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MICOLOGIA

CARACTERÍSTICAS GENERALES

El término hongo procede del latín fungus. Estos seres han sido considerados tradicionalmente más próximos a las plantas que a otros seres vivos debido a su similitud en la composición química y estructura ultramicroscópica, aunque en la actualidad son grupos que se estudian por separado. Los hongos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, abundando en el suelo, vegetación, en la materia existente en el agua y en general en cualquier ambiente húmedo. Son en su mayoría muy beneficiosos para el hombre, ya que se encargan de destruir la materia orgánica compleja degradándola a formas químicas simples que pasan a formar parte del suelo, donde finalmente son absorbidas por otras generaciones de plantas, encargándose en gran medida de la fertilidad de la tierra. Gracias a los hongos también se pueden obtener ciertos alimentos como los quesos, yogures, pan, bebidas alcohólicas, como la cerveza, vino, etc., así como la producción de ciertos antibióticos, vitaminas, ácido cítrico, etc. Desde un punto de vista clínico, el grupo de hongos más importante para el hombre va a corresponder a aquellos que crecen como parásitos en éste produciendo infecciones, fundamentalmente de tipo superficial o cutáneo, llamadas micosis superficiales y más excepcionalmente de forma sistémica como micosis profundas. La ciencia que estudia en general los hongos, se denomina Micología.

GENERALIDADES Y CARACTERÍSTICAS DE LOS HONGOS

Los hongos son seres vivos cuya estructura celular es de tipo eucariota (eu = verdadero, cario = núcleo), lo que les va a diferenciar de todas las bacterias que son procariotas (pro = primitivo, cario = núcleo). Los hongos son heterótrofos, es decir, necesitan materia orgánica como nutriente. Se pueden comportar como saprófitos; en estos casos su alimento es materia orgánica generalmente muerta, procedente de animales y plantas. Existen otras especies que se pueden comportar como parásitas; en estos casos su alimento procede de huéspedes vivos a los que parásita. En general, los hongos se encuentran en la naturaleza formando hifas, que es la forma vegetativa del moho (hiphe = caña). En estos casos, el hongo es pluricelular y al conjunto de hifas se le denomina micelio. También puede encontrarse en forma de levadura; en estos casos, es una única célula esférica. Se reproducen de manera natural por medio de esporas aunque existen excepciones. Estas esporas se originan de forma sexual o asexual según especies. No tienen clorofila y poseen pared celular que contiene quitina y en ocasiones celulosa. Muchos hongos presentan dimorfismo como característica, es decir, pueden existir en la naturaleza en forma de levadura o en forma de moho.

CRECIMIENTO

Como

unicelularmente (levadura).

se

ha

explicado,

los

hongos

pueden

crecer

en

la

naturaleza

pluricelular-(micelio)

y/o

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Cuando crece pluricelularmente se suelen llamar mohos u hongos pluricelulares. Aquí se forman estructuras libres, las hifas, que crecen formando un conjunto de ramificaciones entrelazadas llamadas micelios. Dichas hifas crecerán por elongación de sus extremos y por producción de ramas laterales (crecimiento apical). Este micelio puede ser a su vez aéreo si el crecimiento del hongo es hacia la superficie y si contiene esporas o células reproductoras se denominará micelio reproductor. Si el crecimiento del micelio se realiza hacia el interior de un medio en busca de nutrientes se denominará micelio vegetativo. En general los micelios, sean del tipo que sean, suelen crecer en líquidos o sólidos húmedos. Las colonias que forman en su crecimiento son irregulares, algodonosas, filamentosas y secas y, en ciertas ocasiones, pueden estar necrosadas por falta de nutrientes y/u oxigeno. Las hifas que forman un micelio pueden estar divididas por paredes transversales llamadas septos (septum = tabique); de ahí el concepto de pluricelular, aunque en algunas ocasiones tal tabicación no existe. Si el crecimiento es unicelular nos encontramos con las levaduras, que corresponden a células eucariotas esféricas u ovales con un diámetro de 3 a 5 micras aproximadamente. Su reproducción es generalmente por gemación y crecen en cualquier caso de forma más lenta que la mayor parte de las bacterias, aunque existen excepciones. Poseen una pared celular rígida que recubre la parte externa de la membrana citoplasmática y la estructura fundamental de ésta es igual en todos los hongos, está formada por polímeros de hexosas y hexosaminas y en muchos casos presenta quitina (N-acetil-glucosamina).

