgico, los mtodos de deteccin, identificacin y cuantificacin de microorganismos en diferentes muestras de alimentos, para poder asegurar procesos limpios en la industria y talleres, as como la calidad de los alimentos que se consumen.

SUBSISTEMA DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS

MATRIZ DE ASIGNATURA

F-CADI-SA-MA-31-M-A REVISIN NO. 0 FECHA DE REVISIN: MARZO DE 2004 PGINA 1 DE 3


FECHA DE REALIZACIN DE LA MATRIZ: MARZO DE 2004 VERSIN DE LA MATRIZ: PRIMERA CDIGO:

CARRERA: TECNOLOGA DE ALIMENTOS

ASIGNATURA: MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

UNIDAD TEMTICA: I IMPORTANCIA DE LA MICROBIOLOGA EN LOS ALIMENTOS


CONTENIDOS TEMTICOS DE APRENDIZAJE DIDCTICA DE ENSEANZA PRCTICA PARCIAL
EVALUACIN PARCIAL

DESGLOSE DE UNIDADES TEMTICAS

PRCTICA FINAL

EVALUACIN FINAL

TIEMPO TOTAL

TEMA

TEORA (SABER)

PRCTICA (SABER HACER) TCNICA MATERIAL

OBJETIVO DE APRENDIZAJE

CRITERIOS DE APRENDIZAJE

RESULTADOS DE APRENDIZAJE

EVIDENCIAS PARCIALES ACTIVIDAD

TCNICA E INSTRUMENTO DE EVALUACIN

EVIDENCIA FINAL ACTIVIDAD

TCNICA E INSTRUMENTO DE EVALUACIN

RESULTADO * PRCTICAS

Clasificacin de los microorganismos

1 Clasificacin de los microorganismos

Ex Di

Apuntes, acetatos o diapositivas

1.1 Explicar y definir la clasificacin de microorganismos en base a dainos, patgenos y benficos 2.1 Describir la morfologa colonial y estructural de microorganismos 2.1.1 Preparacin de medios de cultivo, as como condiciones de trabajo en un laboratorio microbiolgico 3.1.1 Preparar frotis de diferentes cultivos microbianos Ex Di Pro

1.1.1 Diferenciar los microorganismos dainos, patgenos y benficos que afectan los diferentes grupos de alimentos

Pa1: Reunir muestras de diferentes tipos de alimentos y proponer diferentes microorganismos que puedan estar presentes

Lista de cotejo 5

Morfologa celular y colonial de bacterias, levaduras y hongos 3.1 Identificar colonias de microorganismos de acuerdo a la morfologa colonial en medios de cultivo

Explicar y definir la clasificacin de los organismos de acuerdo a sus principales caractersticas (Benficos, dainos y patgenos) Describir la morfologa, estructural y colonial de los diferentes microorganismos en estudio Equipo y materiales de laboratorio microbiolgico , diapositivas, apuntes

Interpretar y debatir las caractersticas generales de los diferentes microorganismos (Benficos, dainos y patgenos) Identificar de acuerdo al crecimiento en los medios de cultivo, el microorganismo en estudio de acuerdo a su morfologa

2 Morfologa colonial y estructural de microorganismos

In1: Investigar las caractersticas de las colonias microbianas desarrolladas en Placa de Petri

Lista de cotejo Preguntas de respuesta corta

Pa2: preparar medios de cultivo, inocularlos y observar colonias resultantes Pa3: Preparar frotis de las colonias de la Pa2

3 Identificar colonias de microorganismos de acuerdo a la morfologa colonial en medios de cultivo 4.1 Explicar qu es un medio de cultivo, clasificacin y composicin Pro Di

Preguntas de respuesta amplia

Pa: A partir de un alimento presuntamente contaminado microbiolgicam ente, obtener un cultivo puro en medios de cultivo escogidos de acuerdo al probable microorganismo presente

Lista de cotejo

Medios de cultivo

4 Medios de cultivo

Explicar que es un medio de cultivo, clasificacin, y composicin de estos

Evaluar y aplicar adecuadamente los medios de cultivo para cada microorganismo

4.1.1 Eleccin de medios de cultivo apropiados en base al alimento y microorganismo en estudio

Equipo y materiales de laboratorio microbiolgico , diapositivas, apuntes

Ta1: Investigar medios de cultivo, composicin y aplicacin, en catlogos de empresas proveedoras Pa4: Obtener un cultivo puro eligiendo el medio de cultivo adecuado

Preguntas de opcin mltiple Lista de cotejo 7

HORAS

13

18

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MATRIZ DE ASIGNATURA

F-CADI-SA-MA-31-M-A REVISIN NO. 0 FECHA DE REVISIN: MARZO DE 2004 PGINA 2 DE 3


FECHA DE REALIZACIN DE LA MATRIZ: MARZO DE 2004 VERSIN DE LA MATRIZ: PRIMERA CDIGO:

CARRERA: TECNOLOGA DE ALIMENTOS

ASIGNATURA: MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

UNIDAD TEMTICA: II CONDICIONES QUE INFLUYEN EN CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS Y SU CONTROL (MEC., FSICO Y QUMICO)
CONTENIDOS TEMTICOS DE APRENDIZAJE DIDCTICA DE ENSEANZA PRCTICA PARCIAL
EVALUACIN PARCIAL

DESGLOSE DE UNIDADES TEMTICAS

PRCTICA FINAL

EVALUACIN FINAL

TIEMPO TOTAL

TEMA

TEORA (SABER)

PRCTICA (SABER HACER) TCNICA MATERIAL

OBJETIVO DE APRENDIZAJE

CRITERIOS DE APRENDIZAJE

RESULTADOS DE APRENDIZAJE

EVIDENCIAS PARCIALES ACTIVIDAD

TCNICA E INSTRUMENTO DE EVALUACIN

EVIDENCIA FINAL ACTIVIDAD

TCNICA E INSTRUMENTO DE EVALUACIN

RESULTADO * PRCTICAS

Concentraci n de sustrato, Temperatura, pH, Aw, potencial redox 1.2 Explicar y discutir la importancia de los factores anteriores en el crecimiento de los microorganismos 1.1 Identificar el sistema de barreras funcionales en diferentes tipos de alimentos 3.1.1Proponer la aplicacin y concentracin de un sanitizante en funcin del microorganismo presente Ex Vi Apuntes, acetatos o diapositivas Ex Di Diapositivas, apuntes

Describir y explicar los siguientes conceptos: temperatura de crecimiento, concentracin de sustrato, pH, Aw, de los microorganismos implicados en los alimentos

Aplicar la temperatura, pH, actividad de agua, potencial redox, de crecimiento adecuada en cada microorganismo

1 Concentracin de sustrato, la temperatura, el pH, la Aw y el Eh

1.1 Explicar y definir que es la concentracin de sustrato, la temperatura, el pH, la Aw y el Eh

1.1.1 Manejar los parmetros analizados para el control de los microorganismos

Ex Di

Ps1: Exponer la clasificacin de microorganismos de acuerdo al Eh y temperatura Ta1: Investigar a los microorganismos que pueden desarrollarse en condiciones extremas para el ser humano Pa1: Comparar el desarrollo de un microorganismo en un medio de cultivo con los parmetros anteriores modificados Ta2: Investigar costos de sanitizantes Py: Proponer diferentes sanitizantes para su uso en las instalaciones escolares

Lista de cotejo

Equipo y materiales de laboratorio microbiolgico, diapositivas, apuntes

Simulacin Preguntas de respuesta amplia Lista de cotejo Estudio de casos

8 Preguntas de respuesta corta Preguntas de respuesta amplia


Lista de verificacin Preguntas de respuesta restringida

Efecto de los parmetros anteriores en el crecimiento de los microorganismos

Explicar la forma en que afectan al crecimiento de los microorganismos, los parmetros anteriores

Manejar los parmetros que inhiben el crecimiento de los microorganismos

2 Efecto de los parmetros anteriores en el crecimiento de los microorganismos

2.1 Explicar cmo afectan al crecimiento de los microorganismos los factores anteriores

Describir los sanitizantes ms usados en la industria de alimentos, su forma de actuar y concentraciones adecuadas de uso de de 4.1. Explicar los mtodos de identificacin de microorganismos que causan dao en los alimentos 4.1.1 Evaluar los mtodos adecuados para la identificacin de microorganismos y su efecto en alimentos Ex Pro Apuntes, acetatos o diapositivas

Aplicar de acuerdo al microorganismo presente, los sanitizantes (cl. I y amoniaco), los agentes qumicos

3 Agentes sanitizantes, agentes qumicos que inhiben o retardan el crecimiento de los microorganismos

3.1Describir los sanitizantes utilizados en la industria de los alimentos, forma de uso y concentraciones recomendadas

Lista de verificacin
Pa2: Realizar la tincin de Gram, esporas y flagelos a cultivos puros Pa3: Realizar pruebas bioqumicas para identificar al microorganismo presente Lista de cotejo Ejecucin de tareas

Agentes sanitizantes, agentes qumicos que inhiben o retardan el crecimiento de los microorganismos Mtodos de identificacin de microorganismos

Identificar y reconocer la importancia de los microorganismos y su efecto en los alimentos

Evaluar los mtodos adecuados para la identificacin de microorganismos y su efecto en los alimentos

4 Mtodos identificacin microorganismos

Ps: demostrar cmo el tratamiento y proceso de conservaci n de un alimento previene el desarrollo de microorgan ismos, asimismo, proponer sanitizante s adecuados para cada etapa del proceso

HORAS

24

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FECHA DE REALIZACIN DE LA MATRIZ: MARZO DE 2004 VERSIN DE LA MATRIZ: PRIMERA CDIGO:

CARRERA: TECNOLOGA DE ALIMENTOS

ASIGNATURA: MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

UNIDAD TEMTICA: III ANLISIS MICROBIOLGICO DE LOS ALIMENTOS


CONTENIDOS TEMTICOS DE APRENDIZAJE DIDCTICA DE ENSEANZA PRCTICA PARCIAL
EVALUACIN PARCIAL

DESGLOSE DE UNIDADES TEMTICAS

PRCTICA FINAL

EVALUACIN FINAL

TIEMPO TOTAL

TEMA

TEORA (SABER)

PRCTICA (SABER HACER) TCNICA MATERIAL

OBJETIVO DE APRENDIZAJE

CRITERIOS DE APRENDIZAJE

RESULTADOS DE APRENDIZAJE

EVIDENCIAS PARCIALES ACTIVIDAD

TCNICA E INSTRUMENTO DE EVALUACIN

EVIDENCIA FINAL ACTIVIDAD

TCNICA E INSTRUMENTO DE EVALUACIN

RESULTADO * PRCTICAS

Microorganismos que causan dao y que estn relacionados con los alimentos

Identificar y explicar, cules son los microorganismos que ms frecuentemente se encuentran en los alimentos y causan dao Ex Di Vi

Aislar a los microorganismos que se encuentran en los alimentos sospechosos

1 microorganismos que causan dao y que estn relacionados con los alimentos

1.1 Identificar los microorganismos que causan dao con mayor frecuencia en los alimentos

1.1.1 Aislar microorganismos que se encuentran en alimentos sospechosos

Ex Di

Equipo y materiales de laboratorio microbiolgico , diapositivas, apuntes

Pa1: Analizar un alimento presuntamente contaminado con microorganismos de acuerdo a la NOM- NOM-113-SSA1-1994

Lista de cotejo

Anlisis microbiolgicos mas comnmente aplicados en los alimentos

Simulacin Preguntas de respuesta amplia Lista de cotejo

18

Identificar y explicar los diferentes anlisis microbiolgicos que se aplicarn a los alimentos de acuerdo a la composicin de los mismos

2 Anlisis microbiolgicos aplicados en los alimentos

2.1 Explicar los mtodos de anlisis microbiolgicos que se aplican a los alimentos en base a la composicin de estos ltimos

2.1.1 Realizar anlisis microbiolgicos para diferentes muestras de alimentos. Coliformes totales, coliformes fecales, E. coli, Salmonella, Shigella, hongos, levaduras.

Equipo y materiales de laboratorio microbiolgico , diapositivas, apuntes

Realizar anlisis microbiolgicos de diferentes muestras de alimentos. Coliformes totales, coliformes fecales, E. coli, Salmonella, Shigella, Hongos, Levaduras, etc.

Pa2: Aplicar las Normas Oficiales Mexicanas o Normas Mexicanas para determinar la presencia de Coliformes totales, coliformes fecales, Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., hongos y levaduras, a partir de muestras de alimentos presuntamente contaminados. In1: Investigar casos recientes (locales, nacionales o internacionales) de infecciones o toxiinfecciones imputables a alimentos

Pa: Realizar todos los anlisis microbiolg icos disponibles en el laboratorio Preguntas de respuesta amplia Preguntas orales

Lista de cotejo

37

HORAS

13

42

55

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

GUA DEL PROFESOR


SECRETARA DE EDUCACIN PBLICA SUBSECRETARA DE EDUCACIN SUPERIOR E INVESTIGACIN CIENTFICA SUBSISTEMA DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS COORDINACIN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS
ELABOR: GRUPO DE DIRECTORES DE LA CARRERA DE INFORMATICA REVIS: FECHA DE ENTRADA EN VIGOR: COMISIN ACADMICA NACIONAL

APROB:

COORDINACIN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS

Revisin no. 0.

Fecha de revisin: MARZO, 2004.

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I. DIRECTORIO Y RECONOCIMIENTOS
DR. REYES TAMES GUERRA SECRETARO DE EDUCACIN PBLICA DR. JULIO RUBIO OCA SUBSECRETARIO DE EDUCACIN SUPERIOR E INVESTIGACIN CIENTFICA DR. ARTURO NAVA JAIMES COORDINADOR GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS RECONOCIMIENTOS M. en C. ROMN LUNA ANAYA UNIVERSIDAD TECNOLGICA DEL SUR DEL ESTADO DE MXICO

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

D. R. 2004

ESTA OBRA, SUS CARACTERSTICAS Y DERECHOS SON PROPIEDAD DE LA: COORDINACIN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS (CGUT) FRANCISCO PETRARCA No. 321, COL. CHAPULTEPEC MORALES, MXICO D. F. LOS DERECHOS DE PUBLICACIN PERTENECEN A LA CGUT. QUEDA PROHIBIDA SU REPRODUCCIN PARCIAL O TOTAL POR CUALQUIER MEDIO, SIN AUTORIZACIN PREVIA Y POR ESCRITO DEL TITULAR DE LOS DERECHOS. ISBN (EN TRMITE) IMPRESO EN MXICO.

II NDICE
I. DIRECTORIO Y RECONOCIMIENTOS ....................................................................................... 2 II NDICE........................................................................................................................................... 3 III. INTRODUCCIN DE LA ASIGNATURA .................................................................................... 4 IV CONTENIDOS TEMTICOS ....................................................................................................... 5 Unidad 1: Importancia de la microbiologa en los alimentos....................................................... 5 Introduccin ............................................................................................................................. 5 Objetivos.................................................................................................................................. 5 1 Clasificacin de los microorganismos ............................................................................ 5 2 Morfologa celular y colonial de microorganismos ......................................................... 7 3 Medios de cultivo .......................................................................................................... 10 Unidad 2: Condiciones que influyen en el crecimiento de los microorganismos y su control (mecnico, fsico y qumico) ...................................................................................................... 13 Introduccin ........................................................................................................................... 13 Objetivos................................................................................................................................ 14 1 Concentracin de sustrato, temperatura, pH, Aw, Eh ................................................... 14 2 Efecto de los parmetros anteriores en el crecimiento de los microorganismos ........ 20 3 Agentes sanitizantes, agentes qumicos que inhiben o retardan el crecimiento de los microorganismos ..................................................................................................................... 2 4 Mtodos de identificacin de microorganismos ........................................................... 29 Unidad III: Anlisis microbiolgicos de los alimentos................................................................ 45 Introduccin ........................................................................................................................... 45 Objetivos................................................................................................................................ 45 1 Microorganismos que causan dao y que estn relacionados con los alimentos....... 45 2 Anlisis microbiolgicos aplicados en los alimentos.................................................... 55 REFERENCIAS .............................................................................................................................. 58

III. INTRODUCCIN DE LA ASIGNATURA


Desde los inicios de la humanidad, ha sido una constante preocupacin del hombre satisfacer sus necesidades de alimentacin. Cuando era cazador y recolector, tomaba de la naturaleza los alimentos que necesitaba cada da. Posteriormente, con el advenimiento de la gran revolucin en los hbitos culturales que ocasion la agricultura, hubo la necesidad de preservar en el tiempo los alimentos cosechados con tanto esfuerzo. Pero los alimentos pierden sus caractersticas deseables por efecto del tiempo, por efecto de sus enzimas, y, sobre todo, por efecto de los microorganismos que existen de manera normal o por contaminaciones. Para un profesional de la industria alimentaria, es indispensable el conocimiento sobre los microorganismos que pueden provocar infecciones o toxiinfecciones en los alimentos, ya sean frescos, durante su procesamiento, o procesados; con el objetivo de prevenir, controlar y combatir el deterioro que causan en los alimentos. Este Manual comprende desde la identificacin de los microorganismos que estn presentes en los alimentos, hasta los anlisis microbiolgicos que se aplican a los alimentos, los factores que afectan y determinan el crecimiento de los microorganismos, y su control.

IV CONTENIDOS TEMTICOS

Unidad 1: Importancia de la microbiologa en los alimentos


Introduccin
Todos los alimentos, de manera natural, poseen una microflora compuesta de bacterias, mohos, virus, protozoarios o levaduras. Estos microorganismos pueden proliferar en el alimento y causar su deterioro, o pueden afectar al organismo productor del alimento, reduciendo o impidiendo la produccin. Otros microorganismos han sido utilizados para mejorar las caractersticas de los alimentos y preservarlos, caso de los quesos, yogurt y otras leches fermentadas, vinos, cervezas, sidras. Por otra parte, los alimentos pueden ser vehculo de transmisin de microorganismos y sus metabolitos, los cuales pueden ser patgenos para el hombre.

Para distinguir unos de otros, se utilizan diferentes tcnicas entre las cuales se desarrollarn en el manual la morfologa colonial y al microscopio.

Para poder estudiar a los microorganismos es necesario cultivarlos en medios apropiados, y por eso el ltimo tema de la unidad comprende el conocimiento de diferentes medios de cultivo.

