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I.

INTRODUCCIN

En la actualidad, las mutaciones son de gran importancia para el estudio, ya que algunas de estas son empleadas en la medicina, con el desarrollo de medicamentos naturales y no sintticos, alimentaria, entre otros, lo que conlleva a la comercializacin. La biotecnologa moderna, ha generado tcnicas para inducir mutaciones, utilizndolas para producir cepas de microorganismos con mejores rendimientos o que orman productos nuevos, los que son econmicamente rentables. Las mutaciones son los cambios que se producen en secuencias de nucletidos de un gen, que puede dar como resultado la produccin de una protena mutante con una secuencia de aminocido alterada o puede a ectar el control de la sntesis del producto del gen. !i la protena mutante di iere uncionalmente de la orma sin mutar, puede ocasionar un cambio correspondiente en un carcter observable y producir un organismo mutante. La di erencia puede encontrarse en la actividad o estabilidad enzimtica, o puede a ectar la uncin de la protena como portador o como componente estructural de la clula. 1.1. Objetivos 1.1.1. Objetivo General "eterminar si la levadura #Sacharomyces cerviceae$ tiene la capacitada de mutar. 1.1.2. Objetivos Especficos %oner a resistencia las levaduras bajo radiacin in rarrojo. &ealizar siembras en agar 'edio 'nimo de "avis para analizar la presencia u ausencia de levaduras irradiadas. para la industria

II. 2.1. Ra&iaci'n Infrarroja

RE I!IN "I"#IOGR$%IC$

La radiacin in rarroja #(&$ es una radiacin electromagntica cuya longitud de onda comprende desde los )*+,)-+ nm, limitando con el color rojo en la zona visible del espectro, hasta los .+.+++ o ./.+++ nm #seg0n autores$, limitando con las microondas. !u descubrimiento se debe a 1 2erschel, quien en .-++ detect en el espectro de la radiacin solar un aumento importante de temperatura en la zona situada ms all del rojo, de la que no provena ninguna luz visible La 3omisin (nternacional de (luminacin o 3(E #del rancs4 3ommission (nternational 5clairage$ ha establecido tres bandas en el (&4 (&64 )-+,.,7++nm (&84 ..7++,9.+++ nm (&34 9.+++,.+.+++ nm !in embargo, a e ectos prcticos, seg0n los e ectos biolgicos, suelen dividirse en (& distales #entre los ./.+++ y ../++ nm$ e (& pro:imales #entre los ../++ y los )*+ nm$. 2.2. (ro&)cci'n &e ra&iaci'n infrarroja

Los emisores luminosos son lmparas especiales, constituidas por ilamentos de tungsteno #en ocasiones, de carbono$ dispuestos en una ampolla de cristal, que contiene un gas inerte a baja presin, con su re lector correspondiente para mejorar la direccionalidad del haz. Este ilamento se calienta hasta temperaturas de ..;++ 3 y emite gran cantidad de (& pro:imal #entre )*+ y ./++ nm$, adems de abundante luz visible. !u radiacin alcanza unos niveles de pro undidad entre / y .+ mm bajo la piel. 2.*. (ropie&a&es fsicas + efectos fisiol',icos &e la ra&iaci'n infrarroja

El 9+< de los (& pro:imales producidos por el sol o las lmparas de tungsteno alcanza el milmetro de pro undidad #en el caso de lmparas de ilamento de carbono, el ./<$, y slo el .,=< llega a un centmetro. 2.-. (ropie&a&es &e la l./para &e t)n,steno

Las regiones de mayor longitud de onda siempre predominan en las lmparas de tungsteno,halgeno. !in embargo, a medida que aumenta la temperatura del ilamento de una lmpara de tungsteno,halgeno, los turnos de emisin de luz per il de longitudes de onda para que la temperatura se acerca al punto de usin limitacin de tungsteno, la proporcin de longitudes de onda visible emitida por el aumento sustancial de la lmpara. 2.0. 1)taci'n a)2otr'fica >na mutacin que ocasiona la incapacidad de la bacteria para crecer en un medio mnimo, debido a la prdida de alg0n tipo de capacidad nutricional. 2.3. El ciclo vital &e la leva&)ra4

La levadura puede crecer como diploide #=n$ o como haploide #n$. #n?.* cromosomas presentes en la levadura$

%i,. 1 3iclo vital de la levadura

2.5.