METABOLISMO

Los hongos son organismos heterótrofos, constituyendo el suelo su hábitat natural. En su mayoría son aerobios, donde el oxígeno actúa como aceptor final de hidrogeniones. También existen en la naturaleza algunas especies anaerobias facultativas y otras que obtienen su energía de procesos fermentativos al crecer en medios mínimos donde utilizan el nitrógeno en forma de nitratos, nitritos, etc. Otras especies pueden utilizar cualquier fuente de carbono, que es siempre un factor limitante para su desarrollo. La fuente de carbono más utilizada en su metabolismo suele ser la glucosa u otros componentes más complejos como el almidón o la celulosa. También pueden necesitar en pequeñas cantidades hierro, zinc, cobre, magnesio, fósforo, potasio, etc. Su metabolismo suele desarrollarse a temperaturas que pueden oscilar entre los 0 y los 60 ºC aunque la temperatura óptima de crecimiento se sitúa en torno a los 22-30 ºC. Suelen crecer mejor a concentraciones de acidez relativamente elevadas, aunque pueden encontrarse excepcionalmente en algunos medios alcalinos. El pH óptimo para casi todas las especies se suele situar en torno a 5,5. Necesitan humedad para su desarrollo y pueden obtener agua de la atmósfera y del medio, aunque muchos mohos pueden sobrevivir en ambientes muy deshidratados debido a la presencia de esporas.

REPRODUCCIÓN

Los hongos pueden reproducirse por medio de ciclos sexuales o asexuales, así como por procesos parasexuales. La estructura responsable de cada uno de estos ciclos es la espora y según las características de su formación hablamos de reproducción sexual o asexual.

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Reproducción asexual Consiste en el crecimiento vegetativo de un micelio, produciéndose división nuclear sin verdadera, división celular; no hay formación de gametos y no hay fusión nuclear. Se conocen 3 tipos:

esporulación por germinación de esporas, gemación y fragmentación de hifas.

de esporas, gemación y fragmentación de hifas. Micelio Levaduras Conidióforo Esporulación por

Micelio

de esporas, gemación y fragmentación de hifas. Micelio Levaduras Conidióforo Esporulación por germinación de

Levaduras

gemación y fragmentación de hifas. Micelio Levaduras Conidióforo Esporulación por germinación de esporas. La

Conidióforo

Esporulación por germinación de esporas. La estructura del hongo que produce las esporas asexuales se denomina conidióforo. Estos conidiófo- ros no son más que hifas especializadas situadas en las zonas apicales de éstas y con gran diversificación en cuanto a forma, color, tamaño, tipo de septación, etc. Tales estructuras especializadas tienen especial importancia para la determinación taxonómica de cada hongo. Las esporas que allí se forman se denominan genéricamente conidios. Existen algunos géneros que forman más de un tipo de conidios o conidias en un mismo talo o hifa. Unas serán más pequeñas o microconidias y otras más grandes, generalmente pluricelulares, llamadas macroconidias. Las microconidias suelen ser esféricas, ovales, piriformes, etc., y las macroconidias suelen ser alargadas y resultan de la tabicación transversal de dos o más células. Una vez producidas estas conidias, dichas esporas germinan cuando llegan a un medio adecuado, aumentando de tamaño y dando lugar a uno o más tubos germinales, que se prolongan para formar hifas que originan al crecer y entrelazarse el micelio, dando lugar a una nueva colonia.