Objetivos

1
1.1

Clasificacin de los microorganismos


Criterios de aprendizaje

1.1.1 Explicar y definir la clasificacin de microorganismos en base a: dainos, patgenos y benficos En el interior y exterior de todos los seres vivos, en el agua, tierra y aire se encuentran los microorganismos. Los alimentos poseen de manera natural una microflora al momento de su cosecha o recoleccin, o ser contaminados por personal y equipo en las operaciones de matanza, procesamiento o almacenamiento. Los microorganismos que afectan alimentos, los podemos clasificar de varias formas, la ms utilizada es aquella que los ubica en tres categoras: Dainos: ocasionan problemas y mermas en la produccin de alimentos, debido a que infectan plantas y reducen su produccin, o infectan animales e impiden su utilizacin para la alimentacin, como los agentes causantes de la mastitis en vacunos. Benficos: Utilizados en fermentaciones, permiten conservar los alimentos o modificarlos para hacerlos ms nutritivos o mejorar sus caractersticas organolpticas: vinos, cervezas, quesos, yogurth (Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus en ste ltimo). Patgenos: Son los que pueden causar infecciones o toxiinfecciones cuando estn presentes (o sus toxinas) en los alimentos: Aeromonas, Brucella, Bacillus cereus, Escherichia coli. 1.2 Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 1.2.1 Diferenciar los microorganismos dainos, patgenos y benficos que afectan los diferentes grupos de alimentos PRCTICA 1: Reunir muestras de diferentes tipos de alimentos (cereales, frutas, carne, lcteos, pescados y mariscos, hortalizas) y que los alumnos propongan

diferentes microorganismos que puedan estar presentes y ser dainos, benficos o patgenos.

2
2.1

Morfologa celular y colonial de microorganismos


Criterios de aprendizaje 2.1.1 Describir la morfologa colonial y estructural de microorganismos

Estructura al microscopio La base para que la clula pueda realzar sus funciones es que mantenga su estructura. Al microscopio ptico (mximo 1500 aumentos) se han identificado varias estructuras en las clulas de los microorganismos. Existen muchos otros tipos de microscopio que han permitido identificar estructuras cada vez ms pequeas: microscopio de contraste de fases, campo oscuro y fluorescencia; microscopio electrnico de transmisin, de barrido. Bacterias Son organismos procariotas. Presentan una pared celular y una membrana citoplasmtica. Estas estructuras comunican a las clulas con su medio ambiente, permiten introducir nutrientes y agua. Adems, la aslan de un medio ambiente que puede ser hostil. Las bacterias pueden presentar de uno a muchos flagelos, involucrados con su movimiento, pili, que estn relacionados con el intercambio gentico. Tambin existen ribosomas (hasta 10000 en una sola bacteria), encargados de la sntesis de protenas, distribuidos en todo el lquido intracelular, llamado citoplasma. El material gentico de las bacterias se presenta en un solo cromosoma, asociado a la membrana, y en plsmidos, unidades de cido desoxirribonucleico. En ocasiones hay inclusiones de materiales de

reserva: carbono, azufre, nitrgeno o fsforo. Se reproducen por fisin binaria o esporas. Las bacterias presentan diferentes formas y maneras de agrupacin, sta ltima depende de la manera de divisin de las clulas. La siguiente figura ilustra estos ltimos conceptos.

Mohos Los mohos son organismos eucariotas que presentan ncleo, vacuolas y mitocondrias. Poseen paredes celulares rgidas. Tambin son llamados hongos filamentosos. Cada filamento es llamado hifa, crecen en cmulos visibles llamados micelios, que surge cuando las hifas crecen y se entrecruzan. Las clulas pueden

ser polinucleadas, incluso con centenares de ncleos. Adems de crecer mediante el micelio, los mohos generan estructuras de esporas asexuales llamados conidias. Algunos mohos producen esporas sexuales en formaciones diferentes: ascosporas, basidiosporas, zigosporas, oosporas. Levaduras: Son hongos unicelulares y la mayora produce ascosporas. Son clulas ovales o cilndricas y se dividen por gemacin. Este proceso involucra la formacin de una yema que aumenta de tamaa hasta que se separa de la clula madre. Normalmente no producen micelio (con excepciones como Candida albicans). Las levaduras son mucho ms grandes que las bacterias y presentan todas las caractersticas de una clula eucaritica. 2.1.2 Identificar colonias de microorganismos de acuerdo a la morfologa colonial en medios de cultivo Los microorganismos se identifican de diferentes maneras. Una de ellas es el cultivo en medios en los cuales desarrollarn caractersticas esenciales para su caracterizacin. Las colonias microbianas que crecen de manera aislada permiten la identificacin del microorganismo presente. Pero es necesario revisar las tcnicas de cultivo asptico y obtencin de un cultivo puro antes de revisar la morfologa de colonias microbianas. En un anlisis rutinario, se inoculan diluciones seriadas del alimento en agua, procediendo a su siembra en un medio general, como el agar nutritivo. De las colonias resultantes, se obtendrn cultivos puros, los cuales se sometern a crecimiento en medios de identificacin (selectivos o prueban bioqumicas). Las caractersticas de una colonia microbiana se enlistan a continuacin. Color

Tamao Apariencia Consistencia Borde Elevacin Halos alrededor

2.2

Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 2.2.1 Preparacin de medios de cultivo, as como condiciones de trabajo en un laboratorio microbiolgico

PRCTICA 2: Explicar las tcnicas de preparacin asptica de medios de cultivo lquido, slido y en medio inclinado, as como el uso de la campana de flujo laminar. Explicar las diferentes tcnicas de cultivo: por estra y asa de vidrio en medio slido, por puncin y estra en medio lquido. Inocular con muestras de alimentos de diferentes orgenes, a dos medios de cultivo slidos, uno para bacterias y otro para mohos y levaduras. Observar las caractersticas y diferencias de las colonias que se desarrollen. 2.2.2 Preparar frotis de diferentes cultivos microbianos PRCTICA 3: De las colonias resultantes en la prctica 2, preparar frotis y teirlos mediante cualquier tcnica para observarlos al microscopio con objetivo de inmersin. Anotar caractersticas de los microorganismos observados.

3
3.1

Medios de cultivo
Criterios de aprendizaje 3.1.1 Explicar qu es un medio de cultivo, clasificacin y composicin

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Para su estudio y deteccin, los microorganismos se cultivan en medios de cultivo artificiales o naturales, que se formulan en base a los factores de crecimiento apropiados para cada tipo de microorganismo: pH, nutrientes, factores esenciales para el crecimiento. Tambin poseen caractersticas que permiten la identificacin y aislamiento de microorganismos. Los medios de cultivo se clasifican en: 1.- Por su estado fsico: lquido, semislido y slido. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es consumido por aquellas que crecen en l. Su concentracin en un medio de cultivo determina si es slido o semislido. Los medios lquidos carecen de agar en su formulacin. 2.- Por su origen: naturales y artificiales: naturales como la papa, zanahoria, suero de sangre o de leche, la leche misma. Hay mas de 10000 medios artificiales formulados para cultivar microorganismos. 3.- Por su uso: Generales: permiten el crecimiento de la mayora de los microorganismos presentes en una muestra. De aislamiento o selectivos: contienen nutrientes solo utilizados por un gnero de microorganismo, lo cual impide el crecimiento de otros microorganismos presentes en la muestra. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como

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inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Grampositivas). De identificacin: tambin llamados para pruebas bioqumicas, cuando sus

nutrientes son utilizados por los microorganismos, de acuerdo a su metabolismo, se pueden identificar en base al conjunto de observaciones: ureasa, movilidad, indol, nitratos, citrato, manitol. De enriquecimiento: En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. De transporte: contienen pocos nutrientes, apenas permiten conservar la viabilidad (pero no permiten el crecimiento de la poblacin) de los microorganismos que han sido colectados en una zona lejana a un laboratorio de anlisis. De mantenimiento: utilizados en los ceparios, sirven para mantener viables los cultivos axnicos durante un periodo de tiempo, siendo necesaria su resiembra rutinaria. 3.2 Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 3.2.1 Eleccin de medios de cultivo apropiados en base al alimento y microorganismo en estudio PRCTICA 4: Obtener un cultivo puro a partir de las colonias desarrolladas en la PRCTICA 3. Para ello, explicar las tcnicas de estriado para obtener colonias aisladas en medios slidos.

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Unidad 2: Condiciones que influyen en el crecimiento de los microorganismos y su control (mecnico, fsico y qumico)
Introduccin
Los microorganismos son afectados por condiciones medioambientales y fisicoqumicas en su entorno. Si graficamos el crecimiento de los microorganismos en el tiempo, la grfica que se obtiene en condiciones ptimas para su desarrollo es la siguiente:

Log N 0

5 Horas

10

15

Es importante conocer cmo se puede evitar el desarrollo de esta curva en instalaciones, materia prima, producto en proceso o en almacn, mediante la manipulacin de las condiciones fisicoqumicas del ambiente, mtodos de conservacin de alimentos, utilizacin de agentes sanitizantes y capacitacin del personal.

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Objetivos

1
1.1

Concentracin de sustrato, temperatura, pH, Aw, Eh


Criterios de aprendizaje 1.1.1 Explicar y definir que es la concentracin de sustrato, la temperatura, el pH, la Aw y el Eh

El medio ambiente en el que se desarrolla un organismo esta formado por factores fsicos, qumicos, y biolgicos. Las relaciones entre organismos (parasitismo, depredacin) tienen tambin efecto entre los microorganismos, pero los siguientes factores revierten especial importancia para el crecimiento de bacterias, mohos y levaduras: 1.- Concentracin de sustrato: las necesidades nutricionales varan de un microorganismo a otro. Mas an: pueden variar en un mismo microorganismo en diferentes etapas de sus desarrollo, o si crece en diferente temperatura. La incapacidad de un microorganismo para utilizar el componente mayoritario de un material alimenticio limitar su desarrollo. 2.- Temperatura: puede existir desarrollo microbiano desde los -8 C hasta las 100C. Slo se requiere que el agua se encuentre en fase lquida, disponible para las reacciones bioqumicas. Pero ningn microorganismo puede sobrevivir a todo el intervalo de temperaturas. La siguiente tabla ilustra los intervalos de temperatura y la clasificacin de los microorganismos basada en su temperatura de crecimiento:

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Grupo Termfilos Mesfilos Psicrfilos Psicrtrofos

Temperatura C Mnima 40 a 45 5 a 15 -5 a 5 -5 a 5 ptima 55 a 75 30 a 40 12 a 15 25 a 30 Mxima 60 a 90 40 a 47 15 a 20 30 a 35

Para alimentos, los microorganismos mesfilos y psicrtrofos son de la mayor importancia. Los mesfilos generalmente son de origen humano o animal y entre ellos se encuentran algunos de los patgenos mas frecuentes: Salmonella, Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens. La curva de la velocidad de crecimiento en el intervalo de desarrollo de un microorganismo es asimtrica:

Comportamiento del crecimiento microbiano ante la temperatura


Velocidad de crecimiento

Tmnima

T ptima Temperatura

Tmxima

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Esto significa que por encima de la temperatura ptima el crecimiento disminuye mas lentamente, que por debajo de ella, porque las protenas se desnaturalizan, en cambio, a bajas temperaturas las reacciones qumicas se ralentizan. 3.- pH: definido como el logaritmo negativo de la concentracin de iones hidrgeno de una solucin, brinda una escala para medir la acidez, neutralidad o alcalinidad de una solucin, que tienen gran impacto en la estabilidad de macromolculas como las enzimas, que poseen un pH de actividad ptimo, de acuerdo a la siguiente grfica:

La velocidad de crecimiento de los microorganismos sufre un gran deterioro cuando estn en un pH diferente al ptimo, tambin se afecta la produccin de toxinas y esporas.

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Evidentemente, cambios en el pH afectan la actividad de las enzimas, y con ello, de toda la actividad de los microorganismos, los cuales se desarrollan de manera ptima en un intervalo de la escala de pH: Microorganismo Mohos Levaduras Bacterias pH mnimo 1.5 a 3.5 1.5 a 3.5 4.5 pH ptimo 4.5 a 6.8 5 a 6.5 6.5 a 7.5 pH mximo 8 a 11 8 a 8.5 11

4.- Actividad de agua (aw): las clulas utilizan el agua de dos maneras: como solvente de compuestos qumicos (nutrientes, metabolitos) lo que facilita su transporte; y como reactivo en las reacciones hidrolticas que originan monmeros que despus se utilizan para sntesis de macromolculas y generacin de energa. La aw representa la disponibilidad del agua en un medio para reacciones qumicas y bioqumicas a travs de membranas semipermeables. Su valor oscila entre 0 y 1. No se debe confundir el concepto de aw con humedad, porque una harina con 21% de humedad tiene la misma aw que una fruta con 80% de humedad. Los microorganismos tambin estn adaptados a un intervalo de aw para su desarrollo; las bacterias requieren aw>0.910, las levaduras se desarrollan a aw>0.87, mientras los mohos lo hacen a aw>0.70. Toda disminucin de la aw disminuye el desarrollo microbiano y la mayor parte de los mtodos de conservacin de alimentos tienen su efecto ms importante en la disminucin de la aw. 5.- Potencial de xido reduccin (Eh) y oxgeno: Segn las necesidades de oxgeno para su metabolismo y reproduccin, los microorganismos pueden ser: aerobios (requieren la presencia de oxgeno: Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus), anaerobios (slo se desarrollan en ausencia de oxgeno o con baja tensin de oxgeno: Clostridium, Bacteroides, Peptococcus, Propionibacterium) y

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anaerobios facultativos (enterobacterias, Staphylococcus). El potencial redox (Eh) de un sistema biolgico es un indicador de su grado de oxidacin. El Eh de un alimento guarda relacin con la composicin qumica del mismo (presencia de sustancias reductoras, cidos) y con la presin parcial del oxgeno durante el almacenamiento. El Eh de un alimento determina en gran medida el tipo de flora microbiana que se puede desarrollar (aerobia, anaerobia). 1.1.2 Explicar y discutir la importancia de los factores anteriores en el crecimiento de los microorganismos Los alimentos constituyen un buen medio nutritivo para los microorganismos, que se desarrollan de acuerdo a las condiciones de los factores anteriores, y de su potencial gentico. La importancia de conocer los factores anteriores en cada tipo de alimento radica en que, mediante su modificacin con los mtodos de conservacin de alimentos, se puede inhibir el crecimiento de los grmenes, prever las consecuencias del desarrollo de los microorganismos, e interpretar las observaciones realizadas sobre un alimento presuntamente contaminado. La curva de la velocidad de crecimiento de un microorganismo contra el tiempo, en condiciones ptimas se ilustra en la siguiente figura:

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Log N 0

5 Horas

10

15

La curva no inicia de cero, sino de una cantidad inicial de microorganismos. Durante la fase de latencia los microorganismos se adaptan a las caractersticas del alimento, despus se empieza a acelerar la velocidad de crecimiento, en la fase de crecimiento exponencial, hasta llegar a una fase estacionaria que precede a la lisis celular cuando se han agotado los nutrientes o se han acumulado metabolitos txicos (o ambas situaciones). El conocimiento de como afectan los parmetros del tema anterior al crecimiento de los microorganismos permite la modificacin de la duracin de la fase de adaptacin, la pendiente de la fase de crecimiento exponencial y la duracin y nivel de la fase estacionaria. 1.2 Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 1.2.1 Manejar los parmetros analizados para el control de los microorganismos

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PRCTICA 5: Del cultivo puro obtenido en la PRCTICA 4, tomar un inculo para suspenderlo en 10 ml de agua destilada estril. Inocular con 0.5 ml de la suspensin a placas de agar nutritivo con pH ajustado a 3.0, a 10.0, a pH normal (testigo); otras 3 placas de agar nutritivo inoculadas se incubarn a 20, 60 y 35C (testigo); cultivar otras placas de agar nutritivo con aw modificadas (adicin de solutos), Eh modificado (aerobio-anaerobio), siempre inoculando una placa testigo para comparar el desarrollo a las 24 h.

Efecto de los parmetros anteriores en el crecimiento de los microorganismos


2.1 Criterios de aprendizaje 2.1.1 Explicar cmo afectan al crecimiento de los microorganismos los factores anteriores

Para la conservacin de los alimentos se utilizan varias tcnicas o mtodos basados en la modificacin de los parmetros que afectan el crecimiento de los microorganismos. Se llama sistema de barreras a la combinacin de dos o ms tcnicas que modifican la aw, pH, temperatura, etc., as, mtodos como el secado, afectan la aw y la temperatura; la adicin de un almbar, afecta el pH, la aw, Eh; pero tambin deben controlarse estos mtodos y su ejecucin porque de no aplicarse correctamente solo se provocan selecciones de microorganismos resistentes.

2.2

Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 2.2.1 Identificar el sistema de barreras funcionales en diferentes tipos de alimentos

Los mtodos de conservacin de alimentos modifican uno o mas de los fatores discutidos para impedir la eliminacin y/o proliferacin de los microorganismos

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presentes en un alimento. Algunos procedimientos de conservacin de alimentos son: conservacin por fro conservacin por calor desecacin, deshidratacin y liofilizacin salazonado ahumado encurtido escabechado radiaciones ionizantes elaboracin de productos de humedad intermedia otros procedimientos

Conservacin en fro (refrigeracin o congelacin) Someter alimentos a bajas temperaturas con el fin de eliminar o inhibir la actividad microbiana o enzimtica, teniendo en cuenta temperatura, humedad relativa y circulacin de aire requeridos para cada alimento. Refrigeracin Someter a los alimentos a bajas temperaturas sin llegar a las de congelacin, manteniendo la uniformidad (no cambios bruscos) durante el periodo de conservacin y sern temperaturas apropiadas de refrigeracin de acuerdo al tipo de alimento. Congelacin Someter a los alimentos a temperaturas menores a las de su punto de congelacin, manteniendo temperatura uniforme durante el periodo de conservacin y sern temperaturas apropiadas a cada tipo de alimento. Los alimentos sometidos a congelacin debern estar en perfectas condiciones higinico-sanitarias de manera que su contenido microbiano inicial antes del

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congelamiento (conservacin) asegure estabilidad del producto hasta el momento de su consumo. Descongelacin Atemperar en forma conveniente el producto congelado hasta que la temperatura de este sea en todos sus puntos superior a la de congelacin del mismo. Los alimentos no podrn ser sometidos a procesos sucesivos de descongelacin y congelacin. Congelacin rpida: Someter a alimentos (materias primas y/o productos elaborados) a un proceso de enfriado brusco que permita exceder rpidamente a la temperatura de mxima cristalizacin, en un tiempo no mayor a 4 h. Proceso de congelacin rpida Se considera completo cuando una vez lograda la estabilizacin trmica, la totalidad del producto en todos sus puntos presente una temperatura de -18c o menor. Almacenado de productos de congelacin rpida En cmaras frigorficas aptas para mantener la temperatura de los productos en valores constantes y siempre de -18C o menos. Conservacin por el calor (esterilizacin, esterilizacin industrial o tcnica, pasterizacin) Someter a los alimentos a la accin de temperaturas y tiempos adecuados para eliminar o reducir las actividades microbianas y enzimticas. Esterilizacin Es el proceso que destruye en los alimentos a temperatura adecuada, todas las formas de vida de microorganismos patgenos y no patgenos.