%actores fsicos + 6)/icos 6)e afectan a los /icror,anis/os

a7 Te/perat)ra Es un actor undamental que act0a sobre los organismos vivos

aumentando, por un lado, la velocidad de las reacciones metablicas y el crecimiento@ y ms all de ciertos lmites, act0a inactivando protenas, 6"A, 6&A, etc. !eg0n ello e:iste para cada microorganismo una temperatura mnima por debajo de la cual no hay crecimiento, una temperatura ptima en la cual el crecimiento es m:imo, y una temperatura m:ima por encima de la cual no hay crecimiento posible.

%i, 2. E ecto de la temperatura en los microorganismos b7 $,)a + s) activi&a&4 La disponibilidad del agua es uno de los actores ms importantes que a ecta el crecimiento de los microorganismos en sus ambientes naturales, ya que sta constituye entre el -+ y ;+< de su peso. La disponibilidad no depende solamente del contenido de agua, sino que es uncin de la cantidad de solutos presentes en una solucin determinada y de la uerza con que est retenida en los distintos materiales slidos.

%i, *. "isponibilidad del agua en el suelo c7 p84 El grado de acidez o alcalinidad de una solucin es el p2, de inido como el menos logaritmo de la concentracin de 2B #p2 ? Clog D2BE$. 3ada organismo tiene un rango de p2 dentro del cual se puede desarrollar adecuadamente. Feneralmente los microorganismos crecen entre p2 que varan entre / y ;. Los hongos y levaduras crecen a p2 que varan entre / y *, y la mayora de las bacterias pre ieren p2 ) a levemente alcalino &7 Ra&iaci'n4 !e de ine como la transmisin de una uente de energa de un lugar a otro a travs del aire o espacio e:terior, incluyen ondas hertzianas #sin e ecto biolgico$, los rayos in rarrojos #producen calentamiento$, la luz visible #9-+ a )=+ nm de longitud de onda. Estas 0ltimas tienen importancia por el e ecto como uente energtica para los microrganismos otosintetizadores como las algas o como inductor a la reproduccin se:ual en los hongos.

%i, -. &elacin de la longitud de onda, recuencia y energa otonica 2.9. 1icroor,anis/os in&)striales4 La levadura mas utilizada en las ermentaciones industriales es

Saccharomyces cerevisiae sobre todo en la produccin de alcohol y en panadera@ esta levadura no degrada la lactosa. !on microhongos que se encuentran generalmente en orma de clulas 0nicas y que se reproducen mediante gemaciones. 6lgunas levaduras estn ormadas 0nicamente por clulas individuales y a veces cadenas cortas mientras que otras se encuentran con un cierto rango de orma celulares, incluyendo diversos tipos de ilamentos. En las levaduras, la envoltura celular incluye la membrana citoplasmtica, constituida por lquidos, protenas y mananos, el espacio periplasmico en la pared celular, que contiene unas protenas en gran cantidad de glucano y manano.

2.:.

Infl)encia &el /e&io en el creci/iento cel)lar4 Los microorganismos necesitan carbono, nitrgeno, minerales, a veces

actores de crecimientos, agua y #si son aerobios$ o:igeno para ormar su biomasa y como uente de energa para la biosntesis y mantenimiento celular. 6lgunos microorganismos crecen en un medio que no contienen actores de crecimiento, mientras que otros necesitan medios complejos que contienen nutrientes espec icos como aminocidos, vitaminas y nucletidos #G1EA, %. .;-;$ 2.1;. 1)taci'n a nivel &el DN$4 Las mutaciones pueden deberse a di erentes tipos de cambio en las secuencias de "A6, y estos se describen con trminos especializados. Estos trminos se e:plican a la luz de los diversos tipos de mutacin que se mencionan en seguida. 3onociendo el cdigo gentico y la estructura de las protenas puede ser posible predecir la gravedad de la alteracin de una protena por un cambio particular en el "A6. 2.1;.1. 1)taciones &e p)nto4