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Además de este tipo de esporas, existen otros tipos con diferentes denominaciones, tales como:

talosporas, llamadas así por formar parte de la hifa vegetativa artrosporas u oídios, que corresponden a células cilíndricas formadas por fragmentación de las hifas y conidios. blastosporas, que son yemas mas o menos alargadas y que se originan por la gemación de una levadura o pseudo-hifa, son, por ejemplo típicas en la especie Candida albicans Clamidosporas que son esporas redondeadas formadas por una pared gruesa que se ha originado a partir de hifas laterares o terminales. Esporangiosporas, que son esporas que se forman en el interior de unas estructuras que presenten forma de saco (esporangio), situadas en extremos de las hifas o ramas especiales.

Gemación. El principal mecanismo de reproducción asexual en las levaduras es la gemación y consiste en la formación de una gema o yema en cualquier lugar de la célula madre, creciendo hacia fuera y aumentando de tamaño a partir de la célula madre. El núcleo de la célula madre se divide y uno de los núcleos resultantes pasará a la célula o yema hija; después de esto, ambas terminan separándose.

o yema hija; después de esto, ambas terminan separándose. Fragmentación de las hifas. Consiste en fragmentar

Fragmentación de las hifas. Consiste en fragmentar parte de una colonia e implantar este fragmento en otro nuevo medio. Se ha observado que este método de reproducción origina un nuevo micelio. Este mecanismo es el utilizado para el cultivo de hongos en laboratorio.

Reproducción sexual Consiste en la reproducción de esporas previa fusión de dos núcleos haploides sexualmente compatibles. Este proceso se efectúa de la siguiente forma:

Un núcleo haploide de una célula donante (el macho) penetra en el citoplasma de la célula receptora (la hembra). Esta fase se denomina fase de plasmogamia. Ambos núcleos, cuando se encuentran y fusionan, forman un nuevo núcleo cigoto diploide (fase de cariogamia). Este cigoto, por meiosis, origina 4 núcleos haploides (fase de reproducción cromatínica).

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Las esporas sexuales se reproducen con menor frecuencia y en menor cantidad que las asexuales y existen distintos tipos que corresponden a:

las asexuales y existen distintos tipos que corresponden a: ∑ Cigosporas. Son esporas sexuales con cuerpo
las asexuales y existen distintos tipos que corresponden a: ∑ Cigosporas. Son esporas sexuales con cuerpo
las asexuales y existen distintos tipos que corresponden a: ∑ Cigosporas. Son esporas sexuales con cuerpo
las asexuales y existen distintos tipos que corresponden a: ∑ Cigosporas. Son esporas sexuales con cuerpo

Cigosporas. Son esporas sexuales con

cuerpo grande, pared gruesa, formadas por la fusión de los contenidos de dos hifas que se juntan.

Ascosporas. Son esporas sexuales

originadas por fusión de dos hifas y posterior

fecundación, originándose este proceso en un saco conocido como asca. Cada asca suele contener un total de 8 esporas.

Oosporas. Son esporas formadas por

la fusión de 2 gametos dentro de una estructura específica denominada oogonio.

Basidiosporas. Son esporas sexuales

que se forman generalmente de 4 en 4 en la pared terminal de una estructura en forma de clavo llamada basidio. Surgen por la unión de 2 núcleos de una hifa. A este tipo corresponde la formación de las setas.

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CLASIFICACION

Los hongos se reproducen por esporas, que son estructuras unicelulares de resistencia que contienen toda la información genética necesaria para el desarrollo completo de un nuevo hongo. Los tipos de esporas, su tamaño y el modo de esporulación son las características principales para clasificar e identificar a los hongos. Las esporas pueden reproducirse de forma asexual (por simple diferenciación del micelio) o de forma sexual (por fusión de dos núcleos haploides con formación de un zigoto sexual). Los hongos forman el reino Fungi. Todos los hongos que producen enfermedades en el hombre son hongos verdaderos o Eumycetes. Los hongos que poseen reproducción sexual (estado teleomorfo) se denominan hongos perfectos. Los hongos imperfectos son los que no poseen reproducción sexual o bien se desconoce (estado anamorfo). Las especies patógenas para el hombre se engloban en cuatro clases:

Zygomycetes Ascomycetes Basidiomycetes Deuteromycetes La forma de reproducción sexual mediante zigosporas, ascosporas y basidiosporas es la base de la clasificación de los hongos perfectos en zigomicetos, ascomicetos y basidiomicetos, respectivamente. Dentro de los deuteromicetos se incluyen todos los hongos en los que se desconoce la reproducción sexual, así como los estados anamorfos de todos los hongos perfectos. La reproducción asexual se caracteriza por la formación de esporangiosporas en los Zygomycetes y de esporas externas o coni- diosporas en las otras tres clases. Las esporangiosporas se producen en el interior de una estructura denominada esporangio, por división consecutiva; al llegar a la madurez, el esporangio se rompe liberándose las esporas. Las conidias son formas de propagación de reproducción asexual que nacen de una célula especializada (célula conidiógena), que, a su vez, puede nacer directamente de una hifa vegetativa o de estructuras diferenciadas (conidióforo). Algunos hongos producen conidias grandes y pequeñas, llamadas macroconidias y microconidas, es el caso de los hongos dermatofitos, Fusarium, etc. Si las conidias se forman por fragmentación de la hifa en células individuales, se habla de artroconidias o artrosporas (Ej. Coccidioides inmitis, Geotrichum candidum). En las levaduras se produce una protuberancia a partir de una célula madre, que posteriormente se separa. Se llama blastospora o blastoconidia. Por último, existe un tipo particular de conidias, las clamidosporas o clamidoconidias, que son comunes a todos los tipos de hongos; se forman por condensación del citoplasma y espesamiento de la pared y constituyen formas de reproducción y resistencia. Habitualmente, la identificación de los hongos miceliales se realiza basándose en el estudio del estado asexual, ya que el estado sexual suele ser difícil de inducir y observar. Debido a ello, a los hongos perfectos se les asigna con dos nombres, uno para el estado sexual y otro para el asexual. Por ejemplo, Filobasidiella neoformans y Pseudoallescheria boydii son los nombres del estado sexual de los hongos Criptococcus neofomans y Scedosporium apíospermum, respectivamente. Mientras no se haya demostrado en el laboratorio que esa cepa se reproduce de forma sexuada, se debe nombrar con el respectivo nombre del estado asexual.

Tabla Clasificación de los hongos Clase Zigomicetos Ascomicetos Basidiomicetos Deuteromicetos Ejemplo Rhizopus spp
Tabla Clasificación de los hongos
Clase
Zigomicetos
Ascomicetos
Basidiomicetos
Deuteromicetos
Ejemplo
Rhizopus spp
Estado teleomorfo
de
la
gran
Estado
teleomorfo
de
C.
mayoria
de
hongos.
Ej.
neoformans
Aspergillus spp
Hongos imperfectos verdaderos
y estado anamorfo de todos los
hongos
Reproducción sexual
Zigosporas
Ascosporas
en
el
interior
de
ascas
Basidiosporas en la extremidad
de basidios
Desconocida
Reproducción
Esporangiosporas
dentro
de
Esporas externas o conidias
Esporas externas o conidias
Esporas externas o conidias
asexual
esporangios
Morfología
Micelio sin tabiques o septos
Micelio
con
tabiques
o
son
Micelio
con
tabiques
o
son
microscópica
levaduras
levaduras
Micelio con tabiques o son leva-
duras