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Esterilizacin industrial o tcnica Es el proceso trmico que, aplicado a un alimento asegura: 1 2 3 Conservacin sin alteracin y buena calidad comercial durante un periodo Ausencia de microorganismos perniciosos para la salud del consumidor Ausencia de todo microorganismo capaz de proliferar en el alimento, lo que suficientemente largo, compatible con las necesidades comerciales. (grmenes patgenos, grmenes toxico gnicos) y ausencia de toxinas. supone la ausencia de toda alteracin de origen microbiano. Pasterizacin: Someter a alimentos a temperaturas inferiores a 100C y por tiempos suficientes para destruir las formas vegetativas de los tipos comunes de microorganismos patgenos y una cierta proporcin de las no patgenos que los contaminan, para que el producto se pueda transportar, mantener, distribuir, consumir o utilizar en otros procesos en condiciones de aceptabilidad a temperaturas apropiadas y por tiempos razonables segn la naturaleza del producto. Desecacin Someter a los alimentos a las condiciones ambientales naturales para privarlos de la mayor parte de agua que contienen. Deshidratacin Someter a los alimentos a la accin principal del calor artificial para privarlos de la mayor parte de agua que contienen Liofilizacin Someter a los alimentos a procesos de congelacin seguidos de sublimacin del hielo formado para privarlos de la mayor parte de agua que contienen.

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Salazn (en seco o salmuera) Someter los alimentos a la accin de la sal comestible con o sin otros condimentos. Salazn en seco Someter a superficies externas de los alimentos a la accin de la sal en condiciones ambientales apropiadas. Conservacin en sal muera Someter a los alimentos a la accin de soluciones de sal en concentracin y tiempos variables, segn la naturaleza del producto. Ahumado Someter a los alimentos a la accin de humos recin formados, procedentes de la combustin incompleta y controlada de maderas duras de primer uso, mezcladas o no con plantas aromticas de uso permitido. Prohibido en maderas resinosas (menos abeto) o maderas con procesos que pueden originar toxicidad por desprendimiento. Los productos ahumados no deben contener: mas de 1 microorganismo por kg (1ppb) de 1,2benzopireno, 3,4 benzopireno, fluoreno, fenantreno u otros hidrocarburos policclicos aisladamente o en mezcla de accin toxica o nociva para la salud. Encurtido Someter los alimentos previamente tratados con salmuera o que hubieren experimentado una fermentacin lctica a la accin del vinagre con o sin la adicin de cloruro de sodio, edulcorantes nutritivos, condimentos, productos aromatizantes, aceites esenciales, colorantes naturales admitidos, etc. La fase liquida de los encurtidos deber tener un pH (a 20C) no mayor a 4,3.

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Escabechado Someter a los alimentos crudos o cocidos, enteros o fraccionados a la accin del vinagre con la adicin o no de cloruro de sodio. La fase liquida de los productos en escabeche deber presentar un pH (a 20C) no mayor a 4,3. Otros procedimientos Podr realizarse siempre que garanticen las condiciones higienizo sanitarias y de aceptabilidad requeridas para los alimentos a que se someten. El empleo de aditivos alimentarios se har solamente en los casos especficamente autorizados. Conservacin por radiacin ionizante o energa ionizante Someter los alimentos a la accin de alguna de las siguientes fuentes de energa Rayos gamma Rayos equis

Agentes sanitizantes, agentes qumicos que inhiben o retardan el crecimiento de los microorganismos
3.1 Criterios de aprendizaje alimentos, forma de uso y concentraciones recomendadas 3.1.1 Describir los sanitizantes utilizados en la industria de los

Existen dos conceptos importantes en la limpieza de industrias de alimentos: la limpieza fsica y la limpieza microbiolgica. La primera se refiere a la eliminacin de la suciedad visible, con cepillo, agua y detergente, se barre, rasca, se despega toda la suciedad. La segunda se refiere a la eliminacin de los microorganismos en las superficies que han sido previamente limpiadas, tambin se conoce como desinfeccin o sanitizacin, y para ello se utilizan diferentes sustancias qumicas conocidas como desinfectantes o sanitizantes.

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La eleccin del sanitizante depende de los siguientes factores: Nmero y tipo de microorganismos Toxicidad y efecto sobre el alimento Corrosin Peligro para el personal Lo afecta suciedad residual Condiciones ptimas de uso (pH, temperatura, dureza del agua, tiempo de contacto) Costo Entre los sanitizantes ms utilizados en la industria de alimentos, se encuentran los siguientes: Detergentes de amonio cuaternario: son detergentes catinicos. Como todos los detergentes, afecta la tensin superficial del agua mejorando su penetracin para arrastrar partculas de suciedad, pero adems, debido a su grupo amonio, altera la membrana de los microorganismos conduciendo a su muerte. No es corrosivo, txico, voltil o inflamable, adems tiene un amplio espectro microbiolgico de accin, que incluye hongos, levaduras, bacterias G(+) y G(-) y algas. Le afecta la dureza del agua. Dixido de cloro: Evita el desarrollo de bacterias, es incoloro e inodoro, no transmite sabor alguno a los alimentos, es seguro, disponible todo el ao, econmico, de uso generalizado en la Industria Alimentaria, de fcil aplicacin, solo se diluye en agua de acuerdo a la siguiente tabla:

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Dosificacin del Cl02 potabilizacin de agua 0.01 AL 0.05 %

sanitizacin instalaciones

de 0.10 AL 0.50%

utensilios, recipientes e sanitizacin de granjas 0.10 AL 0.50 %

sanitizacin de locales y 2.50 % hospitales frutas y legumbres 0.50 %

Vapor de agua: Elimina todo tipo de microorganismos, incluyendo esporas, pero mancha el acero, lo afecta la dureza del agua, se requieren calderas y es peligroso por temperatura. Jabn: adicionado de agentes antimicrobianos, se usa para limpieza y desinfeccin del personal, en base a su poder tensoactivo. Soluciones de yodo: es un lquido caf rojizo, con accin germicida de amplio espectro, econmico, eficiente, que elimina bacterias, hongos y levaduras. Usado ampliamente como sanitizante. Es econmico, acta contra hongos, fcil disolucin en agua, fcil de transportar y conservar, germicida de amplio espectro aun a bajas concentraciones y temperaturas bajas, no es irritante, elimina la suciedad, no es afectado por la dureza del agua ni por detergentes, rpida accin germicida, tiene un gran campo de aplicacin. Se diluye en agua de acuerdo a las siguientes aplicaciones:

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Dosificacin del Yodo desinfeccin de equipos y utensilios desinfeccin de ubres, frutas, verduras y legumbres desinfeccin de granjas desinfeccin contaminadas de superficies muy 0.00750 % 0.01000 % 0.00125 % 0.00250 %

Detergentes alcalinos: Los detergentes son tensoactivos: al mismo tiempo poseen grupos hidrfobos e hidrfilos, reducen la tensin superficial del agua mejorando su penetracin y humectacin. Remueven grasa, suciedad, malos olores, sabores desagradables; suspendindolos y eliminndolos mediante el agua de limpieza, lo cual facilita el lavado de equipo, maquinaria, tubera, ya sea por aspersin o circulacin. Para aplicarlos, primero se enjuaga la superficie a limpiar con agua limpia, se aplica el producto diluido y se enjuaga con agua limpia, aplicando despus un detergente cido. Detergentes cidos: desincrustan los residuos minerales y orgnicos, de las tuberas y equipos, aumentando su vida til y la eficiencia del proceso. Limpia y abrillanta el acero inoxidable. No le afecta la dureza del agua en su aplicacin. Su empleo es recomendado despus de lavar con un detergente alcalino. Rotacin de sanitizantes: se recomienda por la aparicin de resistencia en los microorganismos, hay que tomar en cuenta los factores fisicoqumicos, biolgicos, de instalaciones, para escoger los sanitizantes a rotar. Pero si el desinfectante cumple su funcin, no debe haber rotacin.

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3.2

Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 3.2.1 Proponer la aplicacin y concentracin de un sanitizante en funcin del microorganismo presente

PRCTICA 6: En todas las visitas industriales que se realicen, que los alumnos recopilen la informacin referente a como controlan la sanitizacin de sus instalaciones, as como de los laboratorios y talleres escolares, proponiendo mejoras.

4
4.1

Mtodos de identificacin de microorganismos


Criterios de aprendizaje 4.1.1 Explicar los mtodos de identificacin de microorganismos que causan dao en los alimentos

Los microorganismos pueden hacer dao en los alimentos de dos maneras: produciendo su alteracin o enfermndonos: 1.- Alteracin de los alimentos (microorganismos alterantes) Alimento deteriorado: aquel daado por agentes microbianos, qumicos o fsicos de forma que es inaceptable para el consumo humano. - Aproximadamente el 20% de las frutas y verduras recolectadas se pierden por deterioro microbiano producido por alguna de las 250 enfermedades de mercado. - Los agentes causantes de deterioro pueden ser bacterias, mohos y levaduras; siendo bacterias y mohos lo ms importantes. - Las carnes son los alimentos ms fcilmente deteriorables. Durante el proceso de deterioro se va seleccionando una poblacin o tipo de microorganismos

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predominante; la variedad inicial indica poco deterioro y refleja las poblaciones iniciales. - Cada tipo de alimento se deteriora por accin de un tipo de microorganismo concreto; cada asociacin es especfica. - De todos los microorganismos presentes en un alimento solo algunos son capaces de multiplicarse activamente sobre el alimento resultando seleccionados. Existen una serie de factores que dirigen esta seleccin. Factores intrnsecos (aw, pH, Eh, nutrientes, estructuras, agentes antimicrobianos), composicin del alimento. Tratamientos tecnolgicos: modifican flora inicial. Factores extrnsecos: condiciones fsicas del ambiente. Factores implcitos: relaciones establecidas entre los microorganismos. Estos cuatro factores determinan lo que se denomina resistencia a la colonizacin de un alimento. Los microorganismos al crecer y utilizar los alimentos como fuente de nutrientes producen cambios en la apariencia, sabor, olor y otras cualidades del alimento. Estos procesos de degradacin son: a.- Putrefaccin Protenas alimentos + Microorganismos proteolticos ------> Aminocidos + Aminas + NH3 + SH2 b.- Fermentacin Carbohidratos alimentos + Microorganismos sacarolticos ------> cidos + Alcoholes + Gases

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c.- Enranciamiento Grasas alimentos + Microorganismos lipolticos ------> cidos grasos + Glicerol 2.- Enfermedades de origen microbiano (microorganismos patgenos) a.- Infeccin alimentaria: Salmonelosis b.- Toxiinfeccin alimentaria: Botulismo (por accin de las toxinas de un microorganismo aunque ste ya no se encuentre presente en el alimento) Identificacin de microorganismos Los microorganismos son identificados mediante pruebas morfolgicas y bioqumicas, tinciones, y otros anlisis especializados como serotipos o patrones de inhibicin frente a antibiticos. Cuando es necesario, se utilizan tcnicas de Biologa Molecular como la secuenciacin gentica. En ocasiones, cepas diferentes de la misma especie microbiana presentan diferente patogenicidad, por lo cual se requiere diferenciarlas mediante anlisis de serotipos (como los flagelares), actividad enzimtica, identificacin de toxinas. Tinciones Tincin de Bacterias Si se desean observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias, resulta sumamente til el utilizar las preparaciones fijas y teidas, debido a que estas permiten que las clulas se visualicen de mejor manera y se puedan diferenciar las distintas especies por su coloracin, este mtodo en particular se llama tincin diferencial o selectiva.

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Los pasos a seguir para la tincin de las bacterias es hacer el frote, la fijacin y la aplicacin de las soluciones colorantes. La amplia gama de colorantes que se pueden utilizar, ha obligado a separarlos en tres grupos generales, los de trifenilmetano, los de oxacina y los de tiacina. Esta clasificacin es buena para la distincin de las familias de colorantes, pero en general se utiliza la clasificacin de acuerdo a su carcter cido base, es decir, cidos, bases o neutros, debido a que de esto depende mucho su comportamiento. La coloracin se da de acuerdo con a la accin de los iones complejos del colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula. Entre los diversos tipos de coloracin de bacterias, estn la coloracin simple, diferencial y la tincin negativa. Coloracin Simple Este tipo de coloracin consiste en inundar con un colorante cualquiera la lmina donde se tienen las bacterias, luego lavarlas con agua, y algunas clulas retendrn el colorante, por reaccin con el mismo. Coloracin diferencial Este tipo de coloracin es sumamente importante, ya que discrimina entre un tipo de bacterias y otro de acuerdo con su susceptibilidad ante uno u otro colorante. Entre estos mtodos se encuentra la coloracin de Gram, que es sumamente importante en microbiologa. Este mtodo discrimina entre clulas grampositivas y clulas gramnegativas, es generalmente utilizado debido a que muchas de las clulas patgenas son del tipo gramnegativo, aparte de esta diferencia las clulas grampositivas son ms susceptibles a la penicilina y ms resistentes a la accin mecnica y exposicin a algunas enzimas que las gramnegativas.

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Catalasa Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepcin es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes gneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-) Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos tcnicas: Mtodo del portaobjetos (recomendado): Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos. Mtodo del tubo de ensayo: Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en tubo inclinado densamente inoculado. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo).

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Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaucin de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dar un falso resultado positivo. Citrato Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono y compuestos amoniacales como nica fuente de nitrgeno en su metabolismo, provocando una alcalinizacin del medio. Entre las enterobacterias estas caractersticas se dan en los siguientes gneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrgeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Slo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrn multiplicarse en este medio y liberarn iones amonio lo que, junto con la eliminacin del citrato (cido), generar una fuerte basificacin del medio que ser aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul. Fenilalanina desaminasa Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminocido fenilalanina en cido fenilpirvico por su actividad enzimtica de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies del gnero Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos gneros de otras enterobacterias.

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Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del tubo inclinado con abundante inculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se aade 0,2ml de una solucin de cloruro frrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La presencia de cido fenilpirvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparicin de un color caracterstico verde oscuro o verdeazulado. Indol Mediante esta prueba se detecta la liberacin de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberacin se debe a la degradacin del aminocido triptfano mediante el enzima triptofanasa. Para la realizacin de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptfano). Para la posterior deteccin del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes: Alcohol amlico o isoamlico (puede sustituirse por alc.butlico)........150ml p-dimetilamino-benzaldehdo..........................................................10g HCl (concentrado).........................................................................50ml Se disuelve primero el aldehdo en el alcohol y despus se agrega lentamente a esta mezcla el cido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las ms convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de Klebsiella (indol-). Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al aadir al medio 5 gotas del reactivo de Kovacs, se producir un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba ser considerada positiva. Si esto ocurre despus de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deber incubarse otras 24 horas y

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repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porcin de unos 2 ml que se retira de l aspticamente. Lactosa Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminacin fecal en anlisis, sobre todo, de aguas. En bacteriologa se define el grupo de organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formacin de gas a 35C en 48 horas". No se trata de un grupo taxonmico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayora de ellas de origen intestinal. Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentacin de la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este medio, adems de selectivo frente a bacterias no entricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro). En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y slo crecern las enterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarn productos cidos que producirn un cambio de pH que se detectar gracias al rojo neutro. Las colonias lactosa (+) aparecern de color rojo o violeta contrastando con la coloracin amarillenta de las colonias lactosa (-). Manitol, movilidad y nitratos Se incluyen en este apartado 3 pruebas bioqumicas debido a que se pueden realizar cultivando el microorganismo en un nico medio, el Manitol Movilidad, que se prepara en tubo con agar recto y se siembra en picadura, incubndose a 37C durante 24 horas. Tambin existe la posibilidad de hacer las pruebas en otros medios y por separado.

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Prueba del Manitol Sirve para detectar si los grmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos cidos que sern detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiar a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clnica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-). Prueba de la Movilidad Sirve para determinar si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos mviles. El medio manitol movilidad permite la realizacin de esta prueba gracias a ser semislido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las bacterias mviles producirn un enturbiamiento homogneo del medio debido a la distribucin aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmviles permanecern en la misma lnea de la picadura en que se sembraron. Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el gnero Klebsiella (-) de las restantes que suelen ser movilidad (+). Dentro del gnero Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+). Prueba de la reduccin de nitratos Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos despus de su incubacin se aaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio

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de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc pursimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretacin final. Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre s determinadas bacterias de los gneros Haemophylus y Neisseria. Oxidasa Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que produce agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana. El oxgeno acta por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la produccin de catalasa, ya que sta degrada el perxido de hidrgeno (ver prueba de la catalasa) que se produce como consecuencia de la reduccin del oxgeno y cuya acumulacin es txica. La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para identificar todas las especies de Neisseria (+) , diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias. El reactivo de la oxidasa ms recomendado es la solucin acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos txico y mucho ms sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de

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Gordon y McLeod), pero es ms caro. Este reactivo tie las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a prpura-negruzco intenso. Realizacin de la prueba: Mtodo en placa directa Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla. Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reaccin se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos. Mtodo indirecto sobre papel Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. La reaccin de color positiva se produce a los 5-10 segundos. Rojo de metilo y Voges-Proskauer Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetras y permiten la diferenciacin dentro de las enterobacterias del grupo coli y aergenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarn la glucosa en dos fases: primero la metabolizarn aerobiamente (respiracin oxibintica) consumiendo rpidamente el oxgeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizndola por va anaerobia (fermentacin). sta puede ser de dos tipos: Fermentacin cido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son cidos orgnicos (cidos frmico, actico, lctico y succnico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.

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Fermentacin butiln gliclica: La realizan las bacterias del grupo KlebsiellaEnterobacter (antiguo aergenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, producindose acetona como intermediario que podr ser detectada aadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionarn con este compuesto produciendo un color rojo caracterstico. Para la realizacin de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30C durante un periodo de 3 das como mnimo y 5 como mximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que servirn para cada uno de los ensayos. Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le aade unas gotas (4-5) de solucin indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la coloracin. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo. Foto de los resultados de esta prueba Voges-Proskauer: A la otra porcin de cultivo se le aade: 0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etlico absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso. 0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente. Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violceo, ms o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloracin alguna. Ureasa Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculas de amoniaco por accin del enzima ureasa. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para

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diferenciar este gnero de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. Se cultiva el microorganismo en tubo inclinado en agar urea de Christensen. Este medio se complementa despus del autoclavado con 50ml/l de urea. sta ser degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradacin produce amoniaco que har variar el color del indicador de amarillo a rojo, ponindose as de manifiesto la actividad ureasa. Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubacin ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco despus de la inoculacin y sus resultados deben ser ledos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubacin. Resumen de resultados positivos PRUEBA RESULTADO POSITIVO

Catalasa Citrato Fenilalanina desaminasa Indol Lactosa Manitol Movilidad Nitratos Oxidasa

Aparicin de burbujas de O2 Medio de color azul Aparicin de color verde oscuro Aparicin de un anillo rojo Colonias de color violeta Aparicin de color amarillo Difusin a partir de la lnea del inculo Cambio de color (rojo oscuro) Aparicin de color azul

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Rojo de Metilo Ureasa Voges-Proskauer

Aparicin de color rojo Aparicin de color rojo Aparicin de color rojo

Una vez que se tiene el conjunto de resultados de esta, y mas pruebas bioqumicas, se procede a buscar en tablas preparadas en libros de Anlisis Microbiolgico, el microorganismo que presente los resultados iguales a las pruebas ensayadas.

