ELISA

Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

Recordemos
Cuando un Ag y un Ac interaccionan in vitro PRIMERA ETAPA
INTERACCIN 1

SEGUNDA ETAPA
INTERACCIN 2

No visualizable

Fenmeno visible
Precipitacin Aglutinacin

Cmo podemos visualizar la PRIMERA ETAPA?

Ag o Ac se unen covalentemente a distintos marcadores

Trazador
radiactivo fluorescente enzimtico emisor de luz

Mtodo
RIA IF ELISA
Quimioluminiscencia Electroquimioluminiscencia

Los ELISA se basan en:

1. la elevada especificidad de los Ac; 2. la alta actividad de algunas enzimas usadas en este tipo de ensayos, lo que permite la amplificacin de la seal generada por la muestra.

Comprenden dos etapas generales:

1. la reaccin de un inmunorreactante con un Ag o Ac; 2. la deteccin de ese inmunorreactante mediante la utilizacin de un conjugado enzimtico.

SENSIBILIDAD
Es el cambio en la respuesta por cada cambio de la cantidad de reactante.

LMITE DE DETECCIN
Es la mnima cantidad de inmunorreactante que puede detectar el sistema.

Mtodo Precipitacin (medio gelosado) Precipitacin (medio lquido) Fijacin del complemento (100% de lisis) Fijacin del complemento (50% de lisis) Aglutinacin HAI IFI ELISA RlA

Anticuerpo [g/mL] 20 10 5 0,2 0,4 0,15 0,05 0,01 0,001

Sensibilidad relativa 1 2 4 100 50 133 400 2.000 20.000

Clasificacin de los EIA a. ElA homogneos; b. EIA heterogneos.

Heterogneos: Los ms utilizados. Diversos formatos: microplacas, partculas magnticas, membranas de nitrocelulosa. Implican un paso de separacin del Ag o Ac unido del no unido.

Homogneos: Mas utilizados en drogas de abuso y monitoreo de frmacos. Sin pasos de separacin, no se requiere la separacin del Ag o Ac unido del no unido.

Heterogneos Ventajas: Menos interferencias, ms especficos y sensibles. Instrumentacin menos costosa. Admiten mayor tamao de muestra, as disminuye el lmite de deteccin. Ms verstiles en cuanto a tipo de analito. Desventajas: Ms difciles de automatizar. Mayor tiempo de anlisis.

Homogneos Ventajas: Ms precisos. Al ser en general automatizados se llevan a cabo sin entrenamiento especial. Desventajas: Son ms costosos en reactivos. En general slo sirven para frmacos.

Los EIA heterogneos pueden clasificarse en dos tipos:

1. enzimoinmunoanlisis de amplificacin de actividad o no competitivos; 2. enzimoinmunoanlisis de modulacin de actividad o competitivos.

EIAs no competitivos
Se emplea un gran exceso del inmunorreactante con el objeto de obtener una seal mxima debida a la presencia del compuesto a ser dosado.

EIAs competitivos
Los enzimoinmunoanlisis competitivos (ya sea por inmovilizacin de Ac o por inmovilizacin de Ag) tienen por objeto la cuantificacin de Ag.

EIAs competitivos con Ac inmovilizado en fase slida

Ac + Ag + Ag-E Ac-Ag o Ac-Ag-E

Control: dosis cero de Ag libre Ac-Ag-E 100 % de seal

Anticuerpos

Dosis cero

[Ag libre]

EIAs competitivos con Ag inmovilizado en fase slida

Ag + Agmuestra + Ac-E Ag-Ac-E + Agmuestra

o Ag + Agmuestra-Ac-E

Ag + Agmuestra + Ac1

Ag-Ac1 + Agmuestra o Ag + Agmuestra-Ac1 Ag-Ac1-Ac2-E

Ag-Ac1 + Ac2-E

Etapas bsicas:
1. inmovilizacin del inmunorreactante (Ac o Ag) en la fase slida; 2. incubacin con la muestra de modo que sta reaccione con el inmunorreactante inmovilizado; 3. amplificacin o modulacin por medio de la utilizacin de un conjugado enzimtico.

Sistemas alternativos de reconocimiento:

1. Sistema Avidina-biotina 2. Protena A

Biotina

Enzimas ms utilizadas
Peroxidasa Fosfatasa alcalina Ureasa

Requisitos que deben reunir las enzimas

1. Deben ser estables durante su almacenamiento, ya sea libres o conjugadas. 2. Deben ser de fcil preparacin, obtenerse con elevada pureza y bajo costo. 3. La actividad enzimtica debe ser alta, ya sea como enzima libre o como enzima conjugada. 4. La actividad enzimtica debe ser fcilmente detectable.

