CROMATOGRAFADELQUIDOS CROMATOGRAFADELQUIDOS

PrincipalesComponentes
delCromatgrafo
Cromatografa de Lquidos
Un lquido (fase mvil) transporta los analitos a
travs de una columna empacada con fase
estacionaria.
HPLC: High Performance Liquid
Chromatography (Cromatografia de Lquidos de
AltaResolucin, CLAR)
Proviene de la cromatografa preparativa en
columna.
Mayor versatilidadqueGC.
Fasemvil yfaseestacionaria.
Afectanseparacin(interaccionesFM/FS/Analito).
Ampliadisponibilidad.
3
Compuestos analizables por HPLC
Caractersticas fisicoqumicas
No voltiles.
Solubles en fase mvil.
Termolbiles.
Aplicacin
Separacin de mezclas de compuestos qumicos.
Mxima separacin/menor tiempo posible con alta
sensibilidad.
Anlisis cualitativo y cuantitativo.
4
1. Recipientesdefasemvil.
2.Desgasificador.
3.Sistemadebombeo.
4.Sistemadeinyeccindelamuestra.
5.Termostato.
6.Columnacromatogrfica.
7.Detector.
8.Computadora(Sistemadecontrolyadquisicindedatos).
O
O
O
O
O
O
O
O
SistemaHPLC:ComponentesTpicos
Recipienteparacolectardesechos.
SistemaHPLC:Contenedoresdesolvente
5
Almacenan solvente para operacin continua del sistema.
Recipientes de vidrio acero inoxidable (1 L).
Filtros para eliminar polvo y partculas en suspensin.
Solventes para HPLC:
Purificados: IEC y RPLC.
Remocin de compuestos que absorben en regin UV.
Filtrados a travs de membrana: 0.45 m.
Solventes tpicos para RPLC:
Acetonitrilo (ACN MeCN).
Metanol (menos txico, barato, fcil disponibilidad).
Amortiguadores (mM): cidos y bases dbiles (analitos).
SistemaHPLC:Desgasificador
6
Gases ambientales (N
2
, O
2
, CO
2
, entre otros) disueltos en fase mvil:
Modifica compresibilidad.
Forman burbujas.
Acortan tiempo de vida de columna (O
2
)
Interfieren en sistemas de deteccin (O
2
detector electroqumico, UV)
Desgasificador: Evita formacin de burbujas.
Otras estrategias:
Sistema de bombeo por vaco.
Sistema de destilacin.
Dispositivos para calentar y agitar los disolventes.
Sistema de difusin: arrastra gases disueltos fuera de disolvente
mediante finas burbujas de gas inerte de baja solubilidad.
Forzan paso de fase mvil a travs de empaque de columna. Por lo tanto,
proveen flujo constante y continuo de FM a travs del sistema.
Presin de sistema depende:
Flujo y viscosidad de FM.
Tamao de partculas.
Tipo de bombas: binarias y cuaternarias.
Construccin: acero inoxidable (316), titanio, gata, zafiro, tefln, PEEK
(polethyleneethyketone).
Flujos que pueden alcanzar
1250 Lmin
1
100 Lmin
1
hasta 10 mLmin
1
> 10 mLmin
1
(cromatografa preparativa)
SistemaHPLC:Bombasparaelusin
TiposdeElusinenHPLC:
IsocrticaVs.Gradiente
9
ElusinIsocrtica
Laseparacinocurreutilizandounacomposicinconstantedefasemvil.
Ventajas
Desventajas
Instrumentacin sencilla (una
bomba).
No es necesario volver a equilibrar la
columna.
El ancho de pico incrementa con el
incremento del tiempo de
retencin.
Sensibilidad y LOD se reducen.
El incremento en el ancho de pico
limita el nmero de compuestos en
un cromatograma.
El ancho de pico limita el rango de
polaridad de los compuestos
eludos en un solo cromatograma.
AnilinasSustituidas
10
Elusincongradiente
La separacin ocurre por un continuo incremento de la fuerza del solvente en la FM.
Incremento en la fuerza del solvente = Incremento en el % de solvente orgnico en FM.