4.2

Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 4.2.1 Evaluar los mtodos adecuados para la identificacin de microorganismos y su efecto en alimentos

PRCTICA 7: TINCIN DE GRAM: Reactivos: Cristal violeta (1 g de cristal violeta en 100 ml de agua destilada). Lugol (1 g de iodo en 2 g de ioduro potsico en 100 ml de agua destilada). Safranina (1 g de safranina en 100 ml de agua destilada). Desarrollo: Extensin: En un portaobjetos limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloca una gota de agua destilada a la cual, con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se lleva una pequea cantidad de suspensin de bacterias o, en su caso, de una colonia. Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el portaobjetos y se fija la extensin por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.

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Coloracin: a) 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial) b) Se lava con agua destilada c) 1 minuto en lugol (mordiente) d) Se decolora con alcohol de 95 (decolorante) e) Se lava con agua destilada f) 1 minuto en safranina (colorante de contraste) g) Se lava con agua corriente h) Se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro

Una vez que la preparacin est totalmente seca, poner una gota muy pequea de aceite se inmersin y observar al microscopio con el objetivo de inmersin.

PRCTICA 8: Pruebas bioqumicas. A partir de un cultivo puro obtenido de la flora presente en un alimento, inocular tantos medios para pruebas bioqumicas de que

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se disponga, obtener resultados a las 24 h (corroborar negativos hasta las 48 h), discutirlos y tratar de identificar el gnero y la especie presente.

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Unidad III: Anlisis microbiolgicos de los alimentos

Introduccin
Los alimentos, de cualquier origen, nunca son estriles. De manera normal poseen una flora microbiana cuya composicin depende de cmo llegan los microorganismos al alimento, como se multiplican, que relaciones se establecen entre ellos y como interaccionan al pasar el tiempo. La flora de los alimentos que consumimos depender de esta flora natural inicial, de los microorganismos introducidos durante las operaciones de cosecha, recoleccin, pesca, matanza; procesamiento, almacenamiento y distribucin. Como ya se mencion, esta flora puede causar infecciones o toxiinfecciones al ser consumidos. Uno de los objetivos ms importantes de la Microbiologa de alimentos es contribuir a garantizar al consumidor un abastecimiento de alimentos sanos e inocuos, aplicando los tratamientos adecuados para preservar y asegurar la calidad de los alimentos.

Objetivos

Microorganismos que causan dao y que estn relacionados con los alimentos
1.1 Criterios de aprendizaje 1.1.1 Identificar los microorganismos que causan dao con mayor frecuencia en los alimentos

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Leche La leche es el lquido segregado por los mamferos para alimentar a sus cras (excluyendo el calostro). Econmicamente, la leche de vaca es la ms importante. Sus componentes principales son lactosa, grasa y protenas, adems de un 78% de agua. Posee un pH cercano a la neutralidad, elevada aw y numerosos nutrientes, por lo tanto, es un excelente medio para el desarrollo de microorganismos. Los microorganismos presentes en la piel y ubre de la vaca pueden invadir el pezn y el interior de la ubre. Micrococos, estreptococos y Corynebacterium bovis son los organismos comnmente hallados. Los culpables de las infecciones de las ubres son Staphylococcus aureus, E. coli, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Pseudomonas aeruginosa y Corynebacterium pyogenes. Algunos patgenos de origen humano tambin pueden intervenir en la mamitis: Salmonella, Listeria monocytogenes, Mycobacterium bovis y Mycobacterium tuberculosis. El material para la manipulacin y almacenamiento de la leche, tambin pueden ser fuente de microorganismos. Carne Se llama carne al msculo y vsceras de los animales, las fuentes ms importantes son las de ganado vacuno, los cerdos, borregos, chivos y aves de corral. La carne es una fuente importante de protenas, lpidos y nitrgeno no proteico. Adems, posee una elevada aw y un pH cercano a la neutralidad. Los primeros organismos en crecer en la carne utilizan los carbohidratos y el nitrgeno no proteico soluble. Los microorganismos proteolticos entran en accin en las ltimas etapas de la descomposicin de la carne.

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Durante el procesamiento de los animales, la evisceracin reviste primordial atencin debido a que el tracto intestinal est repleto de microorganismos, muchos de los cuales son patgenos, como Salmonella y Campylobacter en aves de corral. Despus de formar la canal, el lavado con agua caliente (80 C), lavado con agua clorada o con cido ctrico reducen la flora microbiana de superficie de la canal. Adems, regularmente se expone la carne a choque trmico con temperaturas de refrigeracin. Las carnes rojas refrigeradas poseen un elevado Eh en la superficie lo cual permite el crecimiento de aerobios psicrtrofos como Pseudomonas (P. fragi, P. lundesis y P. flurescens), Acinetobacter y Psichobacter. Las Pseudomonas son el organismo predominante en el deterioro de las carnes rojas. Las carnes envasadas al vaco dan origen a una microflora dominada por microorganismos gram positivos, cido lcticos, como Lactobacillus, Carnobacterium y Leuconostoc. Pescado A diferencia de la carne, el pescado no contiene depsitos de grasa visibles. Tambin es una fuente importante de protenas. El pescado recin capturado suele ser estril pero la piel, agallas e intestinos contienen muchas bacterias, principalmente gram negativas como Pseudomonas, Shewanella, Psychrobacter, Vibrio, Flavobacterium y Cytophaga. La grasa del pescado es poliinsaturada y por lo tanto muy reactiva, esto implica que muchas veces la alteracin del pescado es qumica (rancidez oxidativa). La descomposicin microbiana es la ms frecuente y comienza con la utilizacin de la fraccin nitrogenada no proteica que origina la trimetilamina. El olor desagradable del pescado descompuesto se debe a sulfuro de hidrgeno, metil mercaptano y el dimetil sulfuro as como la trimetilamina.

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La alteracin del pescado refrigerado se debe principalmente a bacilos psicrtrofos gram negativos como Shewanella putrefaciens y Pseudomonas spp.

Crustceos y moluscos Adems de su flora endgena, suelen contaminarse con bacterias del lodo que es arrastrado con ellos en su captura. Como contienen mas carbohidratos que la carne y el pescado, su alteracin es glucoltica en lugar de proteoltica. Cereales Trigo, arroz y maz son la principal fuente de alimentacin en el mundo. Al poseer una reducida aw, los mohos son los responsables del deterioro de los granos almacenados. Los gneros Penicillium, Aspergillus y Fusarium son los ms importantes. Legumbres, nueces y semillas oleaginosas Las legumbres constituyen la principal fuente de protenas vegetales, y las nueces y semillas oleaginosas proporcionan aceites vegetales. Las semillas almacenadas pueden ser atacadas por mohos, especialmente lipolticos: Aspergillus niger, A. tamarii, Penicillium spp. y Paelomyces spp. Frutas y sus derivados Aunque poseen aw elevadas, el bajo pH que los caracteriza permite el desarrollo de levaduras y mohos. Los ctricos son deteriorados por Penicillium italicum y P. digitatum. En manzanas, P. expansum provoca la podredumbre blanda. Peras y manzanas son atacadas por los ascomicetos Venturia inaequalis y Monilia fructigena.

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Hortalizas y derivados Su pH ms elevado permite el crecimiento de bacterias, y tambin hongos. La alteracin de las hortalizas es provocada por bacterias pectinolticas de los gneros gram negativos Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas y Clostridium. Alimentos enlatados En los alimentos enlatados los microorganismos pueden causar alteraciones. En general, los microorganismos se asocian con grupos particulares de alimentos. stos pueden sobrevivir al tratamiento trmico requerido para el enlatado o bien contaminar el alimento despus de dicho tratamiento debido a suturas o fugas del envase. Cuando la contaminacin es anterior al tratamiento, es posible predecir el microorganismo responsable si se conocen bien la naturaleza del alimento y las condiciones a las que se ha sometido dicho alimento. Sin embargo, los microorganismos que se introducen por fugas pueden ser muy variados al igual que la composicin de los medios de enfriamiento. En la siguiente tabla se ilustran algunos microorganismos que deterioran alimentos enlatados.

Grupos segn grado de acidez

Rango de pH

Grupos de alimento

Microorganismos

Grupo 1: poco cidos

>5

Productos crnicos Productos marinos Leche Hortalizas Mezclas de carne y vegetales Sopas Salsas Tomates Peras Higos Pia Otras frutas Encurtidos Pomelo Zumos ctricos

Grupo 2: semici dos

4,5 < pH < 5,0

Aerobios esporulados Anaerobios esporulados Levaduras, mohos y bacterias no esporuladas

Grupo 3: cidos Grupo 4: muy cidos

3,7 < pH < 4,5

Bacterias esporuladas Bacterias no esporuladas Levaduras Mohos

PH < 3,7

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Microorganismos en alimentos de acidez baja y media Aerobios esporulados Los ms difundidos son los del gnero Bacillus, que tiene su origen en el suelo y agua, por lo que casi siempre estn presentes en las materias primas empleadas en conservas. Su temperatura ptima de crecimiento oscila entre los 28 y 40 C para la mayora, aunque existen algunos termfilos, que pueden desarrollarse a 55 C e incluso 70 C. Entre estos podemos encontrar, tanto aerobios obligados, como anaerobios facultativos, estos ltimos capaces de crecer en condiciones de vaco. Los tipos de alteraciones que pueden tener lugar son: la fermentacin simple, la produccin de gas y la de cido y gas. La fermentacin simple es la ms comn y se debe al ataque de los carbohidratos con produccin de cido y sin produccin de gas. B. stearothermophilus y B. coagulans son los principales termfilos causantes de la fermentacin simple. El primero, en productos de baja acidez (guisantes, hortalizas;no crece con un pH menor de 5), sometidos a un tratamiento trmico relativamente intenso, aunque no se produce la alteracin cuando el enfriamiento es rpido y si se realiza el almacenamiento en fro. B. coagulans es acidrico (pH de hasta 4,2) y presenta esporas menos resistentes al calor, por lo que las alteraciones tienen lugar en las carnes enlatadas, ya que el tratamiento trmico para estas es ms bajo que en las hortalizas. Tambin aparece asociado a productos cidos (jugo de tomate), ya que por su bajo pH el tratamiento trmico es ligero. La produccin de gas por aerobios esporulados se debe a la denitrificacin del nitrato en carnes curadas enlatadas, maiz, guisantes, etc. B. cereus y B. mesentericus aparecen en salmn y cangrejos, mientras que B. macerans y B. polymixa forman cido y gas. Anaerobios esporulados Los anaerobios esporulados proceden principalmente del suelo, por lo que se encuentran ampliamente distribuidos en la leche, hortalizas y otros productos

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alimenticios. Tambin es posible encontrarlos en la carne, ya que algunas especies tambin se desarrollan en los intestinos del hombre y animales. El gnero ms importante es el Clostridium, pudiendo encontrar organismos termfilos y mesfilos. Entre los primeros, los sacarolticos son los ms importantes, produciendo gran cantidad de gas a partir de los carbohidratos, principalmente dixido de carbono e hidrgeno, lo que da lugar al abombamiento de las latas. Estas alteraciones van acompaadas de un olor butrico. No producen cido sulfhdrico. La temperatura ptima de desarrollo se sita alrededor de los 55 C, apareciendo sobre todo en pases clidos, donde las temperaturas de almacenaje pueden sobrepasar los 35 C. Tambin los termfilos pueden ser causantes de una alteracin sulfurosa, en este caso con produccin de cido sulfhdrico. Los organismos mesfilos son los segundos en importancia despus de los causantes de la fermentacin simple. Entre estos destaca Clostridium botulinum. Se trata de una bacteria Gram positiva, anaerobia y esporgena, cuyo crecimiento queda inhibido a pH menor de 4,5. Sin embargo, los organismos aerbios de un alimento pueden crecer y usar el oxgeno en un recipiente, creando condiciones anaerobias adecuadas para su desarrollo y en un producto cido puede crecer C. botulinum, si est presente, cuando el cido haya sido utilizado por otros organismos, aumentando el pH. Es el ms resistente de los microorganismos que intoxican los alimentos, por lo que la industria de enlatado admite de forma general que todos los productos no cidos tratados deben cumplir los requerimientos bsicos necesarios para destruir a C. botulinum (esterilizacin durante 2,8 minutos a 121,1C). En los alimentos correctamente procesados no se produce el desarrollo de esta bacteria, aunque existen alimentos con porciones slidas en los que puede haber heterogeneidad de pH durante cierto tiempo, por lo que debe mantenerse un pH inferior a 4,5 como margen de seguridad. Este microorganismo merece especial mencin debido a su significancia para la salud humana. Se presenta tanto en forma vegetativa como de esporas, siendo estas ltimas la

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forma importante desde el punto de vista del enlatado de alimentos. La forma vegetativa se destruye fcilmente a temperaturas menores de 100C, mientras que las esporas, que proceden del polvo y del suelo, pueden sobrevivir 300 minutos de ebullicin a 100C. stas varan su resistencia al calor, siendo difcil obtener una suspensin de esporas de resistencia uniforme al calor para su estudio. Tiene poderes proteolticos y sacarolticos. La toxina botulina es soluble en agua y extremadamente letal para el hombre (tipos A y B). Las esporas deben germinar para producir una clula vegetativa que produce la toxina, por lo que es poco probable encontrar presente el organismo con su toxina, de forma que el alimento puede ser ingerido por ausencia de indicios de contaminacin (sabor u olor extraos). Dicha toxina es destruida por exposicin durante diez minutos a calor hmedo a 100C. La determinacin del tipo de toxina se lleva a cabo mediante reacciones antignicas. La temperatura ptima de crecimiento de los organismos mesfilos oscila entre los 20 y 50 C (algunos menos y otros ms, aunque generalmente es de 37 C). Segn su capacidad para atacar a los hidratos de carbono pueden ser de dos tipos: proteolticos o putrefactivos y sacarolticos. Los primeros son causantes de alteraciones gaseosas con degradacin del alimento y produccin de compuestos de olor desagradable. stos son ms importantes en los alimentos de acidez baja y media, excepto en el jamn york enlatado, en el cual se producen alteraciones de tipo sacaroltico causadas por C. perfringens. Destacan C. hystolyticum, C. sporogenes y C. bifermentans. Entre los de tipo sacaroltico los ms frecuentes son C. butyricum, C. pasteurianum, C. perfringens y otros. Levaduras, mohos y bacterias no esporuladas Los nicos importantes en los alimentos de acidez baja y media son aqullos con resistencia trmica relativamente baja, los que producen alteraciones por fugas en la lata y aqullos que producen alteraciones en la leche condensada y las carnes curadas enlatadas (jamn, tocino, etc.).

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Entre las levaduras destacan las fermentadoras de la sacarosa que se desarrollan en la leche condensada, ya que este alimento no es sometido a ningn tratamiento trmico, sino que la base de su conservacin radica en su elevado contenido en azcar. Torula globosa, de clulas redondeadas, ocasiona la distensin de las tapas de las latas. Torula lactiscondensis, de clulas ovales, produce una fermentacin mucho ms vigorosa, por lo que las latas pueden reventar en pocos das. Aspergillus repens es un moho que da lugar a la formacin de botones en la superficie de la leche condensada. Dentro de las bacterias no esporuladas destacan: - Pseudomonas fluorescens, que poduce rancidez. - Streptococcus liquefaciens, que provoca la licuefacin de la gelatina del jamn enlatado. - S. faecicum y S. faecalis, son estreptococos fecales que producen olores y sabores anormales en jamones enlatados. El primero es de mayor inters debido a su mayor termorresistencia. - Las Enterobacteriaceae (coliformes, Aerobacter, Proteus sp., etc.) son responsables del abombamiento del jamn enlatado. Microorganismos en productos cidos En la mayora de los casos se controlan fcilmente con un tratamiento trmico relativamente corto a una temperatura inferior a los 100 C. Bacterias esporuladas Podemos encontrar bacterias anaerobias sacarolticas y otras responsables de la fermentacin simple. Dentro de las primeras destacan Clostridium pasteurianum, que produce la alteracin gaseosa de frutas y tomates enlatados y que no se

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desarrolla a pH inferior a 3,7, y C. butyricum, que afecta tambin a las frutas enlatadas. Bacillus coagulans es responsable de la fermentacin simple en el jugo de tomate enlatado, ocasionando adems sabores anormales. Es termfilo y se desarrolla aun pH de 4,2. B. macerans, produce alteraciones gaseosas en frutas enlatadas y junto a B. polymixa, en hortalizas y frutas enlatadas. Bacterias no esporuladas Son bacterias Gram positivas productoras de cido lctico (cocos y bacilos) y algunas son productoras de gas. Pueden desarrollarse con escasa tensin de oxgeno y son responsables de fermentaciones de vegetales. Se destruyen con tratamiento trmico a menos de 100C. Lactobacillus brevis causa una vigorosa fermentacin en salsa capsup y productos similares y es formador de gas. Leuconostoc pleofructi produce la alteracin de los jugos de fruta, dando lugar a la formacin de una pelcula de limo en las soluciones de azcar (alteracin de productos de tomate). Leuconostoc mesenteroides da lugar a la alteracin gaseosa de la pia enlatada. Levaduras Presentan escasa resistencia al calor, por lo que no son frecuentes en enlatados sometidos a tratamiento trmico y s cuando el tratamiento es subtrmico o cuando se producen fugas. Son responsables de la fermentacin de salsas cidas, gelatinas y productos similares cuya conservacin depende de los cidos, el azcar y la sal. Mohos Byssochlamys fulva es la especie de mohos de mayor importancia en los alimentos enlatados cidos. Afecta a frutas enlatadas y embotelladas. Es responsable de la desintegracin de la fruta por descomposicin del material

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pectnico. Las latas a veces se abomban debido al desprendimiento de dixido de carbono. Su temperatura ptima de crecimiento es de 30-37 C y resulta altamente resistente al calor. Byssochlamys nivea es semejante al anterior y es mucho ms frecuente en la alteracin de fresas enlatadas. Penicillium afecta a las grosellas enlatadas y es altamente termorresistente. Aspergillus tambin es termorresistente y se presenta en las fresas enlatadas. Rhizopus nigricans es responsable de la degradacin de las frutas enlatadas y especialmente del albaricoque. Rhizopus stolonifer ocasiona el ablandamiento de los albaricoques enlatados.