MECANISMOS DE PATOGENICIDAD

Las dos principales barreras fisiológicas para el crecimiento de los hongos en los tejidos humanos son la temperatura y el potencial redox. La mayor parte de los hongos crece de forma óptima a temperaturas más bajas que las del organismo humano. Por otro lado, la mayor parte de sus sistemas enzimáticos actúan con mayor eficacia con potenciales redox propios de sustratos muertos, que en el estado relativamente más reducido de los tejidos metabólicamente activos. Además, el organismo humano posee un sistema muy eficaz de defensas celulares para combatir la implantación y el desarrollo de los hongos. Así pues, la actividad patógena de los hongos depende, sobre todo, de su capacidad para adaptarse a los tejidos y resistir a las defensas celulares. En los hongos patógenos primarios o verdaderos causantes de micosis sistémicas, la capacidad de adaptación es bastante elevada y se manifiesta por un dimorfismo. Así, cuando Histoplasma, Blastomyces o Paracoccidioides invaden el organismo humano, forman levaduras gemantes y Coccidioides forma una esférula endosporulada. En estado parasitario, el metabolismo fúngico aumenta y se ven facilitadas determinadas vías metabólicas; el resultado es un microorganismo que crece y se multiplica con mucha mayor rapidez que en su estado natural a temperaturas más bajas. Estas formas parasitarias son más susceptibles a la fagocitosis y destrucción por los macrófagos. Esta es la razón por la que muchas de estas infecciones cursan de forma subclínica y se resuelven de manera espontánea; la blastomicosis es la única excepción a esta regla. El otro grupo de hongos causantes de micosis sistémicas, mucho menos virulentas, las llamadas oportunistas (Cryptococcus, Aspergillus, etc.), requieren la mayor parte de las ocasiones un defecto de las defensas del huésped para poder establecerse en el interior del organismo humano; no presentan dimorfismo térmico, aunque son tolerantes respecto a la temperatura. Las cepas aisladas de infecciones humanas son metabólicamente más activas a 37 0 C y en el potencial redox de los tejidos, que cuando son aisladas del suelo. En los hongos causantes de micosis subcutáneas también existe una amplia gama de adaptabilidad. Son microorganismos poco virulentos que, para producir un cuadro de infección, tienen que introducirse de forma mecánica en los tejidos (implantación traumática); Sporothrix, el más virulento de este grupo, presenta también un dimorfismo térmico, transformándose en levadura cuando invade los tejidos del huésped. En los agentes de la cromomicosis y micetomas, la fase de adaptación requiere mucho tiempo; en el primer caso, la forma parasitaria es la célula esclerótica que se divide por planos, y en los micetomas se forman microcolonias filamentosas en los tejidos. El grado de inmunidad natural del organismo humano frente a las infecciones fúngicas es considerable. El establecimiento de una micosis depende de la exposición a un inóculo suficiente y del grado de resistencia del huésped. En este sentido, existen dos grandes grupos de infecciones fúngicas sistémicas perfectamente delimitadas. En el primero (patógenos primarios o verdaderos), la infección ocurre en individuos de una determi- nada área endémica que inhalan un número suficiente de conidias. La mayor parte de estas infecciones son asintomáticas o se resuelven con rapidez. Esto suele ir seguido de una resistencia específica a la reinfección y en muy pocos casos se llega a la infección grave. En las infecciones sistémicas producidas por hongos oportunistas, el establecimiento de la enfermedad depende enteramente de la baja resistencia del huésped y, si el paciente se recupera de una infección de este tipo, no suele apreciarse una resistencia específica frente a la misma.

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Los anticuerpos humorales desempeñan un papel muy poco importante en la defensa frente a las infecciones fúngicas. Las defensas celulares parecen ser las únicas eficaces frente a estas infecciones. En pacientes con defectos en los linfocitos B, las micosis son infrecuentes en contraste con la elevada frecuencia de infecciones bacterianas. La importancia de la inmunidad celular se pone también de manifiesto en los diferentes tipos de reacciones histopatológicas de las micosis; en general, los hongos patógenos en un huésped normal inducen reacciones piógenas, seguidas por una reacción granulomatosa, y la respuesta producida como consecuencia de una invasión por hongos oportunistas es necrótica o supurativa.

