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Pruebas normalizadas para la evaluacin de la biodegradabilidad de sustancias qumicas.

una revisin
Resumen La biodegradabilidad es una propiedad de las sustancias qumicas que determina su persistencia ambiental. Diversos organismos han estandarizado mtodos para la evaluacin de esta propiedad, entre los que destacan, por su amplio uso a nivel internacional, las pruebas de la Organizacin para la Cooperacin y el Desarrollo Econmico (OCDE). En este trabajo se presenta una descripcin general de estas pruebas, y se discuten sus principales ventajas e inconvenientes. Para tal efecto, se utiliza la estructura propuesta por dicha organizacin, que distingue tres niveles sucesivos de ensayo: las pruebas de biodegradabilidad inmediata, de biodegradabilidad intrnseca y de simulacin. La complejidad de las condiciones experimentales empleadas aumenta en el mismo orden, por lo que dicho esquema permite evaluar a bajo costo el potencial de biodegradacin de cualquier molcula orgnica. En este artculo se sugieren algunas mejoras a los mtodos, tales como la aplicacin de modelos cinticos para la expresin de los resultados y el uso de la sustancia de prueba como fuente de N, P o S. Se revisan en particular las pruebas de simulacin, que permiten conocer el comportamiento de las sustancias en medios naturales o industriales especficos, y se destaca la importancia de normalizar nuevos mtodos de simulacin y de optimizar los existentes para hacerlos ms accesibles a los posibles usuarios. Entre los medios naturales susceptibles de ser normalizados destacan los anxicos en presencia de distintos aceptores externos de electrones (i.e., nitratos, sulfatos o hierro). Finalmente, se presentan aplicaciones recientes de estas pruebas, as como algunas reas de investigacin futura. Palabras Clave / Normalizacin / OCDE / Pruebas de Biodegradabilidad / Sustancias Antropognicas / Recibido: 06/01/2004. Modificado: 23/09/2004. Aceptado: 28/09/2004. La biodegradabilidad es un parmetro determinante en el comportamiento ambiental de las sustancias qumicas y una propiedad deseable de los productos que se liberan en grandes cantidades al medio natural, tales como detergentes, pesticidas, materiales de embalaje, etc. Mediante el proceso conocido como biodegradacin, los microorganismos transforman los compuestos orgnicos, la mayora de las veces en productos menos txicos que los compuestos originales. La biodegradacin puede ser primaria y conducir a simples alteraciones estructurales del compuesto, o bien implicar su conversin a productos inorgnicos de bajo peso molecular y constituyentes celulares, en cuyo caso se denomina biodegradacin ltima o mineralizacin (OCDE, 1992; Ecuacin 1). microorganismos Compuesto orgnico + O2 > CO2 + H2O + sales + biomasa (1)

La biodegradabilidad ha sido definida como la capacidad intrnseca de una sustancia a ser transformada en una estructura qumica ms simple por va microbiana (Ottenbrite y Albertsson, 1992). Para su evaluacin se han diseado una serie de pruebas, las cuales buscan cuantificar el grado de persistencia de estructuras qumicas en ambientes naturales o industriales. Algunas de estas pruebas han sido normalizadas para garantizar que sus resultados son confiables y vlidos independientemente del laboratorio en el que sean obtenidos. En el presente trabajo se hace una revisin de los mtodos para la evaluacin de la biodegradabilidad que han sido normalizados o que estn en proceso de normalizacin por parte de la Organizacin para la Cooperacin y el Desarrollo Econmico (OCDE). stas son las pruebas de biodegradabilidad ms utilizadas a nivel internacional y de ellas se deriva la mayora de los mtodos estandarizados por la Organizacin Internacional de Normalizacin (ISO), por la Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos (USEPA) y por la Oficina Europea de Sustancias Qumicas (ECB). As mismo, se presenta la estrategia de evaluacin de la biodegradabilidad ms comnmente utilizada, las principales ventajas y limitaciones de las pruebas, as como algunas tendencias de investigacin futura. Estrategia de Evaluacin de la Biodegradabilidad En el esquema establecido por el Programa de Evaluacin de Productos Qumicos de la OCDE, la biodegradabilidad de una sustancia se determina utilizando tres niveles sucesivos de ensayo: las pruebas de biodegradabilidad inmediata, de biodegradabilidad intrnseca y de simulacin (OCDE, 1992). En la Tabla I se muestran las pruebas que la OCDE ha propuesto para cada nivel de evaluacin, as como las pruebas ISO, US-EPA y ECB correspondientes.

