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Extraccin de DNA Genmico

Obtener pellet de cultivo microbiano en medio lquido slido. Si es cultivo lquido pipetear 1.5mL en un tubo eppendorf y centrifugar 5min a 10000rpm. Eliminar el sobrenadante evitando perturbar el pellet del fondo del tubo. Congelar con hielo seco/acetona y descongelar a 37C (3 veces). Adicionar 100L de lisozima (40mg/mL lisozima, 40mM TrisCl pH: 8), 20L de TE (100mM TrisCl pH: 8, EDTA 10mM), 24L de Tritn 10% y 56L de agua estril, mezclar en vortex completamente y golpear en una superficie rgida para desprender el pellet. Incubar a 65C por 30 minutos. Mezclar por inversin cada 10 minutos. Adicionar 367L de TE, 30L de SDS al 10% y 3L de proteinasa K (20mg/mL proteinasa K, 50mM Tris pH: 8, 1.5mM de acetato de calcio), mezclar completamente empleando vortex e incubar 2 horas a 37C. Mezclar por inversin cada 10 minutos. Adicionar 6L de RNAsa, mezclar por inversin e incubar 30 minutos a 37C (cambiar punta entre cada tubo). Adicionar 100L de NaCl 5M y mezclar completamente en vortex. Adicionar 80L de CTAB/NaCl (10% CTAB, 0.7M NaCl) y mezclar completamente usando vortex e incubar 10 minutos a 65C. Adicionar 700L de cloroformo/alcohol isoamlico mezclar completamente en vortex y centrifugar 5 minutos a 10000rpm. Transferir el sobrenadante a un nuevo (DNA se encuentra disuelto en este fase) procurando no perturbar la interfase blanca. Adicionar 700L de fenol/cloroformo/alcohol isoamlico mezclar completamente usando vortex y centrifugar 5 minutos a 10000rpm. Transferir el sobrenadante a un nuevo (DNA se encuentra disuelto en este fase) procurando no perturbar la interfase blanca (repetir 2 veces). Adicionar 420L de isopropanol para precipitar el DNA (Si existe gran cantidad de DNA, ser posible visualizarlo a simple vista), mezclar por inversin. Centrifugar 5 minutos a 14000rpm para obtener un pellet de DNA. Eliminar todo el alcohol, empleando micropipeta de 100L evitando succionar el pellet de DNA. Adicionar 10L de Acetato de Sodio (3M, pH 5.2) y mezclar completamente usando vortex por inversin. Adicionar 250L de Etanol 100% mantenido a -20C. Mezclar en vortex y color el tubo en hielo seco por lo menos 5 minutos descongelar. Centrifugar 5 minutos a 14000rpm y cuidadosamente eliminar todo el alcohol. Adicionar 1mL de Etanol al 70%, mezclar por inversin y centrifugar 5 minutos a 14000rpm. Cuidadosamente eliminar el Etanol y dejar evaporar completamente. Adicionar 50L de TE. Almacenar a -20C.

Electroforesis de DNA
Preparar un gel con 20mL de agua destilada adicionando 400L de TAE 50X (Concentracin final 1X); as como: mg de Agarosa 100 200 400 % en solucin 0.5 1 2 Tipo de DNA DNA genmico 16S rpoB

Calentar por un minuto empleando microondas (o el tiempo necesario para disolver bien la agarosa) y dejar enfriar a 55C aproximadamente (esperar 5 min), vaciar el gel en la cmara de electroforesis y esperar a que gelifique. Llenar la cmara de electroforesis con TAE 1X. Los peines de 8 pozos tiene capacidad de 10L y los de 15 de 5L. Adicionar 1L de buffer de carga a cada muestra (1X), mezclar con 2L de muestra y completar volumen con TAE 1X. Correr los geles a 100V por 30min. Teir con solucin de Bromuro de Etidio (0.5g/mL) por 5 min y desteir por 3min con agua. Observar empleando luz UV (Transiluminador UV).

