Está en la página 1de 50

Deteccin de microorganismos patgenos en los alimentos

Prof. Dr. Luis M. Medina

ANLISIS MICROBIOLGICOS EN ALIMENTOS Indicadores recuento total (BAM) enterobactericeas totales coliformes totales E. coli mohos y levaduras Patgenos Salmonella Campylobacter E. coli O157:H7 Listeria Toxina estafiloccica

Otros E. coli ? Cronobacter Protozoos y virus

2008

Aproximadamente 1500 millones de ensayos microbiolgicos 58% corresponde a la industria alimentaria 49% alimentos 9% bebidas

20% deteccin de patgenos Salmonella y E. coli O157:H7

80% anlisis rutinarios (recuento total, coliformes, mohos y levaduras)

2008

Aproximadamente 1500 millones de ensayos microbiolgicos 58% corresponde a la industria alimentaria 49% alimentos 9% bebidas

30% Amrica del Norte 30% Europa 30% Resto del mundo (creciendo)

MTODOS CONVENCIONALES Ventajas sensibilidad la facilidad de interpretacin bajo costo

Inconvenientes demora en la obtencin de datos grandes cantidades de medios de cultivo laboriosidad

EXPECTATIVAS DE LOS MTODOS ALTERNATIVOS Ventajas rapidez procesar elevado nmero de muestras / tiempo en general, facilidad de uso lmites de deteccin bajos precisin (sensibilidad y especificidad)

Inconvenientes inversin inicial (equipamientos) en general, no excluye la etapa de enriquecimiento a veces, necesidad de confirmacin a veces, difcil traduccin cuantitativa de resultados

Factores de eleccin de una tcnica


Precisin necesaria Nivel de resolucin Facilidad de uso Tiempo de obtencin de resultados Aceptabilidad / Validacin Coste analtico Amortizacin de la inversin Disponibilidad de espacios (en ocasiones) Soporte y mantenimiento tcnico Versatilidad / Evolucin

Factores necesariamente exigibles

Fiable Significativa

Econmicamente aceptable

Clasificacin segn tiempo empleado

Mtodos rpidos

Mtodos muy rpidos

Automatizacin de mtodos convencionales

Clasificacin segn tiempo empleado

Mtodos rpidos
Permiten obtener resultados en 6-12 horas Actan amplificando los efectos del crecimiento activo de los microorganismos

Clasificacin segn tiempo empleado

Mtodos muy rpidos


Permiten obtener resultados incluso en menos de una hora

Clasificacin segn tiempo empleado

Automatizacin de mtodos convencionales


Reducir el gasto de material Aumentan el nmero de muestras a analizar Sin embargo no disminuye el tiempo necesario para completar cada ensayo El principal factor de eleccin ser el nmero habitual de muestras a procesar

Las tcnicas de anlisis microbiolgico de alimentos se basarn en


Tcnicas de enumeracin directa y de recuento de clulas viables Tcnicas de medicin de biomasa Sistemas miniaturizados y kits de diagnstico Mtodos inmunolgicos Mtodos genticos

Automatizacin de procesos y rutinas laboratoriales

Mtodos de enumeracin directa


CITOMETRIA DE FLUJO - Marcador Fluorassure (sustrato enzimtico no fluorescente) fluorescencia del citoplasma celular de clulas viables - Citmetro de flujo capta la fluorescencia

Mtodos de enumeracin directa


TURBIDIMETRIA Las clulas refractan la luz incidente

Mtodos de enumeracin directa


EPIFLUORESCENCIA (DEFT) microscopio de epifluorescencia - No necesario tiempo de incubacin - Filtrado de muestra (concentracin bacteriana) - Tincin con FLUOROCROMO Microscopio Epifluorescencia - Recuento directo de las bacterias - Alta exactitud - Leche (glbulos de grasa/Tripsina)

Mtodos inmunolgicos

- Visualizacin de la interaccin entre un Ag y su correspondiente Ac - No enriquecimiento previo de microorganismos - ELISA (ELISA SANDWICH): Ac inmovilizado sobre matriz solida captura al Ag Un 2 Ac marcado con una enzima reconoce un eptopo del Ac captura color al reaccionar 2 Ac con el complejo Ag-Ac (ELISA DIRECTO) - Alta sensibilidad, rapidez y bajo coste por anlisis - Disminuyen el tiempo de anlisis Minutos a horas Nmero elevado de muestras - Poco instrumental necesario

