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MICOLOGA CLNICA

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

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Transporte

X
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EXAMEN DIRECTO

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Diagnstico
Examen directo SS KOH 10 30 % KOH 10% + DMSO (60/4) KOH: 2 gotas + muestra: mezcla sobre porta Varios pases a la llama (Con DMSO no) Entre porta y cubre 30 Examinar al microscopio (100 400 aumentos, poca luz
y el condensador bajo)
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Ex. directo

Clamidosporas y pseudomicelio

Micelio y cl. escamosas

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Observacin microcpica
La mayora de las hifas son hialinas (incoloras), aunque algunas, especialmente las de los hongos dematiceos, pueden ser obscuras.

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Tipo de reproduccin

Conidios

Clamidosporas

Reproduccin asexual
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La observacin de la reproduccin asexual se puede efectuar a partir una colonia micelial ya desarrollada por: Visualizacin de un fragmento de medio de cultivo con micelio fngico, que observaremos entre porta y cubre con la adicin de una gota de azul de lactofenol. Visualizacin de un fragmento de micelio adherido a cinta adhesiva transparente. Es el procedimiento ms rpido. Se observa tambin con adicin de una gota de azul de lactofenol. Microcultivo. Consiste en la observacin de un micelio fngico en cultivo directamente al microscopio, siendo necesario que ste se desarrolle en un solo plano.
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MICROCULTIVO Bloque de agar

En portaobjetos

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MICROCULTIVO Bloque de agar

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Colonias
La observacin macroscpica de la colonia premite comprobar: el aspecto superficial (algodonoso, pulverulento, aterciopelado, lanoso, etc.) el borde la elevacin de la colonia (plana o elevada en el centro) la pigmentacin durante el crecimiento de la colonia la pigmentacin difundida al medio y observable en el reverso de la colonia la existencia de pliegues.

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Colonias

Es importante recordar: el MC empleado (las caractersticas se refieren a ADS en general) la T de crecimiento el tpo de crecimiento

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Criterios morfolgicos: Clulas


Se observa el tipo de micelio (septado o no, espiral, estndar) Si son esporas asexuales externas o internas (esporangiosporas) El tipo de conidio si existen (blastosporas, clamidosporas, etc.) El tipo de conidio si existen (micro o macroconidio) El tipo de macroconidio si existen (septado o no) Su implantacin en el micelio (talosporas o no)

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Criterios morfolgicos: Tubos germinales

Slo C. albicans es capaz de producir verdaderos tubos germinales; sin embargo, otras especies pueden producir pseudohifas. 1 Emulsionar una porcin de la colonia aislada en 0,5 ml de suero humano o conejo. 2 Incubar a 35 C durante 2 h. 3 Depositar una gota de la emulsin entre porta y cubre y visualizar a x100 y x400.

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Criterios bioqumicos
Prueba de la ureasa

Se recomiendan el caldo urea de Christensen por ser ms sensible en la deteccin de esta actividad.

Auxanogama
(Levaduras especialmente) Medios con peptonas

Para estudiar la asimilacin de HC debe utilizarse un medio exento de azcares, en el que no podra crecer el hongo, ya que todos los microorganismos necesitan una fuente de carbono. La presencia en el medio de, por ejemplo, un disco impregnado con un determinado hidrato de carbono permitir el desarrollo del h. solo si es capaz de utilizar dicho azcar como fuente de carbono.

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Diagnstico
Tincines Azul de lactofenol Gram Calcofluor

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Diagnstico
Tincin Azul de lactofenol

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Los hongos son GRAM

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Observacin microcpica

tincin

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Diagnstico
Tincin Gram

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Diagnstico
Tincin: Calcofluor

KOH
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Calcofluor + KOH
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Diagnstico
Tincin tisular PAS Gomory Gomory - Grocott

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Diagnstico
Ticin tisular: PAS (Periodic Acid - Schiff)

El ac. perydico prepara al reativo de Shiff (una fucsina) que tie los ncleos de azul y los hongos de prpura. La hematoxilina, similar al Azul de Metileno. Tie el fondo.