Requisitos que deben reunir las enzimas

5. Deben ser compatibles con las condiciones del ensayo (pH, fuerza inica, composicin de los buffers, etc.). 6. Deben poseer grupos qumicos reactivos para la conjugacin. 7. Deben ser fcilmente conjugables a anticuerpos u otros sistemas de deteccin. 8. La enzima del conjugado no debe estar presente en el componente que se fijar a la fase slida.

Condiciones que deben reunir los sustratos o compuestos cromognicos

1. Deben ser solubles en agua, incoloros, inodoros y no txicos. 2. Deben ser estables al almacenamiento y luego de la detencin de la reaccin enzimtica. 3. No deben ser fotosensibles. 4. Debe haber un amplio rango de linealidad entre el color formado y la concentracin de enzima.

Requisitos de un buen conjugado

1. Debe tener una composicin definida y homognea. 2. Debe obtenerse sin prdida de la actividad enzimtica debido al proceso de conjugacin. 3. Debe ser altamente estable al almacenamiento por perodos prolongados. 4. Debe ser econmico, rpido y fcil de preparar.

Requisitos de un buen conjugado

5. El procedimiento de conjugacin debe conducir a un alto rendimiento en conjugado y un bajo rendimiento en homopolmeros de Ac y/o enzima. 6. El procedimiento de separacin del conjugado de las especies no marcadas (Ac y enzima) debe ser sencillo.

Preparacin de conjugados enzimticos

Conjugacin qumica Conjugacin inmunolgica

Conjugacin qumica
Se puede realizar en una o dos etapas. Tener en cuenta el pH del buffer. Agentes qumicos: Glutaraldehdo, peridoato de sodio, etc.. Etapa final: Separacin de la enzima y del Ac no conjugados.

Conjugacin inmunolgica
Es posible formar complejos inmunes enzimaanti-enzima: PAP, APAAP, etc.. Ello se logra mediante un puenteo entre el complejo inmune enzima-anti-enzima y la inmunoglobulina a revelar, por medio de Ac anti-inmunoglobulinas especie-especficos.

1. Inmovilizacin de inmunorreactantes en fase slida

Soportes slidos: agarosa, celulosa, dextrn, vidrio, nitrocelulosa, plsticos.

Superficies plsticas para ELISA

esferas, discos, tubos, placas (policubetas) de fondo plano, en U o en V.

1. Inmovilizacin de inmunorreactantes en fase slida

No covalente Hidrofbica

Carga inmunoreactante

Unin a la placa
Covalente

Glutaraldhedo: permite unin covalente de Ag con grupos aminos libres. Sustancias policationicas: permiten la unin covalente de ADN

Tiempo

ON, 4C

Factores importantes Temperatura 1 h., 37C [Inmunoreactante] 1-10 g/mL puros

10-100 g/mL mezclas

2. Bloquear los sitios libres

Se realiza para tapar los sitios de unin al plstico libres que persisten luego de la etapa de sensibilizacin. Se utilizan protenas ajenas al sistema diluidas en solucin salina (PBS)
Leche descremada 3% Suero de animales

3. Incubar con la muestra problema (suero)

Se diluyen las muestras en el lquido de bloqueo. Se incuba un tiempo determinado a 37C. Se lava con PBS Tween.

Lavados

Lavados
Se eliminan componentes libres o unidos de manera no especfica al inmunoreactante inmovilizado en la placa. Se utilizan soluciones salinas isotnicas (PBS) suplementadas con detergentes (Tween 20).

4. Incubacin con el conjugado enzimtico

Ac marcados con peroxidasa (tambin puede ser FA). Cantidad de conjugado diluido que se encuentre en exceso. Se incuba un tiempo determinado a 37C. Se lava con PBS Tween.