Incremento constante de
porcentaje de fase
orgnica por minuto.
11
Cuandoutilizarlaelusincongradiente?
1. Para separar muestras que tienen componentes que varan ampliamente
en polaridad.
12
2. Para separar mezclas de compuestos de bajo peso molecular que tienen
un gran numero de componentes.
13
3. Para separar compuestos de alto peso molecular (por ejemplo, pptidos
y protenas).
Se requiere elusin con gradiente para separar compuesto 1 (555 D) del
compuesto 2 (14000 D) .
14
Ventajas Desventajas
Pueden analizarse mezclas
complejas en un solo anlisis.
Reduce el tiempo de anlisis.
Todos los picos se eluyen con el
mismo ancho de banda.
Se pueden resolver a lnea base
mas picos por unidad de tiempo.
No hay cambio en sensibilidad y
LOD.
Instrumentacin mas cara.
Posible precipitacin en las
interfases.
Es necesario reequilibrar la
columna, lo cual aade mas tiempo
al anlisis.
Elusincongradiente
15
Manual
Dos posiciones
(1) de carga (jeringa)
(2) de inyeccin.
Bucles de muestra
Intercambiables.
Eleccin del volumen de muestra a inyectar.
Analtica: 1 l 5 ml.
Preparativa: 100 l 20 ml.
SistemaHPLC:Inyector
Automuestreador
Programacin de inyeccin de diferente volumen
de muestra.
Viales (1 4 ml) e insertos.
Introduccin de la mezcla de analitos hacia el caudal de la fase mvil .
SistemaHPLC:Termostato
16
Columnas trabajan tpicamente a temperatura ambiente.
Opcional !!
Hornos para control de T ambiente a 150C (dcimas de grado).
Columnas pueden colocarse en camisas con agua suministrada por un bao a
temperatura constante.
Ventajas de columna a T controlada:
Cintica rpida (mejor transferencia de masa).
Disminuye viscosidad de solvente (trabajo a
altos flujos).
Decrece adsorcin de analitos (mejora forma
de picos con cola).
25
o
C
35
o
C
45
o
C
SistemaHPLC:Computadora
17
Control de los parmetros del sistema HPLC.
Composicin de la fase mvil (Mezcla de solventes).
Temperatura (termostato).
Secuencia de inyeccin (automuestreador).
Monitoreo del desempeo del sistema.
Composicin de fase mvil.
Temperatura.
Presin.
Adquisicin de los datos del detector.
SistemaHPLC:Precolumna(guardacolumna)
Columna corta (0.4 1 cm) que se coloca entre inyector y columna analtica.
Incrementa tiempo de vida til de columna.
Elimina materia en suspensin y contaminantes en disolventes.
Debe reemplazarse frecuentemente.
Misma fase estacionaria que columna analtica.
Tamao de partcula de relleno (soporte pelicular) es mayor para evitar la cada de
presin.
Tomado de: http://www.phenomenex.com/cms400min/securityguard.aspx
SistemaHPLC:Columnacromatogrfica
Corazn de sistema cromatogrfico: Produce separacin de
analitos.
La fase mvil entra en contacto con la fase estacionaria
formando una interfase con gran superficie.
El xito o el fracaso de una separacin cromatogrfica
depende en gran medida de las propiedades de la columna:
Dimensiones.
Tamao de partcula de fase estacionaria.
Presin.
20
Tubodeaceroinoxidable,d.i.uniforme
Longitud:10 30cm
Sealarganacoplandodosoms
columnas
Dimetrointerno:2 5mm
Tamaosdepartcula:3,5y10m
4.6mm250mm,5m(40000 60000
platos/m)
TiposdeColumnasparaCromatografadeLquidos
Preparativas
Separacin/purificacin de una gran
cantidad de compuesto.
d. i. > 900 mm
Analticas
ColumnasparaCromatografadeLquidos
Materialdeempaque
Naturalezadelasuperficiedelapartcula.
Tamaodelapartcula.
Contenedor
Longitud
Dimetro
Material
,k
Resolucin
N
Tiempodevida
Eficiencia
Tiempodeanlisis
ColumnasCromatogrficas:Materialdeempaque
Tipo de relleno
Pelicular (precolumnas)
Partcula porosa (columnas analticas).