1.2

Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 1.2.1 Aislar microorganismos que se encuentran en alimentos sospechosos

PRACTICA

9:

Analizar

un

alimento

presuntamente

contaminado

con

microorganismos de acuerdo a la NOM- NOM-113-SSA1-1994 Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.

2
2.1

Anlisis microbiolgicos aplicados en los alimentos


Criterios de aprendizaje 2.1.1 Explicar los mtodos de anlisis microbiolgicos que se aplican a los alimentos en base a la composicin de estos ltimos

Como ya se discuti anteriormente, la composicin qumica y propiedades fisicoqumicas de los alimentos determinan el tipo de flora microbiana que se puede desarrollar.

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Algunos mtodos de anlisis autorizados se encuentran descritos en las siguientes Normas Oficiales Mexicanas y Normas Mexicanas:

Prueba Toma, manejo y transporte de muestras de alimentos Cuenta de bacterias aerobias en placa. Cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. Cuenta de mohos y levaduras en alimentos. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del Nmero Mas Probable. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. Mtodo para la determinacin de Salmonella en alimentos.

Norma y/o Mtodo de Referencia NOM-109-SSA1-1994 Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. NOM-092-SSA1-1994 Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa. NOM-113-SSA1-1994 Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. NOM-111-SSA1-1994 Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. NOM-112-SSA1-1994 Bienes y servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del Nmero Mas Probable. NOM-115-SSA1-1994 Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. NOM-114-SSA1-1994. Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Salmonella en alimentos. NOM-145-SSA1-1995 Productos crnicos troceados y curados. Productos crnicos curados y madurados. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Apndice normativo B. De la estimacin de la densidad microbiana por la tcnica del nmero mas probable. B.2 Determinacin de fecales y Escherichia coli por la tcnica de coliformes diluciones en tubo mltiple. NMX-F-403-S-1981 Alimentos para humanos-microbiolgicos-cuenta de bacillus mesentericus o bacillus subtilis (Esporas formadoras de hebra).

Determinacin de coliformes fecales Escherichia coli por la tcnica de diluciones en tubo mltiple.

Bacillus mesentricos.

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2.2

Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 2.2.1 Realizar anlisis microbiolgicos para diferentes muestras de alimentos. Coliformes totales, coliformes fecales, E. coli, Salmonella, Shigella, hongos, levaduras.

PRCTICA 10: Aplicar las Normas Oficiales Mexicanas o Normas Mexicanas para determinar la presencia de Coliformes totales, coliformes fecales, Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., hongos y levaduras, a partir de muestras de alimentos presuntamente contaminados.

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REFERENCIAS
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http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/medios_100_intro.html http://canales.nortecastilla.es/canalagro/datos/conservas/microorganismos.htm

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MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

GUA DEL ALUMNO


SECRETARA DE EDUCACIN PBLICA SUBSECRETARA DE EDUCACIN SUPERIOR E INVESTIGACIN CIENTFICA SUBSISTEMA DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS COORDINACIN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS
ELABOR: GRUPO DE DIRECTORES DE LA CARRERA DE INFORMATICA REVIS: FECHA DE ENTRADA EN VIGOR: COMISIN ACADMICA NACIONAL

APROB:

COORDINACIN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS

Revisin no. 0.

Fecha de revisin: MARZO, 2004.

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F-CADI-SA-MA-38-GP-A

I. DIRECTORIO Y RECONOCIMIENTOS
DR. REYES TAMES GUERRA SECRETARO DE EDUCACIN PBLICA DR. JULIO RUBIO OCA SUBSECRETARIO DE EDUCACIN SUPERIOR E INVESTIGACIN CIENTFICA DR. ARTURO NAVA JAIMES COORDINADOR GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS RECONOCIMIENTOS M. en C. ROMN LUNA ANAYA UNIVERSIDAD TECNOLGICA DEL SUR DEL ESTADO DE MXICO

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

D. R. 2004

ESTA OBRA, SUS CARACTERSTICAS Y DERECHOS SON PROPIEDAD DE LA: COORDINACIN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS (CGUT) FRANCISCO PETRARCA No. 321, COL. CHAPULTEPEC MORALES, MXICO D. F. LOS DERECHOS DE PUBLICACIN PERTENECEN A LA CGUT. QUEDA PROHIBIDA SU REPRODUCCIN PARCIAL O TOTAL POR CUALQUIER MEDIO, SIN AUTORIZACIN PREVIA Y POR ESCRITO DEL TITULAR DE LOS DERECHOS. ISBN (EN TRMITE) IMPRESO EN MXICO.

II NDICE
I. DIRECTORIO Y RECONOCIMIENTOS ............................................................................................. 2 II NDICE................................................................................................................................................. 3 III. INTRODUCCIN DE LA ASIGNATURA .......................................................................................... 4 IV DIAGNSTICO DE CONOCIMIENTOS............................................................................................ 5 V CONTENIDOS TEMTICOS .............................................................................................................. 6 Unidad 1: Importancia de la microbiologa en los alimentos............................................................. 6 Introduccin ................................................................................................................................... 6 Objetivos........................................................................................................................................ 6 1 Clasificacin de los microorganismos .................................................................................. 6 2 Morfologa celular y colonial de microorganismos ............................................................... 8 3 Medios de cultivo ................................................................................................................ 14 Unidad 2: Condiciones que influyen en el crecimiento de los microorganismos y su control (mecnico, fsico y qumico) ............................................................................................................ 18 Introduccin ................................................................................................................................. 18 Objetivos...................................................................................................................................... 19 1 Concentracin de sustrato, temperatura, pH, Aw, Eh ......................................................... 19 2 Efecto de los parmetros anteriores en el crecimiento de los microorganismos .............. 24 3 Agentes sanitizantes, agentes qumicos que inhiben o retardan el crecimiento de los microorganismos ......................................................................................................................... 30 4 Mtodos de identificacin de microorganismos ................................................................. 34 Unidad III: Anlisis microbiolgicos de los alimentos...................................................................... 51 Introduccin ................................................................................................................................. 51 Objetivos...................................................................................................................................... 51 1 Microorganismos que causan dao y que estn relacionados con los alimentos............. 51 2 Anlisis microbiolgicos aplicados en los alimentos.......................................................... 62 VI REFERENCIAS................................................................................................................................ 65

III. INTRODUCCIN DE LA ASIGNATURA


Desde los inicios de la humanidad, ha sido una constante preocupacin del hombre satisfacer sus necesidades de alimentacin. Cuando era cazador y recolector, tomaba de la naturaleza los alimentos que necesitaba cada da. Posteriormente, con el advenimiento de la gran revolucin en los hbitos culturales que ocasion la agricultura, hubo la necesidad de preservar en el tiempo los alimentos cosechados con tanto esfuerzo. Pero los alimentos pierden sus caractersticas deseables por efecto del tiempo, por efecto de sus enzimas, y, sobre todo, por efecto de los microorganismos que existen de manera normal o por contaminaciones. Para un profesional de la industria alimentaria, es indispensable el conocimiento sobre los microorganismos que pueden provocar infecciones o toxiinfecciones en los alimentos, ya sean frescos, durante su procesamiento, o procesados; con el objetivo de prevenir, controlar y combatir el deterioro que causan en los alimentos. Este Manual comprende desde la identificacin de los microorganismos que estn presentes en los alimentos, hasta los anlisis microbiolgicos que se aplican a los alimentos, los factores que afectan y determinan el crecimiento de los microorganismos, y su control.

IV DIAGNSTICO DE CONOCIMIENTOS
Responder las siguientes preguntas para determinar el conocimiento del grupo sobre los temas de la asignatura. Las respuestas pueden ser tan amplias como se desee. 1.- Cul es la diferencia entre un microorganismo que causa la mastitis (inflamacin de las ubres) en vacas y Escherichia coli, una bacteria que nos puede provocar diarreas? 2.- Y la diferencia de los microorganismos de la pregunta 1, con las levaduras que producen cerveza y vinos? 3.- Qu aspecto poseen las colonias de microorganismos que se desarrollan en medios de cultivo? 4.- Para qu sirve un medio de cultivo selectivo? 5.- Son lo mismo la Actividad de agua que el contenido de humedad de un alimento? 6.- Cmo es que los alimentos cidos (bebidas carbonatadas, cervezas, yogurt) se conservan contra los microorganismos? 7.- Cmo (proceso) y con qu (agentes qumicos) limpiaras las instalaciones (maquinaria, pisos, instrumentos, mesas de trabajo) de una industria alimentaria? 8.- Que se realiza para realzar las clulas cuando se observan al microscopio?

V CONTENIDOS TEMTICOS

Unidad 1: Importancia de la microbiologa en los alimentos


Introduccin
Todos los alimentos, de manera natural, poseen una microflora compuesta de bacterias, mohos, virus, protozoarios o levaduras. Estos microorganismos pueden proliferar en el alimento y causar su deterioro, o pueden afectar al organismo productor del alimento, reduciendo o impidiendo la produccin. Otros microorganismos han sido utilizados para mejorar las caractersticas de los alimentos y preservarlos, caso de los quesos, yogurt y otras leches fermentadas, vinos, cervezas, sidras. Por otra parte, los alimentos pueden ser vehculo de transmisin de microorganismos y sus metabolitos, los cuales pueden ser patgenos para el hombre.

Para distinguir unos de otros, se utilizan diferentes tcnicas entre las cuales se desarrollarn en el manual la morfologa colonial y al microscopio.

Para poder estudiar a los microorganismos es necesario cultivarlos en medios apropiados, y por eso el ltimo tema de la unidad comprende el conocimiento de diferentes medios de cultivo.

Objetivos

4
1.1

Clasificacin de los microorganismos


Criterios de aprendizaje

1.1.1 Explicar y definir la clasificacin de microorganismos en base a: dainos, patgenos y benficos En el interior y exterior de todos los seres vivos, en el agua, tierra y aire se encuentran los microorganismos. Los alimentos poseen de manera natural una microflora al momento de su cosecha o recoleccin, o ser contaminados por personal y equipo en las operaciones de matanza, procesamiento o almacenamiento. Los microorganismos que afectan alimentos, los podemos clasificar de varias formas, la ms utilizada es aquella que los ubica en tres categoras: Dainos: Ocasionan problemas y mermas en la produccin de alimentos, debido a que infectan plantas y reducen su produccin, o infectan animales e impiden su utilizacin para la alimentacin, como los agentes causantes de la mastitis en vacunos. Es decir, disminuyen la produccin de alimentos e impiden su comercializacin al afectar sus caractersticas de calidad (color, sabor, aroma, consistencia) Benficos: Utilizados en fermentaciones, permiten conservar los alimentos o modificarlos para hacerlos ms nutritivos o mejorar sus caractersticas organolpticas: vinos, cervezas (Saccharomyces cereviseae), quesos, yogurth (Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus en ste ltimo), sidras, vinagre. Patgenos: Son los que pueden causar infecciones o toxiinfecciones cuando estn presentes (o sus toxinas) en los alimentos: Aeromonas, Brucella, Bacillus cereus, Escherichia coli.

1.2

Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 1.2.1 Diferenciar los microorganismos dainos, patgenos y benficos que afectan los diferentes grupos de alimentos

PRCTICA 1: Reunir muestras de diferentes tipos de alimentos (cereales, frutas, carne, lcteos, pescados y mariscos, hortalizas) y proponer diferentes microorganismos que puedan estar presentes y ser dainos, benficos o patgenos. Es recomendable examinar las caractersticas de calidad daadas mediante la comparacin con alimentos frescos y en buen estado.

5
2.1

Morfologa celular y colonial de microorganismos


Criterios de aprendizaje 2.1.1 Describir la morfologa colonial y estructural de microorganismos

Estructura al microscopio La base para que la clula pueda realzar sus funciones es que mantenga su estructura. Al microscopio ptico (mximo 1500 aumentos) se han identificado varias estructuras en las clulas de los microorganismos. Existen muchos otros tipos de microscopio que han permitido identificar estructuras cada vez ms pequeas: microscopio de contraste de fases, campo oscuro y fluorescencia; microscopio electrnico de transmisin, de barrido. Bacterias Son organismos procariotas. Presentan una pared celular y una membrana citoplasmtica. Estas estructuras comunican a las clulas con su medio ambiente, permiten introducir nutrientes y agua. Adems, la aslan de un medio

ambiente que puede ser hostil. Las bacterias pueden presentar de uno a muchos flagelos, involucrados con su movimiento, pili, que estn relacionados con el intercambio gentico. Tambin existen ribosomas (hasta 10000 en una sola bacteria), encargados de la sntesis de protenas, distribuidos en todo el lquido intracelular, llamado citoplasma. El material gentico de las bacterias se presenta en un solo cromosoma, asociado a la membrana, y en plsmidos, unidades de cido desoxirribonucleico. En ocasiones hay inclusiones de materiales de reserva: carbono, azufre, nitrgeno o fsforo. Se reproducen por fisin binaria o esporas. Las bacterias presentan diferentes formas y maneras de agrupacin, sta ltima depende de la manera de divisin de las clulas. La siguiente figura ilustra estos ltimos conceptos.

Mohos Los mohos son organismos eucariotas que presentan ncleo, vacuolas y mitocondrias. Poseen paredes celulares rgidas. Tambin son llamados hongos filamentosos. Cada filamento es llamado hifa, crecen en cmulos visibles llamados micelios, que surge cuando las hifas crecen y se entrecruzan. Las clulas pueden ser polinucleadas, incluso con centenares de ncleos. Adems de crecer mediante el micelio, los mohos generan estructuras de esporas asexuales llamados conidias. Algunos mohos producen esporas sexuales en formaciones diferentes: ascosporas, basidiosporas, zigosporas, oosporas.

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Levaduras: Son hongos unicelulares y la mayora produce ascosporas. Son clulas ovales o cilndricas y se dividen por gemacin. Este proceso involucra la formacin de una yema que aumenta de tamaa hasta que se separa de la clula madre. Normalmente no producen micelio (con excepciones como Candida albicans). Las levaduras son mucho ms grandes que las bacterias y presentan todas las caractersticas de una clula eucaritica.

2.1.2 Identificar colonias de microorganismos de acuerdo a la morfologa colonial en medios de cultivo

Los microorganismos se identifican de diferentes maneras. Una de ellas es el cultivo en medios en los cuales desarrollarn caractersticas esenciales para su caracterizacin. Las colonias microbianas que crecen de manera aislada permiten la identificacin del microorganismo presente. Pero es necesario revisar las tcnicas de cultivo asptico y obtencin de un cultivo puro antes de revisar la morfologa de colonias microbianas. En un anlisis rutinario, se inoculan diluciones seriadas del alimento en agua, procediendo a su siembra en un medio general, como el agar nutritivo. De las colonias resultantes, se obtendrn cultivos puros, los cuales se sometern a crecimiento en medios de identificacin (selectivos o prueban bioqumicas). Las caractersticas de una colonia microbiana se enlistan a continuacin. Color: puede ser desde los tonos claros (blanco, amarillo, beige) hasta los oscuros (caf, azul rojo) dependiendo del tipo de microorganismo. Un mismo microorganismos puede producir colonias con diferente color si se cultiva en

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diferentes medios de cultivo (lo mismo se aplica a las dems caractersticas de las colonias) Tamao: desde las colonias puntiformes hasta las que pueden medirse en milmetros. Consistencia: seca, gelatinosa, escamosa, blanda. Borde: puede ser determinado (colonias redondas) o bien con bordes irregulares (aserrados, en forma de raiz). Forma: redonda, fusiforme, irregular, ovalada. Elevacin: planas, cncavas o convexas. Halos alrededor: pueden indicar utilizacin de un sustrato, produccin de cidos o de metabolitos que afectan el desarrollo de otros microorganismos (antibiticos).

2.2

Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 2.2.3 Preparacin de medios de cultivo, as como condiciones de trabajo en un laboratorio microbiolgico

PRCTICA 2: Explicar las tcnicas de preparacin asptica de medios de cultivo lquido, slido y en medio inclinado, as como el uso de la campana de flujo laminar. Explicar las diferentes tcnicas de cultivo: por estra y asa de vidrio en medio slido, por puncin y estra en medio lquido. Inocular con muestras de alimentos de diferentes orgenes, a dos medios de cultivo slidos, uno para

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bacterias y otro para mohos y levaduras. Observar las caractersticas y diferencias de las colonias que se desarrollen. Siembra en tubos de agar inclinado: El cuello del tubo debe ser flameado antes y despus de ser sembrado. Con el asa previamente esterilizada a la llama, se toma una pequea cantidad de la muestra y se lleva al fondo del tubo, luego se estra suavemente la superficie del medio en forma ondulante. Siembra por picadura: El inculo es introducido con el asa recta o pipeta Pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de la siembra. Siembra en superficie y picadura: El inculo es introducido con el asa recta o pipeta Pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida, se retira hacia la superficie inclinada del agar haciendo suavemente una estra ondulada. Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de la siembra. Siembra en profundidad: Al inocular un medio lquido como es el tioglocolato, el tubo se inclina y el material se extrae del asa por frotamiento contra la pared del tubo, cuando ste se endereza el material se encuentra bajo la superficie del medio. Al inocular el

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medio lquido con trula o con inculo lquido se deposita este en el fondo del tubo. Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de efectuada la siembra. 2.2.4 Preparar frotis de diferentes cultivos microbianos PRCTICA 3: De las colonias resultantes en la prctica 2, preparar frotis y teirlos mediante cualquier tcnica para observarlos al microscopio con objetivo de inmersin. Anotar caractersticas de los microorganismos observados.

6
3.1

Medios de cultivo
Criterios de aprendizaje 3.1.1 Explicar qu es un medio de cultivo, clasificacin y composicin

Para su estudio y deteccin, los microorganismos se cultivan en medios de cultivo artificiales o naturales, que se formulan en base a los factores de crecimiento apropiados para cada tipo de microorganismo: pH, nutrientes, factores esenciales para el crecimiento. Tambin poseen caractersticas que permiten la identificacin y aislamiento de microorganismos. Los medios de cultivo se clasifican en: 1.- Por su estado fsico: lquido, semislido y slido. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es consumido por aquellas que crecen en l. Su concentracin en un medio de cultivo determina si es slido o semislido. Los medios lquidos carecen de agar en su formulacin.