Mtodos inmunolgicos

- Automatizacin de ELISA para: Salmonella E. coli O157:H7 Listeria monocytogenes Campylobacter spp. Toxina estafiloccica Tecnologa ELFA Enzyme-Linked Fluorescent Assay

Mtodos inmunolgicos
Mtodo muy rpido

TECNOLOGA ELFA Enzyme-Linked Fluorescent Assay

Sistema VIDAS

Mtodos inmunolgicos

A veces, separacin inmunomagntica (SIM) previa a ELISA

Mtodos inmunolgicos

Kits que combinan inmunoensayo

- Extraccin del Ag flagelar de listeria - Lnea inmovilizada de Ac lnea azul

Mtodos genticos - Se dirigen a la deteccin de caractersticas celulares mucho ms estables contenida en los cidos nucleicos - Hibridacin (existen tcnicas de hibridacin con ARN ribosmico)

Mtodos genticos - Se dirigen a la deteccin de caractersticas celulares mucho ms estables contenida en los cidos nucleicos PCR

(amplificando microorganismos diana)

el

ADN

de

los

Se han desarrollado tcnicas alternativas para detectar los productos de amplificacin

RIBOTIPADO
El Ribotipado es un mtodo que permite identificar y clasificar bacterias en funcin de los genes del RNA ribosomal. Los genes del rRNA se encuentran dentro de las regiones mejor conservadas del genoma bacteriano. Existen varias copias de genes para el rRNA en cada clula y su nmero y localizacin especfica en el cromosoma varan segn las especies.

RIBOTIPADO
RIBOPRINTER

El sistema determina la huella gentica de un microorganismo y la compara con los marcadores genticos almacenados de los diferentes microorganismos de inters

RIBOTIPADO

- Suministra marcadores genticos de multitud de bacterias de una manera automtica, de esta forma caracteriza genticamente microorganismos. - Herramienta ideal para transferir rpidamente informacin microbiana de determinadas fuente de contaminacin - Suministra una identificacin taxonmica de bacterias patgenas de gran inters - Caracteriza e identifica rpidamente la contaminacin microbiolgica - Incluso puede utilizarse para caracterizar los cultivos iniciadores u otros microorganismos beneficiosos

PCR MLTIPLE ADIAFOOD kits PCR


- Un solo protocolo de amplificacin de PCR para todos los patgenos aplicables - Anlisis simultneo de dichos patgenos - Resultados en menos de 24 horas (11-21 horas) - Listeria sp., Listeria monocytogenes, Salmonella, E. coli O157, E. coli O157:H7, Campylobacter y Staphylococcus aureus - Poca manipulacin: el termociclador controla la extraccin de ADN y la amplificacin PCR y el anlisis de los resultados - Enriquecimiento: 18 horas. Extraccin: <30 minutos. Deteccin: 2 horas

SISTEMA BAX QUALICON

Sistema BAX basado en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Ventajas: Plazo de obtencin de resultados muy reducido Posibilidad de estandarizacin de anlisis Secuencias genticas altamente conservadas (elevada especificidad) Flexibilidad para el desarrollo de nuevos mtodos Lmites de deteccin/cuantificacin bajo Deteccin de microorganismos viables no cultivables Incluyen control positivo interno que permite evaluar presencia de inhibidores de la reaccin en las muestras
Existen Mtodos Oficiales que incluyen la tcnica del Sistema BAX de Listeria monocytogenes y de Salmonella. Estas tcnicas figuran respectivamente en los documentos USDA-FSIS n MLG 8A.03 y USDA-FSIS n MLG 4C.02.

SISTEMA BAX QUALICON


Tecnologa PCR mltiple

- rapidez: preparacin de muestras ms 4 horas - sensibilidad: principales patgenos - flexibilidad de uso (refrigerar muestras) - facilidad de uso: 96 muestras a la vez 200/da

SISTEMA BAX
para deteccin de Listeria Primer ensayo de PCR de transcriptasa inversa aplicado a Microbiologa de los Alimentos
- rapidez: 8 horas - sensibilidad: todas las especies de Listeria - flexibilidad de uso (refrigerar muestras) - facilidad de uso: menor manipulacin

Mtodo muy rpido

BIOLUMINISCENCIA

- Recuento sobre membranas de filtracin - Membranas incubadas se libera el ATP y acta complejo luciferina / luciferasa