Inicialmente se lleva a cabo una prueba de biodegradabilidad inmediata, con la finalidad de clasificar las molculas en la categora fcilmente biodegradable con medios analticos simples. Las condiciones experimentales de las pruebas inmediatas restringen al mximo las posibilidades de que la biodegradacin suceda, razn por la cual se considera que un resultado positivo indica la biodegradabilidad de la sustancia en la mayora de los medios naturales y de los sistemas de tratamiento (Nyholm, 1991). Si el resultado de la prueba de biodegradabilidad inmediata es negativo, se procede a realizar una prueba intrnseca. Estas pruebas utilizan condiciones experimentales ms favorables a la degradacin, por lo que un resultado positivo implica que la sustancia es intrnsecamente biodegradable bajo las condiciones empleadas, aunque no necesariamente en el medio natural. Por otra parte, un resultado negativo indica muy probablemente la persistencia ambiental de la sustancia. Finalmente, si la sustancia mostr una biodegradabilidad mediocre en una prueba intrnseca, se llevan a cabo pruebas de simulacin. Tales pruebas tienen como objetivo estudiar su comportamiento en sistemas de tratamiento o medios naturales relevantes, para lo cual debe contarse con un cierto conocimiento de la distribucin de la sustancia en los diferentes compartimientos ambientales (agua, suelos, etc.). Si el resultado de la prueba de simulacin pertinente es a su vez negativo, se presume que la sustancia persiste en el ambiente y que puede considerrsele sujeta a restricciones en cuanto a su esquema de produccin o comercializacin; as mismo, suele exigirse la bsqueda de compuestos sustitutos para un cierto uso (Kaiser, 1998). Mtodos de Evaluacin de la Biodegradabilidad

Las pruebas de biodegradabilidad inmediata La OCDE ha normalizado varias pruebas de biodegradabilidad inmediata, cuyas condiciones experimentales se resumen en laTabla II. El principio general de estas pruebas es la incubacin aerobia esttica, o por lote, de una cantidad reducida de biomasa en un medio mineral, a pH neutro y a una temperatura entre 20 y 25C. La sustancia en estudio se aade a una concentracin definida, como nica fuente de carbono y energa. El inculo consiste en una poblacin microbiana natural que no haya sido expuesta al compuesto de prueba.

Estas pruebas pueden aplicarse a una gran variedad de compuestos, debido a que se basan en el seguimiento de parmetros directos y no especficos a la molcula que se estudia, como el Carbono Orgnico Disuelto (COD), o bien de parmetros indirectos correlacionados con la mineralizacin de la molcula, como la Demanda Bioqumica de Oxgeno (DBO) o la produccin de CO2. Simultneamente a la prueba se corren varios testigos, que aseguran que los resultados no se deben a una degradacin abitica, a la eliminacin fsica de la molcula por adsorcin, a la toxicidad de la sustancia o a una actividad deficiente del inculo; sta ltima se evala con molculas de referencia fcilmente biodegradables, tales como la anilina o el acetato de sodio. Los resultados de los ensayos respiromtricos se corrigen con la respiracin endgena del inculo, la cual se mide en ausencia de la sustancia de prueba. El nivel lmite de biodegradacin exigido por estas pruebas es una disminucin del 70% cuando se monitorea el COD, y del 60% de la Demanda Terica de O2 (ThO2) o de la

Produccin Terica de CO2 (ThCO2) cuando se trata de pruebas respiromtricas, valores que deben alcanzarse en un perodo de 28 das. ThO2 y ThCO2 se calculan a partir de la estructura qumica de la molcula considerando una biodegradacin total de la misma (OCDE, 1992). Para un resultado positivo, y a excepcin de la prueba MITI I (301 C), los niveles lmite de biodegradacin deben adems alcanzarse en los diez das que se suceden al final de la fase de latencia, la cual se define arbitrariamente como el tiempo necesario para alcanzar una biodegradacin del 10%. A este criterio se le conoce como la ventana de los 10 das . El nivel mximo de biodegradacin presentado al cabo de 28 das, la duracin de la fase de latencia (tL) y el tiempo de vida media (t1/2), definido como el tiempo transcurrido para obtener una biodegradacin del 50%, se reportan como resultado de las pruebas. La obtencin de estos parmetros est representada en la Figura 1.