AISLAMIENTO Y EXAMEN DE HONGOS: DIAGNOSTICO MICOLOGICO

Examen directo

El diagnóstico micológico a partir de muestras clínicas se realiza mediante examen directo de las mismas o, de forma indirecta, tras su cultivo. El examen directo en fresco se lleva a cabo realizando una suspensión del producto patológico con unas gotas de KOH al 10-30 % , lo que facilita la disolución de otras células y fibras. En muestras de líquido cefalorraquideo y suero, puede ser interesante realizar una prueba de «tinta china» si hay sospecha de infección criptocócica. Sobre el fondo oscuro de la tinta se observará la gran cápsula de C. neoformans. La tinción de Gram permite ver las levaduras como células gram positivas de gran tamaño, pero la coloración de los hongos es más homogénea cuando se utiliza el azul de metileno o Giemsa . Si se usa la tinción de blanco de calco flúor, los hongos se observarán de color verde fluorescente a microscopio de fluorescencia. En cortes histológicos, la técnica de PAS-Gridley colorea intensamente los polisacáridos de la pared de los hongos, al igual que las técnicas argénticas como la plata -metenamina de Grocott-Gomori. El examen histopatológico resulta de gran ayuda cuando el patógeno se trata de un hongo oportunista, ya que con frecuencia resulta difícil su valoración en el medio de cultivo.

Medios de cultivo

Los hongos, como las bacterias, crecen en medios de cultivo artificiales y, en general, son poco exigentes desde el punto de vista nutritivo. Por ello, el aislamiento de los hongos es relativamente fácil, pero su identificación y la determinación de su significado clínico es mucho más difícil. El medio de cultivo más utilizado en micologia es el Sabouraud pH 5,6; esta acidez dificulta el desarrollo bacteriano. Aunque no necesariamente todos los hongos crecen mejor en este medio, su utilización está consagrada por el uso. De hecho, la mayor parte de las descripciones de hongos patógenos se basan en el aspecto que tienen sobre este medio de cultivo. El medio de Sabouraud suele hacerse selectivo por adición de antibacterianos, como el cloranfenicol, o antifúngicos como la cicloheximida (actidiona); esta última inhibe de forma selectiva la mayor parte de los hongos saprófitos y no tiene acción, en general, sobre los hongos patógenos (existen excepciones como Cryptococcus neoformans). Por otro lado, la mayor parte de los medios de cultivo de uso habitual en bacteriología también permiten el desarrollo de los hongos causantes de micosis humanas. En micología, los medios de cultivo se incuban en aerobiosis, y la temperatura óptima de incubación es 25-30ºC para los hongos causantes de infecciones superficiales y 35ºC para los causantes de micosis sistémicas.

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Las levaduras dan lugar a colonias similares a las bacterianas, macroscópicamente visibles a las 24-48

h.

Algunos hongos filamentosos se desarrollan en los cultivos en 3-5 días, pero otros requieren varias

semanas de incubación; macroscópicamente se presentan como colonias centrífugas, con filamentos entrelazados más o menos largos como una costra compacta recubierta por filamentos cortos. En el caso de los hongos dimórficos patógenos primarios, existen medios de cultivo que ayudan a obtener in vitro la fase parasitaria levaduriforme (medios con sangre o huevo incubados a 35-37ºC).

Identificación

Los hongos se identifican, en primer lugar, por la morfología macroscópica de sus colonias, el color, la textura, la velocidad de crecimiento, etc., pero sobre todo por la morfología microscópica del cultivo esporulado (forma, tamaño, situación, mecanismo de reproducción y el tipo de esporas asexuales). Para la observación con microscopia óptica de los hongos filamentosos, el colorante más empleado es el azul de algodón. Algunos hongos degenerados por el parasitismo no esporulan, lo que hace muy difícil o imposible su identificación. Las levaduras se identifican por el estudio de la morfología que presentan cuando crecen en medios pobres (Corn Meal Tween Agar, Rice Tween Agar) y por pruebas bioquímicas: asimilación y fermentación de carbohidratos. La asimilación (auxonograma y zimogama) consiste en el crecimiento de la levadura utilizando un único compuesto como fuente de carbono o nitrógeno. La fermentación implica la acidificación del medio con producción de gas. Para la identificación de Candida albicans se usa una prueba rápida de producción de tubos germinales en suero (prueba de filamentación. Algunas especies de levaduras requieren pruebas concretas: hidrólisis de la urea y esculina. Por el contrario, la detección de antígenos fúngicos en muestras clínicas parece más prometedora. De hecho, la aglutinación de partículas de látex para detectar el antígeno capsular de C. neoformans en suero y liquido cefalorraquideo es de gran utilidad. No obstante, las técnicas diagnósticas en micología ofrecen en conjunto unos resultados muy por debajo de lo deseable, y continuamente se investigan nuevos métodos de cultivo y de detección de componentes celulares que permitan un diagnóstico más rápido y certero. En este sentido, las técnicas de diagnóstico basadas en la ampliación de ADN fúngico a partir de muestras normalmente estériles pueden ser de utilidad en un

futuro.

