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EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD DE LACASAS Y PROTEASAS DE Pleurotus ostreatus PRODUCIDAS POR FERMENTACIN SLIDA Y LQUIDA.

Tllez-Tllez M1,2, Fernndez-Perrino FJ2, Montiel-Gonzlez AM1, Snchez C1, Daz-Godnez G1*.
Laboratorio de Biotecnologa, CICB, Universidad Autnoma de Tlaxcala. Tlaxcala, Tlax. C.P. 90062, Tel/Fax: +52 248 48 15482. *E-mail: diazgdo@hotmail.com. 2Laboratorio de Ingeniera Gentica y Metabolismo Secundario de la Universidad Autnoma Metropolitana-I Mxico
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Aproximadamente el 90% de enzimas que se producen industrialmente es por fermentacin lquida (FML) debido principalmente a las ventajas de manejo, sin embargo la fermentacin slida (FMS) ha mostrado algunas ventajas en relacin a la FML. Las lacasas (-difenol: oxgeno oxido-reductasas E.C. 1.10.3.2) son enzimas ampliamente distribuidas en plantas superiores, bacterias, algunos insectos y hongos. Los hongos del gnero Pleurotus (de pudricin blanca) han mostrado ser buenos productores de lacasas por FML, sin embargo existen pocos estudios en FMS. Por otro lado, en general las proteasas resultan ser enzimas indeseables ya que son la principal causa de destruccin de la actividad de inters. Por lo que en esta investigacin se evalu la actividad de lacasas y proteasas de Pleurotus ostreatus (NRRL 3526) en FML y FMS utilizando la espuma de poliuretano (PUF) como soporte inerte. La FMS se desarroll a 25 C en matraces Erlenmenyer de 125 ml con 1g de cubos de PUF de 0.5 cm por lado (17 Kg/m2), impregnados con 30 ml de medio de cultivo (glucosa 10 g/L, extracto de levadura 5g/L, elementos traza 1.6 g/L y CuSO4 0.25 g/L). La FML se realiz en matraces Erlenmeyer (125 mL) conteniendo 50 mL de medio de cultivo (antes mencionado) con agitacin orbital de 120 rpm, cada matraz de ambas fermentaciones fue inoculado con tres fragmentos de micelio de 4 mm de dimetro tomados de la periferia de la colonia desarrollada sobre agar papa-dextrosa por 7 das a 25 C. Se tomaron muestras cada 24 h y el extracto enzimtico fue obtenido en la FMS por prensado de la PUF con una jeringa y filtrado a travs de papel Wathman No. 1 y en la FML se separ la biomasa por filtracin. La biomasa fue determinada por diferencia de peso seco. La actividad de lacasas se evalu utilizando 2-6 dimetoxifenol como sustrato (Tllez-Tllez y col. 2005), la actividad de proteasas se evalu utilizando casena como sustrato (Kunitz, 1947). La biomasa mxima obtenida por FML fue 1.5 veces mayor que la obtenida por FMS (8.6 y 5.6 g/L respectivamente, Figura 1), sin embargo, la velocidad especifica de crecimiento () fue 2.5 veces mayor en la FMS que en la FML (0.05 y 0.02 h-1 respectivamente). La actividad de lacasas fue baja en ambos sistemas (aprox. 2 U/mL al final de las fermentaciones, Figura 2). Con respecto a la actividad de proteasas solo se detectaron en la FMS (Figura 3), lo cual es contrario a lo que otros autores han reportado para la produccin de enzimas relacionadas con la obtencin de fuente de carbono por ambos sistemas de fermentacin. Se ha reportado que esta cepa presenta una elevada productividad a nivel de planta piloto (Snchez y Viniegra-Gonsalz 1996), sin embargo no present elevados niveles de actividad de lacasas como ocurre en otras cepas de esta misma especie (Tllez-Tllez y cols. 2008). Esto sugiere que los extractos enzimticos obtenidos por FML son ms estables que los obtenidos por FMS ya que no presentaron actividad de proteasas.

Bibliografa
Kunitz M. 1947. Crystalline soy bean trypsin inhibitor. General properties. J Gen Physiol 30: 291 M. Tllez-Tllez, FJ Fernndez-Perrino, AM Montiel-Gonzlez, Snchez C y G. DazGodnez. 2008. Growth and laccase production by Pleurotus ostreatus in submerged and solid-state fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology (ID: AMB-0816503.R1) Snchez C. y Viniegra-Gonzles G. 1996. Detection of highly productive strains of Pleurotus ostreatus by their tolerance to 2-deoxy-D-glucose in starch-based media. Mycological Research. 100: 455-461. M. Tllez-Tllez., C. Snchez, O. Loera y G. Daz-Godnez. 2005. Differential patterns of constitutive intracellular laccases of the vegetative phase for Pleurotus species. Biotechnology Letters 27(18):1391-1394
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Biomasa (g/L)

6 5 4 3 2 1 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Tiempo (h)

Figura1. Cintica de crecimiento de Pleurotus ostreatus en FML () y FMS ()


3.5 3

Actividad (U/mL)

2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Tiempo (h)

Figura 2. Actividad de lacasas de Pleurotus ostreatus obtenida por FML () y FMS ()


0.09 0.08

Actividad (U/mL)

0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Tiempo (horas)

Figura 3. Actividad de proteasas de Pleurotus ostreatus obtenida por FML () y FMS ()