La seleccin de una prueba se lleva a cabo considerando las propiedades fisicoqumicas de la sustancia. Los compuestos voltiles deben evaluarse en sistemas cerrados y preferiblemente mediante la concentracin de O2 disuelto (i.e., prueba 301 D). La biodegradacin de los compuestos poco solubles en agua no deber cuantificarse mediante el consumo de COD (i.e., evitar las pruebas 301 A y E), mientras que debern preferirse los ensayos respiromtricos para los compuestos adsorbibles. Sin embargo, la sola eleccin de un mtodo puede afectar el resultado de la prueba. Por la reducida concentracin de biomasa que estipulan, las pruebas 301 D y E proporcionan ms resultados negativos, ya que frecuentemente necesitan largos perodos para que los microorganismos puedan reproducirse suficientemente. Por otra parte, dado que un resultado positivo en alguna de estas pruebas restrictivas garantiza que el compuesto se biodegradar rpidamente, son las ms indicadas para los compuestos que se encontrarn en grandes cantidades en el medio ambiente.

Se ha reportado que la cintica de biodegradacin de un compuesto determinado depende de la prueba que se seleccione. Reuschenbach et al. (2003) encontraron que la anilina se biodegrada ms rpidamente en la prueba 301 A, basada en el seguimiento del COD, que en la prueba 301 F y ms an que en la 301 B, basadas en el consumo de O2 y en la produccin de CO2, respectivamente. La prueba 301 B mide el CO2 producido, el cual es capturado por un lcali en un dispositivo externo al recipiente en el que se lleva a cabo la biodegradacin. Si ste no cuenta con aireacin y agitacin suficientes, se producir una acumulacin de HCO3- que modificar la cintica de biodegradacin. Adems, el mtodo de cuantificacin del CO2 capturado es impreciso per se, ya que ste se calcula a partir de la diferencia entre los valores de titulacin del lcali del recipiente de prueba y del testigo, que son relativamente elevados. En virtud de que la prueba 301 B no es muy confiable desde el punto de vista cintico, es recomendable que el criterio de la ventana de los 10 das se elimine cuando se utiliza dicho mtodo. De hecho, se ha mostrado que en el caso de surfactantes este criterio produce falsos resultados negativos (Richterich y Steber, 2001), aun cuando se utilicen otras pruebas de biodegradabilidad inmediata. La prueba 310 (en proceso de normalizacin; OCDE, 2001c) fue propuesta para solventar algunas de las limitaciones de la prueba 301 B. Esta prueba, que permite probar compuestos voltiles, poco solubles en agua y adsorbibles, se lleva a cabo en recipientes cerrados, en los que se deja un volumen determinado de aire. Durante y al final de la incubacin, se sacrifican botellas de rplica para determinar el C inorgnico presente en el aire o en el lquido despus de aadir un cido o una base, respectivamente. Considerando la relacin de volmenes de lquido y de aire, es posible determinar la totalidad de CO2producido. Mediante un ensayo interlaboratorio se mostr que esta prueba es la ms adecuada para la determinacin de la biodegradabilidad inmediata de surfactantes (Painter et al., 2003). Las pruebas de biodegradabilidad intrnseca Las pruebas de biodegradabilidad intrnseca se desarrollan bajo condiciones ambientales ms favorables a la biodegradacin, sobre todo en lo que concierne a la duracin del ensayo y al mantenimiento de una viabilidad elevada del inculo. Lo anterior se logra mediante la adaptacin previa del inculo a la sustancia y la adicin de una fuente adicional de C. A la fecha, la OCDE ha normalizado tres pruebas de biodegradabilidad intrnseca en medio aerobio: los ensayos SCAS (Semi-Continuous Activated Sludge), Zahn-Wellens y MITI II, descritos en las lneas directrices 302 A, B y C, respectivamente (Tabla III).