La identificación de los mohos se lleva a cabo en base a sus características morfológicas y de cultivo; así pues, es necesario utilizar métodos de cultivo y de análisis que eviten en lo posible el deterioro de las estructuras reproductoras. Hay que tener en cuenta, además, que la fórmula del medio en el que ha crecido un moho tiene una influencia importante en el aspecto de las colonias y en el desarrollo de las estructuras aéreas reproductoras, clamidosporas, esclerocios, etc. Se recomienda, por tanto, que cuando se esté realizando la identificación de un moho se le cultive en varios medios diferentes. Como ya se indicó anteriormente, estos medios pueden ser agar malta, agar Czapek-Dox, agar patata glucosa, agar patata zanahoria glucosa, agar levadura sal de Davis, etc. Para determinar las características coloniales y de cultivo en medios sólidos, se siembra el centro de una placa con esporas (tomadas de la superficie de una colonia con ayuda de un asa de alambre) o con una pequeña porción de agar que contenga micelio de una colonia del moho. Las características morfológicas pueden, a veces, determinarse por las preparaciones en fresco a partir de cultivos en placa. Sin embargo, con mucha frecuencia ocurre que las estructuras reproductoras quedan seriamente deterioradas al hacer estas preparaciones, desligándose la ma-

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yoría de las esporas. Si a causa de esto no se puede realizar la identificación, deberán prepararse cultivos en portaobjetos. Existen dos métodos de cultivo en portaobjetos que pueden utilizarse.

Cultivo en bloque de agar sobre portaobjetos. En una placa de Petri se depositan 10 ml de medio y se deja solidificar. Se esteriliza una placa de Petri que contenga en la base un disco de papel de filtro, sobre el cual se coloca una varilla de vidrio en forma de U que lleve dos portaobjetos limpios. Una vez realizada la esterilización, se añaden unos ml de solución estéril de glicerina al 20 % al papel de filtro, con el fin de evitar que el cultivo que se encuentra en el portaobjetos se seque durante la incubación. Del medio solidificado se cortan asépticamente varios bloques de 1 cm2, montándolos sobre los portaobjetos. Se siembran las cuatro superficies cortadas de cada bloque con el moho que se va a estudiar y se coloca sobre cada bloque un cubreobjetos esterilizado. Los cultivos se incuban en las placas de Petri, con las tapas colocadas. Los portaobjetos pueden sacarse de vez en cuando con el fin de examinar el cultivo al microscopio, con el objetivo de poco aumento o de gran aumento; los cubreobjetos contribuyen a evitar que se produzca contaminación en esos momentos. Una vez que se observa un desarrollo satisfactorio del moho se pueden hacer preparados en fresco, ya que el moho tiende a adherirse al cubreobjetos y al portaobjetos. Con mucho cuidado se quitan los cubreobjetos de los bloques de agar, colocándolos en portaobjetos limpios, con lactofenol, lactofenol azul algodón o lactofenol ácido pícrico. Además de esto se pueden quitar los bloques de agar de los portaobjetos en que se encontraban, examinando estos portaobjetos con colorante y cubreobjetos limpios.

Método de cultivo en portaobjetos de Johnson (Johnson, 1946). Se esteriliza una placa de Petri que contenga papel de filtro, una varilla de cristal y portaobjetos, y se añade glicerol estéril al 20 % de la forma indicada anteriormente. Se colocan asépticamente dos líneas, estrechas y paralelas, de vaspar estéril, a unos 2 cm de distancia, a lo ancho del portaobjetos. En el centro, entre las dos líneas de vaspar, se coloca el inóculo del hongo y se tapa con un cubreobjetos que se coloca sobre las líneas de vaspar (fig. a). Con ayuda de una pipeta Pasteur estéril, se vierte una cantidad de medio fundido estéril (enfriado a 55ºC) entre el portaobjetos y el cubreobjetos hasta que la línea de medio llegue al inóculo (fig. b). Se consigue así una línea de cultivo para el hongo. Finalmente, se sella el borde del cubreobjetos por el lado del medio para evitar que éste se seque (fig. c). El cuarto lado del cubreobjetos se deja abierto. Se incuba el cultivo sobre el portaobjetos dentro de una placa de Petri tapada. El cultivo puede examinarse al microscopio cada cierto tiempo y, cuando sea necesario, puede examinarse una preparación en fresco y teñida del cubreobjetos. Para quitar el cubreobjetos se corta