Caractersticas
Material inerte.
Elevada superficie por unidad de volumen.
Alta resistencia mecnica.
Baja resistencia al flujo de la fase mvil.
Soporte
Mantienelafaseestacionaria inmvilenlacolumna.
Materialesdeempaquetpicamente
utilizadosenlasfasesestacionarias
23
Composicin qumica Usadopara Desventajas
Slica,SiO
2
LSC,LLC,BPC(NPy RP), SEC,IEC SolubleapH 8
Actividadqumica
Alumina, Al
2
O
3
LSC,IEC Actividadqumica
Zirconia,ZrO
2
BPC(NPy RP),IEC
Estireno/divinilbenceno BPC,IEC
Polisacridos SEC,IEC Compresible
Otrospolmeros (hidroximetilestireno) SEC
Grafitoporoso
Slice tradicional Polmeroorgnico
Ventajas
Altaresistenciamecnica
Abundante
Relativamentebarata
Diferenteforma,tamaoy
gradodeporosidad.
Fcilenlacedegrupos
funcionalesasilanoles
Altaeficiencia,1.5<pH<7.5
AmpliointervalodepH(113)
Buenaresolucindecompuestos
bsicos
MuyusadosenIECySEC
Desventajas
IntervalodepHlimitado
(2>pH>8)
Problemasenresolucin
decompuestosbsicos(picos
asimtricos)
Bajaresistenciamecnica
Restringidoentrminosde
concentracindemodificador
orgnico.
ComparacindeDosTiposdeSoporte
25
Estructurasqumicadelsoportedesliceydel
polmeroorgnico
O
Si Si
Siloxano
OH
Si
Silanoles libres
HO
OH
Si
Silanoles geminales
HO OH
Si Si
Silanoles asociados
GruposFuncionales
enlaSuperficiedelaSlice
Estructuraquimicade
laresinaorgnica
poliestirenodivinilbenceno
26
Seobtieneporreaccinentrelosgrupossilanol yloscompuestosorganosilanos.
SoportedeSliceQumicamenteModificada
Eficacia de modificacin <<100%:
Grupos silanol libres en la superficie del
soporte.
Para minimizar la presencia de los grupos silanol
no deseados , despus de la reaccin de
modificacin, se lleva a cabo la desactivacin de
estos grupos.
En RPC, los grupos silanol libres en la superficie
de partculas de slice afecta al proceso de
separacin (sobre todo a compuestos bsicos).
Dos diferentes
tipos de sitios
de interaccin
Grupossilanol
desactivados
EstructurasdeAlgunasFases
EstacionariasUnidasalSoportedeSlice
O
N Si
R
R
C
C
C
H
H
H
H
H
H
H
H
ami no NH
2
H
H
C
O
C
Si
R
R
C
C
H
H
H
H
H
H
H
C
C
C
C H
H
H
H
H
H
H
H
Oct yl , C8
H
H
C
O
C
Si
R
R
C
C
H
H
H
H
H
H
H
C
C
C
H
H
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
H
H
H
H H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
ODS, C18
O
CH
3
Si
R
R
C
C
N
+
H
H
H
H
CH
3
H
3
C
Cl
-
O
- O
S Si
R
R
C
C
C
O
O
H
H
H
H
H
H
H
+
f uer t e i nt er c ambi ador de
ani ones, SAX
f uer t e i nt er cambi ador de
cat i ones, SCX
O
N Si
R
R
C
C
C
H
H
H
H
H
H
H
H
ami no NH
2
H
H
C
O
C
Si
R
R
C
C
H
H
H
H
H
H
H
C
C
C
C H
H
H
H
H
H
H
H
Oct yl , C8
H
H
C
O
C
Si
R
R
C
C
H
H
H
H
H
H
H
C
C
C
H
H
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
H
H
H
H H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
ODS, C18
O
CH
3
Si
R
R
C
C
N
+
H
H
H
H
CH
3
H
3
C
Cl
-
O
- O
S Si
R
R
C
C
C
O
O
H
H
H
H
H
H
H
+
f uer t e i nt er c ambi ador de
ani ones, SAX
f uer t e i nt er cambi ador de
cat i ones, SCX