En la prueba SCAS, una muestra de lodos activados se expone tanto a la sustancia como a un efluente domstico durante 23 horas, al cabo de las cuales se obtiene el sobrenadante para su anlisis en trminos de COD. El sobrenadante se reemplaza por un volumen equivalente de efluente domstico y se aade nuevamente la sustancia de prueba (20mgCOD/l), para reiniciar el ciclo. Debido a su prolongada duracin (hasta de 6 meses) y al contacto continuo con el efluente, que funge a la vez como inculo y fuente alterna de C, sta es una prueba muy adecuada para la determinacin de la biodegradabilidad intrnseca. La prueba Zahn-Wellens se lleva a cabo en modo discontinuo, y se basa tambin en el seguimiento de la prdida de COD; sin embargo, utiliza altas concentraciones de la sustancia de prueba (50-400mgCOD/l), que pueden ser txicas para los microorganismos. La prueba MITI II permite evaluar la biodegradabilidad de sustancias insolubles en agua. Sin embargo, al igual que la prueba inmediata MITI I, especifica un protocolo de preparacin del inculo sumamente complicado, que precisa la mezcla de 10 muestras naturales (i.e., suelo, agua superficial, lodos activados) y su posterior precultivo con peptona y glucosa en modo semidiscontinuo durante al menos 30 das (OCDE, 1992). Varios autores han reportado que este procedimiento, lejos de aumentar el potencial de biodegradacin del inculo, produce ms resultados negativos que otras pruebas con igual concentracin de biomasa (Painter, 1995). Recientemente se propuso la prueba CONCAWE (302 D, en proceso de normalizacin) para la determinacin de la biodegradabilidad intrnseca de productos derivados del petrleo, y en general de sustancias voltiles y poco solubles. Este ensayo utiliza la misma metodologa que la prueba inmediata 310, pero a diferencia de sta, utiliza una poblacin microbiana mixta previamente adaptada a la sustancia de prueba y un perodo de incubacin de 8 semanas (OCDE, 2001a). Dado que Battersby et al. (1999) encontraron que la prueba proporciona resultados con reproducibilidad semejante a la de otras pruebas inherentes, constituye una mejor alternativa que el ensayo MITI II para el estudio de la biodegradabilidad de sustancias insolubles en agua.

Las pruebas de simulacin El ensayo 303 A, que reproduce una planta de tratamiento de aguas residuales mediante lodos activados, es la prueba de simulacin ms utilizada. En esta prueba se determina la velocidad de remocin de la sustancia (10-20mgCOD/l), contenida en un agua residual sinttica a base de peptona, en un mdulo de lodos activados, compuesto bsicamente de un reactor agitado con un tiempo de retencin de lodos de 6 das y un decantador que separa el agua tratada. La biodegradabilidad de la sustancia se calcula a partir del COD removido en un tiempo de residencia hidrulica de 3-6 horas y considerando los resultados de una prueba testigo realizada simultneamente sin la sustancia. Un inconveniente de la prueba es que utiliza concentraciones muy elevadas con respecto a las que suelen encontrarse en la mayora de las plantas de tratamiento, lo que conduce a cinticas y mecanismos de biodegradacin distintos a los que suceden en la realidad. Por tal motivo, Painter (1995) sugiri realizar estas pruebas a una concentracin aproximada de 10g/l, lo cual necesita una tcnica analtica especfica o la sustancia marcada con 14C. La OCDE tambin propone una variante de esta prueba, en la cual se simula un sistema de tratamiento de aguas residuales por biomasa fija (303 B). Pruebas de biodegradabilidad en suelos. La prueba 304 A fue normalizada por la OCDE en 1981 para determinar la biodegradabilidad intrnseca de sustancias qumicas en suelos. Una versin ms completa de esta prueba ha sido normalizada recientemente (307), que permite estudiar la transformacin aerobia y anaerobia en suelos de compuestos para los cuales exista un mtodo analtico de sensibilidad suficiente (OCDE, 2002a). Este ensayo implica la adicin de la sustancia de prueba, la cual puede ser o no marcada radiactivamente, a muestras de suelo y su posterior incubacin en un bimetro a temperatura y humedad constantes y en ausencia de luz. A diferentes perodos de incubacin se realiza una extraccin de las muestras y se determinan los contenidos de la sustancia de prueba y de los principales productos de degradacin. Los productos voltiles deben ser colectados absorbindolos en los medios apropiados para su posterior cuantificacin. Cuando se usa la sustancia marcada con 14C es posible medir su velocidad de mineralizacin mediante el 14CO2 producido. Para el estudio de las rutas de biodegradacin de una sustancia es suficiente realizar la evaluacin con un solo tipo de suelo por un perodo no mayor de 120 das. Para la determinacin de velocidades de biodegradacin se aconseja realizar las pruebas con al menos tres tipos de suelo diferentes en su contenido de C orgnico, pH, contenido de arcilla y concentracin de biomasa; estos tipos de suelo deben ser representativos del medio receptor de la molcula que se evala y en este caso la duracin del estudio puede alargarse hasta 6 o 12 meses. Se ha encontrado que la adicin de una sustancia fcilmente biodegradable estimula la degradacin de la materia orgnica nativa del suelo, lo que se conoce con el nombre de imprimacin (Alexander, 1977). El uso de sustancias marcadas al 14C permite eliminar este error, al evaluar nicamente el CO2 producto de la degradacin de la sustancia. Pruebas de biodegradabilidad en medio marino. En virtud de las particularidades del medio marino, sobre todo en lo que respecta a las caractersticas de las bacterias responsables de