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2.- Por su origen: naturales y artificiales: naturales como la papa, zanahoria, suero de sangre o de leche, la leche misma. Hay mas de 10000 medios artificiales formulados para cultivar microorganismos. 3.- Por su uso: Generales: permiten el crecimiento de la mayora de los microorganismos presentes en una muestra. De aislamiento o selectivos: contienen nutrientes solo utilizados por un gnero de microorganismo, lo cual impide el crecimiento de otros microorganismos presentes en la muestra. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Grampositivas). De identificacin: tambin llamados para pruebas bioqumicas, cuando sus

nutrientes son utilizados por los microorganismos, de acuerdo a su metabolismo, se pueden identificar en base al conjunto de observaciones: ureasa, movilidad, indol, nitratos, citrato, manitol. De enriquecimiento: En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

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De transporte: contienen pocos nutrientes, apenas permiten conservar la viabilidad (pero no permiten el crecimiento de la poblacin) de los microorganismos que han sido colectados en una zona lejana a un laboratorio de anlisis. De mantenimiento: utilizados en los ceparios, sirven para mantener viables los cultivos axnicos durante un periodo de tiempo, siendo necesaria su resiembra rutinaria. 3.2 Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 3.2.1 Eleccin de medios de cultivo apropiados en base al alimento y microorganismo en estudio PRCTICA 4: Obtener un cultivo puro a partir de las colonias desarrolladas en la PRCTICA 3. Para ello, aplicar las tcnicas de estriado para obtener colonias aisladas en medios slidos: tomar un inculo con el asa de platino a partir de una colonia aislada del cultivo inicial y distribuirla en la superficie del medio en una placa de Petri de la siguiente manera.

Primera estra

Segunda estra

Tercera estra

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Advierta que debe esterilizar el asa de platino entre cada estra, y slo se toma un pequeo extremo como inculo de la siguiente estra. As se pueden obtener colonias bien separadas en la estra ms delgada, y por sucesivas resiembras los cultivos son purificados. Los cultivos puros o axnicos son muy importantes ya que se utilizan para el resto de los anlisis microbiolgicos como tinciones y pruebas bioqumicas.

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Unidad 2: Condiciones que influyen en el crecimiento de los microorganismos y su control (mecnico, fsico y qumico)
Introduccin
Los microorganismos son afectados por condiciones medioambientales y fisicoqumicas en su entorno. Si graficamos el crecimiento de los microorganismos en el tiempo, la grfica que se obtiene en condiciones ptimas para su desarrollo es la siguiente:

Log N 0

5 Horas

10

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Es importante conocer cmo se puede evitar el desarrollo de esta curva en instalaciones, materia prima, producto en proceso o en almacn, mediante la manipulacin de las condiciones fisicoqumicas del ambiente, mtodos de conservacin de alimentos, utilizacin de agentes sanitizantes y capacitacin del personal.

18

Objetivos

5
1.1

Concentracin de sustrato, temperatura, pH, Aw, Eh


Criterios de aprendizaje 1.1.1 Explicar y definir que es la concentracin de sustrato, la temperatura, el pH, la Aw y el Eh

El medio ambiente en el que se desarrolla un organismo esta formado por factores fsicos, qumicos, y biolgicos. Las relaciones como parasitismo, depredacin, tienen tambin efecto entre los microorganismos, pero los siguientes factores revierten especial importancia para el crecimiento de bacterias, mohos y levaduras: 1.- Concentracin de sustrato: las necesidades nutricionales varan de un microorganismo a otro. Mas an: pueden variar en un mismo microorganismo en diferentes etapas de sus desarrollo, o si crece en diferente temperatura. La incapacidad de un microorganismo para utilizar el componente mayoritario de un material alimenticio limitar su desarrollo. 2.- Temperatura: puede existir desarrollo microbiano desde los -8 C hasta las 100C. Slo se requiere que el agua se encuentre en fase lquida, disponible para las reacciones bioqumicas. Pero ningn microorganismo puede sobrevivir a todo el intervalo de temperaturas. La siguiente tabla ilustra los intervalos de temperatura y la clasificacin de los microorganismos basada en su temperatura de crecimiento:

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Grupo Termfilos Mesfilos Psicrfilos Psicrtrofos

Temperatura C Mnima 40 a 45 5 a 15 -5 a 5 -5 a 5 ptima 55 a 75 30 a 40 12 a 15 25 a 30 Mxima 60 a 90 40 a 47 15 a 20 30 a 35

Para alimentos, los microorganismos mesfilos y psicrtrofos son de la mayor importancia. Los mesfilos generalmente son de origen humano o animal y entre ellos se encuentran algunos de los patgenos mas frecuentes: Salmonella, Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens. La curva de la velocidad de crecimiento en el intervalo de desarrollo de un microorganismo es asimtrica:

Comportamiento del crecimiento microbiano ante la temperatura


Velocidad de crecimiento

Tmnima

T ptima Temperatura

Tmxima

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Esto significa que por encima de la temperatura ptima el crecimiento disminuye mas lentamente, que por debajo de ella, porque las protenas se desnaturalizan, en cambio, a bajas temperaturas las reacciones qumicas se ralentizan. 3.- pH: definido como el logaritmo negativo de la concentracin de iones hidrgeno de una solucin, brinda una escala para medir la acidez, neutralidad o alcalinidad de una solucin, que tienen gran impacto en la estabilidad de macromolculas como las enzimas, que poseen un pH de actividad ptimo, de acuerdo a la siguiente grfica:

Comportamiento de la actividad enzimtica ante el pH

Actividad enzimtica

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pH

La velocidad de crecimiento de los microorganismos sufre un gran deterioro cuando estn en un pH diferente al ptimo, tambin se afecta la produccin de toxinas y esporas. Evidentemente, cambios en el pH afectan la actividad de las enzimas, y con ello, de toda la actividad de los microorganismos, los cuales se desarrollan de manera ptima en un intervalo de la escala de pH:

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Microorganismo pH mnimo

pH ptimo

pH mximo

Mohos Levaduras Bacterias

1.5 a 3.5 1.5 a 3.5 4.5

4.5 a 6.8 5 a 6.5 6.5 a 7.5

8 a 11 8 a 8.5 11

4.- Actividad de agua (aw): las clulas utilizan el agua de dos maneras: como solvente de compuestos qumicos (nutrientes, metabolitos) lo que facilita su transporte; y como reactivo en las reacciones hidrolticas que originan monmeros que despus se utilizan para sntesis de macromolculas y generacin de energa. La aw representa la disponibilidad del agua en un medio para reacciones qumicas y bioqumicas a travs de membranas semipermeables. Su valor oscila entre 0 y 1. No se debe confundir el concepto de aw con humedad, porque una harina con 21% de humedad tiene la misma aw que una fruta con 80% de humedad. Los microorganismos tambin estn adaptados a un intervalo de aw para su desarrollo; las bacterias requieren aw>0.910, las levaduras se desarrollan a aw>0.87, mientras los mohos lo hacen a aw>0.70. Toda disminucin de la aw disminuye el desarrollo microbiano y la mayor parte de los mtodos de conservacin de alimentos tienen su efecto ms importante en la disminucin de la aw. 5.- Potencial de xido reduccin (Eh) y oxgeno: Segn las necesidades de oxgeno para su metabolismo y reproduccin, los microorganismos pueden ser: aerobios (requieren la presencia de oxgeno: Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus), anaerobios (slo se desarrollan en ausencia de oxgeno o con baja tensin de oxgeno: Clostridium, Bacteroides, Peptococcus, Propionibacterium) y anaerobios facultativos (enterobacterias, Staphylococcus). El potencial redox (Eh) de un sistema biolgico es un indicador de su grado de oxidacin. El Eh de un alimento guarda relacin con la composicin qumica del mismo (presencia de

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sustancias reductoras, cidos) y con la presin parcial del oxgeno durante el almacenamiento. El Eh de un alimento determina en gran medida el tipo de flora microbiana que se puede desarrollar (aerobia, anaerobia).

1.1.2 Explicar y discutir la importancia de los factores anteriores en el crecimiento de los microorganismos

Los alimentos constituyen un buen medio nutritivo para los microorganismos, que se desarrollan de acuerdo a las condiciones de los factores anteriores, y de su potencial gentico. La importancia de conocer los factores anteriores en cada tipo de alimento radica en que, mediante su modificacin con los mtodos de conservacin de alimentos, se puede inhibir el crecimiento de los grmenes, prever las consecuencias del desarrollo de los microorganismos, e interpretar las observaciones realizadas sobre un alimento presuntamente contaminado. La curva de la velocidad de crecimiento de un microorganismo contra el tiempo, en condiciones ptimas se ilustra en la siguiente figura:

Crecimiento
Fase de desaceleracin Fase estacionaria

Fase de eceleracin

Fase de crecimiento

Fase Lag o de

exponencial

adaptacin

Tiempo (horas)

Fase de muerte

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La curva no inicia de cero, sino de una cantidad inicial de microorganismos. Durante la fase lag los microorganismos se adaptan a las caractersticas del alimento, despus se empieza a acelerar la velocidad de crecimiento, en la fase de crecimiento exponencial, hasta llegar a una fase estacionaria que precede a la lisis celular cuando se han agotado los nutrientes o se han acumulado metabolitos txicos (o ambas situaciones). El conocimiento de como afectan los parmetros del tema anterior al crecimiento de los microorganismos permite la modificacin de la duracin de la fase de adaptacin, la pendiente de la fase de crecimiento exponencial y la duracin y nivel de la fase estacionaria.

1.2

Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 1.2.1 Manejar los parmetros analizados para el control de los microorganismos

PRCTICA 5: Del cultivo puro obtenido en la PRCTICA 4, tomar un inculo para

suspenderlo en 10 ml de agua destilada estril. Inocular con 0.5 ml de la suspensin a placas de agar nutritivo con pH ajustado a 3.0, a 10.0, a pH normal (testigo); otras 3 placas de agar nutritivo inoculadas se incubarn a 20, 60 y 35C (testigo); cultivar otras placas de agar nutritivo con aw modificadas (adicin de solutos), Eh modificado (aerobio-anaerobio), siempre inoculando una placa testigo para comparar el desarrollo a las 24 h.

Efecto de los parmetros anteriores en el crecimiento de los microorganismos


2.1 Criterios de aprendizaje 2.1.1 Explicar cmo afectan al crecimiento de los microorganismos los factores anteriores

24

Para la conservacin de los alimentos se utilizan varias tcnicas o mtodos basados en la modificacin de los parmetros que afectan el crecimiento de los microorganismos. Se llama sistema de barreras a la combinacin de dos o ms tcnicas que modifican la aw, pH, temperatura, etc., as, mtodos como el secado, afectan la aw y la temperatura; la adicin de un almbar, afecta el pH, la aw, Eh; pero tambin deben controlarse estos mtodos y su ejecucin porque de no aplicarse correctamente solo se provocan selecciones de microorganismos resistentes.

2.2

Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 2.2.1 Identificar el sistema de barreras funcionales en diferentes tipos de alimentos

Procedimientos de conservacin de alimentos: conservacin por fro conservacin por calor desecacin, deshidratacin y liofilizacin salazonado ahumado encurtido escabechado radiaciones ionizantes elaboracin de productos de humedad intermedia otros procedimientos

Conservacin en fro (refrigeracin o congelacin):

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Someter alimentos a bajas temperaturas con el fin de eliminar o inhibir la actividad microbiana o enzimtica, teniendo en cuenta temperatura, humedad relativa y circulacin de aire requeridos para cada alimento. Refrigeracin Someter a los alimentos a bajas temperaturas sin llegar a las de congelacin, manteniendo la uniformidad (no cambios bruscos) durante el periodo de conservacin y sern temperaturas apropiadas de refrigeracin de acuerdo al tipo de alimento. Congelacin Someter a los alimentos a temperaturas menores a las de su punto de congelacin, manteniendo temperatura uniforme durante el periodo de conservacin y sern temperaturas apropiadas a cada tipo de alimento. Los alimentos sometidos a congelacin debern estar en perfectas condiciones higinico-sanitarias de manera que su contenido microbiano inicial antes del congelamiento (conservacin) asegure estabilidad del producto hasta el momento de su consumo. Descongelacin Atemperar en forma conveniente el producto congelado hasta que la temperatura de este sea en todos sus puntos superior a la de congelacin del mismo. Los alimentos no podrn ser sometidos a procesos sucesivos de descongelacin y congelacin. Congelacin rpida: Someter a alimentos (materias primas y/o productos elaborados) a un proceso de enfriado brusco que permita exceder rpidamente a la temperatura de mxima cristalizacin, en un tiempo no mayor a 4 hs.

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Proceso de congelacin rpida Se considera completo cuando una vez lograda la estabilizacin trmica, la totalidad del producto en todos sus puntos presente una temperatura de -18c o menor. Almacenado de productos de congelacin rpida En cmaras frigorficas aptas para mantener la temperatura de los productos en valores constantes y siempre de -18c o menos. Conservacin por el calor (esterilizacin, esterilizacin industrial o tcnica, pasterizacin) Someter a los alimentos a la accin de temperaturas y tiempos adecuados para eliminar o reducir las actividades microbianas y enzimticas. Esterilizacin Es el proceso que destruye en los alimentos a temperatura adecuada, todas las formas de vida de microorganismos patgenos y no patgenos. Esterilizacin industrial o tcnica Es el proceso trmico que, aplicado a un alimento asegura: 1 Conservacin sin alteracin y buena calidad comercial durante un periodo suficientemente largo, compatible con las necesidades comerciales. 2 Ausencia de microorganismos perniciosos para la salud del consumidor (grmenes patgenos, grmenes toxico gnicos) y ausencia de toxinas. 3 Ausencia de todo microorganismo capaz de proliferar en el alimento, lo que supone la ausencia de toda alteracin de origen microbiano. Pasterizacin: Someter a alimentos a temperaturas inferiores a 100c y por tiempos suficientes para destruir las formas vegetativas de los tipos comunes de microorganismos patgenos y una cierta proporcin de las no patgenos que los contaminan, para

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que el producto se pueda transportar, mantener, distribuir, consumir o utilizar en otros procesos en condiciones de aceptabilidad a temperaturas apropiadas y por tiempos razonables segn la naturaleza del producto. Desecacin Someter a los alimentos a las condiciones ambientales naturales para privarlos de la mayor parte de agua que contienen. Deshidratacin Someter a los alimentos a la accin principal del calor artificial para privarlos de la mayor parte de agua que contienen Liofilizacin Someter a los alimentos a procesos de congelacin seguidos de sublimacin del hielo formado para privarlos de la mayor parte de agua que contienen. Salazn (en seco o salmuera) Someter los alimentos a la accin de la sal comestible con o sin otros condimentos. Salazn en seco Someter a superficies externas de los alimentos a la accin de la sal en condiciones ambientales apropiadas. Conservacin en sal muera Someter a los alimentos a la accin de soluciones de sal en concentracin y tiempos variables, segn la naturaleza del producto.

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Ahumado Someter a los alimentos a la accin de humos recin formados, procedentes de la combustin incompleta y controlada de maderas duras de primer uso, mezcladas o no con plantas aromticas de uso permitido. Prohibido en maderas resinosas (menos abeto) o maderas con procesos que pueden originar toxicidad por desprendimiento. Los productos ahumados no deben contener: mas de 1 microorganismo por kg (1ppb) de 1,2benzopireno, 3,4 benzopireno, fluoreno, fenantreno u otros hidrocarburos policclicos aisladamente o en mezcla de accin toxica o nociva para la salud. Encurtido Someter los alimentos previamente tratados con salmuera o que hubieren experimentado una fermentacin lctica a la accin del vinagre con o sin la adicin de cloruro de sodio, edulcorantes nutritivos, condimentos, productos aromatizantes, aceites esenciales, colorantes naturales admitidos, etc. La fase liquida de los encurtidos deber tener un pH (a 20C) no mayor a 4,3. Escabechado Someter a los alimentos crudos o cocidos, enteros o fraccionados a la accin del vinagre con la adicin o no de cloruro de sodio. La fase liquida de los productos en escabeche deber presentar un pH (20C) no mayor a 4,3. Otros procedimientos Podr realizarse siempre que garanticen las condiciones higienizo sanitarias y de aceptabilidad requeridas para los alimentos a que se someten. El empleo de aditivos alimentarios se har solamente en los casos especficamente autorizados.

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Conservacin por radiacin ionizante o energa ionizante Someter los alimentos a la accin de alguna de las siguientes fuentes de energa Rayos gamma Rayos equis

Agentes sanitizantes, agentes qumicos que inhiben o retardan el crecimiento de los microorganismos
3.1 Criterios de aprendizaje alimentos, forma de uso y concentraciones recomendadas 3.1.1 Describir los sanitizantes utilizados en la industria de los

Existen dos conceptos importantes en la limpieza de industrias de alimentos: la limpieza fsica y la limpieza microbiolgica. La primera se refiere a la eliminacin de la suciedad visible, con cepillo, agua y detergente, se barre, rasca, se despega toda la suciedad. La segunda se refiere a la eliminacin de los microorganismos en las superficies que han sido previamente limpiadas, tambin se conoce como desinfeccin o sanitizacin, y para ello se utilizan diferentes sustancias qumicas conocidas como desinfectantes o sanitizantes. La eleccin del sanitizante depende de los siguientes factores: Nmero y tipo de microorganismos Toxicidad y efecto sobre el alimento Corrosin Peligro para el personal Lo afecta suciedad residual Condiciones ptimas de uso (pH, Temp., dureza del agua, tiempo de contacto)

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Costo Entre los sanitizantes ms utilizados en la industria de alimentos, se encuentran los siguientes: Detergentes de amonio cuaternario: son detergentes catinicos. Como todos los detergentes, afecta la tensin superficial del agua mejorando su penetracin para arrastrar partculas de suciedad, pero adems, debido a su grupo amonio, altera la membrana de los microorganismos conduciendo a su muerte. No es corrosivo, txico, voltil o inflamable, adems tiene un amplio espectro microbiolgico de accin, que incluye hongos, levaduras, bacterias G(+) y G(-) y algas. Le afecta la dureza del agua.