Preparar buffer TAE 1X: TAE 50X 5mL 10mL 20mL Aforo 250mL 500mL 1000mL

Preparar buffer de carga (azul) de acuerdo a las proporciones siguientes: Reactivo Ficoll 400 (20%) EDTA de Sodio 0.1M, pH: 8 SDS (1%) Azul de Bromofenol (0.25%) Xilencialnol (0.25%) Agua Preparar Bromuro de Etidio como sigue: Tomar 10L de solucin de Bromuro de Etidio (10mg/mL) y adicionar 190L de agua 0.5 mg/mL Tomar 100L de solucin de Bromuro de Etidio (0.5mg/mL) y adicionar 100mL de agua 0.5 g/mL Cantidad 2g 2mL (0.5M) 100mg 25mg 25mg Aforar a 10ml

10X

Polymerase Chain Reaction (PCR)


Los oligonucletidos (primers) se deben hidratar en una proporcin 1/100. Diluir los oligonucletidos (primers) 1/10 para emplearlos en la PCR. Master Mix Primer 1 Primer 2 DNA H2O 12.5L 1L 1L 3L (puede variar) 7.5L (puede variar) 25L

Las condiciones de reaccin para el gen rDNA16S son: Etapa Temperatura (C) Tiempo (minutos) Desnaturalizacin inicial 95 15 Desnaturalizacin 94 1 Alineamiento 57 1 Extensin 72 1 Extensin final 72 10 4 Ciclos

35

Primers: 27F 1492R

5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3

Las condiciones de reaccin para el gen rpoB son: Etapa Temperatura (C) 94 94 40 72 Tiempo (minutos) 3 1 1.5 2 Ciclos Temperatura (C) 94 50 72 72 4 Tiempo (minutos) 1 1.5 2 10 Ciclos

Desnaturalizacin inicial Desnaturalizacin Alineamiento Extensin Extensin final

10

25

Primers: rpoB 1698f 5-AACATCGGTTTGATCAAC-3 rpoB B2041r 5-CGTTGCATGTTGGTACCCAT-3 rpoB B2041rR 5-CGCCCCCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCGTTGCATGTTGGTACCCAT-3

Purificacin de productos de PCR


Recortar la banda deseada de gel a purificar (aproximadamente 200mg en peso, para un banda de pozo doble a partir de un peine de 8 pozos). Adicionar 600L de buffer QG. Incubar a 50C por 10min, mezclar cada 2 3 min. Verificar que el color de la solucin sea amarillo. Adicionar 1 volumen de isopropanol / 1 volumen de gel, adicionar 200L. Transferir el lquido a la columna de QIAquick en dos partes. Centrifugar por 1min a 14000rpm. Adicionar 500L de buffer QG y centrifugar 1min a 14000rpm. Adicionar 750L de buffer PE, dejar reposar 5min. Centrifugar 1min a 14000rpm. Centrifugar 1min a 14000rpm. Colocar la columna en un tubo nuevo de 1.5mL. Adicionar 40L de buffer EB y dejar reposar 2 min. Centrifugar 1min a 14000rpm.

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)


Reactivo TAE 50X (1X) Poliacrilamida 40% (37.5:1) Formamida Urea Glicerol Agua 0% 40% 80% 100% 2mL 2mL 2mL 2mL 20mL 20mL 20mL 20mL 0mL 16mL 32mL 40mL (40% v/v) 0g 16.8g 33.6g 42g (7M) 2mL 2mL 2mL 2mL 76mL ~40mL ~20mL 100mL 100mL 100mL 100mL

Poliacrilamida 40% (37.5:1): Pesar 38.96g de acrilamida y 1.04g de bis-acrilamida y aforar a 100mL. TAE 50X (1L): Tris EDTA cido actico pH: 8.3 APS 1%: Pesar 100mg de APS y disolver en 900l de agua. Para gelificar el gel adicionar 65L de APS y 6.5L de TEMED por cada 10mL de solucin, para gelificar en 10min aproximadamente. Los geles de la cmara Ettan Dalt Six tiene capacidad de 80mL aproximadamente. Almacenar soluciones en refrigeracin. Reusar buffer TAE 1X fasta cuatro veces. 242g 18.612g 57.1mL 60mL 40mM 1mM 20mM