los procesos de biodegradacin (i.e., su halotolerancia), la OCDE propone una prueba de simulacin de este compartimiento ambiental (306). Esta prueba esttica usa agua marina como medio e inculo a la vez, y existe en dos variantes: el ensayo en matraz agitado que mide el consumo de COD durante 60 das, y la prueba de DBO en botella cerrada, con una duracin de 28 das. Dado que se utiliza el compuesto de prueba como nica fuente de C y de energa, as como una cantidad muy reducida de biomasa, frecuentemente se considera este mtodo como una prueba de biodegradabilidad inmediata (Nyholm, 1991). Pruebas de biodegradabilidad en sedimentos. Los sedimentos naturales son el receptculo final de un gran nmero de sustancias qumicas descargadas al medio acutico, principalmente de aquellas que por su hidrofobicidad se adsorben a la materia particulada. La prueba OCDE 309 (en proceso de normalizacin; OCDE, 2001b), diseada para evaluar la biodegradabilidad aerobia de compuestos a bajas concentraciones (<100g/l) en aguas superficiales, es un ensayo en matraz agitado que contempla la adicin de sedimento (1g/l) para simular la interfase sedimento/agua. La biodegradacin se mide mediante el monitoreo de la molcula de prueba marcada con 14C o del 14C O2 producido, o utilizando tcnicas analticas lo suficientemente sensibles, durante un mximo de 60 das. En funcin del medio que se pretenda estudiar, el sedimento puede caracterizarse por un elevado contenido en C orgnico (2,5-7,5%) y una textura fina (contenido de arcillas >50%), o bien por un contenido en C orgnico reducido (0,5-2,5%) y una textura gruesa (contenido de arcillas <50%). En un ensayo ms complejo (308), la OCDE propone la simulacin de las diferentes condiciones que pueden prevalecer en un sistema sedimentario (OCDE, 2002b). En una de sus dos variantes, la prueba simula una columna de agua aerobia con una capa subyacente de sedimento sujeta a un gradiente de O2. En la otra variante, se simula un sistema aguasedimento completamente anaerobio. Esta prueba permite, si se utiliza la molcula marcada con 14C , la identificacin y cuantificacin de los productos de transformacin, as como su distribucin en las fases slida y lquida. Los sedimentos deben caracterizarse en funcin del pH, contenido en C orgnico, potencial redox y concentracin de biomasa. Prueba de biodegradabilidad anaerobia. En estudios anteriores (OCDE, 1981) se ha encontrado que algunos ambientes anaerobios (i.e., sedimentos) estn sujetos a concentraciones de contaminantes mayores que los ambientes aerobios. Aunado a lo anterior, se ha evidenciado que los microorganismos anaerobios son metablicamente ms verstiles de lo que se crea (Caldwell et al., 1998; Anderson y Lovley, 2000), lo cual ha incentivado el estudio y la aplicacin de sistemas anaerobios para el tratamiento y la evaluacin de la biodegradabilidad de una gran variedad de contaminantes. Para tal efecto la OCDE propuso el mtodo 311, actualmente en proceso de normalizacin (OCDE, 2001d). El mtodo consiste en incubar en recipientes hermticos, durante 60 das a 35 2C, lodos provenientes de un digestor anaerobio (1-3gSST/l; SST: slidos suspendidos totales) en presencia de una concentracin de 20 a 100mgC/l de la sustancia de prueba. La cuantificacin de la presin ejercida por los gases producto de la biodegradacin anaerobia (i.e., CO2 y CH4) permite calcular el grado y la velocidad de degradacin de la sustancia. Como control se emplean sustancias de referencia fcilmente biodegradables, tales como