5. Revelado
Se agrega el sustrato de la enzima Se forma un cromgeno soluble y cuantificable por espectrofotometra. 2 DH + H2O2 2 H2O + 2 D

6. Frenar la reaccin con un cido o una base y leer DO

Enzimoinmunoensayos no competitivos con Ag inmovilizado en fase slida

Se pueden distinguir tres tipos de mtodos:

a) mtodos directos; b) mtodos indirectos; c) mtodos por puenteo. detectabilidad creciente

Los mtodos directos presentan la desventaja de que debe disponerse de un conjugado enzimtico para cada Ag que se desea detectar

Ag + Ac-E

Ag-Ac-E

Los mtodos indirectos consisten en la inmovilizacin de Ag, reaccin con Ac especficos y posterior revelado con un conjugado anti-Igs especie-especfico

Ag + Ac1 Ag-Ac1 + Ac2-E

Ag-Ac1 Ag-Ac1-Ac2-E

Sustrato
Cromgeno

Anticuerpo Secundario
a m i z En

Anticuerpo Primario

Antgeno

Los mtodos por puenteo emplean conjugados inmunolgicos (como es el caso de la peroxidasa-anti-peroxidasa o PAP), la reaccin entre biotina y avidina o lectinas
Ag + Ac1 Ag-Ac1 + Ac2 + PAP Ag-Ac1 Ag-Ac1-Ac2-PAP

Trypanosoma cruzi
Etapa aguda Parsito en sangre o IgM
Diagnstico parasitolgico directo: 1. Observacin microscpica en fresco 2. Gota gruesa 3. Mtodo de concentracin: MicroStrout 4. Xenodiagnstico 5. PCR

Etapa crnica

Mtodos inmunolgicos

Diagnstico parasitolgico indirecto: HAI ELISA IFI

Tests serolgicos para diagnstico de la infeccin por T. cruzi ms utilizados para el tamizaje serolgico Pruebas convencionales: Inmunofluorescencia indirecta (IFI) Hemaglutinacin indirecta (HAI) ELISA Ag lisado parasitario 1 Generacin Ag parcialmente purificados 2 Generacin Ag recombinantes 3 Generacin

HAI
Utilizada desde 1962 Deteccin de Ac IgG Bajo costo Lectura visual Subjetiva Valor de corte en el tamizaje: 1/32 Alto % de RFN

IFI
Utilizada desde 1966 Deteccin de Ac IgG e IgM Costo intermediario Lectura en microscpio de fluorescencia Visual / subjetiva Valor de corte en el tamizaje: 1/32 Alto % de RFP

ELISA
Utilizada desde 1972 Deteccin de Ac IgG Costo ms elevado que HAI y IFI Lectura en espectrofotmetro (DO) Lectura objetiva Valor de corte (cut-off) y zona gris Define sensibilidad y especificidad Gran nmero de kits comerciales Sensibilidad: 97,7 100% Especificidad: 93,3 100%

Reactivos provistos

CP

CN

Diluyente de Muestras Control Positivo Control Negativo Muestra

200 L 10 L

200 L 10 L -

200 L 10 L -

Incubar y lavar Luego agregar 1 gota del conjugado

Luego agregar en cada pocillo: 1 gota de Revelador A (H2O2 en buffer citrato), 1 gota de Revelador B (TMB: tetrametilbencidina en HCl). Mezclar durante 10. Incubar 30 a T ambiente y luego agregar: 1 gota de Stopper (H2SO4). Mezclar durante 10. Leer en espectrofotmetro a 450 nm o evaluar el resultado a simple vista por comparacin con los CP y N.

Clculo del valor de corte

Un elemento esencial en todo ELISA cuantitativo es establecer el valor de discriminacin entre una muestra positiva y una muestra negativa. Este valor se denomina valor de corte o cut-off.

Enzimoinmunoensayos no competitivos con Ac inmovilizado en fase slida ELISAs de captura o Sandwich

Es posible inmovilizar tanto Igs enteras como fragmentos F(ab) o F(ab)2 (Ac de captura) con el objeto de cuantificar Ag en diversas muestras

Ac1 + Ag Ac1-Ag + Ac2-E

Ac1-Ag Ac1-Ag-Ac2-E

Reactivos provistos

D Control Positivo Control Negativo Muestra 100 L

CP 100 L -

CN 100 L -

Incubar y lavar Luego agregar 100 L de conjugado

Luego agregar en cada pocillo: 1 gota de Revelador A (H2O2 en buffer citrato), 1 gota de Revelador B (TMB: tetrametilbencidina en HCl). Mezclar durante 10. Incubar 30 a T ambiente y luego agregar: 1 gota de Stopper (H2SO4). Mezclar durante 10. Leer en espectrofotmetro a 450 nm o evaluar el resultado a simple vista por comparacin con los CP y N.