Dixido de cloro: Evita el desarrollo de bacterias, es incoloro e inodoro, no transmite sabor alguno a los alimentos, es seguro, disponible todo el ao, econmico, de uso generalizado en la Industria Alimentaria, de fcil aplicacin, solo se diluye en agua de acuerdo a la siguiente tabla:

Dosificacin del Cl02 potabilizacin de agua sanitizacin de utensilios, 0.01 AL 0.05 % 0.10 AL 0.50% 0.10 AL 0.50 % y y 2.50 % 0.50 %

recipientes e instalaciones sanitizacin de granjas sanitizacin hospitales enjuague legumbres de frutas de locales

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Vapor de agua: Elimina todo tipo de microorganismos, incluyendo esporas, pero mancha el acero, lo afecta la dureza del agua, se requieren calderas y es peligroso por temperatura. Jabn: adicionado de agentes antimicrobianos, se usa para limpieza y desinfeccin del personal, en base a su poder tensoactivo. Soluciones de yodo: es un lquido caf rojizo, con accin germicida de amplio espectro, econmico, eficiente, que elimina bacterias, hongos y levaduras. Usado ampliamente como sanitizante. Es econmico, acta contra hongos, fcil disolucin en agua, fcil de transportar y conservar, germicida de amplio espectro aun a bajas concentraciones y temperaturas bajas, no es irritante, elimina la suciedad, no es afectado por la dureza del agua ni por detergentes, rpida accin germicida, tiene un gran campo de aplicacin. Se diluye en agua de acuerdo a las siguientes aplicaciones:

Dosificacin del Yodo desinfeccin de equipos y utensilios desinfeccin de ubres, frutas, verduras y legumbres desinfeccin de granjas desinfeccin contaminadas de superficies muy 0.00750 % 0.01000 % 0.00125 % 0.00250 %

Detergentes alcalinos: Los detergentes son tensoactivos: al mismo tiempo poseen grupos hidrfobos e hidrfilos, reducen la tensin superficial del agua mejorando su penetracin y humectacin. Remueven grasa, suciedad,

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malos olores, sabores desagradables; suspendindolos y eliminndolos mediante el agua de limpieza, lo cual facilita el lavado de equipo, maquinaria, tubera, ya sea por aspersin o circulacin. Para aplicarlos, primero se enjuaga la superficie a limpiar con agua limpia, se aplica el producto diluido y se enjuaga con agua limpia, aplicando despus un detergente cido. Detergentes cidos: desincrustan los residuos minerales y orgnicos, de las tuberas y equipos, aumentando su vida til y la eficiencia del proceso. Limpia y abrillanta el acero inoxidable. No le afecta la dureza del agua en su aplicacin. Su empleo es recomendado despus de lavar con un detergente alcalino. Rotacin de sanitizantes: se recomienda por la aparicin de resistencia en los microorganismos, hay que tomar en cuenta los factores fisicoqumicos, biolgicos, de instalaciones, para escoger los sanitizantes a rotar. Pero si el desinfectante cumple su funcin, no debe haber rotacin.

3.2

Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 3.2.1 Proponer la aplicacin y concentracin de un sanitizante en funcin del microorganismo presente

PRCTICA 6: En todas las visitas industriales que se realicen, que los alumnos

recopilen la informacin referente a como controlan la sanitizacin de sus instalaciones, as como de los laboratorios y talleres escolares, proponiendo mejoras.

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4.1

Mtodos de identificacin de microorganismos


Criterios de aprendizaje 4.1.1 Explicar los mtodos de identificacin de microorganismos que causan dao en los alimentos

Los microorganismos pueden hacer dao en los alimentos de dos maneras: produciendo su alteracin o enfermndonos: 1.- Alteracin de los alimentos (microorganismos alterantes) Alimento deteriorado: aquel daado por agentes microbianos, qumicos o fsicos de forma que es inaceptable para el consumo humano. - Aproximadamente el 20% de las frutas y verduras recolectadas se pierden por deterioro microbiano producido por alguna de las 250 enfermedades de mercado. - Los agentes causantes de deterioro pueden ser bacterias, mohos y levaduras; siendo bacterias y mohos lo ms importantes. - Las carnes son los alimentos ms fcilmente deteriorables. Durante el proceso de deterioro se va seleccionando una poblacin o tipo de microorganismos predominante la variedad inicial indica poco deterioro y refleja las poblaciones iniciales. - Cada tipo de alimento se deteriora por accin de un tipo de microorganismo concreto; cada asociacin es especfica. - De todos los microorganismos presentes en un alimento solo algunos son capaces de multiplicarse activamente sobre el alimento resultando seleccionados. Existen una serie de factores que dirigen esta seleccin.

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Factores intrnsecos (aw, pH, Eh, nutrientes, estructuras, agentes antimicrobianos), composicin del alimento. Tratamientos tecnolgicos: modifican flora inicial. Factores extrnsecos: condiciones fsicas del ambiente. Factores implcitos: relaciones entre los microorganismos establecidas como consecuencia de los factores a, b y c. Estos cuatro factores determinan lo que se denomina resistencia a la colonizacin de un alimento. Los microorganismos al crecer y utilizar los alimentos como fuente de nutrientes producen cambios en la apariencia, sabor, olor y otras cualidades del alimento. Estos procesos de degradacin son: a.- Putrefaccin Protenas alimentos + Microorganismos proteolticos ------> Aminocidos + Aminas + NH3 + SH2 b.- Fermentacin Carbohidratos alimentos + Microorganismos sacarolticos ------> cidos + Alcoholes + Gases c.- Enranciamiento Grasas alimentos + Microorganismos lipolticos ------> Acidos grasos+ Glicerol 2.- Enfermedades de origen microbiano (microorganismos patgenos) a.- Infeccin alimentaria: Salmonelosis b.- Toxiinfeccin alimentaria: Botulismo (por accin de las toxinas de un microorganismo aunque ste ya no se encuentre presente en el alimento)

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Los microorganismos son identificados mediante pruebas morfolgicas y bioqumicas, tinciones, y otros anlisis especializados como serotipos o patrones de inhibicin frente a antibiticos. Cuando es necesario, se utilizan tcnicas de Biologa Molecular como la secuenciacin gentica. En ocasiones, cepas diferentes de la misma especie microbiana presentan diferente patogenicidad, por lo cual se requiere diferenciarlas mediante anlisis de serotipos (como los flagelares), actividad enzimtica, identificacin de toxinas
Tinciones

Tincin de Bacterias Si se desean observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias, resulta sumamente til el utilizar las preparaciones fijas y teidas, debido a que estas permiten que las clulas se visualicen de mejor manera y se puedan diferenciar las distintas especies por su coloracin, este mtodo en particular se llama tincin diferencial o selectiva. Los pasos a seguir para la tincin de las bacterias es hacer el frote, la fijacin y la aplicacin de las soluciones colorantes. La amplia gama de colorantes que se pueden utilizar, ha obligado a separarlos en tres grupos generales, los de trifenilmetano, los de oxacina y los de tiacina. Esta clasificacin es buena para la distincin de las familias de colorantes, pero en general se utiliza la clasificacin de acuerdo a su carcter cido base, es decir, cidos, bases o neutros, debido a que de esto depende mucho su comportamiento.La coloracin se da de acuerdo con a la accin de los iones complejos del colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula. Entre los diversos tipos de coloracin de bacterias, estn la coloracin simple, diferencial y la tincin negativa.

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Coloracin Simple Este tipo de coloracin consiste en inundar con un colorante cualquiera el portaobjetos donde se tienen las bacterias, luego lavarlas con agua, y algunas clulas retendrn el colorante, por reaccin con el mismo. Coloracin diferencial Este tipo de coloracin es sumamente importante, ya que permite diferenciar entre un tipo de bacterias y otro de acuerdo con su susceptibilidad ante uno u otro colorante. Entre estos mtodos se encuentra la coloracin de Gram, que es muyy importante en Microbiologa. Este mtodo discrimina entre clulas grampositivas y clulas gramnegativas, es generalmente utilizado debido a que muchas de las clulas patgenas son del tipo gramnegativo, aparte de esta diferencia las clulas grampositivas son ms susceptibles a la penicilina y ms resistentes a la accin mecnica y exposicin a algunas enzimas que las gramnegativas.

Productos que se utilizan

Reaccin y coloracin de las bacterias GRAM + GRAM Clulas color violeta continan teidas de color violeta. Eliminacin por extraccin de grasas de las paredes celulares. Aumenta la

1) Cristal violetaClulas color violeta 2) Lugol 3) Alcohol solucin iodada continan teidas de color violeta. Se deshidratan las paredes celulares. Se contraen los poros. Disminuye la

Se forma el complejo CV-I. Las clulas Se forma el complejo CV-I. Las clulas

permeabilidad. El complejo CV-I no sale porosidad. El complejo CV-I se separa de las clulas que continan teidas de de la clula. color violeta. 4) Safranina Clulas no decoloradas; quedan teidas Clulas decoloradas; se tien de color de color violeta. rosado

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Pruebas bioqumicas (o de metabolismo) Catalasa

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepcin es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes gneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-) Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos tcnicas: Mtodo del portaobjetos (recomendado): Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos. Mtodo del tubo de ensayo: Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo).

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Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaucin de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dar un falso resultado positivo.
Citrato

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono y compuestos amoniacales como nica fuente de nitrgeno en su metabolismo, provocando una alcalinizacin del medio. Entre las enterobacterias estas caractersticas se dan en los siguientes gneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrgeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Slo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrn multiplicarse en este medio y liberarn iones amonio lo que, junto con la eliminacin del citrato (cido), generar una fuerte basificacin del medio que ser aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.
Fenilalanina desaminasa

Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminocido fenilalanina en cido fenilpirvico por su actividad enzimtica de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies del gnero Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos gneros de otras enterobacterias

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Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con abundante inculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se aade 0,2ml de una solucin de cloruro frrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La presencia de cido fenilpirvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparicin de un color caracterstico verde oscuro o verde-azulado.
Indol

Mediante esta prueba se detecta la liberacin de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberacin se debe a la degradacin del aminocido triptfano mediante el enzima triptofanasa. Para la realizacin de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptfano). Para la posterior deteccin del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes: Alcohol amlico o isoamlico (puede sustituirse por alc.butlico)........150ml p-dimetilamino-benzaldehdo..........................................................10g HCl (concentrado).........................................................................50ml Se disuelve primero el aldehdo en el alcohol y despus se agrega lentamente a esta mezcla el cido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las ms convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de Klebsiella (indol-). Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al aadir al medio 5 gotas del reactivo de Kovacs, se producir un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba ser considerada positiva. Si esto ocurre despus de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deber incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porcin de unos 2 ml que se retira de l aspticamente.

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Lactosa

Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminacin fecal en anlisis, sobre todo, de aguas. En bacteriologa se define el grupo de organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formacin de gas a 35C en 48 horas". No se trata de un grupo taxonmico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayora de ellas de origen intestinal. Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentacin de la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este medio, adems de selectivo frente a bacterias no entricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro). En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y slo crecern las enterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarn productos cidos que producirn un cambio de pH que se detectar gracias al rojo neutro. Las colonias lactosa (+) aparecern de color rojo o violeta contrastando con la coloracin amarillenta de las colonias lactosa (-).
Manitol, movilidad y nitratos

Se incluyen en este apartado 3 pruebas bioqumicas debido a que se pueden realizar cultivando el microorganismo en un nico medio, el Manitol Movilidad, que se prepara en tubo con agar recto y se siembra en picadura, incubndose a 37C durante 24 horas. Tambin existe la posibilidad de hacer las pruebas en otros medios y por separado.

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Prueba del Manitol

Sirve para detectar si los grmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos cidos que sern detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiar a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clnica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).
Prueba de la Movilidad

Sirve para determinar si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos mviles. El medio manitol movilidad permite la realizacin de esta prueba gracias a ser semislido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las bacterias mviles producirn un enturbiamiento homogneo del medio debido a la distribucin aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmviles permanecern en la misma lnea de la picadura en que se sembraron. Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el gnero Klebsiella (-) de las restantes que suelen ser movilidad (+). Dentro del gnero Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+).

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Prueba de la reduccin de nitratos

Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos despus de su incubacin se aaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc pursimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretacin final. Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre s determinadas bacterias de los gneros Haemophylus y Neisseria.
Oxidasa

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que produce agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana. El oxgeno acta por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asmismo, la presencia de oxidasa va ligada a la produccin de catalasa, ya que sta degrada el perxido de hidrgeno (ver prueba de la catalasa) que se produce como consecuencia de la reduccin del oxgeno y cuya acumulacin es txica.

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La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para Identificar todas las especies de Neisseria (+) Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias. El reactivo de la oxidasa ms recomendado es la solucin acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos txico y mucho ms sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es ms caro. Este reactivo tie las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a prpura-negruzco intenso. Realizacin de la prueba: Mtodo en placa directa Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla. Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reaccin se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos. Mtodo indirecto sobre papel Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. La reaccin de color positiva se produce a los 5-10 segundos.
Rojo de metilo y Voges-Proskauer

Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetras y permiten la diferenciacin dentro de las enterobacterias del grupo coli y aergenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarn la glucosa en dos fases:

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primero la metabolizarn aerobiamente (respiracin oxibintica) consumiendo rpidamente el oxgeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizndola por va anaerobia (fermentacin). sta puede ser de dos tipos: Fermentacin cido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son cidos orgnicos (cidos frmico, actico, lctico y succnico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4. Fermentacin butiln gliclica: La realizan las bacterias del grupo KlebsiellaEnterobacter (antiguo aergenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, producindose acetona como intermediario que podr ser detectada aadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionarn con este compuesto produciendo un color rojo caracterstico. Para la realizacin de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30C durante un periodo de 3 das como mnimo y 5 como mximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que servirn para cada uno de los ensayos. Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le aade unas gotas (4-5) de solucin indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la coloracin. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo. Foto de los resultados de esta prueba Voges-Proskauer: A la otra porcin de cultivo se le aade: 0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etlico absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso. 0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente.

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Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violceo, ms o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloracin alguna.
Ureasa

Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculas de amoniaco por accin del enzima ureasa. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este gnero de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se complementa despus del autoclavado con 50ml/l de urea. sta ser degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradacin produce amoniaco que har variar el color del indicador de amarillo a rojo, ponindose as de manifiesto la actividad ureasa. Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubacin ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco despus de la inoculacin y sus resultados deben ser ledos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubacin.

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Resumen de resultados positivos PRUEBA RESULTADO POSITIVO

Catalasa Citrato Fenilalanina desaminasa Indol Lactosa Manitol Movilidad Nitratos Oxidasa Rojo de Metilo Ureasa Voges-Proskauer

Aparicin de burbujas de O2 Medio de color azul Aparicin de color verde oscuro Aparicin de un anillo rojo Colonias de color violeta Aparicin de color amarillo Difusin a partir de la lnea del inculo Cambio de color (rojo oscuro) Aparicin de color azul Aparicin de color rojo Aparicin de color rojo Aparicin de color rojo

Una vez que se tiene el conjunto de resultados de esta, y mas pruebas bioqumicas, se procede a buscar en tablas preparadas en libros de Anlisis Microbiolgico, el microorganismo que presente los resultados iguales a las pruebas ensayadas. 4.2 Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 4.2.1 Evaluar los mtodos adecuados para la identificacin de microorganismos y su efecto en alimentos

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PRCTICA 7: TINCIN DE GRAM: Reactivos: Cristal violeta (1 g de cristal

violeta en 100 ml de agua destilada). Lugol (1 g de iodo en 2 g de ioduro potsico en 100 ml de agua destilada). Safranina (1 g de safranina en 100 ml de agua destilada). Desarrollo: Extensin: En un portaobjetos limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloca una gota de agua destilada a la cual, con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se lleva una pequea cantidad de suspensin de bacterias o, en su caso, de una colonia. Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el portaobjetos y se fija la extensin por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.

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Coloracin:

a) 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial) b) Se lava con agua destilada c) 1 minuto en lugol (mordiente) d) Se decolora con alcohol de 95 (decolorante) e) Se lava con agua destilada f) 1 minuto en safranina (colorante de contraste) g) Se lava con agua corriente h) Se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro

Una vez que la preparacin est totalmente seca, poner una gota muy pequea de aceite se inmersin y observar al microscopio con el objetivo de inmersin.

PRCTICA 8: Pruebas bioqumicas. A partir de un cultivo puro obtenido de la flora

presente en un alimento, inocular tantos medios para pruebas bioqumicas de que se disponga, obtener resultados a las 24 h (corroborar negativos hasta las 48 h), discutirlos y tratar de identificar el gnero y la especie presente, de acuerdo a las siguientes instrucciones:

Medios y Materiales:
Tubos con tapn de rosca Matraces Erlenmeyer Asa bacteriolgica Estufa de incubacin a 35C Campana de flujo laminar Campana de humos Balanza analtica
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Esptula Perxido de hidrgeno al 30% (H2O2) y portaobjetos Agar nutritivo (preparar en cajas Petri) Agar citrato de Simmons (preparar en tubos inclinado) Reactivo de Kovacs: Alcohol amlico o isoamlico (puede sustituirse por alc.butlico)........150ml p-dimetilamino-benzaldehdo...............................................................10g HCl (concentrado)...............................................................................50ml Se disuelve el aldehdo en el alcohol y se agrega lentamente a esta mezcla el cido. Caldo rojo fenol y lactosa (en tubos) Agar Manitol-Movilidad (preparar en tubos) Caldo urea de Christensen (aadir 2 g de agar por 100 ml y preparar en tubo inclinado) Medio SIM (en tubos)

Desarrollo:
1.- De acuerdo a los apuntes proporcionados de pruebas bioqumicas, realizar las pruebas para catalasa, citrato, lactosa (con el medio Caldo rojo fenol y lactosa en lugar del agar de McConkey), manitol y movilidad, oxidasa, ureasa, indol (con el medio SIM en lugar del caldo de triptona). 2.- Anotar observaciones y entregar informe escrito con esquemas de las observaciones y resultados.

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Unidad III: Anlisis microbiolgicos de los alimentos

Introduccin Objetivos

Microorganismos que causan dao y que estn relacionados con los alimentos
1.1 Criterios de aprendizaje 1.1.1 Identificar los microorganismos que causan dao con mayor frecuencia en los alimentos

Leche

La leche es el lquido segregado por los mamferos para alimentar a sus cras (excluyendo el calostro). Econmicamente, la leche de vaca es la ms importante. Sus componentes principales son lactosa, grasa y protenas, adems de un 78% de agua. Posee un pH cercano a la neutralidad, elevada aw y numerosos nutrientes, por lo tanto, es un excelente medio para el desarrollo de microorganismos. Los microorganismos presentes en la piel y ubre de la vaca pueden invadir el pezn y el interior de la ubre. Micrococos, estreptococos y Corynebacterium bovis son los organismos comnmente hallados. Los culpables de las infecciones de las ubres son Staphylococcus aureus, E. coli, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Pseudomonas aeruginosa y Corynebacterium pyogenes.