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Diagnstico
Ticin tisular: Gomory

Hongos pardo oscuro a negro. Fondo verde-azulado

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Diagnstico
Ticin tisular: Gomory-Grocott. (Variacin de la anterior)

Hongos pardo oscuro a negro. Fondo azulado. Resalta ms especficamente la PC de hongos.

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Diagnstico
Tincin (LCR y sangre) Tinta china Tinta china + KOH 10% Cpsula

Levadura

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Cultivo

Miceliar
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Diagnstico
Los MC se incuban en aerobiosis a 25-30C para micosis superficiales y oportunistas y 37C para infecciones sistmicas. Los h. levaduriformes dan lugar en 24-48 horas a colonias de aspecto similar a las bacterianas. Los h. filamentosos son de aspecto variable, crecen lentamente, pero sus colonias son caractersticas. Los MC para h. necesitan una fuente de N (peptonas) y de C (HC).
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Cultivo
La temperatura ptima de crecimiento de la mayora de los hongos patgenos es 30 C . Hay laboratorios que utilizan la temperatura ambiente en lugar de 30C, pero no es recomendable, ya que los cambios de temperatura son notables. La temperatura de 37 C no se recomienda por : 1 Las muestras contienen abundantes bacterias que crecen a esta T

2 Algunos hongos crecen mal a esta temperatura o no crecen,especialmente los hongos que infectan la piel. La temperatura de 37 C debe reservarse para h. dimrficos o algn hongo que se desarrolle mejor a esta temperatura y en patologa sistmica. La estufa ha de estar humedecida, con un recipiente con agua.
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Cultivo
Los medios ms empleados en Micologa pueden agruparse en dos categoras en funcin de su utilidad: aislamiento e identificacin. Los cultivos de hongos deben incubarse durante 3-4 semanas antes de ser desechados. Sin embargo, hay muestras que se pueden eliminar a los 7 das de forma habitual: Orina y exudados de mucosas. Para la identificacin, puede ser necesario un nmero mayor de medios que depender del nmero de muestras, las etiologas ms probables en la zona geogrfica, las posibilidades del laboratorio y el nivel diagnstico esperable segn el tipo de centro. Como norma general, todos los medios deben utilizarse antes de la fecha de caducidad indicada por el fabricante y, antes de su utilizacin, deben atemperarse durante unos minutos.
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Diagnstico
Cultivo
HC pH 6 Antibiotico o/y antifngicos

Sabouraud (Mycosel)
Frmula en g/l de agua destilada Peptona: Glucosa: Actidiona: Cloranfenicol: Agar: 15 g. pH: 6-6.3 10 g. 20 g. 0,5 g. (Inhibe h. Saprfitos) 0,5 g. (Inhibe bacterias)

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Agar Sabouraud
Las levaduras (Candida, Cryptococcus, Malasezia, dermatofitos, ...) crecen bien en agar sangre, agar chocolate, Cled, etc., pero el agar Sabouraud es el medio de aislamiento por excelencia.

Candida AS ADS

Paracocidioides
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Paracoccidiomicosis

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Agar Sabouraud
En ADS las colonias de levaduras son algo abombadas, lisas o rugosas. Si se observa un micelio areo definido: hongo dimrfico (Blastomyces, Histoplasma, coccidioides) levaduras que forman micelio (no hifas) verdadero (Geotrichum o Trichosporon) Una colonia de consistencia mucoide: formacin de cpsulas (Cryptococcus)

Colonias mucosas en ADS Cryptococcus en SS Gram

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Agar Sabouraud
Tb los h. filamentosos crecen bien en MC habituales pero en agar Sabouraud las colonias son tpicas. Se cultivan a 25 C

Trichophyton

Sporotix

Cladosporium

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Agar Sabouraud
H. filamentosos en agar Sabouraud. Colonias son tpicas.