Las mutaciones de punto son resultados del cambio de una sola base en la secuencia de "A6. 'uestran una tendencia caracterstica a su rir una mutacin en retroceso, es decir, regresar al tipo salvaje. La terminacin prematura de una cadena de protenas por una mutacin sin sentido casi siempre dar como resultado la perdida de la uncin, pero los resultados de una mutacin con sentido alterado varan.

III.

1$TERI$#E! < 1=TODO!

*.1. Ubicaci'n &el e2peri/ento


El presente trabajo de investigacin se realiz en el laboratorio de 'icrobiologia de la >niversidad Aacional 6graria de la !elva, se encuentra ubicado en el distrito de &upa &upa, provincia de Leoncio %rado, regin 2unuco.

III.2.

1ateriales &e #aboratorio 'atraz 6za de siembra %orta objeto 6ceite de cedro &eactivo Jcristal violetaK 'icroscopio 6gar 'nimo de "avis #6'"$

/ envases plsticos transparentes Faza 6z0car rubia 6gua destilada Levadura comercial #&E" !H6&$ Flucosa Iaso de precipitado .- placas %etri III.*. 1eto&olo,a4

En un vaso precipitado de .Lt se disolvi . g. de levadura comercial en =/+ ml de agua destilada azucarada #ma:.=+ g de az0car$, dejar a temperatura ambiente por m:imo = horas. &ealizar prueba mor olgica #coloracin$. "e los =/+ ml de levadura reactivados tomar /+ml. #=/ ml$ y e:ponerlos a la luz in rarrojo por los siguientes perodos4 , =7 horas , 7- horas , )= horas , ;= horas >na porcin de la levadura reactivada dejar sin e:poner a la luz in rarroja #testigo$. "espus de los tiempos de e:posicin sembrar las levaduras en placas con 6gar 'nimo de "avis #6'"$ adicionadas con Flucosa en di erentes

concentraciones #+.=/ <, +./<, +.)/< y .< de glucosa$. (ncubar por =7 a )= horas #.,9 das$. Gbservar el desarrollo de las levaduras sobre el 6'" resaltando las caractersticas del crecimiento. &ealizar coloraciones para determinar la mor ologa.

IV. IV.2.

RE!U#T$DO!

E2posici'n &e la leva&)ra a la ra&iaci'n infrarrojo a 2- >oras4

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%i, 0. 'uestras de siembra a las =7 horas

3oloracin de Levaduras y observacin en microscopio4

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%i, 3. Gbservacin del testigo #derecha$ y la levadura e:puesta a la luz (& #izquierda$ a las =7 h.
4.1.

E2posici'n &e la leva&)ra a la l)? infrarrojo a -9 >oras.

12

%i, 5. 'uestras de siembra a las 7- horas

%i, 9. Gbservacin del testigo #derecha$ y la levadura e:puesta a la luz (& #izquierda$ a las 7- h.

13

%i,. :. 3urva de crecimiento de la levadura.


4.2.

E2posici'n &e la leva&)ra a la l)? infrarrojo a 52 >oras.

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%i, 1;. 'uestras de siembra a las )= horas.

%i, 11. Gbservacin de la levadura e:puesta a la luz (& a las )= h

4.3.

E2posici'n &e la leva&)ra a la l)? infrarrojo a :3 >oras.

15

%i, 12. 'uestras de siembra a las ;* horas

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%i, 1*. Gbservacin del testigo #derecha$ y la levadura e:puesta a la luz (& #izquierda$ a las ;* h.