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Algunos patgenos de origen humano tambin pueden intervenir en la mamitis: Salmonella, Listeria monocytogenes, Mycobacterium bovis y Mycobacterium tuberculosis. El material para la manipulacin y almacenamiento de la leche, tambin pueden ser fuente de microorganismos.
Carne

Se llama carne al msculo y vsceras de los animales, las fuentes ms importantes son las de ganado vacuno, los cerdos, borregos, chivos y aves de corral. La carne es una fuente importante de protenas, lpidos y nitrgeno no proteico. Adems, posee una elevada aw y un pH cercano a la neutralidad. Los primeros organismos en crecer en la carne utilizan los carbohidratos y el nitrgeno no proteico soluble. Los microorganismos proteolticos entran en accin en las ltimas etapas de la descomposicin de la carne. Durante el procesamiento de los animales, la evisceracin reviste primordial atencin debido a que el tracto intestinal est repleto de microorganismos, muchos de los cuales son patgenos, como Salmonella y Campylobacter en aves de corral. Despus de formar la canal, el lavado con agua caliente (80 C), lavado con agua clorada o con cido ctrico reducen la flora microbiana de superficie de la canal. Adems, regularmente se expone la carne a choque trmico con temperaturas de refrigeracin. Las carnes rojas refrigeradas poseen un elevado Eh en la superficie lo cual permite el crecimiento de aerobios psicrtrofos como Pseudomonas (P. fragi, P. lundesis y P. flurescens), Acinetobacter y Psichobacter. Las Pseudomonas son el organismo predominante en el deterioro de las carnes rojas.

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Las carnes envasadas al vaco dan origen a una microflora dominada por microorganismos gram positivos, cido lcticos, como Lactobacillus, Carnobacterium y Leuconostoc.
Pescado

A diferencia de la carne, el pescado no contiene depsitos de grasa visibles. Tambin es una fuente importante de protenas. El pescado recin capturado suele ser estril pero la piel, agallas e intestinos contienen muchas bacterias, principalmente gram negativas como Pseudomonas, Shewanella, Psychrobacter, Vibrio, Flavobacterium y Cytophaga. La grasa del pescado es poliinsaturada y por lo tanto muy reactiva, esto implica que muchas veces la alteracin del pescado es qumica (rancidez oxidativa). La descomposicin microbiana es la ms frecuente y comienza con la utilizacin de la fraccin nitrogenada no proteica que origina la trimetilamina. El olor desagradable del pescado descompuesto se debe a sulfuro de hidrgeno, metil mercaptano y el dimetil sulfuro as como la trimetilamina. La alteracin del pescado refrigerado se debe principalmente a bacilos psicrtrofos gram negativos como Shewanella putrefaciens y Pseudomonas spp.
Crustceos y moluscos

Adems de su flora endgena, suelen contaminarse con bacterias del lodo que es arrastrado con ellos en su captura. Como contienen mas carbohidratos que la carne y el pescado, su alteracin es glucoltica en lugar de proteoltica.

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Cereales

Trigo, arroz y maz son la principal fuente de alimentacin en el mundo. Al poseer una reducida aw, los mohos son los responsables del deterioro de los granos almacenados. Los gneros Penicillium, Aspergillus y Fusarium son los ms importantes.
Legumbres, nueces y semillas oleaginosas

Las legumbres constituyen la principal fuente de protenas vegetales, y las nueces y semillas oleaginosas proporcionan aceites vegetales. Las semillas almacenadas pueden ser atacadas por mohos, especialmente lipolticos: Aspergillus niger, A. tamarii, Penicillium spp. y Paelomyces spp.
Frutas y sus derivados

Aunque poseen aw elevadas, el bajo pH que los caracteriza permite el desarrollo de levaduras y mohos. Los ctricos son deteriorados por Penicillium italicum y P. digitatum. En manzanas, P. expansum provoca la podredumbre blanda. Peras y manzanas son atacadas por los ascomicetos Venturia inaequalis y Monilia fructigena.
Hortalizas y derivados

Su pH ms elevado permite el crecimiento de bacterias, y tambin hongos. La alteracin de las hortalizas es provocada por bacterias pectinolticas de los gneros gram negativos Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas y Clostridium.

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Alimentos enlatados

En los alimentos enlatados los microorganismos pueden causar alteraciones. En general, los microorganismos se asocian con grupos particulares de alimentos. stos pueden sobrevivir al tratamiento trmico requerido para el enlatado o bien contaminar el alimento despus de dicho tratamiento debido a suturas o fugas del envase. Cuando la contaminacin es anterior al tratamiento, es posible predecir el microorganismo responsable si se conocen bien la naturaleza del alimento y las condiciones a las que se ha sometido dicho alimento. Sin embargo, los microorganismos que se introducen por fugas pueden ser muy variados al igual que la composicin de los medios de enfriamiento. En la siguiente tabla se ilustran algunos microorganismos que deterioran alimentos enlatados.

Grupos segn grado de acidez

Rango de pH

Grupos de alimento

Microorganismos

Grupo 1: poco cidos

>5

Productos crnicos Productos marinos Leche Hortalizas Mezclas de carne y vegetales Sopas Salsas Tomates Peras Higos Pia Otras frutas Encurtidos Pomelo Zumos ctricos

Grupo 2: semici dos

4,5 < pH < 5,0

Aerobios esporulados Anaerobios esporulados Levaduras, mohos y bacterias no esporuladas

Grupo 3: cidos Grupo 4: muy cidos

3,7 < pH < 4,5

Bacterias esporuladas Bacterias no esporuladas Levaduras Mohos

PH < 3,7

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MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS DE ACIDEZ BAJA Y MEDIA AEROBIOS ESPORULADOS

Los ms difundidos son los del gnero Bacillus, que tiene su origen en el suelo y agua, por lo que casi siempre estn presentes en las materias primas empleadas en conservas. Su temperatura ptima de crecimiento oscila entre los 28 y 40 C para la mayora, aunque existen algunos termfilos, que pueden desarrollarse a 55 C e incluso 70 C. Entre estos podemos encontrar, tanto aerobios obligados, como anaerobios facultativos, estos ltimos capaces de crecer en condiciones de vaco. Los tipos de alteraciones que pueden tener lugar son: la fermentacin simple, la produccin de gas y la de cido y gas. La fermentacin simple es la ms comn y se debe al ataque de los carbohidratos con produccin de cido y sin produccin de gas. B. stearothermophilus y B. coagulans son los principales termfilos causantes de la fermentacin simple. El primero, en productos de baja acidez (guisantes, hortalizas;no crece con un pH menor de 5), sometidos a un tratamiento trmico relativamente intenso, aunque no se produce la alteracin cuando el enfriamiento es rpido y si se realiza el almacenamiento en fro. B. coagulans es acidrico (pH de hasta 4,2) y presenta esporas menos resistentes al calor, por lo que las alteraciones tienen lugar en las carnes enlatadas, ya que el tratamiento trmico para estas es ms bajo que en las hortalizas. Tambin aparece asociado a productos cidos (jugo de tomate), ya que por su bajo pH el tratamiento trmico es ligero. La produccin de gas por aerobios esporulados se debe a la denitrificacin del nitrato en carnes curadas enlatadas, maiz, guisantes, etc. B. cereus y B. mesentericus aparecen en salmn y cangrejos. B. macerans y B. polymixa forman cido y gas.

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ANAEROBIOS ESPORULADOS

Los anaerobios esporulados proceden principalmente del suelo, por lo que se encuentran ampliamente distribuidos en la leche, hortalizas y otros productos alimenticios. Tambin es posible encontrarlos en la carne, ya que algunas especies tambin se desarrollan en los intestinos del hombre y animales. El gnero ms importante es el Clostridium, pudiendo encontrar organismos termfilos y mesfilos. Entre los primeros, los sacarolticos son los ms importantes, produciendo gran cantidad de gas a partir de los carbohidratos, principalmente dixido de carbono e hidrgeno, lo que da lugar al abombamiento de las latas. Estas alteraciones van acompaadas de un olor butrico. No producen cido sulfhdrico. La temperatura ptima de desarrollo se sita alrededor de los 55 C, apareciendo sobre todo en pases clidos, donde las temperaturas de almacenaje pueden sobrepasar los 35 C. Tambin los termfilos pueden ser causantes de una alteracin sulfurosa, en este caso con produccin de cido sulfhdrico. Los organismos mesfilos son los segundos en importancia despus de los causantes de la fermentacin simple. Entre estos destaca Clostridium botulinum. Se trata de una bacteria Gram positiva, anaerobia y esporgena, cuyo crecimiento queda inhibido a pH menor de 4,5. Sin embargo, los organismos aerbios de un alimento pueden crecer y usar el oxgeno en un recipiente, creando condiciones anaerobias adecuadas para su desarrollo y en un producto cido puede crecer C. botulinum, si est presente, cuando el cido haya sido utilizado por otros organismos, aumentando el pH. Es el ms resistente de los microorganismos que intoxican los alimentos, por lo que la industria de enlatado admite de forma general que todos los productos no cidos tratados deben cumplir los requerimientos bsicos necesarios para destruir a C. botulinum (esterilizacin durante 2,8 minutos a 121,1 C). En los alimentos correctamente procesados no se produce el desarrollo de esta bacteria, aunque existen alimentos con porciones slidas en los

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que puede haber heterogeneidad de pH durante cierto tiempo, por lo que debe mantenerse un pH inferior a 4,5 como margen de seguridad. Este microorganismo merece especial mencin debido a su significancia para la salud humana. Se presenta tanto en forma vegetativa como de esporas, siendo estas ltimas la forma importante desde el punto de vista del enlatado de alimentos. La forma vegetativa se destruye fcilmente a temperaturas menores de 100 C, mientras que las esporas, que proceden del polvo y del suelo, pueden sobrevivir 300 minutos de ebullicin a 100 C. stas varan su resistencia al calor, siendo difcil obtener una suspensin de esporas de resistencia uniforme al calor para su estudio. Tiene poderes proteolticos y sacarolticos. La toxina botulina es soluble en agua y extremadamente letal para el hombre (tipos A y B). Las esporas deben germinar para producir una clula vegetativa que produce la toxina, por lo que es poco probable encontrar presente el organismo con su toxina, de forma que el alimento puede ser ingerido por ausencia de indicios de contaminacin (sabor u olor extraos). Dicha toxina es destruida por exposicin durante diez minutos a calor hmedo a 100 C. La determinacin del tipo de toxina se lleva a cabo mediante reacciones antignicas.

La temperatura ptima de crecimiento de los organismos mesfilos oscila entre los 20 y 50 C (algunos menos y otros ms, aunque generalmente es de 37 C). Segn su capacidad para atacar a los hidratos de carbono pueden ser de dos tipos: proteolticos o putrefactivos y sacarolticos. Los primeros son causantes de alteraciones gaseosas con degradacin del alimento y produccin de compuestos de olor desagradable. stos son ms importantes en los alimentos de acidez baja y media, excepto en el jamn york enlatado, en el cual se producen alteraciones de tipo sacaroltico causadas por C. perfringens. Destacan C. hystolyticum, C. sporogenes y C. bifermentans. Entre los de tipo sacaroltico los ms frecuentes son C. butyricum, C. pasteurianum, C. perfringens y otros.

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LEVADURAS, MOHOS Y BACTERIAS NO ESPORULADAS

Los nicos importantes en los alimentos de acidez baja y media son aqullos con resistencia trmica relativamente baja, los que producen alteraciones por fugas en la lata y aqullos que producen alteraciones en la leche condensada y las carnes curadas enlatadas (jamn, tocino, etc.). Entre las levaduras destacan las fermentadoras de la sacarosa que se desarrollan en la leche condensada, ya que este alimento no es sometido a ningn tratamiento trmico, sino que la base de su conservacin radica en su elevado contenido en azcar. Torula globosa, de clulas redondeadas, ocasiona la distensin de las tapas de las latas. Torula lactiscondensis, de clulas ovales, produce una fermentacin muco ms vigorosa, por lo que las latas pueden reventar en pocos das. Aspergillus repens es un moho que da lugar a la formacin de botones en la superficie de la leche condensada. Dentro de las bacterias no esporuladas destacan: - Pseudomonas fluorescens, que produce rancidez. - Streptococcus liquefaciens, que provoca la licuefacin de la gelatina del jamn enlatado. - S. faecicum y S. faecalis, son estreptococos fecales que producen olores y sabores anormales en jamones enlatados. El primero es de mayor inters debido a su mayor termorresistencia. - Las Enterobacteriaceae (coliformes, Aerobacter, Proteus sp., etc.) son responsables del abombamiento del jamn enlatado.

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MICROORGANISMOS EN PRODUCTOS CIDOS En la mayora de los casos se controlan fcilmente con un tratamiento trmico relativamente corto a una temperatura inferior a los 100 C. BACTERIAS ESPORULADAS Podemos encontrar bacterias anaerobias sacarolticas y otras responsables de la fermentacin simple. Dentro de las primeras destacan Clostridium pasteurianum, que produce la alteracin gaseosa de frutas y tomates enlatados y que no se desarrolla a pH inferior a 3,7, y C. butyricum, que afecta tambin a las frutas enlatadas. Bacillus coagulans es responsable de la fermentacin simple en el jugo de tomate enlatado, ocasionando adems sabores anormales. Es termfilo y se desarrolla aun pH de 4,2. B. macerans, produce alteraciones gaseosas en frutas enlatadas y unto a B. polymixa, en hortalizas y frutas enlatadas. BACTERIAS NO ESPORULADAS Son bacterias Gram positivas productoras de cido lctico (cocos y bacilos) y algunas son productoras de gas. Pueden desarrollarse con escasa tensin de oxgeno y son responsables de fermentaciones de vegetales. Se destruyen con tratamiento trmico a menos de 100 C. Lactobacillus brevis causa una vigorosa fermentacin en salsa capsup y productos similares y es formador de gas.

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Leuconostoc pleofructi produce la alteracin de los jugos de fruta, dando lugar a la formacin de una pelcula de limo en las soluciones de azcar (alteracin de productos de tomate). Leuconostoc mesenteroides da lugar a la alteracin gaseosa de la pia enlatada. LEVADURAS Presenta escasa resistencia al calor, por lo que no son frecuentes en enlatados sometidos a tratamiento trmico y s cuando el tratamiento es subtrmico o cuando se producen fugas. Son responsables de la fermentacin de salsas cidas, gelatinas y productos similares cuya conservacin depende de los cidos, el azcar y la sal. MOHOS Byssochlamys fulva es la especie de mohos de mayor importancia en los alimentos enlatados cidos. Afecta a frutas enlatadas y embotelladas. Es responsable de la desintegracin de la fruta por descomposicin del material pectnico. Las latas a veces se abomban debido al desprendimiento de dixido de carbono. Su temperatura ptima de crecimiento es de 30-37 C y resulta altamente resistente al calor. Byssochlamys nivea es semejante al anterior y es mucho ms frecuente enla alteracin de fresas enlatadas. Penicillium afecta a las grosellas enlatadas y es altamente termorresistente. Aspergillus tambin es termorresistente y se presenta en las fresas enlatadas.

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Rhizopus nigricans es responsable de la degradacin de las frutas enlatadas y especialmente del albaricoque. Rhizopus stolonifer ocasiona el ablandamiento de los albaricoques enlatados.

1.2

Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 1.2.1 Aislar microorganismos que se encuentran en alimentos sospechosos

PRACTICA

9:

Analizar

un

alimento

presuntamente

contaminado

con

microorganismos de acuerdo a la NOM- NOM-113-SSA1-1994 Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.

4
2.1

Anlisis microbiolgicos aplicados en los alimentos


Criterios de aprendizaje 2.1.1 Explicar los mtodos de anlisis microbiolgicos que se aplican a los alimentos en base a la composicin de estos ltimos

Como ya se discuti anteriormente, la composicin qumica y propiedades fisicoqumicas de los alimentos determinan el tipo de flora microbiana que se puede desarrollar. Algunos mtodos de anlisis autorizados se encuentran descritos en las siguientes Normas Oficiales Mexicanas y Normas Mexicanas:

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Prueba
Toma, manejo y transporte de muestras de alimentos

Norma y/o Mtodo de Referencia


NOM-109-SSA1-1994 Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.

NOM-092-SSA1-1994 Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa. NOM-113-SSA1-1994 Cuenta de microorganismos Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de coliformes totales en placa. microorganismos coliformes totales en placa. NOM-111-SSA1-1994 Cuenta de mohos y Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. levaduras en alimentos. Determinacin de bacterias NOM-112-SSA1-1994 coliformes. Bienes y servicios. Determinacin de bacterias Tcnica del Nmero Mas coliformes. Tcnica del Nmero Mas Probable. Probable. Mtodo para la NOM-115-SSA1-1994 determinacin de Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en Staphylococcus aureus en alimentos. alimentos. NOM-114-SSA1-1994. Mtodo para la determinacin de Salmonella Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Salmonella en alimentos. en alimentos. Cuenta de bacterias aerobias en placa. NOM-145-SSA1-1995 Determinacin de coliformes Productos crnicos troceados y curados. Productos crnicos curados y madurados. Disposiciones y fecales Escherichia coli por especificaciones sanitarias. Apndice normativo B. la tcnica de diluciones en De la estimacin de la densidad microbiana por la tubo mltiple. tcnica del nmero mas probable. B.2 Determinacin de coliformes fecales y Escherichia coli por la tcnica de diluciones en tubo mltiple. NMX-F-403-S-1981 Alimentos para humanos-microbiolgicos-cuenta de Bacillus mesentricos. Bacillus mesentericus o Bacillus subtilis (Esporas formadoras de hebra).

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2.2

Demostracin de habilidades como resultado del aprendizaje 2.2.1 Realizar anlisis microbiolgicos para diferentes muestras de alimentos. Coliformes totales, coliformes fecales, E. coli, Salmonella, Shigella, hongos, levaduras.

PRCTICA 10: Aplicar las Normas Oficiales Mexicanas o Normas Mexicanas para

determinar la presencia de Coliformes totales, coliformes fecales, Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., hongos y levaduras, a partir de muestras de alimentos presuntamente contaminados.

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VI REFERENCIAS
Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J. Biologa de los Microorganismos de Brock. Primera Edicin en espaol. Prentice Hall, Inc. 1998. Bourgeois, C. M., Mescle, J. F., Zucca, J. Microbiologa Alimentaria. Tomos 1 y 2. Editorial ACRIBIA, S.A. 1988. Adams, M. R. y Moss, M. O. Microbiologa de los Alimentos. Editorial ACRIBIA, S.A. 1995. Herson, A. C. y Hulland, E. D. Conservas Alimenticias. Editorial ACRIBIA, S.A. 1980. Mossel, D. A. A., y Moreno Garca, B. Micr Microbiologa de los Alimentos. Editorial ACRIBIA, S.A. 1985. http://www.bioinformacion.net/deterioro%20y%20conservacion%20de%20alimento s.txt http://www.geocities.com/grupoindustrialaisa (Grupo Industrial AISA) http://www.promase.com.mx/santec.htm (Sanitizantes y material de limpieza para la industria farmacutica cosmtica y de alimentos) http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema31.html#anchor305138 http://www.engormix.com/nuevo/prueba/areadeporcicultura1.asp?valor=276 http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/medios_100_intro.html http://canales.nortecastilla.es/canalagro/datos/conservas/microorganismos.htm

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