Dematiceos

Cladosporium

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Medio de Czapek
Para aislamiento y cultivo de Aspergillus y Penicillium

sacarosa nitrato sdico sulfato de magnesio ClK sulfato de Fe fosfato dipotsico Agar

30 g 3g 0.5 g 0.5 g 0.01 g 1g 13 g

Aspergillus

Conidiophores

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Medio de Dixon o Leeming (ricos en grasas) aislamiento y cultivo de Malassezia furfur


Extracto de malta Peptona Agar Bilis Tween 40 Glycerol Ac. Oleico 18 g 18 g 7.25 g 10 g 5 ml 2.5 ml 2 ml

Malassezia
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Tincin con a.de lactofenol


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BHIA (Brain Heart Infusin Agar) aislamiento y cultivo de h.dimrficos


agar infusin de cerebro corazn 52 g sangre de carnero 50 ml gentamicina 0.65 ml cloramfenicol 250 mg agua destilada 1000 ml

macro y microconidios

Histoplasma
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Detalle
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Cornmeal Agar (Agar harina de maz) identificacin.


(Almidn, minerales, vitaminas)
agar harina de maz agua destilada

8.5 g 500 ml

macro y microconidios

Trichophyton

Macro y microconidias. Hifas espirales


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CGB (Canavanina glicina bromotimol azul)


Identificacin de Cryptococcus.
Glicina KH2PO4 MgSO4 Ciamina L-canavanina Agua destilada 10 g 1g 1g 1 mg 30 mg 100ml

Otros criptococos
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C. neoformans
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Medios cromognicos

(Medios de cultivo de hongos en los cuales se ha incluido substratos cromognicos que permiten detectar actividades enzimticas: Cambia el color del medio o de la colonia) Para levaduras generalmente.

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Otros medios de cultivo


Extracto de malta (Agar lquido o slido) (Glucosa +
Glucosa) Para cultivo e identificacin de levaduras.

Agar papa dextrosa (Almidn) (Amilosa y amilopectina: Cadenas de glucosa)


Propsito general. Estimula la formacin de conidios.

Arroz (Lquido en viales, triurado o entero.


Almidn)
Estimula la esporulacin de los dermatofitos.

Agar de semillas de alpiste (Agar de Staib)


Para diferenciar Cryptococcus (nico que metaboliza el alpiste).

Agar inhibidor de hongos (Con cloranfenicol, pero sin


actidiona)
Para h. sensibles a la cicloheximida ( Cryptococcus, zigomicetos, etc.) a partir de muestras contaminadas.
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Otros medios de cultivo


La incorporacin de cicloheximida (actidiona), inhibidor de h. contaminantes, ayuda en las micosis de la piel, aunque puede inhibir patgenos fngicos importantes; por ello, debe utilizarse siempre en combinacin con otro medio sin cicloheximida.

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Cultivo

Miceliar

Candida
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Levaduriforme
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Medios de cultivo bsicos

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Pruebas de identificacin

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Pruebas de identificacin

Tubos germinales

Fermentacin

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Agar urea (Contiene glucosa, urea e indicador)


Prueba de la ureasa

A: - despus de 7 dias
B: + antes de 7 dias C: Control no inoculado

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Auxanogama (Levaduras especialmente)


Medios con peptonas

Para estudiar la asimilacin de HC debe utilizarse un medio exento de azcares, en el que no podra crecer el hongo, ya que todos los microorganismos necesitan una fuente de carbono. La presencia en el medio de, por ejemplo, un disco impregnado con un determinado hidrato de carbono permitir el desarrollo del h. solo si es capaz de utilizar dicho azcar como fuente de carbono.
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Pruebas con antifngicos

En placa En pocillos: El medio contiene un indicador de oxido-reduccin que cambia su color de azul (ausencia de crecimiento) a rosa (crecimiento). Fungitest

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Serologa

microtitulacin

Aglutinacin

precipitacin
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ATB

inhibe poco el crecimiento

no inhibe el crecimiento inhibe el crecimiento

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ANTIFUNGICOS

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ANTIFNGICOS

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ANTIFNGICOS

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