28
ModificacinSuperficialdelaSlice:GruposFuncionales
Grupofuncional Estructura Tipodecromatografa
Alquil CH
3
,C
4
H
9
,C
8
H
17
,C
18
H
37
Reparto(faseinversa)
Fenil C
6
H
5
Reparto(faseinversa)
Ciano (CH
2
)
3
CN Reparto(faseinversaynormal)
Amino (CH
2
)
3
NH
2
Reparto(faseinversaynormal)
Intercambioinico(dbilintercambiador)
Diol (CH
2
)
3
OCH
2
CH(OH)CH
2
(OH)
Reparto(fasenormal)
Filtracinmolecular
Amida (CH
2
)
3
CONHCH
3
Filtracinmolecular
Acidosulfnico (CH
2
)
3
SO
3
H Intercambioinico(fuerteintercambiador)
Acidocarboxlico (CH
2
)
3
COOH Intercambioinico(dbilintercambiador)
Aminacuaternaria [(CH
2
)
3
N
+
(CH
3
)
3
]Cl

Intercambioinico(fuerteintercambiador)
Dimetilamina (CH
2
)
3
N(CH
3
)
2
Intercambioinico(dbilintercambiador)
Tamaodepartculadelacolumna
Determina el nmero de platos tericos por unidad de
longitud de la columna.
Pequeas partculas:
Altas eficiencias.
Incremento en presin !
Pequeas partculas en columnas cortas
disminuyen el tiempo de anlisis
aumentan eficiencia simultneamente.
29
Tamaodepartculavs.N
Tamaodepartculavs.
Resistenciaatransferenciademasa
Tamaodepartculavs.
Resistenciaatransferenciademasa
Columnas: Material de empaque
Partculas no porosas
Partculas nucleo-
coraza (core-shell)
Materiales monolticos
Slica
Polimricos
33
Adaptado de Supelco, Ascentis
DimetroInternodelaColumna
Afecta:
Capacidaddelacolumna.
Dilucindelabandacromatogrfica.
Flujodelafasemvil.
Amayordimetrointerno:
Mayorcapacidaddecolumnaymayorflujo.
Incrementadilucindepicos.
TpicosDI:25mm
34
35
DimetroInternodelaColumna
Afecta la sensibilidad.
La sensibilidad mejora debido a un menor factor de dilucin de la
muestra durante el proceso de separacin.
El aumento de sensibilidad, por uso de columnas de bajo
dimetro (12 mm), es recomendable cuando:
Se usan disolventes caros.
Hay limitado volumen de muestra.
La respuesta del detector depende de difusin (ej. detector
electroqumico).
LongituddeColumna
Afecta:
Eficiencia(N).
Velocidaddeseparacin.
Largascolumnas=
Largostiemposdeanlisis.
Mayoreficiencia(aumentaN).
Cortascolumnas:
separacionessimples.
Tpicaslongitudes:30a300
mm.
Soportarpresiones.
Qumicamenteresistente
afasemvil.
Aceroinoxidable316.
Vidrio,teflonypeek(HCl
protenas)
IEC:polmero.
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Materialdeelaboracin
Caractersticas de columnas
Tipo i.d. Longitud Dimetro de partculas
de empaque
Flujo tpico
Convencional, empacada 4.6 mm 3-25 cm 5 m 1 mL/min
Microbore, empacada 0.2-1 mm 10-10
3
cm 5 m 1-20L/min
OT, empacada 40-80 m 1-100 m 10-30 m 0.5-2 L/min
OT, no empacada 15-50m 1-100 m <1 L/min
39
SistemaHPLC:Detectorestpicos
E s p e c t r o s c p i c o
Absorcin UV/Vis
Longitud de onda fija
Longitud de onda variable
Arreglo de diodos (DAD PAD)
Fluorescencia
MS
E l c t r i c o
Amperomtrico
Conductividad electroltica
O t r o s
ndice de refraccin, RID
Detector de dispersin de luz, ELSD
40