HBV

Puenteo no inmunolgico

Test de Embarazo

Positivo
muestra con hCG se pega a AcMo Ac policlonales anti-hCG + hormona hCG de ratn anti-hCG-E en sustrato en la zona del test se la zona de reaccin unen a otros eptopes de la hCG AcMo de ratn anti-hCG-E que no se unieron se pegan a Ac antiratn + sustrato test control en la zona de control Unin del sustrato con la enzima y desarrollo de color

Dot-blot
El Dot-blot es un mtodo inmunoenzimtico en el que se inmoviliza un inmunorreactante en una fase slida compuesta por un papel. Los sustratos que se emplean generan un producto insoluble que se deposita sobre la nitrocelulosa en los sitios donde se localiza la actividad enzimtica.

Principio de la Prueba
Es un EIA y como todos los dems, consiste en dos componentes:

1. fase slida: peine plstico con 12 dientes sensibilizados en diferentes puntos con materiales reactivos y un control interno. 2. El conjugado y otros reactivos estn listos para ser usados dentro de la bandeja de desarrollo del ImmunoComb sellada con papel de aluminio.

 La prueba se realiza de manera rpida y fcil. Se depositan los especmenes en los pocillos de la primera lnea de la bandeja de desarrollo del ImmunoComb y se avanza el peine de lnea en lnea, incubando en cada paso. Los resultados se visualizan en minutos, apareciendo como puntos de color gris azul sobre la superficie de los dientes del peine.

ImmunoComb
Toxo IgG: Detecta Ac IgG anti-T. gondii en suero o plasma humano. Pueden persistir durante toda la vida. Toxo IgM: Detecta Ac IgM anti-T. gondii en suero o plasma humano. Indica infeccin aguda o reciente.

Toxo IgG

Peine

Validacin

Screening

Interpretacin semi-cuantitativa

HIV

HIV Ag/Ac ELISA 4 Generacin

Deteccin simultnea de anticuerpos antiVIH y antgeno p24. Aumenta la capacidad clnica de deteccin, reduciendo el perodo de ventana de 4-10 das, permitiendo la deteccin temprana de la infeccin del VIH.

HIV Ag/Ac ELISA 4 Generacin

Los pocillos de la policubeta estn recubiertos con PR y PS de HIV-1 y HIV-2 y AcMo anti-p24. La muestra se incuba en los pocillos y si la misma contiene p24 y/o Ac anti-HIV-1 o HIV-2 se unirn a los Ag y/o Ac del pocillo. El material no unido se remueve por lavado. En el paso siguiente se agrega el Conjugado 1 que contiene Ac y Ag marcados con biotina que se unirn a los Ag/Ac si estn presentes en la muestra.

HIV Ag/Ac ELISA 4 Generacin

Luego se agrega el Conjugado 2 (peroxidasaestreptavidina) que se unir al Conjugado 1. El conjugado no unido se remueve por lavado. A continuacin se agrega una solucin conteniendo TMB y H2O2. Las muestras reactivas desarrollan color azul que vira al amarillo cuando la reaccin se detiene con H2SO4 (Stopper).

Determine HIV-1/2
Inmunoanlisis cualitativo in vitro de lectura visual para deteccin de Ac VIH-1 y VIH-2 en suero, plasma o sangre total.

 Procedimiento Simple. Requiere de mnimo entrenamiento. No requiere de un equipo especial para llevar a cabo la prueba. La obtencin de la muestra puede ser por venopuncin o puncin digital. No requiere refrigeracin. Puede ser transportado y almacenado en diferentes condiciones ambientales (2-30C).

Procedimiento

Recoleccin de la muestra

Interpretacin de los resultados

Positivo Negativo Invlido

Clearview COMPLETE HIV 1 / 2

Recoleccin Proceso Anlisis, 3 pasos en 1. Sistema de coleccin de muestra, procesamiento y anlisis de la muestra de sangre total, suero o plasma, para la deteccin de anticuerpos VIH-1 y VIH-2

Resultados

Negativo

Positivo

Invlido

ELISPOT
Es una tcnica que permite detectar la frecuencia de clulas T productoras de una determinada citocina. La poblacin de clulas T es estimulada con un Ag especfico. Estas clulas son dejadas en reposo en pocillos de ELISA cuya superficie contiene adsorbido el Ac anti-citocina. Estas clulas son activadas a secretar la citocina, que es capturada por el Ac que se halla fijado a la placa. Se remueven las clulas. Un Ac secundario se aade a la placa revelando la localizacin donde existe citocina (lugar donde estuvo la clula). Finalmente se cuentan los spots = n de clulas productoras de la determinada citocina.

ELISPOT