C)a&ro 1.@ A0mero de colonias observadas en los cultivos con determinada e:posicin al (& #>L3$. 2-> T ;.20 ;.0 ;.50 1 + + + + + -9> .;;/ .+/+ .=++ ./99 ./*+ 52> , + + + + :3> + + + + +

C)a&ro 2. Aumero de colonias observadas en los cultivos con determinada e:posicin al >I #>L3$

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Porcentaje e !"ucosa #$% 0.25 24 Hor 48 Hor 72 Hor 96 Hor Presencia 1 UFC Ausencia 0 UFC Presencia Presencia 0.5 Ausencia 0 UFC Ausencia 0 UFC Presencia Presencia 0.75 Presencia 1 UFC Presencia 29 UFC Presencia Presencia 1 Ausencia 0 UFC Presencia 34 UFC Presencia Presencia &esti'o Ausencia 27 UFC Presencia 673 UFC Ausencia Presencia

C)a&ro *. Aumero de colonias observadas en los cultivos con determinada e:posicin al 3olchicina.
1UE!TR$ "espus de =7 h. "espus de 7- h. "espus de )= h. "espus de ;* h. Testi,o A1B7 Ao creci 3reci 3reci Ao creci ;.20 B Ao creci 3reci Ao creci Ao creci $,ar 1ni/o &e Davis ;.0 B ;.50 B Ao creci 3reci Ao creci Ao creci Ao creci 3reci Ao creci Ao creci 1B Ao creci 3reci Ao creci Ao creci

C)a&ro -. Aumero de colonias observadas en los cultivos con determinada e:posicin al (& #Frupo 7$
&() &I!* 8 52 0 3 0.25 0 103 0 0 0.5 0 193 0 0 0.75 0 220 0 0 1 189 155 0 0

24 + 48 + 72 + 96 +

V.

DI!CU!IN

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Los e ectos prcticos, seg0n los e ectos biolgicos, suelen dividirse en (& distales #entre los ./.+++ y ../++ nm$ e (& pro:imales #entre los ../++ y los )*+ nm$. Las regiones de mayor longitud de onda siempre predominan en las lmparas de tungsteno,halgeno. !in embargo los rayos in rarrojos de menor longitud de onda son los que ocasionan mutacin gentica, es por ello que en la e:posicin de4 =7 horas no hubo crecimiento de colonias de levadura sembradas en agar 'nimo de "avis. En 7- horas si hubo crecimiento esto seria por el tiempo de e:posicin. En las )= horas y ;* horas no hubo crecimiento de colonias de levaduras. Los microorganismos necesitan carbono nitrgeno minerales, a veces actores de crecimientos, agua y #si son aerobios$ o:igeno para ormar su biomasa y como uente de energa para la biosntesis y mantenimiento celular. 6lgunos microorganismos crecen en un medio que no contienen actores de crecimiento, mientras que otros necesitan medios complejos que contienen nutrientes espec icos como aminocidos, vitaminas y nucletidos #G1EA, %. .;-;$. En e ecto en la levadura se le adiciono glucosa con agua en un recipiente para su crecimiento e:puestas en luz in rarroja a distintos tiempos, luego se sembr en el medio de 'nimo de "avis para que pueda desarrollarse en di erentes concentraciones. 6l disminuir la concentracin de glucosa, las clulas atraviesan por el cambio diu:ico, un periodo breve de tiempo en el cual no hay divisin, y la clula cambia de un metabolismo ermentativo a uno respiratorio. En la ase postdiu:ica las clulas usan como uente de carbono el etanol producido durante la ase logartmica e incrementan su resistencia al estrs gradualmente@ en tanto que la ase estacionaria se presenta cuando los nutrientes del medio se han agotado y no hay divisin celular #6L6' =++7$. !in embargo en el tiempo de e:posicin a la radiacin (& en las =7 horas no hubo presencia de colonias de levadura, esto se debera a que las clulas pasaban el cambio diau:ico y no hubo divisin celular@ en las 7- horas hubo presencia