fenol o benzoato de sodio. Cuando se desconoce si la sustancia es txica para los microorganismos anaerobios, se recomienda un control adicional en el que se adicionan la sustancia de prueba y la de referencia en la misma concentracin; as mismo, cuando se trabaja con una sustancia poco soluble y se emplea un disolvente, debe incluirse un control en el que se adicionan el disolvente, el medio de cultivo y el inculo. Este mtodo tambin considera el empleo de un inculo preadaptado a la sustancia de estudio, cuando se sospecha que sta no es fcilmente biodegradable. El mtodo OCDE 311 est limitado a la evaluacin de un sistema metanognico; sin embargo los microorganismos anaerobios pueden utilizar una variedad de aceptores finales de electrones (i.e., nitratos, sulfatos, Mn y Fe), los cuales estn presentes en ambientes naturales y en aguas residuales industriales. Adems, no puede asumirse que el potencial metablico en un ambiente anaerobio es el mismo con los diferentes aceptores finales de electrones (Strevett et al., 2002). Por ejemplo, Hee-Sung et al. (2002), al estudiar la biodegradacin de pirrolidina y piperidina en ambientes desnitrificantes, sulfatorreductores y metanognicos, observaron una degradacin completa en el ambiente desnitrificante y ninguna degradacin en los otros dos ambientes despus de seis meses. Otra limitante del mtodo OCDE 311 es en relacin al medio de cultivo, el cual carece de compuestos orgnicos (i.e., vitaminas y aminocidos), los cuales pueden ser requeridos por los microorganismos anaerobios para su ptimo crecimiento (Colleran y Pender, 2002). Conclusiones La normalizacin de las pruebas de biodegradabilidad enfrenta un problema que es inherente a cualquier intento de simulacin ambiental in vitro. Cuando se pretende integrar en el laboratorio el mayor nmero de variables, buscando reflejar la complejidad real de los fenmenos naturales, disminuye tambin la posibilidad de construir mtodos reproducibles y por lo tanto susceptibles de normalizacin. As, las pruebas de biodegradabilidad normalizadas deben contar con metodologas experimentales simples y al mismo tiempo aproximarse lo ms posible a los fenmenos que realmente suceden en la naturaleza. No obstante, es posible cambiar ciertas prcticas que en un principio tuvieron como propsito la fcil implementacin de las pruebas y que ahora limitan el uso de los datos que proporcionan. Por ejemplo, es necesario modificar la expresin de los resultados cinticos de las pruebas (usualmente en trminos de tiempo de latencia y nivel mximo de biodegradacin), de modo que stos puedan usarse en la prediccin cuantitativa del comportamiento de las sustancias. La aplicacin de modelos cinticos y su validacin a distintas concentraciones de la sustancia sera de gran utilidad para el anlisis cuantitativo del riesgo ambiental asociado a su dispersin. Otro aspecto importante que debe considerarse es el uso de la sustancia de prueba como nica fuente de C. Lo anterior conduce a una subestimacin de su potencial de degradacin, ya que en el medio natural son frecuentes los procesos cometablicos. La adicin de una fuente de C fcilmente asimilable (i.e., glucosa) podra aumentar la relevancia de los

resultados de las pruebas, aunque por otra parte hara indispensable el uso de una tcnica analtica especfica para el seguimiento de la molcula de inters. Todas las pruebas normalizadas han sido diseadas para considerar la sustancia de prueba como fuente de C. Sin embargo, ciertos compuestos orgnicos pueden tambin constituir fuentes de N, P o S. Con algunas modificaciones a los mtodos, sobre todo en lo que respecta al medio de cultivo, podra conocerse ms acerca de la biodegradabilidad de dichos compuestos. Las pruebas de biodegradabilidad inmediata, por su simplicidad, son las ms utilizadas y referenciadas en la literatura especializada. Por ello, sus principales inconvenientes ya han sido detectados y revisados, y se ha normalizado un mtodo (310) como alternativa a la limitada prueba 301 B. Aunque han sido menos aplicadas, la situacin de las pruebas inherentes es semejante. Con la normalizacin de la prueba CONCAWE se superarn las desventajas de la prueba MITI II, y se dispondr de un mtodo confiable para el ensayo de compuestos voltiles y poco solubles. En contraste, a excepcin de las pruebas 306 y 311, las pruebas de simulacin implican un alto costo que limita su aplicacin y por ende su optimizacin por parte de los usuarios. No obstante, es de importancia que se mejoren las pruebas de simulacin disponibles, y que se propongan nuevos mtodos que reproduzcan de manera realista, y ms econmica, los medios receptores de sustancias qumicas. Entre los medios susceptibles de ser normalizados destacan los anaerobios en presencia de distintos aceptores finales de electrones (i.e., nitratos, sulfatos, Mn o Fe). Una mayor aplicacin de las pruebas de biodegradabilidad en general, y de las de simulacin en particular, contribuir sin duda a aumentar el conocimiento acerca del comportamiento ambiental de las sustancias qumicas.