examinarse una preparación en fresco y teñida del cubreobjetos. Para quitar el cubreobjetos se corta Página

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el cierre de vaspar que se encuentra en el borde del portaobjetos y se empuja cuidadosamente el cubreobjetos con ayuda de otro portaobjetos (fig. d). Se cortan las líneas de Vaspar que hay a cada lado y se corta con cuidado el agar, dejando el cultivo de bongos sobre el cubreobjetos. Este se monta en un portaobjetos y se tiñe con uno de los colorantes a base de lactofenol.

Serologia

En las infecciones fúngicas, las técnicas serológicas suelen ser de menor utilidad que en las infecciones bacterianas o víricas. Los antígenos fúngicos comerciales permiten la detección de anticuerpos frente a hongos patógenos primarios, pero en el caso de las micosis oportunistas resulta difícil distinguir las infecciones de las colonizaciones no invasivas.

ANTIFUNGICOS

Para el tratamiento de las micosis se dispone de un número reducido de fármacos. La anfotericina B es un antifúngico poliénico que, como todos los del grupo, posee un amplio anillo cerrado con un sistema de dobles enlaces conjugados. Este antifúngico, aislado en 1955 de una bacteria del género Streptomyces del suelo venezolano, es el compuesto más eficaz y más utilizado en el tratamiento de las micosis sistémicas. El fármaco se une a la membrana celular del hongo (esteroles), aumentando su permeabilidad. Los hongos son más sensibles a la anfotericina B que a otros polienos, por su mayor afinidad y avidez para unirse al ergosterol, que es el principal esterol de las membranas fúngicas. Con excepción de algunos hongos dematiáceos, Scedosporium y algunos zigomicetos, el resto de los hongos que producen enfermedad en el hombre son sensibles a la anfotericina B. Su gran inconveniente son los efectos tóxicos, que pueden ser muy graves. La 5-fluorocitosina es un antifúngico sintético, una pirimidina fluorada, que se absorbe por vía oral y es eficaz en el tratamiento de unas pocas micosis, en particular las producidas por determinadas levaduras. Actúa inhibiendo la síntesis de ácidos nucleicos. En la actualidad se utiliza casi exclusivamente en algunas infecciones causadas por Candida o Cryptococcus y algunos hongos dematiáceos responsables de cromomicosis. No suele dar buen resultado cuando se utiliza sola. El desarrollo de resistencia a la 5-fluorocitosina durante el tratamiento (resistencia adquirida) hace necesaria su asociación con la anfotericina B. Los derivados azólicos (miconazol, clotrimazol, ketoconazol, fluconazol, itraconazol) tienen una estructura común y un amplio espectro de actividad antimicrobiana. El efecto fungistático primario de los azoles se debe a la inhibición de la síntesis de los esteroles de la membrana celular. La existencia de un metabolismo activo es indispensable para que los derivados azólicos ejerzan su actividad antifúngica; por el contrario, la anfotericina B actúa sobre componentes preformados de la membrana. Al igual que ocurre con la 5-fluorocitosina, algunos constituyentes de los medios de cultivo interfieren la actividad de los azoles; este hecho, junto con su carácter fungistático, dificulta considerablemente la estandarización de los Estudios in Vitro de estos fármacos. Actualmente se tiende a utilizar para esta prueba medios sintéticos de composición definida, pero, aun así, todavía no se ha alcanzado con los antifúngicos la correlación clínica alcanzada con los antibióticos.