BIOLUMINISCENCIA

Ventajas
Rapidez en obtencin de los resultados: hasta en 11 segundos Fcil manejo: equipos porttiles Tcnica sencilla Resultados estimulantes Posibilidad de medidas correctoras Elevada Sensibilidad: Deteccin de muy bajos niveles de ATP

BIOLUMINISCENCIA

Desventajas
Fungible de costo elevado Resultados no extrapolables a ufc/g o ml No especifica tipo de microorganismo Interferencias por ATP no microbiano Interferencias por detergentes y desinfectantes

Medicin de actividad metablica


REDUCCIN DE COLORANTES: modificacin del color MICROCALORIMETRIA: cantidad de calor debida al catabolismo microbiano RADIOMETRIA: CO2 en el metabolismo IMPEDANCIA: Resistencia al flujo de una corriente elctrica (BACTOMETER y MALTHUS) - Metabolismo microbiano Altera la composicin qumica de los medios de cultivo Variacin en la impedancia del medio - Reduce de 2 a 15 veces el tiempo de anlisis IDENTIFICACIN RAPIDA AUTOMATIZADA

Mtodo rpido

MEDICION DE LA IMPEDANCIA

IDENTIFICACION RAPIDA AUTOMATIZADA

SISTEMA API

VITEK ANALYZER

IDENTIFICACION RAPIDA AUTOMATIZADA

Compuesto por: - Mdulos de cultivo que facilitan la inoculacin en pocos minutos - Sustratos bioqumicos y alto rango de identificacin y susceptibilidad - Un incubador/lector simultneo que incuba y lee los mdulos de cultivos inoculados, de alta capacidad. E. coli en 2-4 h - Un ordenador que almacena, procesa e interpreta los resultados

IDENTIFICACION RAPIDA AUTOMATIZADA BIOLOG


Detecta la capacidad de los microorganismos para usar 95 fuentes de carbono. Los 295 (4x1028) patrones metablicos posibles permiten, adems de la identificacin, el establecimiento de relaciones filogenticas entre distintos aislados

Automatizacin de mtodos

SISTEMA ESPIRAL DE SIEMBRA


- Dispensador: deposita de forma continua un volumen decreciente de muestra en la superficie de una placa de agar - Intervalo amplio de recuento en una sola placa - Se eliminan las diluciones seriadas (menos material) - Siembra automtica

Automatizacin de mtodos

DILUIDOR GRAVIMETRICO

- Se coloca la muestra en la bolsa de Stomacher - El diluidor aade la cantidad necesaria de diluyente hasta conseguir la dilucin deseada - Aumenta el nmero de muestras a analizar

Automatizacin de mtodos

ANALIZADOR DE IMAGEN
- Contador de colonias por anlisis de imagen - Ordenador analiza la poblacin de la placa caractersticas pticas de las colonias - Alta reproducibilidad - Automatizacin del recuento - No diferencia entre diferentes tipos de colonias dentro de una misma placa

SCAN 300

Automatizacin de mtodos

PETRIFILM

Automatizacin de mtodos

METODO ISOGRID
- Mtodo de filtracin - Malla hidrofbica colocada en un medio de cultivo e incubada

MEDIOS CROMOGENICOS
Medio selectivo Coliformes y Escherichia coli 2 Sustratos: - -glucuronidasa + - -galactosidasa +

Perspectivas de futuro segn Fung (1995) y contrastadas en 2007

El recuento de clulas viables se mantendr en 25 aos (+) El control de higiene tendr lugar in situ (+) La PCR, el ribotipado y los tests genticos sern una realidad en los laboratorios (+) Los tests inmunolgicos, y ELISA en particular, estarn totalmente automatizados y ampliamente empleados (+) La tecnologa de varillas proveer respuestas rpidas (+)

Perspectivas de futuro segn Fung (1995) y contrastadas en 2007

Se usarn biosensores para los programas APPCC (?) Biochips, microchips y la nanotecnologa avanzar muchsimo en este campo (+) El aislamiento y concentracin efectivas de clulas objetivo ayudarn a las identificaciones rpidas (+) Un sistema de alerta microbiolgica estar en los alimentos y envases (?) Los consumidores dispondrn de kits de alerta rpida por patgenos en casa (?)

Perspectivas de futuro
Hoy, la mayora de ls tcnicas rpidas se dirigen a detectar bacterias Identificacin rpida de virus y parsitos implicados en los alimentos Uso de biosensores y microchips en la industria alimentaria Envases inteligentes que alerten a los consumidores

Muchas gracias

Prof. Dr. Luis M. Medina