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de colonias en las distintas concentraciones sembradas este se debera a que las levaduras han mutado y consumidos los nutrientes del medio mnimo de "avis # ase logartmica$, en las )= y ;* horas no hubo presencia de colonias esto de debera a que las levaduras sembradas en agar mnimo de davis estaran en la ase estacionaria y han perdido la capacidad de asimilar nutrientes. Las mutaciones de punto son resultados del cambio de una sola base en la secuencia de "A6. 'uestran una tendencia caracterstica a su rir una mutacin en retroceso, es decir, regresar al tipo salvaje #G1EA, %. .;-;$. En consecuencia en la muestra de 7- horas se observo la presencia de colonias en el medio 'nimo de "avis en todas las concentraciones e:puestas a radiacin in rarroja. !eg0n las cuadro ., cuadro = y cuadro 9, de los resultados obtenidos tanto de (&, >I y de colchicina respectivamente se observo que en el (& se obtuvo menos crecimiento de colonias en los tiempos de e:posicin, por el contrario en la e:posicin al >I se obtuvo mas crecimiento de colonias sembradas en el agar mnimo de "avis. !eg0n la cuadro . #grupo *$ y la cuadro 7 #grupo 7$ los resultados observados son similares, teniendo como crecimiento de colonias de levadura en ambas en las 7- horas@ siendo una di erencia mnima en los testigos de =7horas y ;* horas.

I.

CONC#U!IN

20

!e determin que la levadura # Sacharomyces cerviceae$ tiene la capacidad de mutar ante la e:posicin a la radiacin in rarrojo y se observ que stas no mostraron resistencia, pero el tiempo ptimo para su crecimiento ue de 7- horas.

!e realizaron las siembras en agar 'edio 'nimo de "avis para el anlisis del crecimiento de levaduras, donde se observ la presencia 0nicamente en la muestra de e:posicin al (& a 7- horas, comprobndose que estos microorganismos su rieron una mutacin nutritiva, mientras que las dems muestras no presentaron alg0n crecimiento@ en las di erentes concentraciones a +.=/, +./, +.)/ y . habindose ormado .+/+, .=++,./99 y ./*+ respectivamente.

VII.

"I"#IOGR$%I$

8&E!32, 3. .;;*. Fentica 3lsica y 'olecular. (nstudtrias oragi o !.6. 'adrid EspaMa. //+ p.

21

36&&(LLG, L. =++9. 'icrobiologa 6grcola. 3aptulo = Iida y muerte de los 'icroorganismos NEmory >niversity. "erechos &eservados. LGL32,'6LLGL, O. =++7 La respuesta a estrs en la levadura !accharomyces cerevisiae. . Iol. 7*,.pp. =7 , 7* FEG&FE!, 3. .;;* .El 'undo de los 'icrobios. ':ico. " . 'icrobiologa de los 6limentos. Lactores que 6 ectan a la !upervivencia de los 'icroorganismos en los 6limentos. F&(LL(H2!, O. et al. #=++=$. Fentica. 'cFraP,2ill (nteramericana. 'EH68GL(!'G 863HE&(6AG. DEn lneaQ4

#http4RRbibliotecadigital.ilce.edu.m:RsitesRcienciaRvolumen.Rciencia=R79R htmlRsecS*.html, .- de 'ayo =+..$ G1EA, %. .;-; 8(GHE3AGLGF(6 "E L6 LE&'EAH63(GA, Editorial 6cribia Edicin EspaMola Taragoza.=*)p. !'(H2, 3. y 1GG", E. .;;-. 8iologa molecular y biotecnologa. 6ddison, 1esley (beroamericana !.6. 8ilbao, EspaMa. =7) pg. 1E!H&ELL, H. =++.. 'icrobiologa de alimentos. Editorial Taragoza. 9 er Edicin EspaMola. /== p

III.

$NECO!

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%i,)ra 1-.@ 'uestra de cultivo de Saccharomyces cereviceae, para e:posicin de (& a =7 horas.

%i,)ra 10.E:posicin de las muestras de levadura a la luz (n rarroja.